CN108624472A - 一种用于全血中循环肿瘤细胞富集和检测的二氧化硅纳米线阵列芯片及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用聚二甲基硅氧烷界面生长的二氧化硅纳米线阵列芯片实现对全血中循环肿瘤细胞的富集与检测。在有机相体系中，利用溶解性差异制得油包水型的微乳液，并将其组装在聚二甲基硅氧烷界面上，继而催化促进二氧化硅纳米线的原位生长，得到二氧化硅纳米线阵列芯片；然后将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在二氧化硅纳米线上，制备得到由表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的二氧化硅纳米线阵列芯片；将含有循环肿瘤细胞的待测全血样品滴加到该芯片的表面上，由所述的循环肿瘤细胞表面的特异性抗体与所述的纳米线结构的协同作用，特异性检测待测全血中的循环肿瘤细胞。

Description

一种用于全血中循环肿瘤细胞富集和检测的二氧化硅纳米线 阵列芯片及制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料和临床检测领域，具体涉及一种全血捕获癌细胞的二氧化硅纳米线阵列芯片及制备方法，特别涉及用于全血中循环肿瘤细胞富集和检测的二氧化硅纳米线阵列芯片及制备方法。
背景技术
肿瘤复发转移是导致死亡的主要原因。在外周血中检测循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells，CTCs)对解决复发转移监测、肿瘤分子特征等临床问题有重要的应用价值。循环肿瘤细胞(CTCs)是指因自发或诊疗操作由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。侵入循环系统的肿瘤细胞，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在适于自身存活和增殖的器官或组织形成转移灶。因此，循环肿瘤细胞(CTCs)检测对肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等临床问题有重要的应用价值。
随着生物纳米技术的深入发展，目前较为成熟的循环肿瘤细胞检测技术，主要依据循环肿瘤细胞(CTCs)物理性质(如大小尺寸)和基于抗体对其亲和性与识别的生物性质以及两者综合利用，包括免疫磁性分离技术、微流体技术、微过滤技术、密度梯度离心技术，以及将几种技术结合联合起来使用。但这些方法仍然存在着效率低，纯度低以及捕获时间长等缺点。虽然两种或三种方法的结合有可能成为较为理想的方法，但近十几年的研究进展不大。
目前中科院理化技术研究所王树涛研究员等开发了特异性识别、粘附肿瘤细胞的三维微纳米界面材料，利用微纳米尺度效应对固液界面上的粘附特性调控，结合特异性抗体和界面纳米结构，实现了肿瘤细胞的高灵敏的特异性捕获，并能够从全血样品中分离活的循环肿瘤细胞，提高了对于循环肿瘤细胞的捕获效率，得到了广泛关注。
我国在循环肿瘤细胞(CTCs)分离检测技术方面的研究尚处于萌芽阶段。循环肿瘤细胞(CTCs)检测是高度可重复的一种新型微创诊断手段，目前在临床上也得到了认可，有重要的临床应用价值。因此，开发新型的功能性生物医学材料，提高对循环肿瘤细胞的捕获效率，给循环肿瘤细胞(CTCs)的研究及临床应用提供了更多的信息，这是目前本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全血中捕获癌细胞的二氧化硅纳米线阵列芯片，克服血液检测中循环肿瘤细胞(CTCs)浓度很低、不易于检测的难点，同时提供一种生产成本低廉、简便快捷但高灵敏度、适于工业化批量生产的用于全血检测的特异性方法。
本发明的用于全血循环肿瘤细胞富集和检测的二氧化硅纳米线阵列芯片，其特征在于，所述二氧化硅纳米线阵列芯片包括：聚二甲基硅氧烷(PDMS)基底、在聚二甲基硅氧烷界面原位生长的二氧化硅(SiO2)纳米线阵列以及在所述二氧化硅(SiO2)纳米线阵列表面修饰有特异性识别肿瘤细胞的抗体(如Anti-EpCAM)；其中，所述特异性识别肿瘤细胞的抗体固定量不少于0.1μg/cm2。
根据本发明所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其中，所述特异性识别循环肿瘤细胞的抗体，包括但不限于：与肿瘤细胞表面EpCAM等特异性抗原结合的特异性抗体(Anti-EpCAM)；与白细胞表面共同抗原CD45结合的特异性抗体；对循环肿瘤细胞(CTCs)标志物，如鸟苷酸环化酶C，细胞角蛋白(CK18，CK19，CK20)，上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)进行特异性识别的抗体；对肿瘤组织标志物(如癌胚抗原CEA，前列腺特异抗原PSA，糖类抗原)进行特异性识别的抗体。
根据本发明所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其中，所述二氧化硅纳米线阵列的线直径是70-300nm，长度为0.3-20μm。
根据本发明所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其中，所述聚二甲基硅氧烷基底经过亲水化处理。
根据本发明所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其中，所述二氧化硅纳米线阵列是在氨水和正硅酸乙酯作用下，以微乳液滴为中心形成；所述微乳液滴为：在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、水和乙醇共混形成油包水型的微乳液。
本发明的上述二氧化硅纳米线阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20-300g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液；
(2)将聚二甲基硅氧烷进行亲水化处理；
(3)以步骤(2)处理后的聚二甲基硅氧烷为基底，吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水(质量浓度25％，20-400μL)和正硅酸乙酯(30-600μL)氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底；
(4)将特异性识别肿瘤细胞的抗体固定在步骤(3)制得的二氧化硅纳米线上。
根据本发明所述的制备方法，其中，步骤(1)所述正戊醇、水和乙醇的摩尔比为1：0.01-3：0.01-3。
根据本发明所述的制备方法，其中，步骤(2)所述亲水处理为表面等离子体处理。
根据本发明所述的制备方法，其中，步骤(4)所述将特异性识别肿瘤细胞的抗体固定在二氧化硅纳米线上的方法包括以下步骤：
(a)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5-30％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述体积浓度为5-30％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(b)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5-30mM的溶液，将步骤(a)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5-30mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(c)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10-50μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(b)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10-50μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(d)将特异性识别肿瘤细胞的抗体(循环肿瘤细胞表面的特异性抗体)用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10-50μg/mL，然后滴加到步骤(c)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体。
本发明还提供了上述二氧化硅纳米线芯片的应用，尤其是在全血中循环肿瘤细胞捕获中的应用。
本发明利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)界面生长的二氧化硅(SiO2)纳米线阵列芯片用于循环肿瘤细胞富集和检测。在有机相体系中，利用溶解性差异制得油包水型的微乳液，并将其组装在聚二甲基硅氧烷界面上，继而催化促进二氧化硅纳米线的原位生长，得到二氧化硅纳米线阵列芯片；然后将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在二氧化硅纳米线上，制备得到由表面固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体的二氧化硅纳米线阵列芯片；将含有循环肿瘤细胞的待测样品滴加到该芯片的表面上，由所述的循环肿瘤细胞表面的特异性抗体与所述的纳米线结构的协同作用，特异性捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。并在病人血液中达到较高的捕获效率，为临床应用提供了简便快捷的方法。
本发明利用特异性识别分子修饰的二氧化硅纳米线表面，对外周血中存在的循环肿瘤细胞(CTCs)进行特异性富集和分离。二氧化硅纳米线阵列芯片具有良好的生物相容性，可将捕获的循环肿瘤细胞(CTCs)用于进一步的无损伤培养和临床检测。
本发明的实现是利用循环肿瘤细胞(CTCs)表面的抗体的特异性，同时利用二氧化硅纳米线阵列的纳米结构与循环肿瘤细胞(CTCs)表面结构相匹配的性质，提高对靶向循环肿瘤细胞(CTCs)的高效以及特异性捕获。
本发明的利用全血捕获癌细胞的二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞(CTCs)的特异性捕获的方法，此方法(1)证明了特异性识别分子修饰的二氧化硅纳米线阵列表面可以实现循环肿瘤细胞(CTCs)的高效捕获；(2)特异性强，灵敏度高，可以捕获特异性肿瘤细胞，减少非特异性肿瘤细胞的粘附。
本发明的利用特异性识别分子修饰的二氧化硅纳米线阵列表面进行循环肿瘤细胞(CTCs)的特异性捕获的方法，实现了全血中靶向癌细胞的捕获。所述的方法可以明显提高循环肿瘤细胞(CTCs)的捕获效率，成本低廉，操作简单，可用于临床上对癌症的早期诊断和术后监测的要求。
附图说明
图1为本发明实施例1的对于循环肿瘤细胞的捕获的示意图。
图2为本发明实施例1的生物素化抗EpCAM抗体的修饰过程。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明进行进一步的说明，然而，本发明可以以不同形式进行体现，并不应理解成受限于文中所述实施方式。相反，提供这些实施方式可以使得本发明公开彻底而完整，并完整地将本发明的范围传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为0.3μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列表面微纳结构和特异性识别分子协同作用，进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:0.01:0.01；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为0.3μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)作为对照组1，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除前列腺癌细胞PC3悬浮液，将捕获了前列腺癌细胞PC3的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(10)作为对照组2，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴B细胞癌细胞Daudi，将捕获了人淋巴B细胞癌细胞Daudi的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(11)作为对照组3，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴癌细胞Jurkat，将捕获了人淋巴癌细胞Jurkat的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(12)作为对照组4，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除子宫癌细胞Hela，将捕获了子宫癌细胞Hela的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(13)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对MCF7细胞的捕获效率为85.6％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为82％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.02％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.02％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例2
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为1.5μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列表面微纳结构和特异性识别分子协同作用，进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，300g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:0.01:0.01；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为1.5μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体。
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)作为对照组1，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除前列腺癌细胞PC3悬浮液，将捕获了前列腺癌细胞PC3的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(10)作为对照组2，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴B细胞癌细胞Daudi，将捕获了人淋巴B细胞癌细胞Daudi的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(11)作为对照组3，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴癌细胞Jurkat，将捕获了人淋巴癌细胞Jurkat的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(12)作为对照组4，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除子宫癌细胞Hela，将捕获了子宫癌细胞Hela的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(13)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对MCF7细胞的捕获效率为87.6％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为80.5％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.02％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例3
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为10μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列表面微纳结构和特异性识别分子协同作用，进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:3:3；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为10μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)作为对照组1，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除前列腺癌细胞PC3悬浮液，将捕获了前列腺癌细胞PC3的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(10)作为对照组2，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴B细胞癌细胞Daudi，将捕获了人淋巴B细胞癌细胞Daudi的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(11)作为对照组3，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴癌细胞Jurkat，将捕获了人淋巴癌细胞Jurkat的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(12)作为对照组4，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除子宫癌细胞Hela，将捕获了子宫癌细胞Hela的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
(13)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对MCF7细胞的捕获效率为83.3％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为74.5％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.01％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例4
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为20μm；以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列表面微纳结构和特异性识别分子协同作用，进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，300g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:3:3；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为20μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)作为对照组1，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除前列腺癌细胞PC3悬浮液，将捕获了前列腺癌细胞PC3的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(10)作为对照组2，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴B细胞癌细胞Daudi，将捕获了人淋巴B细胞癌细胞Daudi的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(11)作为对照组3，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴癌细胞Jurkat，将捕获了人淋巴癌细胞Jurkat的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(12)作为对照组4，将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除子宫癌细胞Hela，将捕获了子宫癌细胞Hela的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(13)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对MCF7细胞的捕获效率为85％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为81.5％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.02％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获，并实现极低的非特异性吸附。
实施例5
本实施例所制备的平整二氧化硅芯片，以循环肿瘤细胞EpCAM特异性细胞和EpCAM非特异性细胞为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用平整二氧化硅芯片进行循环肿瘤细胞捕获的方法包括以下步骤：
(1)作为对照组，选用平整的二氧化硅基底；
(2)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅基底浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(3)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(2)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(4)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(3)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(5)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(4)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅基底的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(6)将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(7)作为对照组1，将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除前列腺癌细胞PC3悬浮液，将捕获了前列腺癌细胞PC3的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(8)作为对照组2，将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴B细胞癌细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴B细胞癌细胞Daudi，将捕获了人淋巴B细胞癌细胞Daudi的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)作为对照组3，将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的人淋巴癌细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除人淋巴癌细胞Jurkat，将捕获了人淋巴癌细胞Jurkat的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(10)作为对照组4，将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，加入3mL浓度为1×105个细胞/mL的子宫癌细胞Hela悬浮液，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除子宫癌细胞Hela，将捕获了子宫癌细胞Hela的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，2μg/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(11)实验结果表明，平整二氧化硅芯片对MCF7细胞的捕获效率为3.0％，前列腺癌细胞PC3细胞的捕获效率为3.0％，人淋巴B细胞癌细胞Daudi细胞的捕获效率为0.01％，人淋巴癌细胞Jurkat细胞的捕获效率为0.01％，子宫癌细胞Hela细胞的捕获效率为0.01％。这些数据表明该方法证明平整二氧化硅芯片无法实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
实施例6
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为0.3μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:0.01:0.01；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为0.3μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为0.3μm)正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratin PE和FITC anti-human CD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为5。这些结果表明本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对于全血中的循环肿瘤细胞具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例7
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为1.5μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，300g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:0.01:0.01；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为1.5μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为1.5μm)正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratin PE和FITC anti-human CD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为6。这些结果表明本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对于全血中的循环肿瘤细胞具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例8
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为10μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:3:3；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为10μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为10μm)正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratin PE和FITC anti-human CD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为6。这些结果表明本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对于全血中的循环肿瘤细胞具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例9
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为20μm；以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，300g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:3:3；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为20μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratin PE和FITC anti-human CD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为8。这些结果表明本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对于全血中的循环肿瘤细胞具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
实施例10
本实施例所制备的平整的二氧化硅芯片，以乳腺癌病人血液中乳腺癌细胞的捕获为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用平整的二氧化硅芯片进行循环肿瘤细胞捕获的方法包括以下步骤：
(1)作为对照组，选用平整的二氧化硅基底；
(2)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将平整的二氧化硅基底浸泡在上述浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(3)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(2)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(4)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(3)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(5)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(4)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到平整的二氧化硅基底的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(6)将步骤(5)得到的芯片正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL乳腺癌病人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将捕获了乳腺癌细胞MCF7的芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratinPE和FITC anti-human CD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(7)实验结果表明，本发明的平整二氧化硅芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为1。这些结果表明本发明的平整二氧化硅纳芯片无法实现对于全血中的循环肿瘤细胞高效特异性的捕获。
实施例11
本实施例所制备的二氧化硅纳米线阵列芯片的纳米线长度为20μm；以正常人血液中乳腺癌细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用二氧化硅纳米线阵列芯片进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP，20g/L)、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水、乙醇采用比例1:3:3；
(2)将PDMS基底进行亲水处理；
(3)将步骤(2)基底均匀吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底(优先选择的纳米线长度为20μm)；
(4)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述浓度为10％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(5)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5mM的溶液，将步骤(4)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(6)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(5)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(7)将循环肿瘤细胞表面的特异性抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10μg/mL，然后滴加到步骤(6)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体；
(8)将步骤(7)得到的芯片(优先选择的纳米线长度为20μm)正面朝上置于无菌六孔板中，置于芯片培养皿中，加入1mL正常人的血液，置于细胞培养箱中，优先进行反应的时间为45分钟。移除多余的血液，将芯片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4％的Triton-X100水溶液浸泡10分钟，加入200μg的阻断剂(5％羊血清，0.1％吐温20，3％牛血清蛋白磷酸缓冲液)，在室温下放置一小时。加入200μg荧光标记的抗体溶液(20μg/mL的起始浓度，抗体分别为anti-cytokeratinPE和FITC anti-humanCD45)，然后将基底在避光条件下4摄氏度保存12小时，加入磷酸缓冲液进行清洗3次。加入10μg/mL DAPI水溶液浸泡5分钟，加入磷酸缓冲液进行清洗3次，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的芯片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的芯片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率；
(9)实验结果表明，本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片应用于全血捕获癌细胞的捕获个数为0。这些结果表明本发明的二氧化硅纳米线阵列芯片对于全血中的循环肿瘤细胞具有高效灵敏的捕获性能和极低的非特异性吸附。临床实验结果显著。
当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于全血中循环肿瘤细胞富集和检测的二氧化硅纳米线阵列芯片，其特征在于，所述二氧化硅纳米线阵列芯片包括：以聚二甲基硅氧烷为基底、在聚二甲基硅氧烷界面原位生长的二氧化硅纳米线阵列，以及在所述二氧化硅纳米线阵列表面修饰有特异性识别肿瘤细胞的抗体。
2.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其特征在于，所述二氧化硅纳米线阵列的线直径是70-300nm，长度为0.3-20μm。
3.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其特征在于，所述特异性识别肿瘤细胞的抗体，包括：与肿瘤细胞表面EpCAM特异性抗原结合的特异性抗体，与白细胞表面共同抗原CD45结合的特异性抗体，对循环肿瘤细胞标志物进行特异性识别的抗体，或者对肿瘤组织标志物进行特异性识别的抗体。
4.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米线阵列芯片，其特征在于，所述特异性识别肿瘤细胞的抗体在二氧化硅纳米线上固定量不少于0.1μg/cm2。
5.一种权利要求1-4任一所述二氧化硅纳米线阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)在正戊醇体系中，将聚乙烯吡咯烷酮、水和乙醇共混搅拌形成油包水型的微乳液，其中正戊醇、水和乙醇的摩尔比为1：0.01-3：0.01-3；
(2)将聚二甲基硅氧烷进行亲水化处理；
(3)以步骤(2)处理后的聚二甲基硅氧烷为基底，吸附步骤(1)制备得到的微乳液，在室温下，将其置于氨水和正硅酸乙酯氛围下催化制得二氧化硅纳米线阵列基底；
(4)将特异性识别肿瘤细胞的抗体固定在步骤(3)制得的二氧化硅纳米线上。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述将特异性识别肿瘤细胞的抗体固定在二氧化硅纳米线上的方法包括以下步骤：
(a)将(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷与乙醇按体积比混合配制成浓度为5-30％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液；室温下，将二氧化硅纳米线阵列基片浸泡在上述体积浓度为5-30％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，室温下放置；取出基片，分别用乙醇和二甲基亚砜润洗，吹干；
(b)用二甲基亚砜将N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺配制成浓度为5-30mM的溶液，将步骤(a)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为5-30mM的N-(4-马来酰亚胺丁酰基)琥珀酰亚胺的溶液中，室温下放置；取出基片，分别用二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液润洗，吹干；
(c)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液稀释为浓度为10-50μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(b)吹干后得到的基片浸泡在上述浓度为10-50μg/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置；取出基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
(d)将特异性识别肿瘤细胞的抗体用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10-50μg/mL，然后滴加到步骤(c)用磷酸盐缓冲液洗涤后得到的基片的表面上，室温下放置，得到二氧化硅纳米线阵列基片的表面上固定有循环肿瘤细胞表面的特异性抗体。
7.权利要求1-4任一项所述二氧化硅纳米线芯片在全血中循环肿瘤细胞捕获中的应用。
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