CN104313139A - 一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒 - Google Patents

一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒。所述单分子细胞检测方法包括如下步骤：1)提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；2)提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体具有特异性结合所述受体分子的结构域；3)在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，富集到探针-细胞-磁珠复合物；4)在步骤(3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，加热，离心，取上清液进行单分子荧光检测。

Description

一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，具体涉及一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒。
背景技术
癌症的检测方法对临床诊断非常重要。
目前，以蛋白质和基因等作为生物标志物的分子识别方法在癌症检测中已有应用，比如：利用免疫染色、质谱、荧光谱等能够检测细胞表面及血液中的特异性抗体；利用核酸序列扩增的方法检测目标基因、基因变化和基因甲基化。然而，检测抗体的方法易出现假阳性信号；检测基因等生物标志物的方法需要复杂的基因提取过程，并通常要结合核酸序列扩增手段以放大信号。
流式细胞仪能在细胞水平实现对癌症的检测，但是对细胞个数有一定的要求(通常需要大于10万个细胞)，因此，流式细胞仪对于含量极少的循环肿瘤细胞(CTCs)很难实现有效检测。
因此，有必要提供一种简便、快速、高灵敏度的细胞检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种单分子细胞检测方法，包括如下步骤：
1)提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；
2)提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体具有特异性结合所述受体分子的结构域；
3)在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，混匀后孵育0.5～2小时，再离心去上清，然后加入链霉亲和素标记的磁珠，室温孵育20～60分钟时间后，磁分离2～10分钟，富集到探针-细胞-磁珠复合物；
4)在步骤(3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，80～95℃下加热2～10分钟，离心，取上清液进行单分子荧光检测。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述第一配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述第二配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述第一配体与第二配体相同或不同。
如本发明所述的，“具有特异性结合所述受体分子的结构域”是指配体分子具有能与待测细胞表面受体特异性结合的核酸片段结构、多肽片段结构或抗体结构域。
如本发明所述的，“核酸适体DNA、核酸适体RNA”是指能与待测细胞表面受体结合的核酸片段。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(1)中，所述核酸适体DNA包括如SEQ ID NO:1～4所示的任一种核苷酸序列。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(1)中，所述核酸适体DNA为但不限于人小细胞肺癌细胞(NCI-H69)的核酸识体DNA、人B淋巴瘤细胞(Ramos)的核酸识体DNA、耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞(Toledo)的核酸识体DNA、人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的核酸识体DNA、人肝肿瘤细胞(HepG2)的核酸识体DNA、人结肠癌细胞(HT-29)的核酸识体DNA、人卵巢癌细胞(TOV-21G，卵巢透明细胞腺癌)的核酸识体DNA或人卵巢癌细胞(CAOV-3，卵巢浆液性腺癌)的核酸识体DNA。
如本发明所述的，所述人小细胞肺癌细胞(NCI-H69)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:5为HCA12：5′-GTG GAT TGT TGT GTT CTG TTG GTT TTT GTG TTG TC-3′，所述SEQ IDNO:6为HCC03：5′-TCC GTG CCA CTG GCC CCC GGT GCC CCG GTC CCCGG-3′。
如本发明所述的，所述人B淋巴瘤细胞(Ramos)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:7为TD05：5′-AACACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG TTC AGG GTC TCC TCC CGGTG-3′。
如本发明所述的，所述耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞(Toledo)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:8为sgd5/T1：5′-ATA CCA GCT TAT TCA ATT ATC GTG GGT CAC AGC AGC GGTTGT GAG GAA GAA AGG CGG ATA ACA GAT AAT AAG ATA GTA AGT GCAATC T-3′；
如本发明所述的，所述人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:9为sgc8：5′-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTAGA-3′；
如本发明所述的，所述人肝肿瘤细胞(HepG2)的核酸识体DNA包括如SEQID NO:10或11所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:10为B-2：5′-CAACTC AAT AAG CTA GGT GGG TGG GGG ACA CTG CCC GGG GGT GGT TGGGT-3′(SEQ ID NO:10)；所述SEQ ID NO:11为E-1：5′-CGA TGG CGG TGG GTGGGG GAC AAA TTT GGG GGG CGT TGG GTG TTT GTG GT-3′。
如本发明所述的，所述人结肠癌细胞(HT-29)的核酸识体DNA包括如SEQID NO:12或13所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:12为SYL1：5′-AGCGTC GAA TAC CAC TAC AGT TTG GCT CTG GGG GAT GTG GAG GGG GGTATG GGT GGG AGT CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3′；所述SEQ ID NO:13为SYL2：5′-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AGA GCT CGG GGT TTT TTG GGGTTT TTT GGG GTT TTG GTG GGG CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3′。
如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞(TOV-21G，卵巢透明细胞腺癌)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:14或15所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQID NO:14为Tov2：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA TAA TCT CTA CAG GCGCAT GTA ATA TAA TGA AGC CCA TCC ACC TGG ACA CGG TGG CTT A-3′；所述SEQ ID NO:15为Tov3：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA CTC ACT CTGACC TTG GAT CGT CAC ATT ACA TGG GAT CAT CAG TCG ACA CGG TGGCTT A-3′。
如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞(CAOV-3，卵巢浆液性腺癌)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ IDNO:16为DOV4：5′-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AGG GCA TCA GAT TAGGAT TAG GAT CTA TAG GTT CGG ACA TCG TGA GGA CCA GGA GAGCA-3′；所述SEQ ID NO:17为DOV6：5′-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AATGTT GGG GTA GGT AGA AGG TGA AGG GGT TTC AGT TGA GGA CCA GGAGAG CA-3′.
在本发明一优选实施例中，所述步骤(1)中，所述核酸适体RNA包括但不限于人类星形胶质细胞瘤细胞(U251，脑癌)的核酸识体RNA、人乳腺癌细胞(MCF7)的核酸识体RNA或人前列腺癌细胞(LNCaP)的核酸识体RNA。
如本发明所述的，所述人类星形胶质细胞瘤细胞(U251，脑癌)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:18为E9P2-2：5′-UGC CCA CUA UGC GUG CCG AAA AAC AUU UCC CCC UCUACC C-3′.
如本发明所述的，所述人乳腺癌细胞(MCF7)的核酸识体RNA包括如SEQID NO:19所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:19为A30：5′-CAG CGAAAG UUG CGU AUG GGU CAC AUC GCA GGC ACA UGU CAU CUG GGC G-3′。
如本发明所述的，所述人前列腺癌细胞(LNCaP)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO:20或21所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:20为A9：5′-ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA AGU CUA CGU UCC-3′；所述SEQ ID NO:21为A10：5′-AUC AGC CAU GUU UAC GUC ACU CCU UGU CAAUCC UCA UCG G-3′。
如本发明所述的，“抗体分子”是指能与待测细胞表面受体结合的抗体。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(1)中，所述抗体分子包括但不限于上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM/CD326)、白细胞共同抗原抗体(anti-CD45)、表皮生长因子抗体(anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体(anti-AFP)、造血干细胞抗原CD133抗体(anti-CD133)、乳腺癌HER2抗体(anti-HER2/neu)、MUC1粘蛋白抗体(anti-MUC1)或乳腺癌相关抗原BRCAA1抗体(anti-BRCAA1/RBBP1L1)。
本发明所述的捕获探针和报告探针，在配体类别的选择上，可以选择核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
优选地，当不同待测细胞与某种抗体分子都能结合时，优选核酸适体DNA/RNA作为配体，如EGFR分布于上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，anti-EGFR能结合表皮鳞癌细胞(A431)、人结直肠癌细胞(DiFi)、前列腺癌细胞(DU145)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)、宫颈癌细胞(ME180)等。
优选地，当指数富集的配基系统进化技术(SELEX)未筛选出核酸适体DNA/RNA、或筛选出核酸适体DNA/RNA的亲和常数(Kd)值较大、或核酸适体DNA/RNA对几种细胞都有作用时，优选抗体分子作为配体，如针对NCI-H69细胞筛选出的核酸适体DNA(HCH07:5′-GCC GAT GTC AAC TTT TTC TAACTC ACT GGT TTT GC-3′),能识别人小细胞肺癌细胞(NCI-H69、NCI-H146、NCI-H128)、人肺腺癌细胞(NCI-H23)、肝癌细胞(IMEA、BNL)。
在本发明一实施例中，所述步骤(1)中，所述荧光分子为有机染料分子、无机荧光纳米颗粒或发光蛋白质。
在本发明一优选实施例中，所述有机染料分子包括但不限于Alexa Fluor488、Alexa Fluor 640、FAM、R6G、ROX、FITC、cy3、cy5、PE或APC。
在本发明一优选实施例中，所述无机荧光纳米颗粒包括但不限于QD525量子点、QD605量子点或QD655量子点。
在本发明一优选实施例中，发光蛋白质包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。
本发明提供的报告探针采用的荧光分子可根据实际需要进行选择，本发明采用的有机染料分子标记配体、发光蛋白质标记抗体等容易直接合成或购得；本发明采用的无机荧光纳米颗粒具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄且对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长的特点，其标记配体时具有易控性。
在本发明一实施例中，所述步骤(2)包括至少一种待测细胞，每种待测细胞采用至少一种报告探针，其中，每种报告探针的荧光分子均不相同。
在此优选条件下，采用不同的荧光分子即可对不同的待测细胞进行标记，因此，通过对不同报告分子进行单分子检测可以读出待测细胞的信息，从而同时对多种细胞进行检测。
在本发明一实施例中，所述步骤(2)包括至少一种待测细胞，每种待测细胞采用至少一种捕获探针，其中，每种捕获探针的第一配体均不相同。
在此优选条件下，每种待测细胞上具有不同的受体分子，这些受体分子可以特异地与不同的第一配体结合，从而提高待测细胞在后续磁分离过程中被富集的概率。
在本发明一实施例中，所述步骤(2)包括至少一种待测细胞，所述待测细胞来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述结合缓冲液为包含酵母转移核糖核酸(Yeast tRNA)和牛血清白蛋白(BSA)的洗涤缓冲液。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述结合缓冲液中还包含胎牛血清(FBS)。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(3)中，所述洗涤缓冲液为包含4.5g/L葡萄糖和5mM氯化镁的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS，pH 7.3)。
如本发明所述的，所述“结合缓冲液”可以由本领域技术人员根据具体需要(即细胞上的受体分子和捕获探针、报告探针上的配体分子相结合所需要的缓冲液)进行配置。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述报告探针的浓度为100～5000nM。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(3)中，所述报告探针的浓度为100～500nM。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述捕获探针的浓度为100～5000nM。
在本发明一优选实施例中，所述步骤(3)中，所述捕获探针的浓度为100～500nM。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述待测细胞的浓度为0.01～1000个/μl。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，混匀后孵育的温度条件为0～10℃。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，离心去上清的方法采用本领域常用的对细胞进行离心的条件。
在本发明一实施例中，所述步骤(3)中，所述链霉亲和素标记的磁珠包括但不限于购买的链霉亲和素标记的磁珠。
如本发明所述的，所述步骤(3)中，“探针-细胞-磁珠复合物”是指细胞上的受体特异性地与捕获探针、报告探针结合后，由于捕获探针上修饰有生物素，通过生物素和链霉亲和素的结合作用，磁分离后可以对同时结合有捕获探针以及报告探针的细胞进行富集，得到所述探针-细胞-磁珠复合物。
在本发明一实施例中，所述步骤(4)中，所述洗脱缓冲液包括但不限于DL--二硫苏糖醇(DTT，300mM)、2-巯基乙醇(2.0M)、十二烷基硫酸钠(SDS，0.1％)、或含95％甲酰胺的乙二胺四乙酸(EDTA，10mM，pH 8.2)。
如本发明所述的，所述“洗脱缓冲液”可以由本领域技术人员根据具体需要(使生物素-链霉亲和素断开所需要的缓冲液)进行配置。
如本发明所述的，所述步骤(4)中，所采用的洗脱缓冲液可使生物素-链霉亲和素断开，通过后续加热处理可使配体和细胞受体断开结合，从而释放细胞上的捕获探针和报告探针，通过离心分离得到包含捕获探针和报告探针的上层清液，将此上清液用于单分子检测；由于报告探针上的报告分子的荧光分子数量或荧光强度与细胞数量成正比，因此，由所检测到的荧光分子数量或荧光强度即可获知细胞的数量，进而实现高灵敏特异性的细胞检测；此外，报告探针上的报告分子的荧光分子数量或荧光强度可以反映每个细胞上平均结合的配体数量，从而获得待测细胞表面受体的种类和数量信息。
如本发明所述的，所述“单分子检测”的设备优选是采用单分子仪检测分子个数，或检测单分子水平上的荧光强度。
第二方面，本发明提供了一种单分子细胞检测试剂盒，包括：
捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；所述第一配体和第二配体具有与待测细胞表面的受体分子结合的结构域；以及
结合缓冲液、链霉亲和素标记的磁珠和洗脱缓冲液。
在本发明一实施例中，所述第一配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
在本发明一实施例中，所述第二配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
在本发明一实施例中，所述第一配体与第二配体相同或不同。
如本发明所述的，“具有特异性结合所述受体分子的结构域”是指配体分子具有能与待测细胞表面受体特异性结合的核酸片段结构、多肽片段结构或抗体结构域。
如本发明所述的，“核酸适体DNA、核酸适体RNA”是指能与待测细胞表面受体结合的核酸片段。
在本发明一优选实施例中，所述核酸适体DNA包括如SEQ ID NO:1～4所示的任一种核苷酸序列。
在本发明一优选实施例中，所述核酸适体DNA为但不限于人小细胞肺癌细胞(NCI-H69)的核酸识体DNA、人B淋巴瘤细胞(Ramos)的核酸识体DNA、耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞(Toledo)的核酸识体DNA、人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的核酸识体DNA、人肝肿瘤细胞(HepG2)的核酸识体DNA、人结肠癌细胞(HT-29)的核酸识体DNA、人卵巢癌细胞(TOV-21G，卵巢透明细胞腺癌)的核酸识体DNA或人卵巢癌细胞(CAOV-3，卵巢浆液性腺癌)的核酸识体DNA。
如本发明所述的，所述人小细胞肺癌细胞(NCI-H69)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:5为HCA12：5′-GTG GAT TGT TGT GTT CTG TTG GTT TTT GTG TTG TC-3′，所述SEQ IDNO:6为HCC03：5′-TCC GTG CCA CTG GCC CCC GGT GCC CCG GTC CCCGG-3′。
如本发明所述的，所述人B淋巴瘤细胞(Ramos)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:7为TD05：5′-AACACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG TTC AGG GTC TCC TCC CGGTG-3′。
如本发明所述的，所述耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞(Toledo)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:8为sgd5/T1：5′-ATA CCA GCT TAT TCA ATT ATC GTG GGT CAC AGC AGC GGTTGT GAG GAA GAA AGG CGG ATA ACA GAT AAT AAG ATA GTA AGT GCAATC T-3′；
如本发明所述的，所述人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:9为sgc8：5′-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTAGA-3′；
如本发明所述的，所述人肝肿瘤细胞(HepG2)的核酸识体DNA包括如SEQID NO:10或11所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:10为B-2：5′-CAACTC AAT AAG CTA GGT GGG TGG GGG ACA CTG CCC GGG GGT GGT TGGGT-3′(SEQ ID NO:10)；所述SEQ ID NO:11为E-1：5′-CGA TGG CGG TGG GTGGGG GAC AAA TTT GGG GGG CGT TGG GTG TTT GTG GT-3′。
如本发明所述的，所述人结肠癌细胞(HT-29)的核酸识体DNA包括如SEQID NO:12或13所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:12为SYL1：5′-AGCGTC GAA TAC CAC TAC AGT TTG GCT CTG GGG GAT GTG GAG GGG GGTATG GGT GGG AGT CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3′；所述SEQ ID NO:13为SYL2：5′-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AGA GCT CGG GGT TTT TTG GGGTTT TTT GGG GTT TTG GTG GGG CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3′。
如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞(TOV-21G，卵巢透明细胞腺癌)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:14或15所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQID NO:14为Tov2：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA TAA TCT CTA CAG GCGCAT GTA ATA TAA TGA AGC CCA TCC ACC TGG ACA CGG TGG CTT A-3′；所述SEQ ID NO:15为Tov3：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA CTC ACT CTGACC TTG GAT CGT CAC ATT ACA TGG GAT CAT CAG TCG ACA CGG TGGCTT A-3′。
如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞(CAOV-3，卵巢浆液性腺癌)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO:16或17所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ IDNO:16为DOV4：5′-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AGG GCA TCA GAT TAGGAT TAG GAT CTA TAG GTT CGG ACA TCG TGA GGA CCA GGA GAGCA-3′；所述SEQ ID NO:17为DOV6：5′-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AATGTT GGG GTA GGT AGA AGG TGA AGG GGT TTC AGT TGA GGA CCA GGAGAG CA-3′.
在本发明一优选实施例中，所述核酸适体RNA包括但不限于人类星形胶质细胞瘤细胞(U251，脑癌)的核酸识体RNA、人乳腺癌细胞(MCF7)的核酸识体RNA或人前列腺癌细胞(LNCaP)的核酸识体RNA。
如本发明所述的，所述人类星形胶质细胞瘤细胞(U251，脑癌)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:18为E9P2-2：5′-UGC CCA CUA UGC GUG CCG AAA AAC AUU UCC CCC UCUACC C-3′.
如本发明所述的，所述人乳腺癌细胞(MCF7)的核酸识体RNA包括如SEQID NO:19所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:19为A30：5′-CAG CGAAAG UUG CGU AUG GGU CAC AUC GCA GGC ACA UGU CAU CUG GGC G-3′。
如本发明所述的，所述人前列腺癌细胞(LNCaP)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO:20或21所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO:20为A9：5′-ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA AGU CUA CGU UCC-3′；所述SEQ ID NO:21为A10：5′-AUC AGC CAU GUU UAC GUC ACU CCU UGU CAAUCC UCA UCG G-3′。
如本发明所述的，“抗体分子”是指能与待测细胞表面受体结合的抗体。
在本发明一优选实施例中，所述抗体分子包括但不限于上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM/CD326)、白细胞共同抗原抗体(anti-CD45)、表皮生长因子抗体(anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体(anti-AFP)、造血干细胞抗原CD133抗体(anti-CD133)、乳腺癌HER2抗体(anti-HER2/neu)、MUC1粘蛋白抗体(anti-MUC1)、乳腺癌相关抗原BRCAA1抗体(anti-BRCAA1/RBBP1L1)。
本发明所述的捕获探针和报告探针，在配体类别的选择上，可以选择核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
优选地，当不同待测细胞与某种抗体分子都能结合时，优选核酸适体DNA/RNA作为配体，如EGFR广泛分布于上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，anti-EGFR能结合表皮鳞癌细胞(A431)、人结直肠癌细胞(DiFi)、前列腺癌细胞(DU145)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)、宫颈癌细胞(ME180)等。
优选地，当指数富集的配基系统进化技术(SELEX)未筛选出核酸适体DNA/RNA、或筛选出核酸适体DNA/RNA的亲和常数(Kd)值较大、或核酸适体DNA/RNA对几种细胞都有作用时，优选抗体分子作为配体，如针对NCI-H69细胞筛选出的核酸适体DNA(HCH07:5′-GCC GAT GTC AAC TTT TTC TAACTC ACT GGT TTT GC-3′),能识别人小细胞肺癌细胞(NCI-H69、NCI-H146、NCI-H128)、人肺腺癌细胞(NCI-H23)、肝癌细胞(IMEA、BNL)。
在本发明一实施例中，所述荧光分子为有机染料分子、无机荧光纳米颗粒或发光蛋白质。
在本发明一优选实施例中，所述有机染料分子包括但不限于Alexa Fluor488、Alexa Fluor 640、FAM、R6G、ROX、FITC、cy5、PE或APC。
在本发明一优选实施例中，所述无机荧光纳米颗粒包括但不限于QD525量子点、QD605量子点或QD655量子点。
在本发明一优选实施例中，发光性蛋白质包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。
本发明提供的报告探针采用的荧光分子可根据实际需要进行选择，本发明采用的有机染料分子标记配体、发光蛋白质标记抗体等容易直接合成或购得；本发明采用的无机荧光纳米颗粒具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄且对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长的特点，其标记配体时具有易控性。
在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细胞，每种待测细胞采用至少一种报告探针，其中，每种报告探针的荧光分子均不相同。
在此优选条件下，采用不同的荧光分子即可对不同的待测细胞进行标记，因此，通过对不同报告分子进行单分子检测可以读出待测细胞的信息，从而同时对多种细胞进行检测。
在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细胞，每种待测细胞采用至少一种捕获探针，其中，每种捕获探针的第一配体均不相同。
在此优选条件下，每种待测细胞上具有不同的受体分子，这些受体分子可以特异地与不同的第一配体结合，从而提高待测细胞在后续磁分离过程中被富集的概率。
在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细胞，所述待测细胞来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
在本发明一实施例中，所述结合缓冲液为包含酵母转移核糖核酸(YeasttRNA)和牛血清白蛋白(BSA)的洗涤缓冲液。
在本发明一实施例中，所述结合缓冲液中还包含胎牛血清(FBS)。
在本发明一优选实施例中，所述洗涤缓冲液为包含4.5g/L葡萄糖和5mM氯化镁的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS，pH 7.3)。
如本发明所述的，所述“结合缓冲液”可以由本领域技术人员根据具体需要(即细胞上的受体分子和捕获探针、报告探针上的配体分子相结合所需要的缓冲液)进行配置。
在本发明一实施例中，所述报告探针的浓度为100～5000nM。
在本发明一优选实施例中，所述报告探针的浓度为100～500nM。
在本发明一实施例中，所述捕获探针的浓度为100～5000nM。
在本发明一优选实施例中，所述捕获探针的浓度为100～500nM。
在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测的待测细胞的浓度为0.01～1000个/μl。
在本发明一实施例中，所述链霉亲和素标记的磁珠包括但不限于购买的链霉亲和素标记的磁珠。
在本发明一实施例中，所述洗脱缓冲液包括但不限于DL--二硫苏糖醇(DTT，300mM)、2-巯基乙醇(2.0M)、十二烷基硫酸钠(SDS，0.1％)、或含95％甲酰胺的乙二胺四乙酸(EDTA，10mM，pH 8.2)。
如本发明所述的，所述“洗脱缓冲液”可以由本领域技术人员根据具体需要(使生物素-链霉亲和素断开所需要的缓冲液)进行配置。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的单分子细胞检测方法在制备癌症或肿瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了单分子细胞检测方法及应用和单分子细胞检测试剂盒具有如下有益效果：
(1)本发明提供的单分子细胞检测方法简便、快速、灵敏度高，利用细胞表面受体特异性结合大量捕获探针和报告探针的优势，以放大待测细胞的检测信号，无需序列放大反应；
(2)本发明提供的单分子细胞检测方法特异性好，可以同时检测多种细胞；
(3)本发明提供的单分子细胞检测试剂盒设计简单、成本较低。
附图说明
图1为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法的流程示意图。
图2为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法对两种细胞进行检测的原理示意图。
图3为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法检测细胞的荧光图像结果。
图4为本发明实施例提供的不同个数A549细胞的单分子检测结果。
图5为本发明实施例提供的不同个数H23细胞的单分子检测结果。
图6为本发明实施例提供的同时对A549细胞和H23细胞进行单分子检测的结果。
图7为本发明实施例提供的对A549细胞、H23细胞、H460细胞、H69细胞、MCF-7细胞分别进行单分子检测的结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明涉及的英文说明：U/μl：单位每微升；mmol/L：毫摩尔每升；μmol/L(μM)：微摩尔每升；nmol/L(nM)：纳摩尔每升；pmol/L(pM)皮摩尔每升；fmol/L(fM)飞摩尔每升；μg/mL：微克每毫升。
表1中的DNA寡核苷酸由英潍捷基(广州)公司合成：
表1.合成序列
在表1中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的5’端由生物素(biotin)修饰；SEQID NO:2和SEQ ID NO:4的5’端分别修饰有Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647荧光分子。
在表1中，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2均可以特异性地与A549细胞表面的受体结合；SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4均可以特异性地与H23细胞表面的受体结合，其中，所述序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4通过cell-SELEX方法筛选。
若无特别说明，在本发明实施例中，采用的单分子荧光检测设备为全内反射荧光显微镜。采用激发波长为488nm，激光功率为37mW，曝光时间为200ms，发射滤光片范围为520±17.5nm，检测Alexa Fluor 488分子。用激发波长为640nm，激光功率为34mW，曝光时间为200ms，发射滤光片范围为692±20nm，检测Alexa Fluor 647分子。
应该指出的是，所述单分子荧光检测设备不限于上述的检测设备，可采用其他的荧光检测设备，激发波长、激光功率、曝光时间和发射滤光片范围及其他参数均可根据测试需要调节参数范围。
若无特别说明，在本发明实施例中，选取测试范围为41×82μm的10张荧光图像，利用Image J软件的“Analyze particle”功能进行单分子计数，计算得出10张荧光图像的荧光分子总个数N。得到的报告探针1的个数与A549细胞的个数成比例，得到的报告探针2的个数与H23细胞的个数成比例，从而实现高灵敏特异性的细胞检测。
若无特别说明，在本发明实施例中，培养细胞，收集细胞的方式为：将细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，置于5％CO2、37℃培养箱。当细胞在100毫米培养皿中长满后，用PBS洗3次，刮下的细胞，分散于4mLPBS中，800转/分钟离心5分钟。将细胞重悬于洗涤缓冲液中，用血球计数板确定细胞数量。
若无特别说明，在本发明实施例中，各试剂配制如下：
洗涤缓冲液为包含4.5g/L葡萄糖和5mM氯化镁的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS，pH 7.3)；
结合缓冲液为包含1mg/mL酵母转移核糖核酸(Yeast tRNA)和1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的洗涤缓冲液。
若无特别说明，在本发明实施例中，采用的细胞英文缩写如下：
人肺腺癌细胞(A549)，人肺腺癌细胞NCI-H23(H23)，人肺大细胞癌NCI-H460(H460)，人肺小细胞癌NCI-H69(H69)，人乳腺癌细胞(MCF-7)。
若无特别说明，本发明实施例中所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1
图1为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法的流程示意图，图2为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法的示意图，结合图2，利用本发明提供的单分子细胞检测试剂盒，本实施例提供了一种单分子细胞检测方法，包括如下步骤：
(1)准备试剂：HPLC纯化的寡核苷酸，链霉亲和素标记的磁珠，酵母转移核糖核酸(Yeast tRNA)，DL-二硫苏糖醇(DTT)，牛血清白蛋白(BSA)；洗涤缓冲液；结合缓冲液。
(2)培养、收集待测细胞：人肺腺癌细胞(A549)，人肺腺癌细胞NCI-H23(H23)；分别获得重悬于洗涤缓冲液中的A549和H23细胞，并用血球计数板确定细胞数量。
(3)单分子荧光检测：
采用表1中与A549细胞(捕获探针1和报告探针1)、H23细胞(捕获探针2和报告探针2)匹配的捕获探针和报告探针进行如下平行实验。
捕获探针和报告探针的混合溶液95℃10分钟，在冰上冷却10分钟。在包含500nM捕获探针，500nM报告探针，1mg/mL酵母转移核糖核酸(Yeast tRNA)，1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和20％胎牛血清(FBS)的100μL溶液(各试剂溶于洗涤缓冲液的混合溶液)中加入细胞，4℃孵育1小时，2000转/分钟离心10分钟，去除上层溶液。加入链霉亲和素标记的磁珠(～1.2×108beads/mL)，室温孵育30分钟后，磁分离2-3分钟，用洗涤缓冲液洗3次。加入300mM DL-二硫苏糖醇(DTT)95℃加热10分钟，以分解结合在细胞上的磁珠，以及释放细胞上的捕获探针和报告探针，14000转/分钟离心10分钟，分离细胞碎片沉淀，得到的上层溶液。
将得到的上层溶液用于单分子荧光检测：采用全内反射荧光显微镜进行单分子荧光检测，并利用Image J软件的“Analyze particle”功能进行单分子计数，计算得出10张荧光图像的分子总个数N。分别得到的报告探针1的个数与A549细胞的个数成比例，可以反映出A549细胞的个数，报告探针2的个数与H23细胞的个数成比例，可以反映出H23细胞的个数。
因此，本发明提供的单分子细胞检测方法可以根据所检测到的荧光分子的总数获得捕获探针以及报告探针共同结合的细胞的信息，比如细胞的个数、细胞受体种类和数量。
为充分说明本发明的有益效果，本发明实施例还提供了如下实施例：
实施例2
检测原理的验证实验
为了验证本技术方案的可行性，本发明实施例将捕获探针1、检测探针1、捕获探针2和检测探针2混合，组成探针混合液中分别进行四组实验：1)不加任何细胞，2)只加入A549细胞，3)只加入H23细胞，4)同时加入A549细胞和H23细胞。图3为四组实验的单分子检测荧光图像结果：A和E:不加任何细胞，B和F:只加入A549细胞，C和G:只加入H23细胞，D和H:同时加入A549细胞和H23细胞。A-D为488nm检测通道，E-H为640nm检测通道。
在不加任何细胞的实验下，如图3A和E，在488nm通道和640nm通道都未检测到荧光信号，体现为不能检测到检测探针1和检测探针2的信号。在只加入A549细胞的实验下，如图3B和F，在488nm通道检测到荧光信号，在640nm通道未检测到荧光信号，体现为能检测到检测探针1，不能检测到检测探针2的信号。在只加入H23细胞的实验下，如图3C和G，在488nm通道未检测到荧光信号，在640nm通道检测到荧光信号，体现为不能检测到检测探针1，能检测到检测探针2的信号。在同时加入A549细胞和H23细胞的实验下，如图3D和H，在488nm通道和640nm通道都检测到荧光信号，体现为能检测到检测探针1和检测探针2的信号。这些结果表明本发明提供的单分子细胞检测方法可用于细胞的检测。
实施例3
灵敏度实验
为了评估本技术方案检测细胞的灵敏性，本发明实施例对不同个数的细胞进行检测分析。图4为不同个数的A549细胞进行检测分析：按浓度梯度将10到10万个A549细胞加入到捕获探针1和检测探针1组成的混合液，得到检测探针1的信号，函数相关关系为log10N＝1.8+0.34log10C，其中N为检测探针1上荧光分子个数，C为每100μL中A549细胞个数，经过计算，该技术方案的对A549细胞的检测限可达到1.5个细胞每100μL。
图5为不同个数的H23细胞进行检测分析：按浓度梯度将10到10万个H23细胞加入到捕获探针2和检测探针2组成的混合液，得到检测探针2的信号。函数相关关系为log10N＝1.9+0.29log10C，其中N为检测探针2上荧光分子个数，C为每100μL中H23细胞个数，经过计算，该技术方案的对H23细胞的检测限可达到0.4个细胞每100μL。这些结果表明本发明提供的单分子细胞检测方法具有很高检测灵敏性。
实施例4
同时检测实验
为了研究复合检测细胞的能力，本发明实施例将捕获探针1、检测探针1、捕获探针2和检测探针2混合，组成探针混合液，将3万个A549细胞和H23细胞分别或合并加入。单分子细胞检测结果如图6所示，由图6可知，当将A549细胞加入探针混合液后，只检测到了检测探针1的信号；当将H23细胞加入探针混合液后，只检测到了检测探针2的信号；当将A549细胞和H23细胞都加入探针混合液后，同时检测到了检测探针1和检测探针2的信号。这些结果表明本发明提供的单分子细胞检测方法对不同细胞进行同时检测的可行性。
实施例5
特异性实验
为了研究检测细胞的特异性，我们将上述探针混合液中分别加入10万个不同细胞：人肺腺癌细胞A549，人肺腺癌细胞NCI-H23(H23)，人肺大细胞癌NCI-H460(H460)，人肺小细胞癌NCI-H69(H69)，人乳腺癌细胞MCF-7。单分子细胞检测结果如图7所示，由图7可知，探针混合液中加入A549细胞后，只检测到了检测探针1的信号；探针混合液中加入H23细胞后，只检测到了检测探针2的信号；探针混合液中加入H460细胞、H69细胞、MCF-7细胞后，都未检测到了检测探针1或检测探针2的信号。这些结果表明本发明提供的单分子细胞检测方法的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单分子细胞检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；
2)提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体具有特异性结合所述受体分子的结构域；
3)在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，混匀后孵育0.5～2小时，再离心去上清，然后加入链霉亲和素标记的磁珠，室温孵育20～60分钟时间后，磁分离2～10分钟，富集到探针-细胞-磁珠复合物；
4)在步骤(3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，80～95℃下加热2～10分钟，离心，取上清液进行单分子荧光检测。
2.如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第一配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
3.如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第二配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
4.如权利要求2或3所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述抗体分子包括上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM/CD326)、白细胞共同抗原抗体(anti-CD45)、表皮生长因子抗体(anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体(anti-AFP)、造血干细胞抗原CD133抗体(anti-CD133)、乳腺癌HER2抗体(anti-HER2/neu)、MUC1粘蛋白抗体(anti-MUC1)或乳腺癌相关抗原BRCAA1抗体(anti-BRCAA1/RBBP1L1)。
5.如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述荧光分子为有机染料分子、无机荧光纳米颗粒或发光蛋白质。
6.如权利要求5所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述无机荧光纳米颗粒包括QD525量子点、QD605量子点或QD655量子点。
7.权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(2)包括至少一种待测细胞，所述待测细胞来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
8.如权利要求1所述单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述结合缓冲液为包含酵母转移核糖核酸(Yeast tRNA)和牛血清白蛋白(BSA)的洗涤缓冲液。
9.一种单分子细胞检测试剂盒，其特征在于，包括：捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；所述第一配体和第二配体具有与待测细胞表面的受体分子结合的结构域；以及
结合缓冲液、链霉亲和素标记的磁珠和洗脱缓冲液。
10.如权利要求1所述的单分子细胞检测方法在制备癌症或肿瘤诊断试剂盒中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104597240A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 广西医科大学 石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
CN106053405A (zh) * 2016-05-10 2016-10-26 东南大学 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法
CN108444960A (zh) * 2018-02-09 2018-08-24 清华大学 荧光相关光谱检测方法
CN108593910A (zh) * 2018-04-08 2018-09-28 国家纳米科学中心 基于微球载体的粒子检测系统及方法
CN109142756A (zh) * 2018-10-29 2019-01-04 领航基因科技（杭州）有限公司 一种单分子蛋白的检测方法
CN110596383A (zh) * 2019-09-24 2019-12-20 珠海市德灏生物科技有限公司 基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒
CN112415184A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 香港科技大学 用于细胞群体和单细胞的单分子分离系统及其方法和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839210A (zh) * 2011-06-22 2012-12-26 江南大学 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839210A (zh) * 2011-06-22 2012-12-26 江南大学 氧化亚铁硫杆菌检测探针组合物及相关检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI LI: "MUC-1 aptamer-conjugated dye-doped silica nanoparticles for MCF-7 cells detection", 《BIOMATERIALS》 *
JING ZHANG: "Fluorescent quantum dot-labeled aptamer bioprobes specifically targeting mouse liver cancer cells", 《TALANTA》 *
OHK S.H.: "Antibody–aptamer functionalized fibre-optic biosensor for specific detection of Listeria monocytogenes from food", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 *
ZILONG ZHAO: "Recognition of subtype non-small cell lung cancer by DNA aptamers selected from living cells", 《ANALYST》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104597240A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 广西医科大学 石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
CN104597240B (zh) * 2015-02-02 2016-06-15 广西医科大学 石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
CN106053405A (zh) * 2016-05-10 2016-10-26 东南大学 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法
CN106053405B (zh) * 2016-05-10 2018-10-02 东南大学 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法
CN108444960A (zh) * 2018-02-09 2018-08-24 清华大学 荧光相关光谱检测方法
CN108593910A (zh) * 2018-04-08 2018-09-28 国家纳米科学中心 基于微球载体的粒子检测系统及方法
CN108593910B (zh) * 2018-04-08 2022-06-21 国家纳米科学中心 基于微球载体的粒子检测系统及方法
CN109142756A (zh) * 2018-10-29 2019-01-04 领航基因科技（杭州）有限公司 一种单分子蛋白的检测方法
CN109142756B (zh) * 2018-10-29 2022-02-08 领航基因科技（杭州）有限公司 一种单分子蛋白的检测方法
CN112415184A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 香港科技大学 用于细胞群体和单细胞的单分子分离系统及其方法和用途
CN110596383A (zh) * 2019-09-24 2019-12-20 珠海市德灏生物科技有限公司 基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒

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