CN105259096B - 磷酸锌纳米基底及其制备方法和在循环肿瘤细胞捕获与释放中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底及其制备方法。该磷酸锌纳米基底以生长于透明基底的氧化锌纳米线为起始原料，在磷酸根和镁离子的影响下，采用低温水热的方法制备。本发明还提供一种利用该磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞（CTC）的方法，包括以下步骤：磷酸锌纳米基底表面修饰羧基；活化羧基，修饰特异性识别靶细胞的生物分子；捕获CTC；采用生物相容性好的柠檬酸钠溶解磷酸锌纳米基底，释放肿瘤细胞。本发明制备的基底具有捕获循环肿瘤细胞效率高、灵敏度高、易操作、重现性好等特点。同时，采用柠檬酸钠溶解基底，释放的肿瘤细胞活性高，可进行分子水平分析、耐药性研究，对于肿瘤细胞的后续研究具有潜在意义。

Description

磷酸锌纳米基底及其制备方法和在循环肿瘤细胞捕获与释放 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料、纳米材料技术领域，具体涉及一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底及其应用。

背景技术

循环肿瘤细胞，简称CTCs。是指从原发性肿瘤或者转移部位脱落、侵袭并进入血液循环系统的癌细胞。研究发现血液中CTC数目多少与癌症患者病情发展息息相关，所以监测血液中CTC数目变化对于评估癌症转移和疗效十分重要。另外，CTC分子水平分析可以提供许多临床相关的重要信息，有效指导临床治疗，为实现个体化治疗奠定坚实基础。

近年来不同形状结构的纳米材料，诸如纳米颗粒、纳米阵列等无机纳米材料以其独特的结构效应被应用于细胞行为及其界面设计等研究中。2012年，Zhang等利用二氧化钛纳米纤维经过功能化处理后做为基底，实现了循环肿瘤细胞的富集和检测（Adv.Mater.,2012,24,2756-2760）。2013年，Park等利用热化学气相沉积生长法制备出表面被金纳米簇均匀包覆的无机硅纳米线阵列基底。该基底经过表面抗体修饰后对靶向肿瘤细胞有高的捕获效率（Nano Lett.,2012,12,1638-1642）。然而，制备这些纳米结构往往需要昂贵的仪器设备、复杂的技术和娴熟而又精湛的操作；而且制备的纳米结构基底透光性较差，不利于观察、成像和操作。另外，从纳米结构基底上温和地释放肿瘤细胞，利于CTC的再培养、分子水平分析、耐药性研究等，仍然亟需解决。因此发展易制备、透明纳米结构基底高效捕获、温和释放肿瘤细胞十分必要且重要。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，其特征在于，所述磷酸锌纳米基底的制备依次包括以下步骤：

（1）制备氧化锌纳米线基底；

（2）形成分形结构磷酸锌纳米基底：以生长氧化锌纳米线的基底为起始原料，将其置于25～37℃的含镁离子的磷酸盐溶液中孵育12～72 h即可形成；

优选的步骤（1）所述的基底包括透明的玻璃、石英 、聚二甲基硅氧烷（PDMS）和不透光的硅片；

优选的步骤（2）所述的磷酸盐溶液是指含磷酸酸根的溶液；

本发明的另一目的在于提供一种利用磷酸锌纳米基底高效捕获、温和释放循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在磷酸锌纳米基底表面修饰羧基：将磷酸锌纳米基底置于等离子清洗机腔室，用等离子体清洗其表面，提高基底表面的润湿性能，增强分子黏附，然后，再将等离子体处理过表面的基底和硅烷三醇丙酸钠的磷酸缓冲液孵育3 h，洗去多余的溶剂，即得到表面修饰羧基的磷酸锌基底；

制备生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底：将羧基化基底置于含1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的10 mM硼酸缓冲液中活化30 min, 通过羧基和氨基反应，与 50～200 μg生物分子a在冰盒上孵育4 h，可得到生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底，所述的生物分子a可以为适配体、链霉亲和素、抗体及其他含氨基分子；

制备能特异性识别靶细胞的磷酸锌纳米基底：生物分子a修饰的基底和1～5 μg生物分子c孵育0.5 h，所述生物分子c被特异性结合生物分子a的生物分子b标记，洗去多余的生物分子c，所述的生物分子c可以为抗体、适配体及其他被生物分子b标记的分子，且能特异性识别靶细胞；

生物分子功能化修饰的基底和细胞悬浮液或全血孵育0.5～1 h,洗去未捕获的细胞，染色，置于荧光显微镜下观察、成像、计数；

将已捕获细胞的基底置于0.1～2%柠檬酸钠的磷酸缓冲液中孵育5 min～1 h,溶解磷酸锌基底，释放细胞。

优选的步骤中的生物分子a为链霉亲和素，生物分子b为生物素。

优选的步骤中的生物分子c为上皮细胞黏附分子抗体（anti-EpCAM)。

本发明的原理：氧化锌纳米线作为一种半导体纳米材料，易于制备，且可以掺杂二价金属元素如镁，引起结构发生变化。另外，氧化锌对磷酸根十分敏感，生理条件下即可与磷酸根反应生成磷酸锌。同时，锌离子络合剂如柠檬酸钠、草酸、乙二胺四乙酸等能够在室温下有效络合锌离子，快速溶解纳米结构基底。而且，将氧化锌纳米线生长于透明的基底如玻璃、聚二甲基硅氧烷（PDMS）等，该基底具有良好的透光性。

本发明的优点和有益效果在于：

1. 本发明提供的透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，制备方法简单、条件温和、廉价、结构重现性好。

2. 本发明提供的透明磷酸锌纳米基底有利于观察、成像和操作。

3. 本发明提供的分形结构磷酸锌纳米基底模仿癌细胞表面基质较正常细胞明显的分形行为，利于癌细胞黏附、捕获，而且协同特异性识别靶细胞的生物分子能够有效提高肿瘤细胞的捕获效率。

4. 本发明提供的可牺牲磷酸锌纳米基底，可采用生物相容性好的锌离子络合剂如柠檬酸钠（血液抗凝剂），溶解磷酸锌基底，温和释放肿瘤细胞，便于CTC再培养、分子水平分析和耐药性研究。

附图说明

图1 是实施例1制备的氧化锌纳米线基底(a)和分形结构磷酸锌纳米基底（b）的扫描电镜图

图（a）中的插图是制备的氧化锌纳米线高度的扫描电镜图，图（b）中的插图为虚线框处分形结构的放大图；

图2 是实施例1制备的氧化锌纳米线和分形结构磷酸锌纳米基底的X射线衍射图谱（a）和（b）；

图3 是实施例1制备的分形结构磷酸锌纳米基底的透光性表征图

将该基底置于选定图片（武汉大学校徽）上面的照片；

图4 是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底捕获和释放MCF-7 细胞的明场荧光显微镜照片；

图5 是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底用柠檬酸钠处理后，释放的MCF-7细胞活性结果图；

图（a）是释放下来细胞的明场显微镜照片，图（b）是将释放下来的细胞培养48 h后的明场荧光显微镜照片；

图6 是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底从1 mL癌症病人全血中检测出的CTC个数；

图7 是实施例2制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底（HZnPNS）与CellSearch从不同的癌症转移患者全血中检测出的CTC个数

两种方法平行实施，CellSearch局限于检测7.5mL乳腺癌、结肠癌和前列腺癌转移患者的血液样品，而制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底检测的血液量为1mL。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】制备透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底

1、制备氧化锌纳米线基底：首先，干净的玻璃基底表面用等离子体处理1～3 min,而后置于匀胶机，2500 rpm均匀旋涂10 mM醋酸锌的乙醇溶液，最后，放于300℃加热台加热3 h,产生一层氧化锌种子。第二步，将铺有氧化锌种子的玻璃基底倒置于50 mM硝酸锌和六亚甲基四胺水溶液，90℃生长3 h，产生氧化锌纳米线基底。

2、形成分形结构磷酸锌纳米基底：氧化锌纳米线基底在含10 mM镁离子的生理等渗磷酸缓冲液中，37℃孵育12～72 h,直到玻璃基底表面铺满分形纳米结构。氧化锌纳米线基底（a）和分形结构磷酸锌基底(b)的扫描电镜图图1 和X射线衍射图谱图2。所需达到的制备要求：分形结构透光性好（图3），能够和癌细胞表面纳米结构拓扑作用，有利于癌细胞黏附。

【实施例2】上皮细胞黏附分子抗体（anti-EpCAM)修饰的磷酸锌纳米基底捕获、释放肿瘤细胞

1、将磷酸锌基底（面积：1 cm × 2 cm）放入等离子清洗机的腔室内，用等离子体清洗其表面1-5 min，提高基底表面的润湿性能，增强分子黏附。然后，再将等离子清洗机清洗后的基底置于含有硅烷三醇丙酸钠（25% 的水溶液, 40 μL）的磷酸盐缓冲液（2 mL）中，然后，羧基修饰的基底置于含25 mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的10mM硼酸缓冲液中活化30 min, 通过羧基和氨基反应，与 400 μL (100 μg)链霉亲和素冰盒上孵育4 h。最后，将链霉亲和素修饰的基底和200 μL (5 μg）生物素标记的anti-EpCAM孵育30 min,洗去多余的anti-EpCAM.

2、将anti-EpCAM功能化的基底放入四孔腔室载玻片中，加入500 μL （10⁴个SYTO@13染色的MCF-7乳腺癌细胞）细胞悬浮液，置于细胞培养箱中孵育45 min, 90 rpm摇2 min,洗去未捕获的细胞，重复两次。MCF-7细胞的捕获结果如图4所示。

3、肿瘤细胞释放和再培养

捕获细胞后，将基底置于含1%柠檬酸钠的生理等渗磷酸缓冲液(pH 6.5) 90 rpm摇20 min，除去柠檬酸钠溶液，加入生理等渗的磷酸缓冲液，洗脱捕获的细胞，90 rpm摇2min,重复两次，结果见图3。然后将释放的细胞收集，置于培养基中培养48 h,细胞伸展的很好，具有很高的生物活力性（图5）

4、癌症病人血液中CTC捕获

取1mL癌症病人血液于生物分子anti-EpCAM修饰的磷酸锌基底，60 rpm孵育 45min,轻轻洗去未捕获细胞，重复至少三次，而后依次用4%多聚甲醛固定细胞20 min,0.1%trionX-100处理20 min，5% BSA 和0.2% Tween-20 孵育20 min,400 μL 三色染料（40 μL，250μg/mL DAPI核染料、10 μL FITC标记的anti-cytokeratin 19、80μL PE标记的anti-CD45）孵育30 min。最后，洗去多余染料，置于荧光显微镜下观察、成像、计数。

结果显示，我们制备的anti-EpCAM修饰的磷酸锌纳米基底（HZnPNS）能够从1mL不同癌症患者全血样品检测0-75个CTC (图6），且与检测CTC的金标准CellSearch（适用于7.5mL癌症转移患者全血样品）比较，我们的检测方法测出的CTC数目较多、较灵敏，结果见图7。

Claims (4)

1.一种透明、可牺牲、分形结构磷酸锌纳米基底，其特征在于，所述磷酸锌纳米基底的制备依次包括以下步骤：

(1)制备氧化锌纳米线基底；所述的基底包括透光的玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷(PDMS)和不透光的硅片；

(2)形成分形结构磷酸锌纳米基底：以生长氧化锌纳米线的基底为起始原料，将其置于含10mM镁离子的生理等渗磷酸盐溶液中，25～37℃孵育12～72h，直到基底上竖直方向排列的氧化锌纳米线转化为多维数分形结构铺满基底，所述的磷酸盐溶液是指含磷酸酸根的溶液。

2.一种利用权利要求1所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①在磷酸锌纳米基底表面修饰羧基：首先，将磷酸锌纳米基底置于等离子清洗机腔室内，用等离子体清洗其表面，然后，再将等离子体处理过表面的基底和硅烷三醇丙酸钠的磷酸缓冲液孵育3h，洗去多余的溶剂，即得到表面修饰羧基的磷酸锌基底；

②制备生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底：将羧基化基底置于含1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的10mM硼酸缓冲液中活化30min,通过羧基和氨基反应，与50～200μg生物分子a在冰盒上孵育4h，可得到生物分子a修饰的磷酸锌纳米基底，所述的生物分子a可以为适配体、链霉亲和素、抗体及其他含氨基分子；

③制备能特异性识别靶细胞的磷酸锌纳米基底：生物分子a修饰的基底和1～5μg生物分子c孵育0.5h，所述生物分子c被特异性结合生物分子a的生物分子b标记，洗去多余的生物分子c，所述的生物分子c可以为抗体、适配体及其他被生物分子b标记的分子，且能特异性识别靶细胞；

④生物分子功能化修饰的磷酸锌纳米基底和细胞悬浮液或全血孵育0.5～1h，洗去未捕获的细胞，染色，置于荧光显微镜下观察、成像、计数；

⑤将已捕获细胞的基底置于0.1～2％柠檬酸钠的磷酸缓冲液中孵育5min～1h，溶解磷酸锌基底，释放细胞。

3.根据权利要求2所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤②中的生物分子a为链霉亲和素，生物分子b为生物素。

4.根据权利要求2或3所述的磷酸锌纳米基底捕获、释放循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤③中的生物分子c为上皮细胞黏附分子抗体。