CN113576541A - 一种泪液中囊泡的捕获方法及隐形眼镜捕获芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泪液中囊泡的捕获方法，包括下述步骤：S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。本发明可以不用进行泪液的收集工作，直接捕获囊泡进行研究；由于是可以戴入式的，戴入时间较长，所以捕获的样本更具有病患眼睛状况的代表性，采集导致的误差较小。
Description
技术领域
本发明涉及一种泪液中囊泡的捕获方法及隐形眼镜捕获芯片，用于捕获泪液中的囊泡。
背景技术
目前关于眼泪指征疾病状况的研究少之又少，文献表明眼泪中带有的外泌体可以反映眼睛疾病状况，相比于正常人来说，眼病患者泪液中外泌体表达，以及外泌体上带有的蛋白存在着差异，目前只有少数几种眼病的泪液外泌体研究，但是泪液来源的外泌体(来自原发性干燥综合征、原发性开角型青光眼和多发性硬化症的患者)提供了无创诊断潜力或疾病活性的生物标志物。关于眼病的可以检测的靶蛋白也研究的很少，归结原因，是病患本身的泪液存在难以收集，收集量过少，不足以用于后续的研究。
目前临床上比较常见的泪液的收集方案是：
方案一：干眼病检测——滤纸试验。临床上采用的滤纸条根据泪液湿润的长度，来判断是否患有干眼病，也有研究是通过滤纸条收集的泪液分离所需的目标物进行研究。
方案二：微量液体采集器1-2ul样本。目前已有专用的微量采集器可以收集泪液进行后续的泪液检测或研究。
以上方案存在的几点不足如下：
收集眼泪的途径是需要短暂刺激眼睛从而分泌的，并且收集的量也是微乎其微的。同样可能量不足够用于外泌体的研究；收集了少量的泪液如果用于后续的外泌体研究，还需要将收集的泪液进行外泌体的分离，外泌体的分离过程比较复杂复杂，极易造成外泌体的损失。目前常用的外泌体的分离采用了几种方法:超速离心法、ExoQuickTM提取试剂盒、蔗糖密度梯度超离心和免疫亲和沉淀。这些方法有一定的局限性，如产率低、纯度低等。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种泪液中囊泡的捕获方法，可以不用进行泪液的收集工作，直接捕获囊泡进行研究；由于是可以戴入式的，戴入时间较长，所以捕获的样本更具有病患眼睛状况的代表性，采集导致的误差较小。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种泪液中囊泡的捕获方法，包括下述步骤：
S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；
S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；
S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。
目前关于表面修饰抗体的方案较多，部分捕获CTC的专利有提供修饰方案，如专利201910048076.4，或者已有的CELL COLLECTOR产品中的修饰方案，只需将抗体换成捕获囊泡的捕获抗体CD63或者CD63适配体，在临床应用前可对捕获抗体或者适配体的浓度进行优化。
将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面具体采用下述方法：首先通过过氧等离子活化隐形眼镜表面PDMS分子中的硅氧键，使其活化成[HO-Si]，进一步与无水乙醇中的三甲氧基硅烷(MPTS)分子末端的[-OH]反应，从而连接上一个[-SH]基团。再进一步与4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)中的马来酰亚胺基反应，从而在隐形眼镜表面连接琥珀酰亚胺键，以便与链霉亲和素分子中的氨基连接，最终将链霉亲和素修饰在芯片表面，带有生物素的抗体或者适配体可以通过“链霉亲和素——生物素”桥联反应修饰在隐形眼镜的表面。
前述的一种泪液中囊泡的捕获方法中，所述步骤S100还包括下述方法：
S110：芯片硅氧基活化：将载玻片与PDMS薄膜置入等离子清洗机中，通入氧气开紫外，活化硅氧基；
S120：芯片修饰。
前述的一种泪液中囊泡的捕获方法中，所述步骤S120包括下述方法：
S121：将经过键合的芯片置于用无水乙醇配制的4％-4.75％三甲氧基硅烷(MPTS)中浸泡1小时；
S122：用无水乙醇冲洗芯片，然后置于100℃烘箱中1h；
S123：待芯片降温至室温时，用无水乙醇配制的0.5mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)浸泡芯片，置于室温下30min；
S124：用超纯水冲洗芯片，然后用PBS冲洗芯片；
S125：将由PBS配制的15-20μg/mL链霉亲和素浸泡芯片，室温1h或置入4℃过夜；
S126：用PBS冲洗芯片，加入含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)与0.1％NaN3的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)配制的20μg/mL生物素化的捕获抗体CD63或者10μM CD63适配体浸泡芯片，置于室温1h或置于4℃过夜。
一种隐形眼镜捕获芯片，用于捕获泪液中的囊泡，包括隐形眼镜本体，隐形眼镜的表面修饰有具有囊泡捕获功能的捕获抗体。
前述的一种隐形眼镜捕获芯片中，所述隐形眼镜本体的生产材料中含有聚二甲基硅氧烷。
与现有技术相比，本发明可以不用进行泪液的收集工作，直接捕获囊泡进行研究；由于是可以戴入式的，戴入时间较长，所以捕获的样本更具有病患眼睛状况的代表性，采集导致的误差较小。目前，通过滤纸试验或者微量液体采集器其实质均是采集泪液，然而泪液中的含量较少，一般1-2ul泪液中含有囊泡的数量是15-35个，但是采用本方法及芯片只需要佩戴24小时，可以采集600个以上囊泡，为后期检测输出准确结果提供基础。
眼病诊断泪液研究相对较少，但是泪液中的囊泡又存在一定的研究前景，本发明研究的可戴入式的隐形眼镜可直接以捕获收集泪液中的囊泡，与其他技术相结合用于后续的研究。比如准确评估囊泡的物理化学特征，如大小、形状和密度，对于探索这些囊泡的生物学相互作用至关重要。蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、动态光散射(DLS)、荧光检测、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、原子力显微镜(AFM)、和透射电子显微镜(TEM)是外泌体表征的常用技术。Western blotting和ELISA用于泡内或膜蛋白标记物的鉴定，而RT-qPCR用于外泌体相关RNA的检测。NTA、AFM和TEM已经被用来确定外泌体的大小、密度、形态和组成。最近，一种新的技术，可调电阻脉冲传感(TRPS)，已被用于测量外泌体的大小分布和浓度。采用本发明的技术方案获取的采集样本与现有的这些技术的结合，可以填补目前泪液活检的研究空白。
附图说明
图1是隐形眼镜修饰抗体及捕获囊泡的原理图；
图2是隐形捕获眼镜表面修饰捕获抗体的示意图。
图3是隐形捕获眼镜表面修饰捕获适配体的示意图；
图4是TEM表征的外泌体形态；
图5是外泌体表面的CD63表达情况；
图6是显微镜下同样曝光时间的对照抗体以及CD9染色抗体的染色效果；
图7是对照抗体以及CD9染色抗体的荧光值。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
由图4-图7可知：体外的相应表征：选用A375细胞提取的外泌体进行相应的体外验证，使用的外泌体的相应表征数据如下，图4是TEM表征的外泌体形态，图5是外泌体表面的CD63表达情况将修饰了捕获抗体的聚二甲基硅氧烷的薄膜与外泌体共孵育一段时间后，加入表征的抗体，在荧光显微镜下观察荧光抗体的表征效果如下：图6是显微镜下同样曝光时间的对照抗体以及CD9染色抗体的染色效果，图7是对应的荧光值。表明了修饰有捕获抗体的聚二甲基硅氧烷的薄膜捕获EV的可行性
实施例1：一种泪液中囊泡的捕获方法，包括下述步骤：
S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；
所述步骤S100具体的包括下述方法：
S110：芯片硅氧基活化：将载玻片与PDMS薄膜置入等离子清洗机中，通入氧气开紫外，活化硅氧基；
S120：芯片修饰：S121：将经过键合的芯片置于用无水乙醇配制的4％三甲氧基硅烷中浸泡1小时；
S122：用无水乙醇冲洗芯片，然后置于100℃烘箱中1h；
S123：待芯片降温至室温时，用无水乙醇配制的0.5mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯浸泡芯片，置于室温下30min；
S124：用超纯水冲洗芯片，然后用PBS冲洗芯片；
S125：将由PBS配制的15μg/mL链霉亲和素浸泡芯片，室温1h；
S126：用PBS冲洗芯片，加入含有0.2％BSA与0.1％NaN3的磷酸盐缓冲盐溶液配制的20μg/mL生物素化的捕获抗体CD63或者10μM CD63适配体浸泡芯片，置于室温1h。
S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；表面修饰有捕获囊泡的捕获抗体，可在病人或者正常的人戴隐形眼镜的这段时间里，对于泪液中存在的囊泡进行捕获；
S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。当戴入几个小时后，取出，放入专用的储存盒里，置入冰箱4度保存，这是泪液囊泡样本的收集过程。受试群体可以灵活选择采集时间，并在有效时间内回收样本，即可进行泪液囊泡的研究。
实施例2：一种泪液中囊泡的捕获方法，包括下述步骤：
S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；
所述步骤S100具体的包括下述方法：
S110：芯片硅氧基活化：将载玻片与PDMS薄膜置入等离子清洗机中，通入氧气开紫外，活化硅氧基；
S120：芯片修饰：S121：将经过键合的芯片置于用无水乙醇配制的4.75％三甲氧基硅烷中浸泡1小时；
S122：用无水乙醇冲洗芯片，然后置于100℃烘箱中1h；
S123：待芯片降温至室温时，用无水乙醇配制的0.5mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯浸泡芯片，置于室温下30min；
S124：用超纯水冲洗芯片，然后用PBS冲洗芯片；
S125：将由PBS配制的20μg/mL链霉亲和素浸泡芯片，置入4℃过夜；
S126：用PBS冲洗芯片，加入含有0.2％BSA与0.1％NaN3的磷酸盐缓冲盐溶液配制的20μg/mL生物素化的捕获抗体CD63或者10μM CD63适配体浸泡芯片，置于4℃过夜。
S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；表面修饰有捕获囊泡的捕获抗体，可在病人或者正常的人戴隐形眼镜的这段时间里，对于泪液中存在的囊泡进行捕获；
S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。当戴入几个小时后，取出，放入专用的储存盒里，置入冰箱4度保存，这是泪液囊泡样本的收集过程。受试群体可以灵活选择采集时间，并在有效时间内回收样本，即可进行泪液囊泡的研究。
实施例3：一种泪液中囊泡的捕获方法，包括下述步骤：
S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；
所述步骤S100具体的包括下述方法：
S110：芯片硅氧基活化：将载玻片与PDMS薄膜置入等离子清洗机中，通入氧气开紫外，活化硅氧基；
S120：芯片修饰：S121：将经过键合的芯片置于用无水乙醇配制的4.35％三甲氧基硅烷中浸泡1小时；
S122：用无水乙醇冲洗芯片，然后置于100℃烘箱中1h；
S123：待芯片降温至室温时，用无水乙醇配制的0.5mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯浸泡芯片，置于室温下30min；
S124：用超纯水冲洗芯片，然后用PBS冲洗芯片；
S125：将由PBS配制的17μg/mL链霉亲和素浸泡芯片，置入4℃过夜；
S126：用PBS冲洗芯片，加入含有0.2％BSA与0.1％NaN3的磷酸盐缓冲盐溶液配制的20μg/mL生物素化的捕获抗体CD63或者10μM CD63适配体浸泡芯片，置于室温1h或置于4℃过夜。
S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；表面修饰有捕获囊泡的捕获抗体，可在病人或者正常的人戴隐形眼镜的这段时间里，对于泪液中存在的囊泡进行捕获；
S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。当戴入几个小时后，取出，放入专用的储存盒里，置入冰箱4度保存，这是泪液囊泡样本的收集过程。受试群体可以灵活选择采集时间，并在有效时间内回收样本，即可进行泪液囊泡的研究。
经检测，实施例1中隐形眼镜捕获泪液囊泡621个，实施例2中隐形眼镜捕获泪液囊泡612个，实施例3中隐形眼镜捕获泪液囊泡637个.
一种隐形眼镜捕获芯片，用于捕获泪液中的囊泡，包括隐形眼镜本体，隐形眼镜的表面修饰有具有囊泡捕获功能的捕获抗体。所述隐形眼镜本体的生产材料中含有聚二甲基硅氧烷。
Claims (5)
1.一种泪液中囊泡的捕获方法，其特征在于，包括下述步骤：
S100：将具有囊泡捕获功能的捕获抗体修饰在隐形眼镜的表面；
S200：将经过修饰的隐形眼镜佩戴在用户的眼部；
S300：用户佩戴指定时间后，取出隐形眼镜，对隐形眼镜上的囊泡进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种泪液中囊泡的捕获方法，其特征在于，所述步骤S100还包括下述方法：
S110：芯片硅氧基活化：将载玻片与PDMS薄膜置入等离子清洗机中，通入氧气开紫外，活化硅氧基；
S120：芯片修饰。
3.根据权利要求2所述的一种泪液中囊泡的捕获方法，其特征在于，所述步骤S120包括下述方法：
S121：将经过键合的芯片置于用无水乙醇配制的4％-4.75％三甲氧基硅烷中浸泡1小时；
S122：用无水乙醇冲洗芯片，然后置于100℃烘箱中1h；
S123：待芯片降温至室温时，用无水乙醇配制的0.5mg/mL的4-马来酰亚胺基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯浸泡芯片，置于室温下30min；
S124：用超纯水冲洗芯片，然后用PBS冲洗芯片；
S125：将由PBS配制的15-20μg/mL链霉亲和素浸泡芯片，室温1h或置入4℃过夜；
S126：用PBS冲洗芯片，加入含有0.2％BSA与0.1％NaN3的磷酸盐缓冲盐溶液配制的20μg/mL生物素化的捕获抗体CD63或者10μM CD63适配体浸泡芯片，置于室温1h或置于4℃过夜。
4.一种隐形眼镜捕获芯片，用于捕获泪液中的囊泡，其特征在于，包括隐形眼镜本体，隐形眼镜的表面修饰有具有囊泡捕获功能的捕获抗体。
5.根据权利要求4所述的一种隐形眼镜捕获芯片，其特征在于，所述隐形眼镜本体的生产材料中含有聚二甲基硅氧烷。
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