CN109142756A - 一种单分子蛋白的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白检测领域，公开了一种单分子蛋白的检测方法，待测蛋白与靶蛋白抗体混合生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物，与经标记物标记的检测抗体混合解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片或先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应然后将反应液分散于微流控芯片中；利用激光共聚焦检测系统进行荧光信号扫描，单分子计数。本发明所述检测方法可以快速对单分子蛋白进行定量检测，检测灵敏度高，适用于对表达丰度过低的蛋白。本发明所述检测方法操作方便，检测结果准确、CV值偏差小；而且通量高，可一次性检测多个样本。

Description

一种单分子蛋白的检测方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种单分子蛋白的检测方法。
背景技术
蛋白，作为机体最重要的组成成分，诠释着生命个体每一点的生长，发育和变化。从上世纪40年代开始，随着免疫组化等经典蛋白检测技术的发展，蛋白作为生物标志物的价值逐渐被人们所重视。尽管免疫组化，ELISA，Luminex等蛋白检测技术已经实现了数以千计的蛋白生物标志物检测，但蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢：年均仅有1-2个新的生物标志物进入实际的临床应用。据统计，在400,000多种已知的人类蛋白中，约有300,000种因为表达丰度过低而无法实现传统方法的检测。在现有技术可以检测的约100,000种蛋白中，大多数又无法在健康个体的样本中检测到，而仅仅出现在特定的疾病时期。大量蛋白生物标志物的重要功能，如同海平面下的冰山，无法被现有技术准确界定。不论临床还是基础研究，蛋白生物标志物的应用都拥有可观的发展前景，但现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展。
默克公司推出了单分子检测技术驱动的免疫检测平台，采用激光检测对每个单分子二抗上标记的荧光信号进行计数。其中的单分子检测技术(Single MoleculeCounting,SMCTM)能降低背景，并提高检测信号，MCTM技术相较于传统免疫检测技术，信噪比有了很显著的改善，使得在一个系统里可以同时检测低表达和高表达的蛋白靶标，揭示疾病相关生物标志物的微小变化。SMCTM技术的工作流程，在捕获和检测步骤，特异性抗体将每个生物标志物分子转化成信号。在洗脱步骤，荧光素标记的检测抗体从免疫复合物中解离下来。洗脱物被送入系统的毛细管，毛细管上有一个非常微小的检测空间可供激光照射。通过检测空间时，单个的荧光素标记抗体可以产生荧光闪烁，从而被检测到。峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号事件。由于激光的聚焦效应，会形成一个非常狭小的检测空间“爱里斑”，这个空间集中了多达84％的激光能量，能够最有效地照射和激发单个荧光分子。SMCTM单分子检测技术会依次检测通过“爱里斑”区域的单个荧光信号，峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号，并将检测到的数字信号进行汇总，显著地提高了检测灵敏度，可达pg/ml。但仍无法满足对表达丰度过低的蛋白进行检测的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的检测灵敏度低，无法满足对表达丰度过低的蛋白进行检测的要求的问题，提供一种单分子蛋白的检测方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种单分子蛋白的检测方法，包括以下步骤：
(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；
(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；
(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；
(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。
其中，在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光素标记物为异硫氰酸荧光素(FITC)。其他本领域技术人员惯用的荧光素标记物，如AMCA、Texas Red、TRITC、Rhodamine、R-PE、Cy3/5、Dylight Dyes、APC等，也可以达到相同的技术效果。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标记物为β-半乳糖苷酶，所述酶标记物对应的底物为二半乳糖苷。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酶标记物为HRP，所述酶标记物对应的底物为鲁米诺。
进一步的，在本发明的一些具体实施方案中，所述靶蛋白抗体偶联在磁珠上，加入标记物标记的检测抗体溶液混合孵育后去除磁珠。
其中，作为优选，所述磁珠为纳米级Fe、Ni、Fe3O4或Fe2O3磁性微粒，磁珠粒径为500nm-10um。
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记物为荧光素标记物，本发明所述单分子蛋白的检测方法步骤(3)将靶蛋白与荧光素标记物标记的检测抗体复合物溶液作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成；
在本发明的一些具体实施方案中，所述标记物为酶标记物，本发明所述单分子蛋白的检测方法步骤(3)将靶蛋白与酶标记物标记的检测抗体复合物溶液与酶标记物的底物混合作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成。
进一步的，在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述单分子蛋白的检测方法中所述的液滴生成方法具体为将油相充满微流控芯片整个液滴存储腔；将水相通过压力泵从微流控芯片液滴形成通道道输入芯片，水相在所述微流控芯片中的台阶结构处形成舌状流体，并在剪切力的作用下形成油包水微滴落入液滴存储部件内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，以多层状态铺满腔体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分包括矿物油和烷烃，所述烷烃为12～16烷中的一种或其两者以上的混合物；所述表面活性剂包括EM90和Triton X-100。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片包括上片和基片6；
所述上片设置有液滴形成流道1和液滴存储部件2；
所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2之间通过台阶结构12连接；
所述基片6与所述液滴存储部件2之间设置有液滴存储腔8。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基片6设置有凹槽7，所述凹槽7与所述液滴存储部件2紧密配合，形成液滴存储腔8。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括进样孔4和进样腔10，所述进样孔4、所述进样腔10、所述液滴形成流道1、所述台阶结构12与所述液滴存储部件2依次连接。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括进样部件9、排油流道3、排油腔11和排油孔5；
所述进样部件9包括进油端口9.1和储油端口9.2；
所述进油端口9.1、所述液滴存储部件2、所述排油流道3、所述排油腔11、所述排油孔5与所述储油端口9.2依次连接。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片，包括上片、基片6和进样部件9，所述上片设置有液滴形成流道1、液滴存储部件2、排油流道3、进样孔4、进样腔10、排油腔11和排油孔5；
所述基片6设置有凹槽7，所述凹槽7与所述液滴存储部件2紧密配合，形成液滴存储腔8；
所述进样部件9包括进油端口9.1和储油端口9.2；
所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2之间通过垂直方向的台阶结构12连接；
所述进样孔4、所述进样腔10、所述液滴形成流道1、所述台阶结构12与所述液滴存储部件2依次连接；
所述进油端口9.1、所述液滴存储部件2、所述排油流道3、所述排油腔11、所述排油孔5与所述储油端口9.2依次连接。
在本发明的一些具体实施方案中，所述进样孔4、所述进样腔10设置于所述液滴存储部件2的一侧，所述排油腔11设置于所述液滴存储部件2的其余侧边的外周，所述排油孔5设置于所述液滴存储部件2的另一侧。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴存储部件2横截面的长度与待生成液滴的直径之比为(3～10):1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴存储部件2横截面的长度为200～1000μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1与所述液滴存储部件2连接的端部设置有倒角14，所述倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm，所述倒角的角度为30°～60°。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1、所述排油流道3的数目分别至少为1个。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1的横截面为矩形，宽度为10～200μm，长度为1～100μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴形成流道1的排布密度两侧较为稀疏，中间较为密集。
在本发明的一些具体实施方案中，所述进样部件9设有硅胶材质的密封接口塞，所述密封接口塞设有连通进样腔10的通孔。
在本发明的一些具体实施方案中，所述芯片的上片、基片为透明材料，如玻璃、透明PC等材质。所述进样部件9为黑色材料。
在本发明的一些具体实施方案中，所述激光共聚焦检测系统包括微流控芯片、点光源、成像单元、扫描镜头、三维液滴成像单元；其中，所述点光源的光束经共聚焦检测系统进行聚焦投射到所述微流控芯片中存储的三维液滴上；所述成像单元对所述三维液滴反射的荧光信号进行采集形成截面图像；所述扫描镜头包括振镜或机械方式移动的物镜，移动所述点光源对所述微流控芯片内液滴的聚焦投射位置；所述三维液滴成像单元处理所述液滴的各层截面图像形成三维液滴的成像。
作为优选，所述点光源采用激光器、LED或卤素灯形成点光源投射到三维液滴，或通过滤波片将光束投射到所述液滴上。
在本发明的一些具体实施方案中，所述激光共聚焦检测系统采用所述点光源与所述荧光信号通过滤光片6或/和透镜7相错至少错位10nm波长，在300nm～1100nm波长范围内相错形成检测1～20检测通道。调整所述点光源或/和所述荧光信号以改变其在所述液滴的光线聚焦程度来提高所述截面图像的精准度，所述点光源和所述荧光信号彼此物理光波长区相错。
在本发明的一些具体实施方案中，所述激光共聚焦检测系统采用点光源通过扩束镜调整所述光斑大小，所述扩束镜调整倍率为1～20倍。
作为优选，所述激光共聚焦检测系统中所述成像单元为PMT探测器、APD探测器或EMCCD光子探测器。
在本发明的一些具体实施方案中，所述微流控芯片设置有透明窗，所述点光源通过所述透明窗将光束投射到所述微流控芯片内的液滴上。
在本发明的一些具体实施方案中，所述扫描具体包括以下步骤：
(a)将点光源发射的光束投射到在微流控芯片内部的液滴上；(b)通过光子探测器采集从液滴上反射的反射光；(c)所述成像单元采集所述液滴反射的反射光信号以形成所述液滴的截面图像；(d)移动点光源以将光束再次投射到液滴上；(e)重复步骤(b)至步骤(d)，直至完成对所述微流控芯片内液滴的逐层扫描检测并在计算机中形成三维液滴的成像；(f)系统软件根据阳性荧光液滴比例，基于泊松分布进行计算，对酶分子的浓度进行绝对定量。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1，简称GPC1)，其是肿瘤外泌体的特定标记物。研究发现GPC1在胰腺癌和乳腺癌细胞外泌体中大量表达，且外泌体GPC1的含量与肿瘤大小成正比。外泌体GPC1蛋白检测可用于临床癌症诊断和治疗监测，具有重要意义。
在本发明某一具体实施方案中，采用荧光标记物-异硫氰酸荧光素(FITC)标记的检测抗体按照上述方法对肿瘤标记物GPC1进行检测。结果显示，检测GPC1蛋白的灵敏度为2.5pM。
在本发明某一具体实施方案中，采用酶标记物-辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体按照上述方法对肿瘤标记物GPC1进行检测。结果显示，该方法对GPC1蛋白的检测灵敏度在0.5pM。
进一步的，在本发明某一具体实施方案中，采用级联放大HRP酶标法检测GPC1，结果显示，该方法最低能检测0.1pM的GPC1蛋白。
在本发明某一具体实施方案中，采用酶标记物-β-半乳糖苷酶标记的检测抗体按照上述方法对肿瘤标记物GPC1进行检测。结果显示，该方法最低能检测0.5pM的GPC1蛋白。
进一步的，在本发明某一具体实施方案中，采用级联放大β-半乳糖苷酶标法检测GPC1，结果显示，该方法最低能检测0.1pM的GPC1蛋白。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种单分子蛋白的检测方法，包括以下步骤：(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。本发明所述检测方法可以快速对单分子蛋白进行定量检测，检测灵敏度高，适用于对表达丰度过低的蛋白。本发明所述检测方法操作方便，检测结果准确，灵敏度高；CV值较小，重复性、稳定性好；通量高，可一次性检测多个样本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1三维液滴检测系统的结构示意图；其中，A、微流控芯片；B、点光源；C、成像单元；D、扫描镜头；E、二向色镜；F、四通道荧光滤波器；
图2示实施例1通过机械方式移动的物镜的三维液滴检测系统的结构示意图；其中，A、微流控芯片；B、点光源；C、成像单元；D、扫描镜头；D1、三轴运动平台；E、二向色镜；F、四通道荧光滤波器；G、透镜；
图3示本发明微流控芯片上片结构示意图；其中，1-液滴形成流道；2-液滴存储部件；3-排油流道；4-进样孔；5-排油孔；10-进样腔；11-排油腔；
图4示本发明微流控芯片纵向全剖示意图；其中，4-进样孔；5-排油孔；6-基片；7-凹槽；8-液滴存储腔；9-进样部件；
图5示进样部件9放大示意图；其中，9.1-进油端口；9.2-储油端口；
图6示进样部件9局部放大示意图；其中，13-倒角；
图7示微流控芯片液滴形成流道1局部放大示意图；其中，1-液滴形成流道；10-进样腔；12-台阶结构；14-倒角；
图8示微流控芯片排油流道3局部放大示意图；
图9示微流控芯片台阶结构12放大示意图；
图10示实施例2直接荧光法检测GPC1结果图；
图11示实施例3HRP酶标法检测GPC1结果图；
图12示实施例4级联放大HRP酶标法检测GPC1的激光共聚焦扫描结果图；
图13示实施例4级联放大HRP酶标法检测GPC1经激光共聚焦系统软件分析后结果图；
图14示实施例5β一半乳糖苷酶酶标法检测GPC1结果图；
图15示实施例6级联放大β-半乳糖苷酶酶标法检测GPC1经激光共聚焦系统软件分析后结果图；
图16示实施例2检测数据的重复性验证图。
具体实施方式
本发明公开了一种单分子蛋白的检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：
1、激光共聚焦检测系统(图1和图2)
所述激光共聚焦检测系统包括微流控芯片A、点光源B、成像单元C、扫描镜头D和三维液滴成像单元。
所述点光源B采用激光器、LED灯形成点光源投射到所述液滴。
所述成像单元C为EMCCD光子探测器，所述成像单元C收集、探测通过四通道荧光滤波器F和透镜G处理的所述荧光信号，可利用不同荧光通道独立合成液滴包含荧光信号的特征数值形成液滴形状及荧光强℃的成像。
2、微流控芯片
热压模具的制备，利用镍模制备上片结构，详细结构见图1，其中液滴形成流道1宽度为60微米；整个液滴存储腔2尺度：约15mm×18mm；排油流道3宽度为60微米；液滴存储部件2的高度约为100微米；将制备好的镍模加热约135℃之后，利用PC板材热压制备成结构上片，将上片进样孔4和排油孔5激光打孔，直径为1.5mm。芯片上片的加工也可以通过玻璃蚀刻加工制成。
芯片的制备和键合，将PC基片6对应上片液滴存储部件2的位置做成凹槽7，其中深度约为300微米，将芯片基片与上片，利用溶剂辅助热压键合的方式键合在一起，完成芯片的制备，通过上述方式可形成一个密封的液滴储存腔8，见图2。
芯片基片液滴储存部件2对应位置的凹槽7也可以通过玻璃蚀刻而成，然后将玻璃上片和基片通过溶剂辅助键合的方法，也可以形成一个密封的液滴储存腔8。
在液滴形成流道1连接液滴存储部件2的端部设有倒角14，所述倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm，在此范围内随着倒角的长度增大，液滴的大小会随之改变。
在进样部件9的上表面四周设置有45度倒角13，在对芯片进行检测时，此倒角能够将光线通过45度角垂直反射而不是产生漫反射，使得杂光不能够进入CCD。
3、单分子蛋白的检测方法
所述单分子蛋白的检测方法，包括以下步骤：
(1)将点光源发射的光束投射到在微流控芯片内部的液滴上；(2)通过光子探测器采集从液滴上反射的反射光；(3)所述成像单元采集所述液滴反射的反射光信号以形成所述液滴的截面图像；(4)移动点光源以将光束再次投射到液滴上；(5)重复步骤(2)至步骤(4)，直至完成对所述微流控芯片1内液滴的逐层扫描检测并在计算机中形成三维液滴的成像。
本发明中的每张微流控芯片可以有四个反应腔，每个反应腔可检测一种或多种不同荧光标记的目标蛋白，每个压力液滴生成仪可一次性注液一张芯片及4个反应腔，以同时进行4种靶蛋白监测，用时约30s，而共聚焦检测平台亦可一次性检测约8张芯片即32个反应腔的液滴荧光信号，因此，本发明方法检测通量高、速度快。
实施例2：直接荧光法检测GPC1
多层液滴的制备:
(1)配制油相。按照以下比例配制好油相(均以质量计)：50g矿物油+50g正十四烷+1.5g乳化剂EM90+1.5g TritonX-100，超声波除气后备用。
(2)配制水相。配制不同浓度的GPC1蛋白标准品(abcam，ab114484)，即用标准品稀释液梯度稀释原GPC1蛋白标准品，到最终GPC1蛋白浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5和10PM，终体积不少于200μl。采用Merck公司磁珠欧联GPC1捕获抗体(abcam，ab55971)6μL捕获溶液中的GPC1蛋白200μl，37℃孵育1h，洗涤上清，然后加入FITC标记的检测抗体(Invitrogen，Cat#62-8411)200μl，该检测抗体利用PBS稀释，稀释比例为1：10000，37℃孵育30min，洗涤以除去任何非特异性结合的抗体，随后，利用100μl pH＝2.0，0.1M的甘氨酸洗脱靶蛋白-荧光抗体复活物，并立即将溶液pH值调整值7.5，轻微离心弃上清，洗脱复合物25μl备用。
(3)液滴生成。将洗脱液分散到实施例1中制备完成的芯片，首先将油相注满整个液滴存储区，通过压力泵，将洗脱液从进样流道输入微流控芯片，水相在所述台阶结构处形成纳升级的液滴(直径约40μm左右)，在剪切力的作用下落入液滴存储腔内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，填满腔体，因液滴存储腔高度为200μm，液滴直径大小为40μm，液滴以多层(4-5层)的形式存在于液滴存储腔内。GPC1分子以单拷贝的浓度包裹于液滴中。每个微滴作为一个微反应器，若液滴中包含有GPC1分子，会与标有FITC的检测抗体结合而产生成荧光，而没有GPC1分子存在的液滴，则无法进行荧光显色。
(4)仪器扫描与分析。液滴生成完全后，使用实施例1所述激光共聚焦检测平台逐层对液滴进行检测，每种浓度检测50000个以上的液滴，记录液滴内的荧光信号，根据阳性液滴的比例，基于泊松分布进行计算，对蛋白分子的浓度进行绝对定量。结果如图10，该方法检测GPC1蛋白的灵敏度为2.5pM。
(5)检测结果重复性检验。每个蛋白浓度，包括NTC阴性对照，各设置10个平行重复组，统计每个浓度实验组的荧光值，并计算CV值。如图16所示，统计结果表明各实验组的CV值均不超过6％，证明该检测系统重复性较好。
实施例3：HRP酶标法检测GPC1
多层液滴的制备:
(1)配制油相。按照以下比例配制好油相(均以质量计)：50g矿物油+50g正十四烷+1.5g乳化剂EM90+1.5g TritonX-100，超声波除气后备用。
(2)配制水相。配制不同浓度的GPC1蛋白标准品(abcam，ab114484)，即用标准品稀释液梯度稀释原GPC1蛋白标准品，到最终GPC1蛋白浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5和10pM终体积不少于200μl。采用Merck公司磁珠欧联GPC1捕获抗体(abcam，ab55971)6μl捕获溶液中的GPC1蛋白200μl，37℃孵育1h，洗涤上清，然后加入HRP标记的检测抗体(Invitrogen，Cat#31430)200μl，该检测抗体利用PBS稀释，稀释比例为1：10000，37℃孵育30min，洗涤以除去任何非特异性结合的抗体随后，利用100μl pH＝2.0，0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱靶蛋白-荧光抗体复活物，并立即将溶液pH值调整值7.5，轻微离心弃上清，取25μl洗脱复合物并向其中加入10μl鲁米诺(0.1ng/mL)，37℃孵育10min。
(3)液滴生成。将孵育物分散到实施例1中制备完成的芯片，首先将油相注满整个液滴存储区，通过压力泵，将洗脱液从进样流道输入微流控芯片，水相在所述台阶结构处形成纳升级的液滴(直径约40μm左右)，在剪切力的作用下落入液滴存储腔内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，填满腔体，因液滴存储腔高度为200μm，液滴直径大小为40μm，液滴以多层(4-5层)的形式存在于液滴存储腔内。GPC1分子以单拷贝的浓度包裹于液滴中。每个微滴作为一个微反应器，若液滴中包含有GPC1分子，会与标有HRP的检测抗体结合从而催化底物鲁米诺产生成荧光，而没有GPC1分子存在的液滴，则无法进行荧光显色。
(4)仪器扫描与分析。液滴生成完全后，使用实施例1所述激光共聚焦检测平台逐层对液滴进行检测，每种浓度检测50000个以上的液滴，记录液滴内的荧光信号，根据阳性液滴的比例，基于泊松分布进行计算，对蛋白分子的浓度进行绝对定量。结果如图11，该方法对GPC1蛋白的检测灵敏度在0.5pM。
实施例4：级联放大HRP酶标法检测GPC1
多层液滴的制备:
(1)配制油相。按照以下比例配制好油相(均以质量计)：50g矿物油+50g正十四烷+1.5g乳化剂EM90+1.5g TritonX-100，超声波除气后备用。
(2)配制水相。配制不同浓度的GPC1蛋白标准品(abcam，ab114484)，即用标准品稀释液梯度稀释原GPC1蛋白标准品，到最终GPC1蛋白浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5和10pM，终体积不少于200μl。采用Merck公司磁珠欧联GPC1捕获抗体(abcam，ab55971)6μl捕获溶液中的GPC1蛋白200μl，37℃孵育1h，洗涤弃上清，然后加入100μl利用PBS稀释的生物素-biotin标记的检测抗体(Invitrogen，Cat#B-2763)，稀释比例为1：5000,洗涤，弃上清，加入200μl HRP标记的链霉亲和素(Solarbio|货号：SE068)，该试剂利用PBS稀释，稀释比例为1：5000，37℃孵育30min，洗涤以除去任何非特异性结合的抗体随后，利用100μl pH＝2.0，0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱靶蛋白-荧光抗体复活物，并立即将溶液pH值调整值7.5，轻微离心弃上清，取25μl洗脱复合物并向其中加入10μl鲁米诺(0.1ng/mL)，37℃孵育10min。
(3)液滴生成。将孵育物分散到实施例1中制备完成的芯片，操作方法如实施例3。生成的多层液滴均匀铺于液滴反应腔，每个微滴作为一个微反应器，若液滴中包含有GPC1分子，会与标有HRP的检测抗体结合从而催化底物鲁米诺产生成荧光，而没有GPC1分子存在的液滴，则无法进行荧光显色。
(4)仪器扫描与分析。液滴生成完全后，使用实施例1所述激光共聚焦检测平台逐层对液滴进行检测，每种浓度检测50000个以上的液滴，记录液滴内的荧光信号，根据阳性液滴的比例，基于泊松分布进行计算，对蛋白分子的浓度进行绝对定量。如图12所示，其中A(0)\B(0.1pM)\C(0.25pM)\D(1pM)\E(2.5pM)\F(5pM)为单层液滴经激光共聚焦扫描平台扫描后的图片，分别对应梯度稀释GPC1浓度(0、0.1pM、0.25pM、0.5pM、1pM、2.5pM、5pM、10pM)液滴经激光共聚焦系统软件分析后的同浓度图片(图13)。结果显示，该方法最低能检测0.1pM的GPC1蛋白。
实施例5：β-半乳糖苷酶酶标法检测GPC1
多层液滴的制备与分析：
(1)配制油相。按照以下比例配制好油相(均以质量计)：50g矿物油+50g正十四烷+1.5g乳化剂EM90+1.5g TritonX-100，超声波除气后备用。
(2)配制水相。配制不同浓度的GPC1蛋白标准品(abcam，ab114484)，即用标准品稀释液梯度稀释原GPC1蛋白标准品，到最终GPC1蛋白浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5和10pM，终体积不少于200μl。采用Merck公司磁珠欧联GPC1捕获抗体(abcam，ab55971)6μl捕获溶液中的GPC1蛋白200μl，37℃孵育1h，洗涤上清，然后加入β-半乳糖苷酶(BGAL)标记的检测抗体(SBA，2040-06)200μl，该检测抗体利用PBS稀释，稀释比例为1：10000，37℃孵育30min，洗涤以除去任何非特异性结合的抗体随后，利用100μl pH＝2.0，0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱靶蛋白-荧光抗体复活物，并立即将溶液pH值调整值7.5，轻微离心弃上清，取25μl洗脱复合物并向其中加入25μl 100μM的荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)，37℃孵育10min。
(3)液滴生成。液滴生成将孵育物分散到实施例1中制备完成的芯片，首先将油相注满整个液滴存储区，通过压力泵，将洗脱液从进样流道输入微流控芯片，水相在所述台阶结构处形成纳升级的液滴(直径约40μm左右)，在剪切力的作用下落入液滴存储腔内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，填满腔体，因液滴存储腔高度为200μm，液滴直径大小为40μm，液滴以多层(4-5层)的形式存在于液滴存储腔内。GPC1分子以单拷贝的浓度包裹于液滴中。
(4)仪器扫描与分析。每个微滴作为一个微反应器，若液滴中包含有GPC1分子，会与标有BGAL的检测抗体结合从而催化底物FDG产生成荧光，而没有GPC1分子存在的液滴，则无法进行荧光显色。
(4)仪器扫描与分析。液滴生成完全后，使用实施例1所述激光共聚焦检测平台逐层对液滴进行检测，每种浓度检测50000个以上的液滴，记录液滴内的荧光信号，根据阳性液滴的比例，基于泊松分布进行计算，对蛋白分子的浓度进行绝对定量。如下图14，该方法最低能检测0.5pM的GPC1蛋白。
实施例6：级联放大β-半乳糖苷酶酶标法检测GPC1
多层液滴的制备与分析：
(1)配制油相。按照以下比例配制好油相(均以质量计)：50g矿物油+50g正十四烷+1.5g乳化剂EM90+1.5g TritonX-100，超声波除气后备用。
(2)配制水相。配制不同浓度的GPC1蛋白标准品(abcam，ab114484)，即用标准品稀释液梯度稀释原GPC1蛋白标准品，到最终GPC1蛋白浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5和10pM，终体积不少于200μl。采用Merck公司磁珠欧联GPC1捕获抗体(abcam，ab55971)6μl捕获溶液中的GPC1蛋白200μl，37℃孵育1h，洗涤上清，然后加入100μl利用PBS稀释的生物素-biotin标记的检测抗体(Invitrogen，Cat#B-2763)，稀释比例为1：5000,洗涤弃上清，然后加入200μlβ-半乳糖苷酶(BGAL)标记的Avidin亲和素(SBA货号：7200-06)，该试剂利用PBS稀释，稀释比例为1：5000，37℃孵育30min，洗涤以除去任何非特异性结合的抗体，后利用100μl pH＝2.0，0.1M的甘氨酸洗脱液洗脱靶蛋白-荧光抗体复活物，并立即将溶液pH值调整值7.5，轻微离心弃上清，取25μl洗脱复合物并向其中加入25μl 100μM的荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)，37℃孵育10min。
(3)液滴生成。液滴生成将孵育物分散到实施例1中制备完成的芯片，首先将油相注满整个液滴存储区，通过压力泵，将洗脱液从进样流道输入微流控芯片，水相在所述台阶结构处形成纳升级的液滴(直径约40μm左右)，在剪切力的作用下落入液滴存储腔内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，填满腔体，因液滴存储腔高度为200μm，液滴直径大小为40μm，液滴以多层(4-5层)的形式存在于液滴存储腔内。GPC1分子以单拷贝的浓度包裹于液滴中。每个微滴作为一个微反应器，若液滴中包含有GPC1分子，会与标有BGAL的检测抗体结合从而催化底物FDG产生成荧光，而没有GPC1分子存在的液滴，则无法进行荧光显色。
(4)仪器扫描与分析。液滴生成完全后，使用实施例1所述激光共聚焦检测平台逐层对液滴进行检测，每种浓度检测50000个以上的液滴，记录液滴内的荧光信号，根据阳性液滴的比例，基于泊松分布进行计算，对蛋白分子的浓度进行绝对定量。
由于生物素(biotin)能和亲和素(Avidin)特异性高亲和性结合，亲和力是抗原抗体结合的一万倍且一个Avidin可结合四个(biotin)，这样又起到级联放大的作用，故可更灵敏的检测微量蛋白。通过免疫法，结合上述微流控芯片多层液滴激光共聚焦检测平台，与传统Elisa进行对比，检测的灵敏度显著提高，最低能检测0.1pM的GPC1蛋白(图15)。

Claims (15)

1.一种单分子蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待测蛋白与靶蛋白抗体混合，生成待测蛋白与靶蛋白抗体复合物；
(2)将待测蛋白与靶蛋白抗体复合物与经标记物标记的检测抗体混合，解离收集待测蛋白和检测抗体的复合物；所述标记物为荧光素标记物或酶标记物；
(3)当标记物为荧光素标记物时，将所述待测蛋白和检测抗体的复合物直接分散于微流控芯片；当标记物为酶标记物时，先将所述待测蛋白和检测抗体的复合物与酶标记物对应的底物混合反应，然后将反应液分散于微流控芯片中；
(4)利用激光共聚焦检测系统对所述微流控芯片内部的液滴进行荧光信号扫描，单分子计数。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光素标记物为异硫氰酸荧光素、AMCA、Texas Red、TRITC、Rhodamine、R-PE、Cy3/5、Dylight Dyes或APC。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标记物为β-半乳糖苷酶，所述酶标记物对应的底物为二半乳糖苷；或所述酶标记物为辣根过氧化物酶，所述酶标记物对应的底物为鲁米诺。
4.根据权利要求1～3任一项中所述的检测方法，其特征在于，所述靶蛋白抗体偶联在磁珠上，加入标记物标记的检测抗体溶液混合孵育后去除磁珠；所述磁珠为纳米级Fe、Ni、Fe3O4或Fe2O3磁性微粒，磁珠粒径500nm-10um。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，当标记物为荧光素标记物时，将靶蛋白与荧光素标记物标记的检测抗体复合物溶液作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成；当标记物为酶标记物时，靶蛋白与酶标记物标记的检测抗体复合物溶液与酶标记物的底物混合作为水相，于铺满油相的微流控芯片中进行液滴生成。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的液滴生成方法具体为将油相充满微流控芯片整个液滴存储腔；将水相通过压力泵从微流控芯片液滴形成通道道输入芯片，水相在所述微流控芯片中的台阶结构处形成舌状流体，并在剪切力的作用下形成油包水微滴落入液滴存储部件内，液滴在液滴存储腔中聚集浓缩，以多层状态铺满腔体。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分包括矿物油和烷烃，所述烷烃为12～16烷中的一种或其两者以上的混合物；所述表面活性剂包括EM90和Triton X-100。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上片、基片(6)、进样孔(4)和进样腔(10)；
所述上片设置有液滴形成流道(1)和液滴存储部件(2)；
所述液滴形成流道(1)与所述液滴存储部件(2)之间通过台阶结构(12)连接；
所述基片(6)与所述液滴存储部件(2)之间设置有液滴存储腔(8)；
所述基片(6)设置有凹槽(7)，所述凹槽(7)与所述液滴存储部件(2)紧密配合，形成液滴存储腔(8)；
所述进样孔(4)、所述进样腔(10)、所述液滴形成流道(1)、所述台阶结构(12)与所述液滴存储部件(2)依次连接。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，还包括进样部件(9)、排油流道(3)、排油腔(11)和排油孔(5)；
所述进样部件(9)包括进油端口(9.1)和储油端口(9.2)；
所述进油端口(9.1)、所述液滴存储部件(2)、所述排油流道(3)、所述排油腔(11)、所述排油孔(5)与所述储油端口(9.2)依次连接；
所述进样孔(4)、所述进样腔(10)设置于所述液滴存储部件(2)的一侧，所述排油腔(11)设置于所述液滴存储部件(2)的其余侧边的外周，所述排油孔(5)设置于所述液滴存储部件(2)的另一侧。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述液滴存储部件(2)横截面的长度与待生成液滴的直径之比为(3～10):1；
所述液滴存储部件(2)横截面的长度为200～1000μm；
所述液滴形成流道(1)与所述液滴存储部件(2)连接的端部设置有倒角(14)，所述倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm，所述倒角的角度为30°～60°。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述液滴形成流道(1)、所述排油流道(3)的数目分别至少为1个；
所述液滴形成流道(1)的横截面为矩形，宽度为10～200μm，长度为1～100μm。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述激光共聚焦检测系统包括微流控芯片、点光源、成像单元、扫描镜头、三维液滴成像单元；其中，所述点光源的光束经共聚焦检测系统进行聚焦投射到所述微流控芯片中存储的三维液滴上；所述成像单元对所述三维液滴反射的荧光信号进行采集形成截面图像；所述扫描镜头包括振镜或机械方式移动的物镜，移动所述点光源对所述微流控芯片内液滴的聚焦投射位置；所述三维液滴成像单元处理所述液滴的各层截面图像形成三维液滴的成像。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述点光源采用激光器、LED或卤素灯形成点光源投射到三维液滴，或通过滤波片将光束投射到所述液滴上；采用所述点光源与所述荧光信号通过滤光片6或/和透镜7相错至少错位10nm波长，在300nm～1100nm波长范围内相错形成检测1～20检测通道。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，采用点光源通过扩束镜调整所述光斑大小，所述扩束镜调整倍率为1～20倍；所述成像单元为PMT探测器、APD探测器或EMCCD光子探测器；所述微流控芯片设置有透明窗，所述点光源通过所述透明窗将光束投射到所述微流控芯片内的液滴上。
15.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述扫描具体包括以下步骤：
(a)将点光源发射的光束投射到在微流控芯片内部的液滴上；(b)通过光子探测器采集从液滴上反射的反射光；(c)所述成像单元采集所述液滴反射的反射光信号以形成所述液滴的截面图像；(d)移动点光源以将光束再次投射到液滴上；(e)重复步骤(b)至步骤(d)，直至完成对所述微流控芯片内液滴的逐层扫描检测并在计算机中形成三维液滴的成像；(f)系统软件根据阳性荧光液滴比例，基于泊松分布进行计算，对酶分子的浓度进行绝对定量。
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