CN112724823A - 一类多肽聚合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类多肽聚合物的用途,用于制备抵制生物污染的材料或用于制备抵制异物反应的材料,所述多肽聚合物的结构如说明书和权利要求书所述。本发明的多肽聚合物,能够抵制多种蛋白吸附、血小板粘附,抵制血清血浆污染、长时间抵制细胞粘附与各类微生物粘附,作为植入材料可以抵制异物反应,显示出非常优异的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一类多肽聚合物的用途。
背景技术
植入体内的生物材料和生物器械已经广泛应用于假体和组织工程中,从而实现药物递送,帮助机体组织实现功能等。然而人体的免疫系统会识别这些植入材料,从而通过致密的胶原包裹来隔离这些外来物,导致植入材料失去功能,甚至导致组织变形。这些胶原包裹层的形成是自然界哺乳动物保护机制所采取的体外反应的结果,而导致体外反应的根本原因是蛋白的非特异性吸附。由于巨噬细胞会识别非特异性蛋白吸附的靶点,将其认定为外来物,故而尝试吞噬和消化它们。但大多数的植入物体积大,巨噬细胞无法消化它们,结果形成异物巨细胞。这些巨细胞分泌各种细胞因子引导成纤维细胞在植入物表面沉积成一层致密、无血管的胶原层,最终永久性的将植入物与机体隔离开来。这种体外反应在几乎所用类型的材料植入后都会发生,包括特氟龙、聚脲、硅胶、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、涤纶、金、钛、铝等等。而这些材料涵盖的不同的亲疏水性、不同的软硬程度、和不同的材质,已经广泛用在生物医用材料研究的各个领域。因为非特异性蛋白吸附是发生体外反应的第一步,所以我们认为抵制非特异性蛋白吸附则可以实现抵制异物反应,也就是说,低异物反应是低蛋白吸附的结果。
另一方面,固--液界面蛋白质吸附的研究在生物医学领域具有极其重要的意义,如生物传感器、生物芯片和心血管植入生物医用材料方面等。在生物医用材料领域,蛋白质的吸附是植入机体内的材料与组织作用的第一步,在材料植入后数秒内,蛋白质就会竞相吸附在材料表面,形成一层的蛋白质吸附层,然后机体细胞通过表面受体与吸附蛋白质相互识别,引起后续反应,如与血小板(在血液中)、骨母细胞、白细胞或淋巴细胞(在血液和组织液中)等发生作用,引起机体炎症反应、异体反应、骨发生、凝血和血栓等,并最终决定移植手术的成败。血液中的某些蛋白,如纤维蛋白原,对血小板的吸附和聚合过程有非常重要的作用。对于医用植入材料和体内的传感器来说,表面对来自于复杂体系蛋白吸附和细胞粘附的抵抗性对于避免生命系统对医用植入材料的不良反应是非常必要的。因而,将表面进行修饰从而降低材料对血液相关蛋白的反应成为医用植入材料的一个必然要求。此外,改善材料的生物相容性是急需解决的问题。因此,对抗蛋白吸附材料的研究是生物医用材料、生化分析检测、生物化工、海洋防污等领域的重要课题。
通常减小蛋白吸附的策略是在表面涂覆亲水聚合物,而亲水的特性减弱蛋白和疏水性表面的非极性作用。此外,这些聚合物也通过表面水化层和空间位阻效应来抵制蛋白吸附,从而增加循环时间。当前研究者们已经报道不同的防污聚合物和应用,但目前的防污材料有不同程度的缺陷,如达不到较低的防污性能、生物相容性不好、对环境敏感、只能防止蛋白吸附不能有效抑制细菌生长、稳定性差不能长时间使用等。PEG具有较好的抵制生物污染的功能,曾被认为是防污染聚合物的黄金标准,在诸多领域有广泛的应用。但PEG容易被氧化,且具有较强的异物反应,因此迫切需要开发新型聚合物来替代PEG。
发明内容
本发明的目的在于提供一类多肽聚合物的应用。
本发明提供一类多肽聚合物的用途,所述多肽聚合物由以下结构单元组成:-(NH-(CHR)m-CO)n-,
式中,m为1、2或3;
各R独立地为H、C1-C4烷基、羟基、羟基取代的C1-C4烷基,且至少一个R为羟基或羟基取代的C1-C4烷基;
n为5~300的整数,
所述用途为用于抵制生物污染;
用于抵制异物反应;
用作蛋白保护剂;
用于制备抵制生物污染的材料;
用于制备抵制异物反应的材料;或
用于制备保护蛋白的材料。
在另一优选例中,所述多肽聚合物的结构通式为:
R1(-NH-(CHR)m-CO-)nR2
R1、R2为两侧侧基,没有特别的限制,可以为化学上可接受的任何基团,优先地各自独立地为H、C1-C6烷基、羟基、氨基、羧基、醛基、C2-C6烯基、巯基、叠氮、C2-C6炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、或包含带有马来酰亚胺、生物素、金刚烷、环糊精、多巴(DOPA)等结构;
R、m、n的定义同前所述。
在另一优选例中,所述多肽聚合物用于制备生物医用材料,较佳地用于制备植入材料,如药物释放载体、组织工程支架。
在另一优选例中,所述多肽聚合物用于抵制多种蛋白吸附。
在另一优选例中,所述多肽聚合物由纯手性单体聚合得到(S型或R型)或由不同手性单体混聚得到,优选混旋多肽聚合物。
在另一优选例中,采用所述多肽聚合物修饰需要抵制生物污染或需要抵制异物反应的材料表面,或采用所述多肽聚合物制成有此需要的材料。
在另一优选例中,所述蛋白保护是指提高蛋白在高温(70度以上)环境下的稳定性,提高蛋白在冻融条件下的稳定性,或提高蛋白的生物活性。
在另一优选例中,所述材料包括基片,以及所述基片层上的多肽聚合物层。
在另一优选例中,所述材料为表面修饰材料,包括基片,以及所述基片层上的多肽聚合物层。
在另一优选例中,通过合成不同侧链羟基化多肽聚合物,在表面上先修饰一层与聚合物端基能够反应的相应官能团,从而实现将这类聚合物接枝到表面上。
在另一优选例中,多肽聚合物层主体结构是侧链羟基化的多肽聚合物。
在另一优选例中,所述表面修饰材料采用以下步骤制备:
(1)合成末端官能化的多肽聚合物;
(2)基片的清洗与预处理;
(3)基片表面官能化(基片具有与聚合物末端官能团有反应活性的基团);
(4)多肽聚合物接枝在基片表面。
在另一优选例中,所述的基片包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯(PU)、聚醚醚酮(PEEK)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等高分子材料,包括金、银、钛、合金等金属材料以及玻璃、陶瓷、硅、二氧化钛、羟基磷灰石等无机材料。
在另一优选例中,所述的基片清洗与预处理包括超声清洗,酸碱溶液清洗、紫外臭氧(紫外臭氧)清洗、等离子体清洗(plasma)等,根据不同基材采用其中一种或多种清洗方式配合。
在另一优选例中,所述的基片表面官能化为硅烷化(3-氨丙基二乙氧基硅烷,3-三甲氧基硅烷丙烯酸丙脂)处理或聚多巴胺处理。
在另一优选例中,如果(1)所述的聚合物末端官能团可以和某些特定基材表面直接反应,则不需表面官能化,直接跳过步骤(3);而有些基团的表面官能化则需多步。
在另一优选例中,所述的聚合物接枝在基片表面,包括聚合物溶液滴加在基片表面上或基片浸没在聚合物溶液中。聚合物浓度、环境温度和反应时间由不同官能化的聚合物和不同基片所决定。
在另一优选例中,所述材料为多肽聚合物三维水凝胶材料。
在另一优选例中,用所述多肽聚合物水凝胶进行表面改性,从而实现抵制蛋白、细胞、微生物、血小板等的非特异性吸附或粘附。包括各类生物材料表界面的防污染功能、芯片开发、医学检测和诊断、海洋防污、膜材料的改性等领域。
在另一优选例中,用所述多肽聚合物水凝胶进行表面改性,实现低免疫原性。
在另一优选例中,所述三维水凝胶材料的制备包括以下步骤:
(1)多肽聚合物的合成;
(2)制备多肽水凝胶。
在另一优选例中,步骤(1)所述多肽聚合物包括主链包括α、β、γ或其两两或三者共混骨架,侧链羟基官能化;聚合物包括链状聚合物和体型聚合物,包括单官能团修饰和多官能团修饰,优选多官能团修饰。
在另一优选例中,所述生物污染为蛋白质吸附、血清污染、血浆污染、血小板粘附、细胞粘附或微生物粘附。
在另一优选例中,所述蛋白质为:疏水性蛋白(如纤维蛋白原)、亲水性蛋白(白蛋白);带有正电性蛋白(如溶菌酶)和负电性蛋白(胃蛋白酶),包括经过改性的蛋白(辣根过氧化物酶修饰的免疫球蛋白)。
在另一优选例中,所述血清或血浆为血清或血浆的缓冲盐溶液形式,或是纯血清或纯血浆。在另一优选例中,血清或血浆的缓冲盐溶液形式为10wt%的血清或血浆的缓冲盐溶液形式。
在另一优选例中,所述细胞选自:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、成纤维细胞(NIH3T3)、平滑肌细胞(SMC)等。
在另一优选例中,所述多肽聚合物抵制细胞粘附时间至少3天。
在另一优选例中,所述微生物选自:革兰氏阳性菌(葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等)、革兰氏阴性菌(铜绿假胞杆菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等)及真菌(白色念珠菌、新型隐球菌等)。
在另一优选例中,所述多肽聚合物抵制微生物粘附时间至少7天。
在另一优选例中,所述抵制生物污染的材料或防止异物反应的材料为导管、血袋、隐形眼镜或植入假体。
本发明提供的多肽聚合物的用途,还用于药物修饰与递送、油水分离、维持干细胞干性、芯片涂层、海洋防污、医疗诊断和检测、各类生物医用材料植入体、医疗器械表面涂层。
本发明还提供一种抵制生物污染的方法,采用所述多肽聚合物修饰有此需要的材料表面或采用所述多肽聚合物制成有此需要的材料。
本发明还提供一种抵制异物反应的方法,采用所述多肽聚合物修饰有此需要的材料表面或采用所述多肽聚合物制成有此需要的材料。
本发明还提供一种保护蛋白质的方法,向需要保护的蛋白质中加入所述多肽聚合物。
本发明是基于一类全新的多肽聚合物材料,由于多肽聚合物具有优异的生物相容性,且以酰胺键为骨架结构,具有高亲水性,与侧链羟基共同形成水化作用来提高防污性能;另外聚合物的电中性帮助减弱带电荷的蛋白与表面的静电作用,从而能够达到能更好的性能,从而实现在不同pH条件下均可保持功能。
本发明发现多肽聚合物材料可以抵制多种蛋白吸附、抵制血小板粘附,抵制血清污染、抵制血浆污染、长时间抵制细胞粘附与各类微生物粘附,作为植入材料可以抵制异物反应,显示出非常优异的生物相容性。因此,本发明在生物材料和其他可替代聚乙二醇(PEG)功能的领域有着广泛应用。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征,可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为PDMS表面修饰示意图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究,发现多肽聚合物制备成表面涂层或水凝胶,能够抵制生物污染或抵制异物反应;这类多肽聚合物同样能用于蛋白保护。在此基础上,完成了本发明。
多肽聚合物
本发明所述多肽聚合物由以下结构单元组成:-(NH-(CHR)m-CO)n-,
式中,m为1、2或3;
各R独立地为H、C1-C4烷基、羟基、羟基取代的C1-C4烷基,且至少一个R为羟基或羟基取代的C1-C4烷基;
n为5~300的整数。
在另一优选例中,所述多肽聚合物的结构通式为:
R1(-NH-(CHR)m-CO-)nR2
R1、R2为两侧侧基,没有特别的限制,可以为化学上可接受的任何基团,优先地各自独立地为H、C1-C6烷基、羟基、氨基、羧基、醛基、C2-C6烯基、巯基、叠氮、C2-C6炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、或包含带有马来酰亚胺、生物素、金刚烷、环糊精、多巴(DOPA)等结构;
R、m、n的定义同前所述。
在另一优选例中,R1、R2为两侧侧基,各自独立地为H、C1-C4烷基、羟基、氨基、羧基、醛基、C2-C4烯基、叠氮、C2-C4炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、巯基、或包含带有马来酰亚胺、生物素、金刚烷、环糊精、多巴(DOPA)等结构。
在另一优选例中,对于表面修饰,优选地,n=40~100最佳。
在另一优选例中,对于形成三维水凝胶材料,优选地,n=10最佳。
制备方法
当m=0时,主体为α-多肽聚合物,有两种合成方法:
方法1):通过基于叔丁基保护的丝氨酸的N-羧基环内酸酐(NCA)聚合(Tooney,N.M.;Fasman,G.D.,Synthesis of poly-O-tert-butyl-L-serine and poly-L-serine.Biopolymers 1968,6(1),81-96.),单体可以是S型与R型的任意比例,引发剂为带有功能基团的伯胺类化合物。
聚合反应方程式如下所示:
其中R为端基功能基团,为H、C1-C4烷基、羟基、氨基、羧基、醛基、C2-C4烯基、叠氮、C2-C4炔基、邻二硫吡啶基(OPSS)、巯基、或包含带有马来酰亚胺、生物素、金刚烷、环糊精、多巴(DOPA)等结构;
反应步骤(1)为聚合:在手套箱中称取NCA单体溶解在溶剂中,放入磁力搅拌子,在搅拌下加入伯胺的引发剂,所用溶剂可以是硝基苯、苯、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺的任意一种,优选N,N-二甲基甲酰胺;反应温度为20~60℃,优选25℃;反应浓度为0.05~1M,优选0.2M;反应时间为1~7天,优选3天。反应完毕后加入过量石油醚将反应生成的聚合物沉淀出来,收集得到的聚合物带有叔丁基保护。
反应步骤(2)为脱叔丁基保护,将上一步的聚合物溶解在脱保护试剂中震荡反应,反应结束后加入过量乙醚,收集析出的目标聚合物。脱保护试剂可以选用三氟乙酸、溴化氢醋酸溶液或浓盐酸甲醇溶液等,优选无水三氟乙酸;脱保护温度为0~30℃,优选25℃,脱保护时间为1~16小时,优选2h。
方法2):步骤(1)通过基于叔丁基保护的丝氨酸的N-氨基甲酸苯酯(Ser(tBu)-UD)聚合。(Z.Yang,Z.Mao,J.Ling,Phosgene-free synthesis of non-ionic hydrophilicpolyserine.Polymer Chemistry 7,519-522(2016).)
R的定义同上。
称取丝氨酸衍生物urethane derivatives of O-tert-butyl-Serine(Ser(tBu)-UD)溶解在溶剂中,放入磁力搅拌子,在搅拌下加入伯胺的引发剂,所用溶剂可以是硝基苯、苯、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或N,N-二甲基乙酰胺的任意一种,优选N,N-二甲基乙酰胺;反应温度为50~100℃,优选80℃;反应浓度为0.05~2M,优选1M;在氮气保护下反应1~3天,优选2天。反应完毕后加入过量乙醚将反应生成的聚合物沉淀出来,收集得到的聚合物带有叔丁基保护。
反应步骤(2)为脱叔丁基保护,将上一步的聚合物溶解在脱保护试剂中震荡反应,反应结束后加入过量乙醚,收集析出的目标聚合物。脱保护试剂可以选用三氟乙酸、溴化氢醋酸溶液或浓盐酸甲醇溶液等,优选无水三氟乙酸;脱保护温度为0~30℃,优选25℃,脱保护时间为1~16小时,优选2h。
当m=1时,主体为β-多肽聚合物,合成方法可通过β-内酰胺开环聚合(Zhang,J.;Kissounko,D.A.;Lee,S.E.;Gellman,S.H.;Stahl,S.S.,Access to Poly-beta-Peptideswith Functionalized Side Chains and End Groups via Controlled Ring-OpeningPolymerization of beta-Lactams.Journal of the American Chemical Society 2009,131(4),1589-1597.),单体可以是S型与R型的任意比例,侧链取代位点可以有两种情况,一个是酰胺键碳的邻位即α位,另一个是N原子的邻位即酰胺键的β位。引发剂为带有功能基团与亲电离去基团的化合物,例如酰氯、酸酐或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯等。
反应方程式如下所示:
其中R为端基功能基团,定义同上,X为酰卤、酸酐或NHS活性酯等多种活性脂,优选NHS活性酯;R’为羟基保护基,可以是苄基、叔丁基或三苯甲基、硅醚,优选三苯甲基;
反应步骤(1)为聚合,首先将β-内酰胺单体和引发剂R-X溶解在溶剂中,随后在快速搅拌下加入不具有亲核性的强碱作为拔氢试剂,本发明采用双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS),当量为引发剂的2~3当量,优选2.5当量;溶剂可以选择四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺,优选四氢呋喃;反应浓度为0.05~0.5M,优选0.2M;温度为-20~60℃,优选25℃;步骤(2)为脱三苯甲基保护,可以才用甲酸乙醚、三氟乙酸或钯碳氢解等方式,优选三氟乙酸作为脱保护试剂,加入3当量的三乙基硅烷促进脱保护进行;脱保护温度为0~30℃,优选25℃,脱保护时间为1~16小时,优选2h。聚合物沉淀收集和脱保护方法与上述NCA聚合物处理方法一致。
应用
本发明的多肽聚合物用来修饰基片表面,基片表面具有与聚合物对应的官能团,例如两者分别是巯基-烯、叠氮-炔等,也包括聚多巴胺修饰的表面。如果多肽聚合物端基官能团可以和某些特定基材表面直接反应,则不需表面官能化,例如多巴-二氧化钛,巯基-金等;将基片浸没在与之对应的聚合物溶液体系中,通过足够的反应时间,得到表面修饰聚合物的基片,通过乙醇、水交替清洗,氮气吹干得到产品。
本发明得到的基片修饰产品在蛋白吸附测试中展示出抵制多种蛋白吸附,包括疏水性蛋白(如纤维蛋白原)和亲水性蛋白(白蛋白)、带有正电性蛋白(如溶菌酶)和负电性蛋白(胃蛋白酶)、包括经过改性的蛋白(辣根过氧化物酶修饰的免疫球蛋白)。
本发明得到的基片修饰产品在细胞粘附测试中展示出抵制多种细胞粘附,包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、成纤维细胞(NIH 3T3)、平滑肌细胞(SMC)等,抵制细胞粘附时间至少3天;
本发明得到的基片修饰产品在微生物粘附测试中展示出抵制多种微生物粘附,包括革兰氏阳性菌(葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等)、革兰氏阴性菌(铜绿假胞杆菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等)及真菌(白色念珠菌、新型隐球菌等),抵制微生物粘附时间至少7天;
本发明得到的基片修饰产品可以抵制血清和血浆的污染,血清血浆可以是10%的缓冲盐溶液,也可以是纯血清或纯血浆。
本发明的基于侧链羟基化的多肽聚合物结构的水凝胶材料自身能够抵制生物污染和异物反应。当聚合物两端R1、R2都官能化,例如两端R1、R2均为丙烯基或甲基丙烯基,则可以通过聚合物本体之间的交联反应,从而得到聚合物为基材的三维材料,本发明优选R1、R2均为丙烯基,结构如下所示:
交联反应方法可以是引发剂交联、热交联或光交联等,优选光交联;具体步骤如下:配制一定浓度的聚合物溶液,溶液可用水或二甲基亚砜(DMSO),优选DMSO;加入光引发剂,可以是安息香、二苯基乙酮、异丙基硫杂蒽酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)等,优选2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮;光引发剂加入量为0.01~1%,优选0.1~0.2%;光源波长为365nm,光照强度为10~8000mW/cm2,优选500mW/cm2;光照时间为2~30分钟,优选3分钟。得到的水凝胶通过至少3次水浸泡,得到产品。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件(如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
端基巯基的α多肽聚合物的合成
步骤(1),在2mL反应瓶中准确称量281mg(1mmol)的Ser(tBu)-UD,加入900μL无水二甲基乙酰氨(DMAc)溶解,放入搅拌子。配制0.5M浓度的引发剂溶液,DMAc作溶剂,用移液器取100μL(0.05mmol,单体当量的1/20)加入步骤(1)所述反应瓶中。开启搅拌,将反应瓶在氮气保护下升温至80℃,反应48小时结束。
步骤(2),将反应液转移到50mL离心管中,加入45mL乙醚,出现絮状沉淀,通过4500rpm/min离心2分钟,将上清液取出得到粗产物,粗产物用乙醚超声清洗两次,离心沉淀得到末端带氨基的未脱保护的中间产物。
步骤(3),将上述中间产物溶解在1mL CH2Cl2中,加入57.3mg的封端剂和35μL的三乙胺(0.25mmol,末端氨基当量的5倍),震荡12小时后加入45mL石油醚,出现絮状沉淀,通过4500rpm/min离心2分钟,将上清液取出得到粗产物,重新加入2mL CH2Cl2溶液,重复沉淀、离心、溶解、沉淀、干燥,得到末端封端的未脱保护的产物。
步骤(4),往上述步骤产物中加入1mL三氟乙酸(TFA),1mL CH2Cl2,100μL三乙基硅烷(Et3SiH)震荡两小时,通过重复上述步骤的产物后处理方法,使用甲醇/乙醚体系,三次沉淀后得到粗产物,将产物用5mL超纯水溶解,经过0.45μL聚醚砜(PES)膜过滤,冻干得到产物。
实施例2
金表面修饰侧链羟基化α多肽聚合物抗蛋白吸附测试
步骤(1),将镀金石英片用乙醇、水交替清洗,紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),将用实施例1方法得到的聚合物溶解在超纯水中,配置成浓度为1mg/mL的溶液;将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),蛋白吸附测试采用辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白作为模型蛋白(Yang,Q.;Wang,L.;Lin,W.;Ma,G.;Yuan,J.;Chen,S.,Development of nonfoulingpolypeptides with uniform alternating charges by polycondensation of thecovalently bonded dimer of glutamic acid and lysine.J.Mater.Chem.B 2014,2(5),577-584.),将修饰前后的镀金表面中(用硅橡胶模具限制为6mm直径的圆孔)加入35μL蛋白孵育20分钟,PBS清洗之后将镀金片放入24孔板中,加入邻苯二胺溶液(1mL,1mg/mL),开始酶催化反应,15分钟后用等体积硫酸(2mol/L)终止反应,通过酶标仪测试波长492nm下的光密度(OD)值,扣除背景后蛋白吸附量与OD值成正比。
结果表明,经过侧链带羟基的α多肽聚合物修饰的表面可以抵制97%的蛋白吸附。
实施例3
金表面修饰侧链羟基化α多肽聚合物抗成纤维细胞粘附测试
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制1mg/mL用实施例1方法得到的端基带巯基的α多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)中得到的修饰后的和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,105个/mL的平滑肌细胞,二氧化碳培养箱中孵育3天,培养液为DMEM,取出镀金片用PBS轻轻洗去未粘附的细胞,通过显微镜观察细胞量;结果表明,未修饰的镀金片上长满细胞而经过α多肽聚合物修饰的镀金片上未发现任何细胞粘附。
实施例4
金表面修饰侧链羟基化α多肽聚合物抗鲍曼不动杆菌粘附测试
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制1mg/mL用实施例1方法得到的端基带巯基的α多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,106个/mL的鲍曼不动杆菌,在37℃培养箱中孵育24小时,培养液为LB肉汤培养基用PBS轻轻洗去未粘附的细菌,通过染色拍照观察细菌数量。结果表明,未修饰的镀金片上长满细菌并形成多层生物被膜,而经过α多肽聚合物修饰的镀金片上几乎没有细菌粘附。
实施例5
端基巯基的β多肽聚合物的合成
步骤(1),手套箱内操作,在10mL反应瓶中准确称量137mg(0.4mmol)的β内酰胺,加入800μL无水四氢呋喃(THF)溶解,放入搅拌子。步骤(2),配制0.1M浓度的引发剂溶液,THF作溶剂,用移液器取100μL(0.01mmol,单体当量的1/40)加入步骤(1)所述反应瓶中。
步骤(3),配制0.25M浓度的双甲基硅基(LiHMDS)溶液,THF作溶剂,用移液器取100μL(0.025mmol)加入步骤(1)所述反应瓶中,这时聚合反应进行。反应2小时结束,将反应液转移到50mL离心管中,加入45mL石油醚,出现絮状沉淀,通过4500rpm/min离心2分钟,将上清液取出得到粗产物,重新加入2mL THF溶液,重复沉淀、离心、溶解、沉淀、干燥,得到未脱保护的产物。
步骤(4),往上述步骤产物中加入1mL TFA,1mL CH2Cl2,100μL Et3SiH震荡两小时,通过重复上述步骤的产物后处理方法,使用甲醇/乙醚体系,三次沉淀后得到粗产物,将产物用5mL超纯水溶解,经过0.45μL PES膜过滤,冻干得到产物。
实施例6
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗成纤维细胞粘附测试
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后的和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,105个/mL的成纤维细胞,二氧化碳培养箱中孵育3天,培养液为DMEM,取出镀金片用PBS轻轻洗去未粘附的细胞,通过显微镜观察细胞量;结果表明,未修饰的镀金片上长满细胞而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上未发现任何细胞粘附。
实施例7
玻璃表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗成纤维细胞粘附测试
步骤(1),将玻璃片依次用乙醇、水清洗,氮气吹干,再用紫外臭氧(紫外臭氧)清洗25分钟,立即浸没在2.5%的APTES无水甲苯溶液中,1小时后取出,用乙醇和水清洗,氮气吹干,100℃抽真空干燥2小时取出;
步骤(2),将步骤(1)得到的玻璃片浸没在3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯的无水DMSO溶液中静置2小时;用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的玻璃片浸没在10mg/mL用实施例5方法得到的端基为巯基的侧链羟基化β多肽聚合物的水溶液中,静置2小时;用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(4),将步骤(3)得到的修饰后的和未修饰的玻璃片分别放入24孔板中,加入1mL,105个/mL的成纤维细胞,二氧化碳培养箱中孵育2天,培养液为DMEM,取出镀金片用PBS轻轻洗去未粘附的细胞,通过显微镜观察细胞量;结果表明,未修饰的玻璃片上粘附大量细胞且铺展良好,而经过β多肽聚合物修饰的玻璃片上未发现任何细胞粘附。
实施例8
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗平滑肌细胞粘附测试
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后的和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,105个/mL的平滑肌细胞,二氧化碳培养箱中孵育3天,培养液为DMEM,取出镀金片用PBS轻轻洗去未粘附的细胞,通过显微镜观察细胞量;结果表明,未修饰的镀金片上长满细胞而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上未发现任何细胞粘附。
实施例9
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗革兰氏阳性细菌生物膜形成测试。
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,106个/mL的金黄色葡萄球菌,在37℃培养箱中孵育7天,培养液为LB肉汤培养基,每天更换一次;7天后取出镀金片用PBS轻轻洗去未吸附的细菌,通过染色拍照观察细菌数量。结果表明,未修饰的镀金片上长满细菌并形成多层生物被膜,而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上几乎没有细菌粘附。
实施例10
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗革兰氏阴性细菌生物膜形成测试
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,106个/mL的铜绿假胞杆菌,在37℃培养箱中孵育7天,培养液为LB肉汤培养基,每天更换一次;7天后取出镀金片用PBS轻轻洗去未吸附的细菌,通过染色拍照观察细菌数量。结果表明,未修饰的镀金片上长满细菌并形成多层生物被膜,而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上几乎没有细菌粘附。
实施例11
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗真菌生物膜形成测试。
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL,106个/mL的白色念珠菌,在30℃培养箱中孵育7天,培养液为RPMI 1640培养基,每天更换一次;7天后取出镀金片用PBS轻轻洗去未吸附的细菌,通过染色拍照观察真菌数量。结果表明,未修饰的镀金片上长满真菌并形成多层生物被膜,而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上几乎没有真菌粘附。
实施例12
金表面修饰侧链羟基化β多肽聚合物抗血小板粘附测试。
步骤(1),将镀金片石英片用乙醇、水交替清洗,用紫外臭氧紫外臭氧清洗20min;
步骤(2),配制0.5mg/mL用实施例5方法得到的端基带巯基的β多肽聚合物的水溶液,将步骤(1)预处理后的镀金片浸没在该溶液中24小时,取出镀金片用乙醇和水交替清洗,氮气吹干;
步骤(3),将步骤(2)得到的修饰后和未修饰的镀金片分别放入24孔板中,加入1mL的富血小板血浆液,在37℃培养箱中孵育1小时后取出镀金片用PBS轻轻洗去未吸附的血小板;
步骤(4),将步骤(3)得到的镀金片放入4%的戊二醛溶液中,4℃静置过夜后用PBS清洗3次,通过梯度乙醇脱水,制成扫描电镜(SEM)样品,随后修饰后和未修饰的镀金片通过SEM观察。结果表明,未修饰的镀金片上血小板粘附非常密集,而经过β多肽聚合物修饰的镀金片上没有发现血小板粘附。
实施例13
硅橡胶(聚二甲基硅氧烷,PDMS)表面修饰β多肽聚合物并测试其抗蛋白吸附性能。
步骤(1),将PDMS片依次用乙醇、水清洗,氮气吹干,再用紫外臭氧(紫外臭氧)清洗25分钟,立即浸没在2.5%的3-三甲氧基硅烷丙烯酸丙脂无水乙醇溶液中,1小时后取出,用乙醇和水清洗,吹干;
步骤(2),配制10%,链长80,端基为甲基丙烯基的β多肽聚合物(通过实施例5的合成方法,采用甲基丙烯酸酐做引发剂获得)溶液,加入1%的交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)和0.1%的光引发剂Irgacure 2959;
步骤(3),将20μL步骤(2)溶液滴在步骤(1)得到的硅烷化PDMS片上,用盖玻片压平,形成一层很薄的溶液层;用365nm紫外灯照射3分钟,取下盖玻片,将PDMS片用超纯水清洗,氮气吹干,得到产品,如图1所示;
步骤(4),测试修饰后的PDMS片对辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白的吸附量,用未修饰的PDMS作为对照,采用实施例2同样的蛋白吸附测试方法。
结果表明,经过侧链带羟基的β多肽聚合物修饰的表面可以抵制99%的蛋白吸附。
实施例14
α多肽聚合物水凝胶植入小鼠体内研究
步骤(1),将5mg两端带有丙烯基的α多肽聚合物(平均链长为36mer,通过实施例1的合成方法,采用乙二胺做引发剂,丙烯酸酐做封端剂获得)溶解在20μL超纯水中,加入0.1%光引发剂Irgacure 2959;
步骤(2),将步骤(1)所述溶液加入6mm半径圆孔模具中,通过365nmUV照射3min,形成凝胶;将该凝胶取下放入10mL超纯水中浸泡,每12小时更换一次水,总共更换5次,得到产品;
步骤(3),将步骤(2)得到的水凝胶经过紫外灭菌,植入年龄6周的C57BL/6小鼠背部皮下;一周和四周后分别取样,制备切片做H&E染色分析和masson染色分析,结果表明,α多肽水凝胶在植入小鼠后1周引起很低的炎症反应,在植入小鼠后4周无胶原包裹。
实施例15
β多肽聚合物水凝胶植入小鼠体内研究
步骤(1),将5mg两端带有丙烯基的β多肽聚合物(平均链长为11mer,通过实施例5的合成方法,采用丙烯酰氯做引发剂引发聚合,聚合结束后通过带有丙烯酰胺基团的β内酰胺封端获得)溶解在20μL DMSO中,加入0.1%光引发剂Irgacure 2959;
步骤(2),将步骤(1)所述溶液加入6mm半径圆孔模具中,通过365nmUV照射3min,形成凝胶;将该凝胶取下放入10mL超纯水中浸泡,每12小时更换一次水,总共更换5次,得到产品;
步骤(3),将步骤(2)得到的水凝胶经过紫外灭菌,植入年龄6周的C57BL/6小鼠背部皮下;一周和四周后分别取样,制备切片做H&E染色分析和masson染色分析,结果表明,β多肽水凝胶在植入小鼠后1周引起很低的炎症反应,在植入小鼠后4周无胶原包裹。
实施例16
多肽聚合物增强辣根过氧化物酶的热稳定性
步骤(1),将1.5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解在1mL的PBS中,随后稀释到0.3mg/mL待用;
步骤(2),将20μL步骤(1)的蛋白溶液和20μL不同浓度(多肽聚合物和蛋白质量比分别为1:1、5:1和10:1)的端基为苯基的多肽聚合物(平均链长为184mer,通过实施例5的合成方法,采用苯甲酰氯做引发剂获得)溶液加入玻璃瓶中共混,将共混液放入70℃水浴锅中,维持30分钟;步骤(3),将共混液恢复室温,取10μL稀释1000倍,取10μL稀释后的溶液加入24孔板中;
步骤(4),加入邻苯二胺溶液(1mL,1mg/mL),开始酶催化反应,15分钟后用等体积硫酸(2mol/L)终止反应,通过酶标仪测试波长492nm下的光密度(OD)值,扣除背景后蛋白活性与OD值成正比。
结果表明,没有加入聚合物的hrp活性仅有45%,而加入1、25、50和80%倍体积的β多肽聚合物后的蛋白活性分别达到64%、75%、82%和90%,很大程度上提高了蛋白在高温环境下的稳定性。
实施例17
多肽聚合物增强β-半乳糖苷酶(β-Gal)在冻融条件下的稳定性
步骤(1),将0.4mgβ-Gal溶解于1mL磷酸盐缓冲溶液中,配制成0.4mg/mL的蛋白溶液,取出25μL蛋白溶液与75μL不同浓度的β多肽聚合物(结构同实施例16,平均链长为81mer)溶液共混于250μL管中,多肽聚合物和蛋白质量比分别为1:1、5:1和10:1;
步骤(2),将装有上述溶液的离心管置于液氮中冷冻5分钟,随后冻干12小时,待蛋白经冻干成为冻干粉后,加入100μL超纯水溶解蛋白,混匀后取20μL溶液加入96孔板中;
步骤(3),向每个孔中加入50μL显色剂邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG,4mg/mL),避光孵育5分钟,再加入50μL碳酸钠溶液(1mol/L)终止反应,用酶标仪测试波长405nm下的光密度(OD)值,扣除背景后蛋白活性与OD值成正比。
结果表明,没有加聚合物的半乳糖苷酶经冻融后活性仅有41%,而加入1、5和10倍体积的多肽聚合物后的蛋白活性分别达到66%、84%和86%,很大程度上提高了蛋白在冻融条件下的稳定性。
实施例18
β多肽聚合物保护人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)体内骨诱导活性
β多肽聚合物结构同实施例16,平均链长为60,150,300mer。
准备植入样品:
a组为5μg rhBMP-2/明胶海绵(实验重复数n=8);
b组为5μg rhBMP-2/125μg 60merβ多肽聚合物(结构同实施例17)/明胶海绵(实验重复数n=8);
c组为5μg rhBMP-2/500μg 60merβ多肽聚合物/明胶海绵(实验重复数n=8);
d组为5μg rhBMP-2/125μg 150merβ多肽聚合物/明胶海绵(实验重复数n=8);
e组为5μg rhBMP-2/500μg 150merβ多肽聚合物/明胶海绵(实验重复数n=8);
f组为5μg rhBMP-2/125μg 300mer HS/明胶海绵(实验重复数n=8);
g组为5μg rhBMP-2/500μg 300merβ多肽聚合物/明胶海绵(实验重复数n=8)
明胶海绵以及各试剂均为无菌级别,制备过程同样在无菌环境下进行,具体制备过程为:
步骤(1),明胶海绵支架制备:将购买的明胶海绵剪成尺寸为10mm×10mm×5mm,并放置在24孔板内;
步骤(2),制备植入样品:将10μL 0.5mg/mL rhBMP-2溶液与40μL HS溶液共混,混匀后滴入明胶海绵支架中并充分吸收,放入冻干机中冻干过夜后取出;
步骤(3),保存:4℃冰箱保存。
步骤(4),动物麻醉:每只小鼠腹腔注入3%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉;
步骤(5),手术准备:等待一段时间,小鼠完全麻醉后,使用剃毛器将后腿外侧的绒毛剃去并使用碘伏将手术部位消毒;
步骤(6),样品植入:使用手术剪在后腿处开尺寸约3mm的创口后,使用镊子将肌肉分离产生肌肉陷窝,将上述制备好的样品植入陷窝内,使用手术缝合线将创口缝合。
步骤(7),饲养:为防止小鼠伤口感染、发炎,待小鼠苏醒后注射抗生素,继续饲养。
湿重称量:使用断颈法将小鼠处死后,取出小鼠腿部的样品,将样品周围的肌肉剥除后,天平称量其湿重。
步骤(8),Micro-CT检测:使用上海光源SRμCT对异位骨样本进行三维重建并根据灰度值区分样本内不同组织。具体参数如下:能量为22keV,样本至检测器间的距离为0.8m,像素大小设置为6.5μm,在180°范围内进行1200次拍照。VGstudio软件用于重建3D图像。
结果表明,a~g组的骨质量分别是33.1±9.2、95.4±32.7、80.8±35.8、47.9±24.4、37.6±21.3、65.1±23.4和56.7±25.8mg,BV/TV(骨体积/总体积)分别为0.025±0.008、0.070±0.027、0.063±0.021、0.083±0.042、0.081±0.016、0.099±0.024和0.068±0.044。
因此,多肽聚合物的加入可有效提高rhBMP-2诱导的异位骨生成,提高异位骨总质量的同时,组织内部的骨含量也得到了显著性提高,这意味着在体内环境中,β多肽聚合物可对rhBMP-2进行保护,从而提高其骨诱导活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一类多肽聚合物的用途,所述多肽聚合物由以下结构单元组成:
-(NH-(CHR)m-CO)n-,
式中,m为1、2或3;
各R独立地为H、C1-C4烷基、羟基、羟基取代的C1-C4烷基,且至少一个R为羟基或羟基取代的C1-C4烷基;
n为5~300的整数,
所述用途为用于抵制生物污染;
用于抵制异物反应;
用作蛋白保护剂;
用于制备抵制生物污染的材料;
用于制备抵制异物反应的材料;或
用于制备保护蛋白的材料。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述材料包括基片,以及所述基片层上的多肽聚合物层。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述材料为多肽聚合物三维水凝胶材料。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述生物污染为蛋白质吸附、血清污染、血浆污染、血小板粘附、细胞粘附或微生物粘附。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述蛋白质为:疏水性蛋白(如纤维蛋白原)、亲水性蛋白(白蛋白);带有正电性蛋白(如溶菌酶)和负电性蛋白(胃蛋白酶),包括经过改性的蛋白(辣根过氧化物酶修饰的免疫球蛋白)。
6.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述血清或血浆为血清或血浆的缓冲盐溶液形式,或是纯血清或纯血浆。
7.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述细胞选自:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、成纤维细胞(NIH 3T3)、平滑肌细胞(SMC)等。
8.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述微生物选自:革兰氏阳性菌(葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等)、革兰氏阴性菌(铜绿假胞杆菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌等)及真菌(白色念珠菌、新型隐球菌等)。
9.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述抵制生物污染的材料或防止异物反应的材料为导管、血袋、隐形眼镜或植入假体。
10.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述多肽聚合物还用于药物修饰与递送、油水分离、维持干细胞干性、芯片涂层、海洋防污、医疗诊断和检测、各类生物医用材料植入体、医疗器械表面涂层。
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