CN106053405A - 一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，用以观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程，包括如下步骤：(1)利用试剂盒提取肿瘤细胞外泌体；(2)使用第一荧光分子和第二荧光分子分别标记肿瘤细胞外泌体膜和肿瘤细胞外泌体膜表面受体，同时使用第三荧光分子染色正常细胞；(3)通过基于单分子定位法的超分辨光学显微镜观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程。该方法解决了现有技术中由于衍射极限限制无法细致观测外泌体的问题，为研究外泌体介导的癌症转移机制以及癌症转移扩散治疗研究提供了新的技术手段。

Description

一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法
技术领域
本发明涉及基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，用以观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程，属于生物光子学技术。
背景技术
外泌体是由细胞分泌出的囊泡中的一类，其尺寸约30-100nm。这种有趣的纳米级囊泡外层为脂质膜，其上表达有特定的信号分子，而其内部包含了蛋白质、RNA等生物分子。外泌体在细胞间通讯和物质交换中扮演了十分重要的角色。已有的研究表明，外泌体与受体细胞之间的相互作用主要分为三种：1)外泌体通过受体细胞表面的外泌体粘附分子结合到受体细胞表面；2)外泌体直接与受体细胞发生融合；3)外泌体通过受体接到的胞吞作用进入受体细胞。肿瘤细胞外泌体与肿瘤的发展关系密切相关，一方面外泌体能改造肿瘤微环境，使其更加适合肿瘤的生长；另一方面，肿瘤细胞外泌体又具有“感染”正常细胞的可能。这使得外泌体成为一种重要的肿瘤标志物以及潜在的药物治疗靶点。但肿瘤细胞外泌体在癌症的发展过程中扮演的实际角色尚不清楚。因此，目前仍需要研究肿瘤细胞外泌体与受体细胞的相互作用过程，从而深入解析外泌体介导的癌症转移机制，为癌症治疗方案的确定提供有用的参考信息。
然而，外泌体30-100nm的尺寸极大地增加了对其进行观测的难度。目前用于观测外泌体的方法有纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)、共聚焦显微术(CLSM)、电子显微术(TEM、SEM)、流式细胞术(FCM)等。其中，隶属光学显微术的CLSM由于其无损、直观、并能实时跟踪观测活细胞样品等特点而获得了较为广泛的应用。但光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，通常只能达到200-300nm。这使得CLSM等光学显微镜无法对外泌体进行细致的观测。近年来，科学家们针对光学显微镜的分辨率极限，开发出了几类能够突破衍射极限的超分辨光学显微镜。例如受激发射损耗显微镜(STED)、结构光照明显微镜(SIM)、随机光学重建显微镜(STORM)以及光活化定位显微镜(PALM)等。其中，以STORM/PALM技术能达到的分辨率最为突出，它们的成像原理相似，都基于单分子定位技术。目前，蔡司、尼康等显微镜厂商已经推出了基于PALM/STORM技术的50-80nm分辨率的超分辨显微系统。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，用以观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程，该方法解决了现有技术中由于衍射极限限制无法细致观测外泌体的问题，为研究外泌体介导的癌症转移机制以及癌症转移扩散治疗研究提供了新的技术手段。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，用以观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程，包括如下步骤：
(1)利用试剂盒提取肿瘤细胞外泌体，一般的商用外泌体试剂盒皆可；
(2)使用第一荧光分子和第二荧光分子分别标记肿瘤细胞外泌体膜和肿瘤细胞外泌体膜表面受体，同时使用第三荧光分子染色正常细胞膜；所述肿瘤细胞外泌体膜表面受体为肿瘤细胞外泌体膜表面的一种特异性肿瘤标志物；
(3)通过基于单分子定位法的超分辨光学显微镜观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程；其中，肿瘤细胞外泌体膜和正常细胞膜通过全内反射(TIRF)显微成像，肿瘤细胞外泌体膜表面受体通过超分辨光学显微成像；超分辨光学显微成像方法是基于单分子定位技术，横向分辨率达50-80nm，可细致地观测到肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程。
具体的，所述第一荧光分子、第二荧光分子和第三荧光分子均为具有荧光闪烁(blink)效应的、适用于单分子定位超分辨光学成像的荧光分子，且第一荧光分子、第二荧光分子和第三荧光分子的荧光发射光谱重叠率低于设定阈值，要求三种荧光分子的荧光发射光谱不能有显著重叠；第一荧光分子为亲脂性荧光染料，第二荧光分子通过间接免疫荧光法标记在肿瘤细胞外泌体膜表面受体上，第三荧光分子为膜染料。
具体的，所述步骤(2)具体包括如下步骤：
(21)在提取出的肿瘤细胞外泌体溶液中，加入与肿瘤细胞外泌体膜表面受体特异性的一抗并进行免疫识别反应，超滤提纯去除过量的一抗；
(22)在连接了一抗并超滤提纯后的肿瘤细胞外泌体溶液中，加入能特异性识别所述一抗的二抗并进行免疫识别反应，超滤提纯去除过量的二抗，所述二抗偶联了第二荧光分子；
(23)使用第一荧光分子标记肿瘤细胞外泌体膜；
(24)使用第三荧光分子染色正常细胞膜。
具体的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：
(31)将使用第一荧光分子和第二荧光分子标记完成的肿瘤细胞外泌体与使用第三荧光分子染色好的正常细胞共同培养一段时间，确保肿瘤细胞外泌体与正常细胞发生相互作用；
(32)将发生相互作用的肿瘤细胞外泌体与正常细胞作为观测样品，固定观测样品；
(33)在固定好的观测样品中加入单分子定位成像所需的成像缓冲液，进行超分辨光学成像，并分析肿瘤细胞外泌体与正常细胞相互作用的过程。
有益效果：本发明提供的基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，相对于现有技术，具有如下优点：1、本发明实现了肿瘤细胞外泌体膜受体的超分辨率光学成像，可进行更加精确的定位，更细致地观测到肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程；2、本发明采用具有荧光闪烁效应的染料分子作为免疫荧光的标记分子，这类荧光分子量子产率高、亮态占空比小、开关次数多、光稳定性好且标记密度高，有利于提高单分子定位成像的分辨率；3、本发明利用间接免疫荧光法标记肿瘤细胞外泌体膜表面的受体，能特异性的实现肿瘤细胞外泌体的靶向观测与成像。
附图说明
图1为标记完成的肿瘤细胞外泌体示意图，包括：1-肿瘤细胞外泌体，2-肿瘤细胞外泌体膜表面受体，3-一抗，4-二抗，5-第一荧光分子，6-第二荧光分子。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
本实施例中涉及的PBS缓冲液为pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液；涉及的正常细胞膜染料(第三荧光分子)为PKH67，其反应溶液为Sigma公司提供的Diluent C溶液；涉及的单分子定位超分辨光学成像技术为PALM技术，涉及的成像缓冲液为PH＝8.0的磷酸盐溶液，其中配有136mM的β-巯基乙醇，5％葡萄糖，0.5mg/mL的葡萄糖氧化酶和40μg/mL的过氧化氢酶；涉及的肿瘤细胞外泌体为乳腺癌细胞(SKBR3细胞)外泌体，正常细胞为人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)；涉及的肿瘤细胞外泌体膜表面受体为HER2，间接免疫荧光所用的一抗为兔抗人HER2，二抗为Alexa fluo 647(第二荧光分子)标记的羊抗兔IgG；涉及的肿瘤细胞外泌体膜染料(第一荧光分子)为CM-Dil；涉及的外泌体提取试剂盒为SBI公司的ExoQuick-TCExosomes Preciptation Solution外泌体试剂盒
步骤一、提取肿瘤细胞外泌体
取5mL的1×106个对数生长期的SKBR3细胞的条件培养液，以3000×g离心15分钟，取上清去除悬浮液中的细胞。向细胞悬浮液上清中加入1mL外泌体提取试剂于4℃反应过夜。将混合溶液在10000×g转速下离心20分钟，取沉淀重悬在100μL的PBS缓冲液中于-75℃冻存。
步骤二、外泌体荧光标记
取5μL外泌体冻存液溶解后稀释在400μL的PBS溶液中，加入1μL的1mg/mL的兔抗人HER2，室温下摇床反应2小时后，用50KD超滤管6000rmp超滤提纯20分钟，去除多余的一抗。沉淀稀释在400μL的PBS溶液中，继续加入1μL的2mg/mL的Alexa fluo 647标记的羊抗兔IgG，室温下摇床振荡反应45分钟后，加入1μL的0.1mg/mL的Dil溶液，继续反应15分钟。将反应溶液于50KD超滤管6000rmp超滤提纯20分钟，去除多余的二抗以及CM-Dil。沉淀稀释在400μL的PBS溶液中，于4℃保存待用。
步骤三、正常细胞染色
取0.2μL的PKH67溶液稀释在50μL的反应液中作为细胞膜染色剂。正常细胞MRC-5培养48小时后，吸去多余培养液，用PBS轻轻冲洗三次后，加入100μL PKH67反应缓冲液。将配好的细胞膜染色剂加入细胞皿中，轻轻摇晃使其分布均匀，将细胞皿继续放入培养箱中反应4分钟后取出，去除多余的染色剂，加入200μL的1％的BSA用于终止PKH67染色，5分钟后除去多余BSA加入新鲜培养液。
步骤四、肿瘤外泌体与正常细胞共培养并成像
向正常细胞中均匀滴入50μL标记过的外泌体溶液，随后将细胞皿继续放入细胞培养液中待其共培养10分钟后取出，吸去多余培养液，用PBS轻轻冲洗三次后，加入200μL4％的多聚甲醛溶液固定细胞20分钟。向固定后的细胞中加入200μL PALM成像缓冲液后进行PALM成像。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，用以观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程，其特征在于：包括如下步骤：
(1)利用试剂盒提取肿瘤细胞外泌体；
(2)使用第一荧光分子和第二荧光分子分别标记肿瘤细胞外泌体膜和肿瘤细胞外泌体膜表面受体，同时使用第三荧光分子染色正常细胞膜；所述肿瘤细胞外泌体膜表面受体为肿瘤细胞外泌体膜表面的一种特异性肿瘤标志物；
(3)通过基于单分子定位法的超分辨光学显微镜观察肿瘤细胞外泌体与正常细胞的相互作用过程；其中，肿瘤细胞外泌体膜和正常细胞膜通过全内反射显微成像，肿瘤细胞外泌体膜表面受体通过超分辨光学显微成像。
2.根据权利要求1所述的基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，其特征在于：所述第一荧光分子、第二荧光分子和第三荧光分子均为具有荧光闪烁效应的、适用于单分子定位超分辨光学成像的荧光分子，且第一荧光分子、第二荧光分子和第三荧光分子的荧光发射光谱重叠率低于设定阈值；第一荧光分子为亲脂性荧光染料，第二荧光分子通过间接免疫荧光法标记在肿瘤细胞外泌体膜表面受体上，第三荧光分子为膜染料。
3.根据权利要求1所述的基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，其特征在于：所述步骤(2)具体包括如下步骤：
(21)在提取出的肿瘤细胞外泌体溶液中，加入与肿瘤细胞外泌体膜表面受体特异性的一抗并进行免疫识别反应，超滤提纯去除过量的一抗；
(22)在连接了一抗并超滤提纯后的肿瘤细胞外泌体溶液中，加入能特异性识别所述一抗的二抗并进行免疫识别反应，超滤提纯去除过量的二抗，所述二抗偶联了第二荧光分子；
(23)使用第一荧光分子标记肿瘤细胞外泌体膜；
(24)使用第三荧光分子染色正常细胞膜。
4.根据权利要求1所述的基于单分子定位法的超分辨光学成像方法，其特征在于：所述步骤(3)具体包括如下步骤：
(31)将使用第一荧光分子和第二荧光分子标记完成的肿瘤细胞外泌体与使用第三荧光分子染色好的正常细胞共同培养一段时间，确保肿瘤细胞外泌体与正常细胞发生相互作用；
(32)将发生相互作用的肿瘤细胞外泌体与正常细胞作为观测样品，固定观测样品；
(33)在固定好的观测样品中加入单分子定位成像所需的成像缓冲液，进行超分辨光学成像，并分析肿瘤细胞外泌体与正常细胞相互作用的过程。
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