CN110514489A - 一种用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层及其制备方法 - Google Patents

一种用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层及其制备方法，涉及生物技术和临床领域，此涂层基于聚缩水甘油醚(PG)或者聚乙二醇(PEG)并结合贻贝黏附仿生化学修饰，进行循环肿瘤细胞特异性捕获。本发明是在基底表面进行功能化聚合物修饰，防止非特异性细胞和其他血液成分黏附，然后将特异性抗体固定在聚合物表面，将待测样品(血液)滴加到涂层表面，由识别循环肿瘤细胞的特异性抗体与抗非特异性黏附的聚合物的协同作用，达到特异性吸附与抗非特异性黏附的协同效果，从而可以高效准确捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。本发明所述的方法可以高效捕获循环肿瘤细胞，成本低廉，操作简单，灵敏性极高，可用于临床检测。

Description

一种用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂 层及其制备方法
技术领域
本发明属于功能材料技术和生物医学材料领域，特别涉及用于循环肿瘤细胞富集和检测的特异性生物涂层及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤有转移和复发的倾向，是癌症患者死亡的主要原因。肿瘤的转移是肿瘤细胞脱离原发病灶侵入细胞外基质，侵袭循环系统，有效地逃避机体免疫清除系统，成为循环肿瘤细胞(CTCs)。虽然CTCs在血液中的数量非常少(几个到上百个每毫升)掺杂在大量血细胞(109个每毫升)中，但在检查癌症的转移和监测治疗的效果中，却有非常重大的意义。也就是说，CTCs不但可以代替活组织检查来发现癌症转移，而且癌症患者体内CTCs的数目对于监测临床治疗有重大意义。近些年来，有很多平台，例如基于微流控芯片和免疫磁珠等技术的CTCs癌症监测技术已经取得较大发展，虽然这些方法都具有一定的CTCs捕获效果，但也存着各种不足，如材料制备过程较为复杂，细胞的捕获特异性不高，或富集时间较长等。基于聚缩水甘油醚(PG)和聚乙二醇(PEG)的聚合物是一种新型的稳定的抗非特异性黏附涂层，聚合物修饰有不同的功能基团，可以修饰针对不同癌症类型的特异性吸附配基，操作简便，成本低廉，易于临床监测应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于全血捕获循环肿瘤细胞的功能化抗非特异性黏附的生物涂层。
本发明另一目的在于提供一种制备简单便捷且具有极高灵敏度的用于全血捕获循环肿瘤细胞的功能化聚合物涂层的制备方法。
本发明通过选用新颖的改性的功能化聚合物涂层，通过贻贝黏附仿生机理来化学改性基材表面，通过生物素/生物亲和素(biotin/neutravidin)相互作用连接上特异性的抗体。功能化聚合物涂层可以在防止非特异性黏附和与抗体特异性识别循环肿瘤细胞的协同作用下去实现对循环肿瘤细胞的高效灵敏捕获。并在病人血液中达到比较高的捕获效率，为以后的临床检测提供简便可行的方法。
本发明用于全血捕获循环肿瘤细胞的功能化聚合物涂层，是将功能化聚合物涂层在基材表面，所述涂层表面修饰有特异性识别肿瘤细胞的抗体。
所述聚合物涂层材料为改性后的基于聚缩水甘油醚的聚合物材料(PG-CatPh)或者聚乙二醇(PEG)，在改性过程中使用的方法是取代和加成反应的化学方法，涂层的方法是浸泡涂层法。
所述功能化聚合物涂层是通过浸泡涂层法涂布的，浸泡温度为室温2-3小时。
所述功能化聚合物的改性表面修饰有特异识别循环肿瘤细胞的抗体。
所述功能化聚合物改性表面在制备过程中所用的聚合物溶液的浓度为1-10mg/mL。
本发明用于全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层具有贻贝黏附仿生化学基团修饰，通过胺基，苯基和邻苯二酚基团结构与基材稳定结合，表面固定的特异性抗体与循环肿瘤细胞的膜表面抗原产生特异性识别和结合效应，另外，其特有的功能化聚合物涂层可以防止非特异性细胞的黏附，为其具有超低背景吸附提供了必备的条件。
实验结果表明，本发明用于全血捕获循环肿瘤细胞的特异性生物涂层对特异性的循环肿瘤细胞(如乳腺癌细胞MCF7)的富集效率高达90％以上，且非特异性的细胞系(如宫颈癌细胞Hela细胞)却极少粘附在生物涂层上，从而可以实现在生物样品(血液)中的高效循环肿瘤细胞的捕获。例如，将掺有循环肿瘤细胞的健康血液(只需1毫升)滴入本发明的生物涂层上，可以实现对血液样本中循环肿瘤细胞的高效和灵敏富集，而血液中正常血细胞或者其他成分却极少粘附在生涂层片上。本发明的特异性生物涂层在临床实验中可以达到非常好的捕获效率以及极低的背景吸附。
本发明用于全血捕获癌细胞的特异性生物涂层的制备方法包括以下步骤:
(1)通过阴离子开环聚合的方法，由乙氧基乙基缩水甘油醚和烯丙基缩水甘油醚制备出聚合物(PEEGE-b-PAGE)。
(2)将步骤(1)得到的聚合物PEEGE-b-PAGE去缩醛保护得到聚合物(PG-b-PAGE)。
(3)将步骤(2)得到的聚合物利用取代反应修饰叠氮基团得到聚合物(N3-PG-b-PAGE)。
(4)将步骤(3)得到的聚合物在紫外光照射下利用“thiol-ene”反应修饰胺基得到聚合物(N3-PG-A)。
(5)将步骤(4)得到的聚合物利用取代反应修饰苯基和邻苯二酚基团得到聚合物(N3-PG-CatPh)。
(6)制备基于聚乙二醇(PEG)的亲水性聚合物。
(7)将步骤(5)或者步骤(6)得到的聚合物利用环炔叠氮-点击化学的方法修饰生物素(Biotin)和生物亲和素(Avidin/Neutravidin/Streptavidin)。
(8)通过化学气相沉积法制备用于涂层的透明基片。
(9)将步骤(8)得到的基片在臭氧清洗机中清洗玻璃以方便以下操作。
(10)将步骤(5)和(6)得到的聚合物溶解在pH值为6.0缓冲液中。
(11)将步骤(9)得到的基片置于步骤(10)得到的缓冲液中，室温下进行反应，将基片取出并清洗。
(12)将特异性识别肿瘤细胞的抗体的缓冲液滴加到步骤(11)得到的玻璃基片上，37℃放置，使抗体充分吸收并固定在基片表面，得到用于全血循环肿瘤细胞富集和检测的所述特异性生物涂层。
所述功能化聚合物具有抗非特异性黏附的的功能，制备方法是阴离子开环聚合的方法。
所述具有贻贝黏附仿生化学基团修饰的功能化聚合物，仿生黏附基团是邻苯二酚基团。
所述功能化聚合物涂层的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗体。
所述功能化聚合物涂层在制备过程中所用的聚合物浓度约为1-10mg/ml。
本发明用于全血捕获癌细胞的功能化聚合物涂层具有制备检测灵敏，成本低廉，操作简单等优点，具有非常灵敏的细胞亲和性与捕获效率，并且易于临床应用。本发明的生物涂层特别适用于对发生转移的乳腺癌、肺癌或者前列腺癌等恶性肿瘤的中后期术后监测，对于转移到血液中的肿瘤细胞具有很好的捕获效果。本发明是用于全血中循环肿瘤细胞捕获和监测的生物涂层，制备过程无有毒和有害物质，环境友好，稳定性好。
附图说明
图1.本发明所用的血液中循环肿瘤细胞捕获的特异性生物涂层的制备方法。
图2.本发明制备的用于血液中捕获循环肿瘤细胞的特异性生物涂层在捕获完细胞后的荧光场和明场环境下的显微镜照片。
图3.本发明实施例1制备的用于捕获循环肿瘤细胞的特异性生物涂层捕获乳腺癌细胞系(MCF7)的定量数据。
图4.本发明实施例2制备的用于捕获循环肿瘤细胞的特异性生物涂层捕获五种细胞系(MCF7、T47D、MDA-MB-231、A549和HeLa)的定量数据。
图5.本发明实施例3-6制备的用于捕获循环肿瘤细胞的混合抗体孵育的特异性生物涂层捕获的人造乳腺癌患者血液中肿瘤细胞的定量数据。
图6.本发明实施例7-14制备的用于全血捕获循环细胞的特异性生物涂层捕获的人造乳腺癌患者血液中的MCF7细胞的定量数据。
图7.本发明实施例15-20制备的用于捕获循环肿瘤细胞的混合抗体孵育的特异性生物涂层捕获的晚期乳腺癌症病人血液中循环肿瘤细胞的定量数据。
具体实施方式
附图1示出了本发明所用的血液中循环肿瘤细胞捕获的特异性生物涂层的制备方法及操作流程，以下实施例参见附图1：
实施例1：
(1)将四正辛基溴化铵脱水，与乙氧基乙基缩水甘油醚和三异丁基铝一起加入到甲苯中，0℃反应三小时，再在冰浴条件下加入烯丙基缩水甘油醚和三异丁基铝，在室温下搅拌过夜即可。加水终止反应，用硫酸钠干燥聚合产物，除去甲苯，透析纯化即可得到聚合物(PEEGE-b-PAGE)。
(2)将步骤(1)得到的聚合物(PEEGE-b-PAGE)与37％盐酸水溶液一起加入到四氢呋喃中，室温下搅拌反应10小时，用四氢呋喃洗涤聚合物沉淀，甲醇透析即可得到去缩醛保护的聚合物(PG-b-PAGE)。
(3)将步骤(2)得到的聚合物(PG-b-PAGE)溶解在干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在冰浴条件下加入三乙胺，再加入对甲基苯磺酰氯，室温下搅拌过夜反应，得到的聚合物在甲醇中透析纯化。
(4)将步骤(3)得到的聚合物沉淀溶解在干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，加入叠氮化钠，加热至40℃反应72小时，即可得到修饰有叠氮基团的聚合物(N3-PG-b-PAGE)。
(5)将步骤(4)得到的聚合物(N3-PG-b-PAGE)与半胱氨酸盐酸盐溶解在甲醇中，接着加入安息香双甲醚，室温下在365nm紫外光照射下反应2小时，即可得到修饰由胺基的聚合物(N3-PG-A)。
(6)将步骤(5)得到的聚合物(N3-PG-A)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到pH 4.8的2-吗啉乙磺酸缓冲液和甲醇的混合溶液中，接着加入3,4-二羟基苯基丙酸和苯基丙酸，并在室温下温和搅拌过夜，即可得到修饰由邻苯二酚基团和苯基修饰的聚合物(N3-PG-CatPh)。
(7)通过化学气相沉积法制备具有二氧化钛薄膜的透明玻璃基片。
(8)将步骤(7)得到的基片在臭氧清洗机中清洗20分钟以方便以下操作。
(9)将步骤(6)得到的聚合物(N3-PG-CatPh)溶解在pH 6的3-吗啉丙磺酸缓冲液中，浓度为1-10mg/mL。
(10)将步骤(8)得到的二氧化钛薄膜玻璃置于步骤(9)得到的缓冲液中，室温下进行反应2-3小时，将玻璃基片取出并用纯水清洗。
(11)将步骤(10)得到的生物基片放置在八孔板内，加入N-(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基-1,8-二氨基-3,6-二辛烷与生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，在室温下放置反应。
(12)将步骤(11)得到的生物基片置于生物亲和素的磷酸盐缓冲液中，37℃下进行反应，将基片取出并用磷酸缓冲液清洗。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于抗体(Anti-EpCAM)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟，将已经染色的细胞以5000个每毫升的浓度掺入无血清RPMI-1640培养基中制成MCF7悬浮液。
(15)将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图2和图3所示。
(16)作为对照组，将步骤(10)得到的PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去前列腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图2和图3所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)对乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为82.57％，生物基片(PG-CatPh)对乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为7.57％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)对MCF7具有非常灵敏的捕获效率，生物基片(PG-CatPh)对细胞有很好的抗污特性，这表明功能化聚合物修饰的生物基片的非特异性黏附率极低。
实施例2：
步骤(1)-步骤(13)与实施例1相同。
(14)使用Accutase将MCF7/T47D/MDA-MB-231/A549/HeLa从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟，将已经染色的细胞以5000个每毫升的浓度掺入无血清RPMI-1640培养基中制成癌细胞悬浮液。
(15)将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图4所示。
(16)作为对照组1，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的乳腺癌细胞T47D悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去前列腺癌细胞T47D悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞T47D进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞T47D捕获定量数据如图4所示。
(17)作为对照组2，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的人乳腺癌细胞MDA-MB-231悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，吸去人乳腺癌细胞MDA-MB-231悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MDA-MB-231捕获定量数据如图4所示。
(18)作为对照组3，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的人肺癌细胞A549悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，吸去人肺癌细胞A549悬浮液，将基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的人肺癌细胞A549进行计数，计算捕获效率。人肺癌细胞A549捕获定量数据如图4所示。
(19)作为对照组4，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5000个每毫升的子宫颈癌细胞HeLa悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，吸去子宫颈癌细胞HeLa悬浮液，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的子宫颈癌细胞HeLa进行计数，计算捕获效率。子宫颈癌细胞HeLa捕获定量数据如图4所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)对乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为92.57％，乳腺癌细胞T47D的捕获效率为80.64％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率为60.13％，肺癌细胞A549的捕获效率为51.71％，子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率为17.43％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片具有非常灵敏的捕获效率，对抗原表达量不同的循环肿瘤细胞均有较高的捕获效率，并且非特异性黏附率极低。
实施例3：
步骤(1)-步骤(13)与实施例1相同。
(14)使用Accutase将MCF7/A549/MDA-MB-231/HeLa从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以1000个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样/人造肺癌病人血样/人造子宫颈癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图5所示。
(16)作为对照组1，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造肺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造肺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的肺癌细胞A549进行计数，计算捕获效率。肺癌细胞A549捕获定量数据如图5所示。
(17)作为对照组2，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MDA-MB-231捕获定量数据如图5所示。
(18)作为对照组3，将步骤(13)得到的Anti-EpCAM-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造子宫颈癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造子宫颈癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的子宫颈癌细胞HeLa进行计数，计算捕获效率。子宫颈癌细胞HeLa捕获定量数据如图5所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为80.5％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率为60.13％，肺癌细胞A549的捕获效率为51.71％，子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率为17.43％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Anti-EpCAM-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7具有非常灵敏的捕获效果，对EpCAM抗原表达较低的MDA-MB-231/A549和不表达EpCAM的子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率较低，因此大大降低了非特异性黏附率。
实施例4：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于抗体(Anti-Her2)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Anti-Her2-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7/A549/MDA-MB-231/HeLa从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以1000个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样/人造肺癌病人血样/人造子宫颈癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Anti-Her2-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图5所示。
(16)作为对照组1，将步骤(13)得到的Anti-Her2-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造肺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造肺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的肺癌细胞A549进行计数，计算捕获效率。肺癌细胞A549捕获定量数据如图5所示。
(17)作为对照组2，将步骤(13)得到的Anti-Her2-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MDA-MB-231捕获定量数据如图5所示。
(18)作为对照组3，将步骤(13)得到的Anti-Her2-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造子宫颈癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造子宫颈癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的子宫颈癌细胞HeLa进行计数，计算捕获效率。子宫颈癌细胞HeLa捕获定量数据如图5所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物基片(Anti-Her2-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为36.25％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率为0.31％，肺癌细胞A549的捕获效率为0.74％，子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率为0.34％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Anti-Her2-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7具有捕获效果但是效率较低，对MDA-MB-231/A549/HeLa细胞几乎没有捕获效率。
实施例5：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于抗体(Anti-EGFR)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Anti-EGFR-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7/A549/MDA-MB-231/HeLa从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以1000个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样/人造肺癌病人血样/人造子宫颈癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Anti-EGFR-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图5所示。
(16)作为对照组1，将步骤(13)得到的Anti-EGFR-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造肺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造肺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的肺癌细胞A549进行计数，计算捕获效率。肺癌细胞A549捕获定量数据如图5所示。
(17)作为对照组2，将步骤(13)得到的Anti-EGFR-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MDA-MB-231捕获定量数据如图5所示。
(18)作为对照组3，将步骤(13)得到的Anti-EGFR-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造子宫颈癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造子宫颈癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的子宫颈癌细胞HeLa进行计数，计算捕获效率。子宫颈癌细胞HeLa捕获定量数据如图5所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物基片(Anti-EGFR-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为62.4％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率为63.90％，肺癌细胞A549的捕获效率为78.11％，子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率为9.11％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Anti-EGFR-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中肺癌细胞A549有较高的捕获效率，对乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的捕获效率较低，而对HeLa细胞几乎没有捕获效果，因此大大降低了非特异性黏附率。
实施例6：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7/A549/MDA-MB-231/HeLa从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以1000个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样/人造肺癌病人血样/人造子宫颈癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图5所示。
(16)作为对照组1，将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造肺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造肺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的肺癌细胞A549进行计数，计算捕获效率。肺癌细胞A549捕获定量数据如图5所示。
(17)作为对照组2，将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的乳腺癌细胞MDA-MB-231进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MDA-MB-231捕获定量数据如图5所示。
(18)作为对照组3，将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1000个每毫升的人造子宫颈癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间90分钟)，吸去人造子宫颈癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的子宫颈癌细胞HeLa进行计数，计算捕获效率。子宫颈癌细胞HeLa捕获定量数据如图5所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为95.8％，乳腺癌细胞MDA-MB-231的捕获效率为91.20％，肺癌细胞A549的捕获效率为83.84％，子宫颈癌细胞HeLa的捕获效率为15.27％。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)可以大大提高对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率，甚至对EpCAM低表达的MDA-MB-231和A549的捕获效率也有显著提高，而对HeLa细胞的捕获效率也有少量提高，这说明混合抗体基片不仅能大大提高目标细胞的特异性捕获效率，对非特异性黏附细胞也有所增加。
实施例7：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以500个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为500个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为500个每毫升的捕获数量为409个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率有较高的灵敏度。
实施例8：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以200个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为200个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为200个每毫升的捕获数量为160个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7的捕获效率有较高的灵敏度。
实施例9：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以100个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为100个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为100个每毫升的捕获数量为82个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例10：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以50个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为50个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为50个每毫升的捕获数量为42个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例11：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以10个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为10个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为10个每毫升的捕获数量为8个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例12：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以5个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为5个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为5个每毫升的捕获数量为3个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例13：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以3个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为3个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为3个每毫升的捕获数量为2个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例14：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)使用Accutase将MCF7从细胞培养瓶中消化下来，并用CellTraceTM violet染料预染细胞20分钟。健康捐献者全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，然后将已经预先染色的MCF7细胞以1个每毫升的浓度掺入健康捐献者血中制成人造乳腺癌病人血样。
(15)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入1毫升浓度为1个每毫升的人造乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去人造乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的癌细胞MCF7进行计数，计算MCF7捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图6所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造乳腺癌病人血样中乳腺癌细胞MCF7的浓度为1个每毫升的捕获数量为1个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对人造癌症病人血样中乳腺癌细胞MCF7有非常高和灵敏的捕获效率，在较低浓度情况下，生物基片仍可保持较高的捕获效率。
实施例15：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取晚期癌症病人Br1全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞和循环肿瘤细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升晚期乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升晚期乳腺癌病人血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为217个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对癌症病人血液中循环肿瘤细胞有非常高和灵敏的捕获效率，这对癌症患者的病情监测的临床应用有非常重要的意义。
实施例16：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取晚期癌症病人Br2全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞和循环肿瘤细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升晚期乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升晚期乳腺癌病人血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为82个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对癌症病人血液中循环肿瘤细胞有非常高和灵敏的捕获效率，这对癌症患者的病情监测的临床应用有非常重要的意义。
实施例17：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取晚期癌症病人Br3全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞和循环肿瘤细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升晚期乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升晚期乳腺癌病人血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为127个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对癌症病人血液中循环肿瘤细胞有非常高和灵敏的捕获效率，这对癌症患者的病情监测的临床应用有非常重要的意义。
实施例18：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取晚期癌症病人Br4全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞和循环肿瘤细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升晚期乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升晚期乳腺癌病人血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为90个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对癌症病人血液中循环肿瘤细胞有非常高和灵敏的捕获效率，这对癌症患者的病情监测的临床应用有非常重要的意义。
实施例19：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取晚期癌症病人Br5全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞和循环肿瘤细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升晚期乳腺癌病人血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去乳腺癌病人血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升晚期乳腺癌病人血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为49个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对癌症病人血液中循环肿瘤细胞有非常高和灵敏的捕获效率，这对癌症患者的病情监测的临床应用有非常重要的意义。
实施例20：
步骤(1)-步骤(12)与实施例1相同。
(13)将步骤(12)得到的生物基片置于混合抗体(Anti-EpCAM:Anti-Her2:Anti-EGFR的比例为1:1:1)的1wt％牛血清白蛋白溶液中，37℃下放置反应，得到CTCs亲和性的生物基片(Antibody-PG-CatPh)。
(14)抽取健康捐献者He1全血与红细胞裂解液在冰上孵育10分钟，以便于裂解红细胞，离心去除红细胞碎片，收集白细胞，用DPBS洗涤并重悬。
(15)将细胞在4％的PFA中固定10分钟，用DPBS洗涤并重悬。
(16)用荧光标记的抗体Anti-CD45/Anti-CK抗体在室温下预染细胞3小时，接着用DAPI标记细胞核，离心并洗涤。
(17)将步骤(13)得到的Antibody-PG-CatPh基片正面朝上放置在八孔板中，加入500微升健康捐献者血样，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为90分钟)，除去健康捐献者血样，将生物基片在磷酸缓冲液中充分冲洗，用Zeiss荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，并计算捕获效率。循环肿瘤细胞的捕获定量数据如图7所示。
实验结果表明，本发明用于循环肿瘤细胞富集和检测的混合抗体生物基片(Antibody-PG-CatPh)对1毫升健康捐献者血样中循环肿瘤细胞的捕获数量为0个。这些数据表明，本发明用于循环肿瘤细胞捕获的生物基片(Antibody-PG-CatPh)对循环肿瘤细胞的捕获过程可以大大降低非特异性黏附率。

Claims (8)

1.一种用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是:所述生物涂层是具有抗非特异性黏附功能的基底，所述功能化聚合物表面修饰有特异性识别循环肿瘤细胞的各种抗体。
2.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是:具有抗非特异性黏附功能的基底为金属、金属氧化物、无机非金属及聚合物基材料。
3.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是:所述生物涂层表面的功能化聚合物是亲水性聚合物，有聚缩水甘油醚，聚乙二醇，聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸羟乙酯，聚甲基丙烯酸-2-乙基己酯，聚降冰片烯，明胶，聚乙烯亚胺，基于聚缩水甘油醚的材料，结合贻贝黏附仿生化学修饰得到功能性材料PG-CatPh，在进行修饰的过程中引入了叠氮基团，胺基，苯基和邻苯二酚基团。
4.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是：所述生物涂层表面修饰有特异性识别循环肿瘤细胞的各种抗体及其不同比例的组合。
5.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是：所述生物涂层表面是具有抗非特异性细胞和其他血液成分黏附的功能。
6.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是:生物涂层表面的功能化聚合物溶液浓度为1-10mg/ml。
7.根据权利要求1所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层，其特征是:修饰的抗黏附单层涂层的厚度为2-18nm的厚度。
8.一种根据权利要求1～7任意一项所述用于癌症监测的特异性全血捕获循环肿瘤细胞的生物涂层的制备方法，其特征是，所述制备方法包括以下步骤：
1)通过阴离子开环聚合的方法，由乙氧基乙基缩水甘油醚和烯丙基缩水甘油醚制备出聚合物PEEGE-b-PAGE；
2)将步骤1)得到的聚合物PEEGE-b-PAGE去缩醛保护得到聚合物PG-b-PAGE；
3)将步骤2)得到的聚合物利用取代反应修饰叠氮基团得到聚合物N3-PG-b-PAGE；
4)将步骤3)得到的聚合物N3-PG-b-PAGE利用“thiol-ene”反应修饰胺基得到聚合物N3-PG-A；
5)将步骤4)得到的聚合物进一步修饰苯基和邻苯二酚基团，得到聚合物N3-PG-CatPh，苯基，胺基和邻苯二酚基团作为锚定区域让聚合物稳定地结合在基底上；
6)制备基于聚乙二醇的亲水性聚合物；
7)制备用于聚合物涂层的基底，并在臭氧清洗机中清洗以方便以下操作；
8)将步骤5)或者步骤6)得到的亲水性聚合物溶解在pH值为6.0缓冲液中；
9)将步骤7)得到的基底置于步骤8)得到的缓冲液中，室温下进行反应，将基底取出并清洗；
10)将特异性识别肿瘤细胞的抗体的缓冲液滴加到步骤9)得到的基底上，37℃孵育，使抗体充分吸收并固定在基底表面，得到用于全血循环肿瘤细胞富集和检测的所述生物涂层。
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