CN105189532A - 用于伤口愈合、皮肤护理和化妆品应用的自组装超短肽水凝胶 - Google Patents

用于伤口愈合、皮肤护理和化妆品应用的自组装超短肽水凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了两亲性线性肽和/或类肽以及包含两亲性线性肽/类肽的水凝胶。两亲性线性肽/类肽能够自组装成三维大分子纳米纤维网络，其束缚水且形成水凝胶。这些肽/类肽包括短两亲性序列，具有脂肪族氨基酸和至少一个酸性、中性或碱性极性氨基酸的疏水部分。两亲性线性肽/类肽由非重复脂肪族氨基酸构成，所述氨基酸可以为L-或D-型。多个此类肽/类肽组装为超分子螺旋纤维且在组装后形成肽水凝胶。相应的水凝胶在水溶液中在生理学pH下形成，并且因此尤其可用于细胞培养、组织工程、组织再生、伤口愈合和生物活性部分(包括细胞、核酸、抗微生物剂、微粒/纳米颗粒、美容剂和小分子治疗剂)的释放，以及用于提供损伤或缺失组织的机械支持。此类水凝胶还可以原位形成，其中胶凝过程在注射肽溶液后在体内发生。刚性、生物相容性且束缚高达99.9％的水的此类水凝胶也非常适合于利用电子装置的应用。

Description

用于伤口愈合、皮肤护理和化妆品应用的自组装超短肽水凝胶
技术领域
本发明提供了两亲性线性肽和/或类肽以及包含两亲性线性肽/类肽的水凝胶。两亲性线性肽/类肽能够自组装成三维大分子纳米纤维网络，其束缚水且形成水凝胶。这些肽/类肽包括短两亲性序列，具有脂肪族氨基酸的疏水部分和至少一个酸性、中性或碱性极性氨基酸。两亲性线性肽/类肽由非重复脂肪族氨基酸构成，所述氨基酸可以为L-或D-型。多个此类肽/类肽组装为超分子螺旋纤维且在组装后形成肽水凝胶。相应的水凝胶在水溶液中在生理学pH下形成，并且因此尤其可用于细胞培养、组织工程、组织再生、伤口愈合和生物活性部分(包括细胞、核酸、抗微生物剂、微粒/纳米颗粒、美容剂和小分子治疗剂)的释放，以及用于提供损伤或缺失组织的机械支持。此类水凝胶还可以原位形成，其中胶凝过程在注射肽溶液后在体内发生。其为刚性、生物相容性且束缚高达99.9％的水的此类水凝胶也非常适合于利用电子装置的应用。
背景技术
超分子结构通过分子间键合保持在一起，所述分子间键合负责多分子系统的组构。限定的超分子结构的组装所需的非共价、分子间作用力主要是静电相互作用、氢键、范德华力等。超分子化学或生物学聚集通过化学或生物种类的结合形成的大量二维或三维复合结构和实体。这些结合由分子互补性或分子识别和自组装原理支配。分子间结合的规则的了解可以用于设计以用于各种生物医学或技术应用的膜、薄膜、层、胶束、小管、凝胶形式的多分子组装物(J.-M.Lehn,Science,295,2400-2403,2002)。
肽已用于通过分子自组装构建超分子结构(S.Zhang,NatureBiotechnology,21,1171-1178,2003)。肽例如能够组装成纳米管(US7,179,784)或由三维骨架组成的超分子水凝胶，所述三维骨架具有大量约98-99％的固定的水或水溶液。基于肽的生物材料是用于潜在应用于生物技术、医学和甚至技术应用中的有力工具。取决于个别特性，这些基于肽的水凝胶被认为在新材料开发中起作用，所述新材料用于组织工程、再生医学、用作药物和疫苗递送媒介物或用于药学研究和诊断的肽芯片(E.Place等人，NatureMaterials,8,457-470,2009)。还存在使用基于肽的自组装生物材料例如凝胶用于开发分子电子装置的强烈兴趣(A.R.Hirst等人Angew.Chem.Int.Ed.,47,8002-8018,2008)。
已生成多种“智能肽水凝胶”，其对外部操作例如温度、pH、机械影响或其他刺激有反应，伴随膨胀、收缩或分解的动态行为。然而，这些生物材料仍没有足够“先进”以模拟天然组织的生物学变异性，所述天然组织例如细胞外基质(ECM)或软骨组织或其他组织。肽水凝胶的有意义用途的挑战是不仅作为“空隙填充物”或机械骨架来模拟替换天然组织，还应理解为应付生物化学信号和生理学需求，其使含有的细胞保持在适当位置且处于“体内”条件下(R.Fairman和K.Akerfeldt,CurrentOpinioninStructuralBiology,15,453-463,2005)。
已采取许多努力以理解和控制肽序列和结构之间的关系，用于合理设计合适的水凝胶。一般而言，水凝胶含有宏观结构例如纤维，其纠缠且形成网。大多数基于肽的水凝胶利用β-折叠片作为其构件块，所述β-折叠片组装为纤维。随后显示能够设计纯粹来自α-螺旋的水胶凝(hydrogelating)自组装纤维。除基于β-折叠结构的材料之外(S.Zhang等人，PNAS,90,3334-3338,1993:A.Aggeli等人，Nature,386,259-262,1997等)，已开发了多种α-螺旋水凝胶(W.A.Petka等人，Science,281,389-392,1998；C.Wang等人，Nature,397,417-420,1999；C.Gribbon等人，Biochemistry,47,10365-10371,2008；E.Banwell等人，NatureMaterials,8,596-600,2009等)。
然而，目前已知的肽水凝胶在大多数情况下与低刚性，有时不利的生理特性和/或复杂性和其导致高生产成本的基本加工要求相关。因此广泛公认存在肽水凝胶的需要，所述肽水凝胶容易形成，无毒且具有足够高的刚性用于标准应用。水凝胶还应适合于递送生物活性部分(例如核酸、小分子治疗剂、美容和抗微生物剂)和/或用作仿生骨架，其支持细胞的体内和体外生长且促进天然组织的再生。肽的刺激应答性胶凝也是期望的，因为它们随后可以作为最低限度侵入性可注射疗法应用，或作为生物构建体植入以替换损伤/缺失组织。
发明概述
因此期望提供能够形成水凝胶的生物相容性化合物，所述水凝胶满足上述需求中的至少一些至比目前可用水凝胶更高的程度，并且不受上述局限性限制。
本发明的目的通过能够自组装成三维大分子纳米纤维网络的两亲性肽和/或类肽得到解决，所述三维大分子纳米纤维网络束缚水且形成水凝胶，所述两亲性肽和/或类肽包含由下述组成的两亲性序列：
n个脂肪族氨基酸的疏水序列段，其中n是2-15的整数，和
与所述疏水序列段连接且具有酸性、中性或碱性的极性部分的亲水序列段，所述极性部分包含m个邻接的亲水性氨基酸，其中m是1-5的整数。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有C末端和N末端，其中所述C末端和所述N末端两者均不携带与之附着的任何保护基团。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有C末端和N末端，其中N末端通过N末端保护基团加以保护。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有C末端和N末端，其中C末端通过C末端保护基团加以保护。
在一个实施方案中，所述N末端保护基团具有通式–C(O)–R，其中R选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
依照本发明的优选烷基是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基。
在一个实施方案中，所述N末端保护基团是乙酰基。
在一个实施方案中，所述N末端保护基团是拟肽(peptidomimetic)分子，包括天然和合成氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的N末端可以用选自下述的官能团进行修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、马来酰亚胺、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐和硅烷。
在一个实施方案中，所述C末端保护基团是酰胺基。
在一个实施方案中，所述两亲性肽和/或类肽的C末端具有式-CONHR或-CONRR’，其中R和R’选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
在一个实施方案中，所述C末端保护基团是酯基。
在一个实施方案中，所述两亲性肽和/或类肽的C末端具有式–CO2R，其中R选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
在一个实施方案中，所述C末端保护基团是拟肽分子，包括天然和合成氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的C末端可以用选自下述的官能团进行修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、马来酰亚胺、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐和硅烷。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有其为乙酰基的N末端保护基团和其为酰胺基的C末端保护基团。
在一个实施方案中，n是2-6，优选2-5的整数。
在一个实施方案中，m是1-2，优选1的整数。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽由如上定义的o个两亲性序列组成，所述两亲性序列彼此连接，o是1-50的整数。
在一个实施方案中，对于给定两亲性肽和/或类肽，所述脂肪族氨基酸和所述亲水性氨基酸是D-氨基酸或L-氨基酸。
在一个实施方案中，亲水性氨基酸各自具有极性基团，其独立地选自羟基、醚、羧基、亚氨基、酰氨基、酯、氨基、胍基、硫基、硫醚、硒基和碲基。
在一个实施方案中，所述亲水序列段的所述极性部分包含m个邻接的亲水性氨基酸，m如上定义，所述亲水性氨基酸选自天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)、2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸、组氨酸，并且其中所述疏水序列段包含n个脂肪族氨基酸，n如上，所述脂肪族氨基酸选自异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、高烯丙基甘氨酸和高炔丙基甘氨酸。
在一个实施方案中，m是1或2。
在一个实施方案中，m是2并且所述极性部分包含两个相同氨基酸，或m是1并且所述极性部分包含天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)、2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)和组氨酸中的任何一个。
在一个实施方案中，所述极性部分与n个脂肪族氨基酸的疏水序列段邻接。
在一个实施方案中，所述极性部分具有选自下述的序列：Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Met、Lys、Orn、Dab、Dap、His、Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-AspThr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu、Cys-Asp、Cys-Lys、Cys-Ser、Cys-Thr、Cys-Orn、Cys-Dab、Cys-Dap、Lys-Lys、Lys-Ser、Lys-Thr、Lys-Orn、Lys-Dab、Lys-Dap、Ser-Lys、Ser-Orn、Ser-Dab、Ser-Dap、Orn-Lys、Orn-Orn、Orn-Ser、Orn-Thr、Orn-Dab、Orn-Dap、Dab-Lys、Dab-Ser、Dab-Thr、Dab-Orn、Dab-Dab、Dab-Dap、Dap-Lys、Dap-Ser、Dap-Thr、Dap-Orn、Dap-Dab、Dap-Dap。
在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲性肽和/或类肽的C末端，或所述极性部分包含两亲性肽和/或类肽的N末端。
在一个实施方案中，所述极性部分包含两亲性肽和/或类肽的C末端。
在一个实施方案中，所述极性部分由位于两亲性肽和/或类肽的C末端处的至少一个氨基酸组成。
在一个实施方案中，所述疏水序列段包含和/或形成两亲性肽和/或类肽的N末端。
在一个实施方案中，疏水序列段的脂肪族氨基酸的全部或一部分以氨基酸尺寸递减的次序排列在从两亲性肽和/或类肽的N末端到C末端的方向上，其中所述脂肪族氨基酸的尺寸定义为I＝L>V>A>G。
在一个实施方案中，以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有其为重复或非重复序列的序列。
在一个实施方案中，以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-7、优选2-6、更优选2-5个氨基酸的序列。
在一个实施方案中，以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LIVAG、ILVAG、LIVAA、LAVAG、IVAG、LIVA、LIVG、IVA和IV的序列，其中任选地，此类序列前N末端处存在A。
在一个实施方案中，疏水序列段的脂肪族氨基酸的全部或一部分以相同氨基酸尺寸次序排列在两亲性肽和/或类肽中。
在一个实施方案中，以相同氨基酸尺寸次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-4个氨基酸的序列。
在一个实施方案中，以相同氨基酸尺寸次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LLLL、LLL、LL、IIII、III、II、VVVV、VVV、VV、AAAA、AAA、AA、GGGG、GGG和GG的序列。
在一个实施方案中，两亲性序列在自组装期间经历构象变化，优选从无规卷曲构象到螺旋中间结构到最终β构象的构象变化。
在一个实施方案中，构象变化取决于两亲性肽和/或类肽的浓度、取决于离子环境(例如盐浓度)、取决于pH和/或取决于温度。在一个实施方案中，构象变化通过pH、离子环境和/或温度中的变化得到促进和/或触发。
在一个实施方案中，两亲性线性序列包含单个亲水性氨基酸和至少两个脂肪族氨基酸。
在一个实施方案中，两亲性序列是SEQIDNO:1-86之一。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽在水溶液中在生理条件下在环境温度下稳定一段时间，所述一段时间范围为1天到至少6个月，优选到至少8个月，更优选到至少12个月。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽在水溶液中在生理条件下在高达90℃的温度下稳定至少1小时。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有通式：
Zp-(X)n-(Y)m-Z’q，
其中
Z是N末端保护基团，
X在每种情况下独立地选自脂肪族氨基酸，
Y在每种情况下独立地选自亲水性氨基酸，
Z’是C末端保护基团，
n是选自2-6，优选2-5的整数，
m选自1和2，其中优选地，m是1，
并且p和q独立地选自0和1，其中优选地，p是1。
优选地，所述脂肪族氨基酸选自异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、高烯丙基甘氨酸和高炔丙基甘氨酸。优选地，所述亲水性氨基酸选自天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)、2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸、组氨酸。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽的C末端氨基酸是中性或碱性亲水性(极性)氨基酸。在一个实施方案中，在上述通式中，m是1，并且Y选自中性或碱性亲水性氨基酸。优选的中性亲水性氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸。优选的碱性亲水性氨基酸包括赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)和2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽的C末端氨基酸选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)和2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)。在一个实施方案中，在上述通式中，m是1，并且Y选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)和2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有选自下述的序列：LIVAGK(SEQIDNO:19或39)、LIVAG(Orn)(SEQIDNO:43或44)、LIVAG(Dab)(SEQIDNO:45或46)、LIVAG(Dap)(SEQIDNO:47或48)、ILVAGK(SEQIDNO:49或50)、ILVAG(Orn)(SEQIDNO:51或52)、ILVAG(Dab)(SEQIDNO:53或54)、ILVAG(Dap)(SEQIDNO:55或56)、AIVAGK(SEQIDNO:57或58)、AIVAG(Orn)(SEQIDNO:59或60)、AIVAG(Dab)(SEQIDNO:61或62)、AIVAG(Dap)(SEQIDNO:63或64)、IIIK(SEQIDNO:27或28)、III(Orn)(SEQIDNO:65或66)、III(Dab)(SEQIDNO:67或68)、III(Dap)(SEQIDNO:69或70)、IVK(SEQIDNO:71或72)、IV(Orn)(SEQIDNO:73或74)、IV(Dab)(SEQIDNO:75或76)、IV(Dap)(SEQIDNO:77或78)、LVK(SEQIDNO:79或80)、LV(Orn)(SEQIDNO:81或82)、LV(Dab)(SEQIDNO:83或84)和LV(Dap)(SEQIDNO:85或86)。在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽由L-氨基酸(L-型)组成。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有酰胺化C末端。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽具有乙酰化N末端。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽的N末端氨基酸是异亮氨酸(I)。
所述目的还通过包含如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽的水凝胶得到解决。水凝胶可以包含超过一种两亲性肽和/或类肽，例如两种、三种、四种或更多种两亲性肽和/或类肽，其可以在其氨基酸序列、N末端和/或C末端保护基团中不同。
在一个实施方案中，水凝胶在水溶液中在环境温度下稳定至少7天、优选至少2至4周、更优选至少1至6个月的时期。
在一个实施方案中，水凝胶的特征在于储能模量G’与损耗模量G”的比率大于2。
在一个实施方案中，水凝胶的特征在于在范围为0.02Hz-16Hz的频率下100Pa-80,000Pa的储能模量G’。
在一个实施方案中，水凝胶具有比胶原或其水解形式(明胶)更高的机械强度。
在一个实施方案中，水凝胶进一步包含非肽聚合物。优选地，就水凝胶的总重量而言，至少一种非肽聚合物以50％(w/w)或更少、优选40％(w/w)或更少的浓度存在。此类非肽聚合物可以用于修饰水凝胶的机械特性(例如增加其弹性)和/或用于生物活性剂/部分的偶联。包含另外的非肽聚合物的复合水凝胶在PCT/SG2012/000421中详细描述，所述专利在此整体通过引用并入本文。可替代地或另外地，水凝胶可以包含超小型自组装天然肽(二聚体至六聚体)，当将其溶解于有机溶剂、油和/或油混合物中时，其形成有机凝胶。此类有机凝胶在SG201201239-9中详细描述，所述专利也整体通过引用并入本文。
在一个实施方案中，水凝胶包含如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽的纤维，所述纤维限定出能够束缚下述中的至少一种的网络：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
在一个实施方案中，水凝胶包含被两亲性肽和/或类肽的纤维网络所束缚的下述中的至少一种：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
在一个实施方案中，两亲性肽和/或类肽的纤维与下述中的至少一种偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
在一个实施方案中，下述中的至少一种与所述非肽聚合物偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
在一个实施方案中，所述药学活性化合物选自止血剂、抗生素、抗微生物剂、抗真菌剂、抗炎剂、镇痛剂、抗凝血剂、抗体、抗原、生长因子和细胞因子。
在一个实施方案中，所述水凝胶以可注射形式提供且原位胶凝。
在一个实施方案中，水凝胶包含于下述中的至少一种之中：燃料电池、太阳能电池、电子电池、生物感应装置、医疗装置、植入物、伤口敷料、药物组合物和化妆品组合物。
在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物以局部凝胶或乳膏、喷雾剂、粉末或片、贴剂或膜的形式提供。
在一个实施方案中，药物组合物或化妆品组合物以可注射溶液的形式提供，所述可注射溶液优选在注射到体内后原位胶凝。
所述目的还通过用于下述中的至少一种中的如上定义的水凝胶得到解决：药学活性化合物的释放、医学工具试剂盒、燃料电池、太阳能电池、电子电池、组织再生、组织置换、伤口愈合、皮肤护理、干细胞治疗和基因治疗。
所述目的还通过制备水凝胶的方法得到解决，该方法包括将如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽溶解于水溶液中。
在一个实施方案中，使在水溶液中溶解的至少一种两亲性肽和/或类肽进一步暴露于温度，其中所述温度范围为20℃至90℃，优选20℃至70℃。
在一个实施方案中，使在水溶液中溶解的至少一种两亲性肽和/或类肽暴露于范围为35℃至40℃(体温)的温度。
在一个实施方案中，至少一种两亲性肽和/或类肽以0.01μg/ml-100mg/ml的浓度、优选以1mg/ml-50mg/ml的浓度、更优选以约1mg/ml-约20mg/ml的浓度溶解。
在一个实施方案中，该方法进一步包括下述步骤中的至少一个：
-添加至少一种生物活性剂；
-添加至少一种非肽聚合物；
-添加至少一种胶凝增强剂；
-添加至少一种缓冲液，优选至少一种生理学可接受的缓冲液。
在一个实施方案中，所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
在一个实施方案中，所述胶凝增强剂是交联剂。
在一个实施方案中，所述添加至少一种非肽聚合物进一步包含将至少一种非肽聚合物与至少一种两亲性肽和/或类肽混合或交联。
所述目的还通过包含肽和/或类肽骨架的手术植入物或支架得到解决，其中所述肽和/或类肽骨架由如上定义的水凝胶形成。
所述目的还通过药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医学装置和/或电子装置得到解决，其包含如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽或如上定义的水凝胶。
在一个实施方案中，药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医学装置和/或电子装置进一步包含药学活性化合物。
在一个实施方案中，药物组合物和/或化妆品组合物进一步包含药学可接受的载体。
在一个实施方案中，药物组合物和/或化妆品组合物局部应用。
在一个实施方案中，药物组合物和/或化妆品组合物是可注射的。
所述目的还通过试剂盒得到解决，该试剂盒包含具有如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽的第一容器和具有水溶液的第二容器。
在一个实施方案中，第二容器的水溶液进一步包含药学活性化合物。
在一个实施方案中，具有至少一种两亲性肽和/或类肽的第一容器进一步包含药学活性化合物。
在一个实施方案中，试剂盒进一步包含具有胶凝增强剂的第三容器。
在一个实施方案中，所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
在一个实施方案中，所述第一、第二或第三容器中的至少一个作为喷雾瓶或注射器提供。在一个实施方案中，所述第一、第二或第三容器全部作为喷雾瓶提供。
所述目的还通过试剂盒得到解决，该试剂盒包含具有如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽的水溶液的第一容器，以及具有胶凝增强剂的第二容器。
在一个实施方案中，第一容器进一步包含药学活性化合物。
在一个实施方案中，所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
在一个实施方案中，所述第一和所述第二容器中的至少一个作为喷雾瓶或注射器提供。在一个实施方案中，所述第一和所述第二容器两者均作为喷雾瓶或注射器提供。
在一个实施方案中，所述第一和所述第二容器以喷雾瓶或注射器的分开区室的形式提供。
所述目的还通过组织再生或组织置换的方法得到解决，所述方法包括下述步骤：
a)提供如上定义的水凝胶；
b)使所述水凝胶暴露于形成再生组织的细胞；
c)允许所述细胞在所述水凝胶上或所述水凝胶中生长。
在一个实施方案中，该方法在体外或在体内或离体进行。术语“离体”指例如这样的情况，其中所述细胞取自患者且在通过如上定义的水凝胶形成的骨架上培养，所述骨架随后植回到患者内。
在一个实施方案中，该方法在体内进行，其中在步骤a)中，所述水凝胶在患者体内期望组织再生或组织置换的位置处提供。
在一个实施方案中，所述组织选自皮肤组织、在椎间盘中的髓核、软骨组织、滑液和在膀胱颈中的粘膜下结缔组织。
在一个实施方案中，通过将所述水凝胶或如上定义的至少一种两亲性肽和/或类肽(即水凝胶的前体)的溶液注射到患者体内期望组织再生或组织置换的位置处来进行所述步骤a)。
在一个实施方案中，所述步骤a)进一步包括胶凝增强剂、优选盐溶液的共同注射。
在一个实施方案中，所述步骤a)进一步包括细胞的共同注射。
在一个实施方案中，该方法离体进行，其中在步骤a)或b)中，将来自患者或供体的细胞与所述水凝胶混合，并且在患者体内期望组织再生或组织置换的位置处提供所得到的混合物。
在一个实施方案中，所述水凝胶包含一种或多种生物活性治疗剂，其刺激再生过程和/或调节免疫应答。
所述目的还通过伤口处理方法得到解决，所述方法包括下述步骤：
a)提供如上定义的水凝胶；
b)使所述水凝胶暴露于所述伤口。
在一个实施方案中，所述伤口是烧伤伤口。
在一个实施方案中，所述水凝胶诱导自溶性清创。
在一个实施方案中，所述水凝胶包含至少一种两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽的C末端氨基酸选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)和2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)。
在一个实施方案中，所述水凝胶充当止血剂。
在一个实施方案中，所述水凝胶充当抗炎剂，其通过清除刺激先天性免疫系统的细胞外核酸起作用。
在一个实施方案中，在步骤a)中，将所述水凝胶与重新填充伤口且加速伤口愈合的细胞混合。
在一个实施方案中，所述水凝胶包含一种或多种生物活性治疗剂，其扩散到伤口内，并且通过调节炎症应答和/或刺激再生过程来促进愈合应答。
所述目的还通过用于组织再生或组织置换的方法中或者用于伤口处理的方法中的两亲性肽和/或类肽，或包含此类肽和/或类肽的水凝胶，或包含此类肽/类肽/或水凝胶的组合物得到解决，其中这些方法如上文进一步限定。
此外，本发明的目的还通过两亲性肽和/或类肽或包含其的水凝胶或包含此类肽/类肽/水凝胶的组合物用于制造药剂的用途得到解决，所述药剂用于组织再生或组织置换的方法或者用于伤口处理的方法，其中这些方法如上文进一步限定。
在第一个方面，本发明提供了能够自组装成三维大分子纳米纤维网络的两亲性肽和/或类肽，所述三维大分子纳米纤维网络束缚水且形成水凝胶。两亲性肽和/或类肽包括疏水和亲水序列。这种疏水序列具有n个L-或D-氨基酸的长度。n是通常范围可以为2-约15的整数。亲水序列具有包含m个L-或D-氨基酸的极性和/或荷电部分。m是1-5的整数。m个脂肪族氨基酸各自携带独立地选择的极性基团。两亲性线性序列在生理学pH下具有净电荷，以及优选地，携带保护基团的N末端。保护基团可以是乙酰基。两亲性肽和/或类肽可以包含o个连接的具有n个疏水性和m个亲水性L-和D-氨基酸的两亲性肽和/或类肽序列，其中o是1-约50的整数。两亲性肽和/或类肽可以由o个连接的具有n个疏水性和m个亲水性L-和D-氨基酸的两亲性肽和/或类肽序列组成。n的值可以为2-约15的整数。m的值可以为1-5。m个亲水性L-和D-氨基酸各自的荷电和/或极性基团可以独立地选自羟基、醚、羧基、酰氨基、酯、氨基、胍基、硫基、硫醚、硒基和碲基。亲水序列的荷电或极性部分可以包含m个选自下述的L-或D-氨基酸：天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)、2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸。亲水序列的荷电和/或极性部分可以包含两个相同的氨基酸。两个相同的氨基酸可以与非极性疏水部分邻接。荷电和/或极性部分可以由具有选自下述的序列的两个氨基酸组成：Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-Asp、Thr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu、Cys-Asp、Cys-Lys、Cys-Ser、Cys-Thr、Cys-Orn、Cys-Dab、Cys-Dap、Lys-Lys、Lys-Ser、Lys-Thr、Lys-Orn、Lys-Dab、Lys-Dap、Ser-Lys、Ser-Orn、Ser-Dab、Ser-Dap、Orn-Lys、Orn-Orn、Orn-Ser、Orn-Thr、Orn-Dab、Orn-Dap、Dab-Lys、Dab-Ser、Dab-Thr、Dab-Orn、Dab-Dab、Dab-Dap、Dap-Lys、Dap-Ser、Dap-Thr、Dap-Orn、Dap-Dab、Dap-Dap。荷电和/或极性部分可以包含两亲性肽和/或类肽的C末端。荷电和/或极性部分可以包含(i)C末端，该C末端携带未保护的C末端羧基，或(ii)N末端，该N末端携带未保护的N末端氨基。荷电和/或极性部分可以包含两亲性肽和/或类肽的C末端，该C末端携带未保护的C末端羧基，并且其中N末端携带保护基团，优选乙酰基。荷电和/或极性部分可以包含两亲性肽和/或类肽的C末端，以及携带保护基团优选乙酰基的N末端，该C末端携带保护的C末端羧基，优选由酰氨基或酯基保护。保护基团可以是酰氨基保护基团。荷电和/或极性部分可以由位于两亲性肽和/或类肽的C末端处的至少一个氨基酸组成。疏水序列可以包含至少两个脂肪族氨基酸，其通过包含1至约20个碳原子的主链限定。非极性部分的氨基酸的一部分可以以尺寸递减的一般序列排列在从两亲性肽和/或类肽的N末端到C末端的方向上，并且非极性部分的邻接氨基酸的尺寸在尺寸递减的一般序列的方向上可以相同或更小。尺寸递减的一般序列可以优选为非重复序列。其中邻接氨基酸可以具有相同或更小尺寸的尺寸递减的一般序列的方向可以是朝向序列的荷电和/或极性部分的方向。以尺寸递减的一般序列排列的氨基酸部分可以具有2-7，优选2-6，更优选2、3、4、5或6个氨基酸的长度。以尺寸递减的一般序列排列的氨基酸部分还可以具有n-m-1个氨基酸的长度，并且其中以尺寸递减的一般序列排列的氨基酸部分可以置于n-m个氨基酸的非极性部分的剩余非极性氨基酸和极性部分之间。n-m个氨基酸的非极性部分的剩余非极性氨基酸可以限定两亲性肽和/或类肽的N末端或C末端。n-m个氨基酸的非极性部分的剩余非极性氨基酸可以是丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸之一。两亲性线性序列可以在自组装期间经历从无规卷曲构象到螺旋构象的构象变化。构象变化可以是浓度、pH、温度和盐浓度依赖性的。两亲性线性序列的非极性部分可以包含选自下述的至少一个L-或D-氨基酸：甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和异亮氨酸。两亲性线性序列可以包含单个极性和/或电荷和单个非极性部分。两亲性线性序列可以具有正或负净电荷。净电荷可以为约-1至约-4或约+5至约+1。净电荷可以为约-1至约-2。净电荷可以为-2。净电荷可以为+1或+2或+5。两亲性肽和/或类肽可以在水溶液中在生理条件下在环境温度下稳定一段时间，所述一段时间范围为1天到至少6个月，优选至少8个月，更优选至少12个月。两亲性肽和/或类肽可以在水溶液中在生理条件下在90℃的温度下稳定至少1小时。两亲性肽和/或类肽的C末端氨基酸可以选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab或Dbu)和2,3-二氨基丙酸(Dap或Dpr)。在一些实施方案中，两亲性肽和/或类肽的N末端氨基酸是异亮氨酸(I)。水凝胶可以包含超过一种两亲性肽和/或类肽，例如两种、三种、四种或更多种两亲性肽和/或类肽，其可以在其氨基酸序列、N末端和/或C末端保护基团中不同。水凝胶可以进一步包含非肽聚合物。
在第二个方面，本发明提供了水凝胶。水凝胶包含根据第一个方面的两亲性肽和/或类肽。水凝胶可以在水溶液中在环境温度下稳定至少7天的时期。水凝胶可以在水溶液中在环境温度下稳定至少2至4周的时期。水凝胶可以在水溶液中在环境温度下稳定至少1至6个月的时期。水凝胶机械特性可以由小于1的损耗模量G”与储能模量G’比来表征。水凝胶的特征可以在于储能模量G’的量级以最小系数1.5大于损耗模量G”。水凝胶的特征可以在于在范围为0.02Hz-16Hz的频率下100Pa-80,000Pa的储能模量G’。水凝胶的特征可以在于伴随肽浓度的增加更高的储能模量G’。水凝胶可以具有比胶原或水解形式(明胶)更高的机械强度。水凝胶可以包含本文描述的两亲性肽和/或类肽的纤维。纤维可以限定出能够束缚下述中的至少一种的网络：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。水凝胶可以包含被两亲性聚合物的纤维网络所束缚的下述中的至少一种：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。两亲性聚合物的纤维与可以被两亲性聚合物的纤维网络所束缚的下述中的至少一种偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。下述中的至少一种还可以与非肽聚合物偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。水凝胶可以包含于下述中的至少一种之中：燃料电池、太阳能电池、电子电池、生物感应装置、医疗装置、植入物、伤口敷料、药物组合物、药物和疫苗递送系统、组织培养基、生物传感器装置和化妆品组合物。药物组合物或化妆品组合物以局部凝胶或乳膏、喷雾剂、粉末或片、贴剂或膜的形式提供。药物组合物或化妆品组合物还可以以可注射溶液的形式提供，所述可注射溶液优选在注射到体内后原位胶凝。水凝胶可用于下述中的至少一种的(控制或持续)释放：药学活性化合物、医学工具试剂盒、燃料电池、太阳能电池、电子电池、组织再生、组织置换、伤口愈合、皮肤护理、干细胞治疗和基因治疗。在一些实施方案中，水凝胶可以用于组织再生、药物释放或基因治疗。
在第三个方面，本发明提供了制备水凝胶的方法。该方法包括提供根据第一个方面的两亲性肽和/或类肽。该方法进一步包括将两亲性肽和/或类肽溶解和/或分散于水溶液中。在水溶液中溶解/分散的两亲性肽和/或类肽可以进一步暴露于温度。温度可以选自约20℃至约90℃，优选20℃至70℃的范围。两亲性肽和/或类肽可以以约0.01μg/ml至约100mg/ml的浓度溶解。两亲性肽和/或类肽可以以约1mg/ml至约50mg/ml的浓度溶解。两亲性肽和/或类肽可以以约1mg/ml至约30mg/ml的浓度溶解和/或分散。该方法可以进一步包括下述步骤中的至少一个：添加至少一种生物活性剂；添加至少一种非肽聚合物；添加至少一种胶凝增强剂；添加至少一种缓冲液，优选至少一种生理学可接受的缓冲液。在一些实施方案中，胶凝增强剂可以是盐或盐溶液，在其他实施方案中，胶凝增强剂可以是交联剂。在一些实施方案中，所述添加至少一种非肽聚合物进一步包含将至少一种非肽聚合物与两亲性肽和/或类肽混合或交联。
在第四个方面，本发明提供了手术植入物或支架。手术植入物或支架包括肽和/或类肽骨架。肽和/或类肽骨架通过根据第二个方面的水凝胶限定。
在第五个方面，本发明提供了药物组合物和/或化妆品组合物。药物组合物和/或化妆品组合物包括根据第一个方面的肽和/或类肽或根据第二个方面的水凝胶。药物组合物和/或化妆品组合物可以包含药学活性化合物。药物组合物和/或化妆品组合物可以包含药学可接受的载体。
在第六个方面，本发明提供了试剂盒。试剂盒包括第一容器和第二容器。第一容器包括根据第一个方面的肽和/或类肽。第二容器包括水溶液。第二容器的水溶液可以进一步包含药学活性化合物。具有两亲性肽和/或类肽的第一容器可以进一步包含药学活性化合物。可替代地，试剂盒包含具有根据第一个方面的两亲性肽和/或类肽的水溶液的第一容器，以及具有胶凝增强剂的第二容器。在一些实施方案中，容器可以作为喷雾瓶或注射器或者注射器的区室提供。
在第七个方面，本发明提供了组织再生或组织置换的方法。
在第八个方面，本发明提供了伤口处理的方法。
在审阅与附图结合的本发明的具体实施方案的下述描述后，本发明的其他方面和特点对于本领域技术人员变得显而易见。
附图简述
本发明的实施方案现通过参考附图进行描述，其中：
图1A至1J代表能够形成水凝胶的本发明的一些示例性肽的分类列表。这些肽是其中整个肽由单一线性两亲性序列组成的实施方案。形成水凝胶的肽以短代码命名，但公开了其各个序列。这些例子的肽由含有3-7个氨基酸的天然氨基酸序列组成。N末端是乙酰化的，其去除电荷，否则将限制肽的两亲性特征。
图2描述了在最低浓度下基于肽的水凝胶的胶凝照片。
图3描述了关于以5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml浓度的Ac-AS-6(Ac-AIVAGS)(L)的胶凝照片。
图4描述了从肽单体自组装为凝聚纤维的超分子网络的假设。(A)据认为通过改变为α-螺旋构象以两个肽单体的反向平行配对起始组装。随后，肽对组装为纤维和纳米结构。肽纤维凝聚为纤维聚集物导致水凝胶形成。
图5描述了Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)(10mg/ml)的水凝胶的环境扫描电子显微镜(ESEM)图像，其中图5A、图5B和图5C是在4℃的温度下伴随以10KV的HV在260X、1000X、2000X、2400X、4000X的放大率下获得的图像。图像指示纤维结构的形成。
图6显示了Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)(15mg/ml)的水凝胶的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像，其中图6A-D是伴随以10KV的HV在6000X、45000X、45000X和40000X的放大率下获得的图像。
图7描述了在12KV下在50X(图7A)和20000X(图7B)的放大率下，Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(D)水凝胶(20mg/ml)的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像。
图8显示了在120X(图8A)和450X(图8B)下获得的，Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(D)(20mg/ml)水凝胶的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像。
图9Aa)-f)显示了如通过场发射扫描电子显微镜测定的，肽骨架的形态和结构评估。(a-f)(a)在20mg/mLAc-AD6(Ac-AIVAGD)(D)水凝胶冻干后观察到蜂窝多孔结构。这些孔以凝聚纤维的膜为界，如在15mg/mL(b)和20mg/mL(c)Ac-ID3(Ac-IVD)(L)水凝胶的特写视图中所示。20mg/mLAc-AD6(L)水凝胶的进一步放大揭示单根纤维(d,e)。在更低浓度下，0.1mg/mLAc-LD6(Ac-LIVAGD)(L)，观察到纳米结构(f)。
图9B显示了在1000x的放大率、12KV的HV下获得的图像，图9C在2500x的放大率、12KV的HV下获得，图9D在4000x的放大率、10KV的HV下获得，图9E在35000x的放大率、10KV的HV下获得，图9F在80000x的放大率、5KV的HV下获得，图9G在120000x的放大率、10KV的HV下获得，并且图9H在200000x的放大率、10KV的HV下获得。
图10显示了(a)Far-UVCD光谱，其证实随着浓度增加，存在从无规卷曲(低于阈值浓度)到α-螺旋(222和208nm峰)和进一步的β型(在218nm处的阴性带)结构的Ac-LD6(Ac-LIVAGD)肽构象过渡。加热样品以促进胶凝增加β型聚集。(b)低于阈值浓度，0.2mg/mLAc-LD6的无规卷曲构象受从25℃到90℃的逐步温度增加(实线)和冷却(虚线)可逆影响。(c,d)在1mg/mLAc-LD6凝胶中，高于阈值浓度，逐步温度增加(c)不可逆地稳定β型结构，从而使得后续冷却(d)不改变CD光谱。(e)以不同浓度的AcID3(Ac-IVD)的远UVCD光谱。所有曲线均在25℃下完成。
图11显示了流变学。(a,b)通过在0.1％应力下，分别在25℃和50℃下，根据角频率测量储能模量(G’)，来测定以20mg/mL浓度的不同肽水凝胶的高机械强度。凝胶证实与明胶相比较良好的热稳定性，所述明胶在50℃下液化(因此在4B中排除)。(c)机械强度是浓度的函数，如由在0.1％应力下在25℃下，使用Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)的振荡频率扫描研究测定的。(d)增加盐浓度减少G’，降低10mg/mLAc-LD6(L)水凝胶的刚性，证实胶凝的可调节性和可逆性。
图12显示了关于基于肽的水凝胶的流变学测量的进一步例子。图12A和图12B描述了对于以20mg/ml浓度的Ac-AD6(Ac-AIVAGD)(L)和Ac-AD6(D)，在25℃和50℃的温度下的振荡波幅扫描研究，使用[1rad-s]的恒频和0.8mm的间隙。图表指示在25℃和50℃的温度下，模量[Pa]相对于应力(％)的曲线。线性粘弹性范围在0.07％-0.2应力％下在25℃和50℃的温度下观察到。图12C和图12D描述了对于以20mg/ml浓度的Ac-AD6(L)和Ac-AD6(D)，在25℃和50℃的温度下的振荡频率扫描研究，使用0.1-100[Rad/s]的不同频率范围以及0.1％线性粘弹性范围的恒定应力[％]和0.8mm的间隙。
图13显示了关于基于肽的水凝胶的流变学测量的进一步例子。描述了在25℃的温度与0.1％应力下uv交联肽的频率扫描研究。
图14描述了关于明胶-1890(A型，猪皮)的流变学测量。该图显示了当应用不同频率时，在25℃下获得的模量数据。
图15举例说明了使用进一步的细胞系，本发明的基于肽的水凝胶的生物相容性。图15A显示了在DMEM培养基中的Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)水凝胶上种植后，在最佳条件下生长72小时，人原代肾小管细胞(HPRTC)的显微镜检查图像。图15B显示了在组织培养塑料上种植后，在最佳条件下生长72小时，人原代肾小管细胞(HPRTC)的显微镜检查图像。图15C显示了在DMEM培养基中的Ac-LD6(L)凝胶上种植后，在最佳条件下生长72小时，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微镜检查图像。图15D显示了在组织培养塑料上种植后，在最佳条件下生长72小时，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微镜检查图像。
图16是在本发明的水凝胶的存在下，关于细胞活力的进一步举例说明。人成纤维细胞在Ac-LD6(Ac-LIVAGD)(L)(5mg/ml)的存在(图16A)和不存在(图16B)下进行培养。显示了异硫氰酸荧光素(FITC)染色的细胞(左图)、德克萨斯红染色的细胞(中图)、以及用FITC和德克萨斯红两者染色的细胞(右图)。
图17显示了通过在自组装期间掺入(A)具有超短肽的线性和(B)分支聚合物，来产生复合聚合物-肽水凝胶。所得到的水凝胶具有更佳的机械特性(由于交联和增加的弹性)和(C)提供掺入生物活性功能性以调节免疫和生理应答的机会。
图18显示了超短肽水凝胶促进烧伤伤口中的坏死性焦痂组织的自溶性清创，且增强伤口挛缩。(A)如通过肉眼检查观察到的，与相比较，Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)和Ac-IK6(Ac-ILVAGK-NH2)水凝胶候选物证实更早的自溶性清创开始和完成。(B)皮肤样品的肉眼组织学分析(第7天)证实对于用肽水凝胶敷料的伤口的自溶性清创完成。如通过红色箭头标记的，对于用AcIK6和AcLK6水凝胶处理的烧伤面积的坏死表皮层丧失，与对于用敷料的伤口粘附至真皮的表皮组织的残留部分形成对比。(C)超短肽水凝胶AcIK6和AcLK6促进止血和伤口闭合，导致到第14天时几乎完全的伤口愈合。(D)使用数字测面积法定量评估伤口愈合揭示AcIK6和AcLK6水凝胶刺激烧伤面积的恢复(混合模型分析，p<0.05)。
图19显示了在第7和14天时的烧伤伤口愈合的组织学评估。(A)如在第7天时检查的，对于所有损伤，组织损害穿透中/深层真皮组织。对于敷料的样品观察到坏死的表皮组织，而对于Ac-IK6(Ac-ILVAGK-NH2)和Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)水凝胶敷料的损伤，观察到焦痂表皮组织的完全清创。(B)在第7天时，对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶敷料的损伤，在受损和健康组织的边界处，观察到健康基底细胞从表皮-真皮连接和邻近的未损伤毛干浸润到损伤组织内。(C)与第7天相比较，在第14天时的损伤组织恢复。特别地，对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶处理的伤口，达到几乎完全的表皮再生。(D)对于用Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶敷料的伤口，在损伤部位的边界处，显著更高程度的细胞复制已在位于毛囊的基底细胞中发生。
图20显示了根据本发明的水凝胶的不同制剂。(A)水凝胶贴剂。(B)可以重构成水凝胶的膜。(C)掺入次级组分(例如生物活性治疗剂)的喷雾剂。刺激应答性的肽亚类(具有赖氨酸或相似氨基酸作为极性首基)可以进一步用于产生产物，当两种喷雾流相遇时，所述产物仅原位胶凝。(D)局部水凝胶和有机凝胶。(E)膜再水合为水凝胶，其可以通过超声处理得到加速。
图21显示了允许刺激应答性胶凝，例如在以生理浓度的盐的存在下的胶凝的肽亚类。(A)最低限度胶凝浓度在盐的存在下减少。互换在N末端处的氨基酸Ile和Leu进一步促进胶凝。(B)与在纯水中溶剂化的水凝胶相比较，这个亚类的机械强度在更高的盐浓度例如盐水和磷酸盐缓冲盐水的存在下增加。(C)赖氨酸残基的脂肪族链长对胶凝没有显著作用，如通过比较Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)、Ac-L(Orn)6(Ac-LIVAG(Orn)-NH2)和Ac-L(Dab)6(Ac-LIVAG(Dab)-NH2)的最低限度胶凝浓度观察到的。
图22证实具有赖氨酸极性头的肽结合核酸的能力。(A)肽Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)在结合且束缚DNA中极为有效。存在最低限度的DNA释放，如经过几天的过程观察到的。Ac-LK6还有效保护DNA不受核酸酶降解(B)。当封装质粒DNA的水凝胶与DNA酶一起温育时，与裸露的DNA对照相比较，未观察到消化的DNA片段。复合的水凝胶片段在电泳期间不迁移出孔，指示肽与寡核苷酸强相互作用，增加质量且从而阻碍通过琼脂糖凝胶的迁移。
图23显示了根据本发明的肽水凝胶增强止血。
图24举例说明了用于椎间盘退变性疾病的可注射治疗。离体提取的猪髓核的机械特性(A)测定为轻微低于我们的可调节肽水凝胶的那种(B)。使用椎间盘退变性疾病的兔模型(C)，评估使用包封MRI造影剂或细胞的肽水凝胶的2种不同处理。(D)水凝胶持续且在2个月后，仍可以使用MRI在髓核空间中检测到，并且在椎间盘解剖后，与未处理的盘相比较，在处理的盘中检测到更多基质样材料。
图25显示了肽水凝胶作为真皮和脂肪填料的用途。(B)将肽水凝胶皮下植入C57BL/6小鼠中。在2个月后，将动物处死，并且收集植入部位用于组织学分析。在所有动物中，对植入物的炎症反应是最低限度到轻度，如由(C)在水凝胶植入物周围的轻度异物型组织学反应(在骨骼肌层下的无定形嗜酸性材料)显而易见的。(D)当人脂肪干细胞包封在Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)肽水凝胶中，且随后皮下植入SCID小鼠内时，脂肪垫在6周后在体内形成。(E)在植入部位处注意到通过由成熟脂肪细胞(F)填充的脂肪组织厚层。这可以潜在应用于脂肪移植，其中目前仅可以实现移植的脂肪组织的30-50％保留。
图26显示了超短肽水凝胶增强伤口挛缩。(a)Ac-ILVAGK-NH2和Ac-LIVAGK-NH水凝胶均加速新表皮组织的再生，如通过再上皮化的面积，E指示的。肉芽G也随着时间过去减少。该图中的所有图像均取自动物H24。用Ac-LIVAGK-NH2水凝胶处理的烧伤损伤到第14天时完全再生其表皮。(b)使用数字测面积法定量评估伤口愈合揭示：与Mepitel相比较，肽水凝胶刺激再上皮化且降低肉芽形成。误差条指示平均值的标准误(n＝6)。
图27给出了关于在伤口愈合期间的不同细胞因子和生长因子谱的概述。在伤口愈合期间，细胞因子和生长因子的复杂相互影响协调不同细胞的迁移和增殖，以介导炎症、肉芽形成、再上皮化、基质形成和重塑的重叠过程。因为已完成不同测定以证实我们的肽是非诱变的、非免疫原性和非变应性的，所以细胞因子谱中的差异可以与愈合过程相关。对于在第7和14天时提取的匀浆化的皮肤样品，对十种细胞因子和生长因子的实验对象组进行多路酶联免疫吸附测定(多路ELISA)。表达水平大部分是可检测的，尽管在针对总样品蛋白质含量标准化后一般很低。在第7天和第14天两时间点时，促炎、抗愈合白细胞介素-2(IL-2)的表达低于测试的所有样品(包括健康皮肤)的检测极限。促炎细胞因子的低表达部分归于下降的肉芽形成和增加的再上皮化(特别对于用Ac-LIVAGK-NH2水凝胶处理的伤口)。对于不同处理组，在平均细胞因子表达的ANOVA分析后获得p值。统计上显著的(p<0.05)变化以粗体表示，并且随后实施事后比较。
图28显示了在14天后，通过用Mepitel和肽水凝胶敷料的烧伤伤口损伤的促炎细胞因子的差异表达。细胞因子浓度针对总蛋白质含量进行标准化。大体上，表达水平很低。统计上显著的(p<0.05)组用符号(*)标记。线指示平均值，而误差条指标准误。进行单因素ANOVA，比较关于三个处理组的不同细胞因子的标准化平均值。在第7天时，在标准化的细胞因子表达水平中，不存在统计上显著的差异(表1)。到第14天时，用Ac-LIVAGK-NH2和Mepitel处理的伤口的细胞因子表达是可比较的。Ac-ILVAGK-NH2引发显著更高的白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达。后面三种是促炎细胞因子。白细胞介素-1α(IL-1α)也轻微升高。IL-1α通过表皮角化细胞组成性产生，以维持屏障功能。当皮肤损伤时，分泌IL-1以刺激胶原前体产生和细胞增殖。IL-1α也与TNF-α协同作用，以诱导炎症且促进再上皮化。IL-6是另一种整合细胞因子，其间接诱导白细胞浸润、基质重塑、血管生成和上皮化。同样地，GM-CSF通过增加角化细胞增殖直接促进再上皮化，且通过上调IL-6间接促进再上皮化。因为用Ac-LIVAGK-NH2处理的伤口已几乎完全再上皮化，所以这些促炎细胞因子的表达已下调；而对于Ac-ILVAGK-NH2，更高水平的IL-1α、IL-6和TNF-α介导进行中的再上皮化。因此，在两种超短肽之间不同的免疫应答可以归于再上皮化速率中的差异。
图29显示了即使当与佐剂共递送时，超短肽也不引发显著的抗体应答。平均UV吸光度可以与接种的动物的血清中存在的特异性抗体的浓度关联。肽水凝胶皮下植入C57BL/6小鼠内，并且在2周后收集血清样品。假对照由对其施用盐水的动物组成。受照射的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)孢子用作阳性对照。在加强免疫应答的尝试中，超短肽Ac-LIVAGK-NH2与完全弗氏佐剂共施用。然而，不生成针对肽的抗体。
发明详述
本发明的示例性实施方案提供了尤其衍生自天然氨基酸的新型类型的形成水凝胶的肽/类肽。这些肽/类肽是具有脂肪族氨基酸的疏水部分和一个或两个极性氨基酸的小型两亲性肽。肽/类肽(通常为3-7聚体)通常是L-或D-型，并且可以自组装成超分子纤维，其组构成网样结构。水凝胶一般特征在于惊人的刚性，并且是生物相容性和无毒的。取决于肽/类肽序列，这些水凝胶可以显示刺激应答性、热应答性和/或触变特征。通过选择肽组装条件，可以控制纤维的厚度和长度以及所得到的水凝胶骨架的机械特性。刚性水凝胶可以用于多种原代人细胞的培养，提供了可以用于不同组织的修复和置换的肽骨架。还公开了制备这些水凝胶的方法。公开了各自水凝胶在诸如下述的应用以及用于技术应用(如例如用于可以包括太阳能或燃料电池的电子装置中)的用途：细胞培养、组织工程、整形手术、药物和疫苗递送、经口应用、化妆品、包装等。
本发明的示例提供了能够形成水凝胶的两亲性肽和/或类肽，所述水凝胶即其中水是分散介质的聚合物网络。两亲性肽和/或类肽包括一种或多种线性两亲性序列，各自具有极性和非极性部分。为了简单起见，下文中的说明在很大程度上集中于两亲性肽和/或类肽，其由单一的线性序列组成。在这些说明中，肽和/或类肽命名为“线性肽和/或类肽”。各说明应用于任何线性序列，其还可以包括在具有多个这些线性序列的两亲性肽和/或类肽中。个别地选择这些线性序列中的每一个。在一些实施方案中，本文公开的两亲性肽和/或类肽包括若干线性两亲性序列，其各自不同于线性两亲性序列中的任何其他。在一些实施方案中，本文公开的两亲性肽和/或类肽包括几个相同的线性两亲性序列。在一个实施方案中，本文公开的两亲性肽和/或类肽包括多个线性两亲性序列，每个线性两亲性序列与每个其他的线性两亲性序列相同。
根据本发明的示例性实施方案的肽和/或类肽包括o个两亲性线性序列。符号o代表在1至约25范围中选择的整数，例如1至约20、1至约18、1至约15、1至约12、1至约10、1至约8、1至约6、1至约51至约4或1至约3。在一些实施方案中，这些两亲性线性序列以连续方式连接，从而限定肽和/或类肽的线性部分。在一些实施方案中，肽和/或类肽具有含一个或多个分支的主链。在此类实施方案中，此类两亲性线性序列可以包括在不同分支上。
如上所述，独立地选择o个两亲性线性序列中的每一个。各个两亲性线性序列具有n个脂肪族氨基酸的长度。符号n代表在3至约18的范围内选择的整数，例如3至约15，3至约14，3至约13，3至约12，3至约11，3至约10，3至约9，3至约8或3至约7，例如3、4、5、6、7、8、9或10个脂肪族氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述的肽和/或类肽的两亲性线性序列是手性的，致使整个两亲性肽和/或类肽手性。相应的线性肽和/或类肽，即由单一的各个线性序列组成的实施方案相应地是手性肽或类肽。各个的两亲性线性序列可以包括任何线性非芳香族氨基酸。如本文使用的，术语“氨基酸”指α-氨基羧酸，即在α-位置中具有氨基的羧酸。分别的氨基可以是-NH2基团或-NHR1基团。部分R1可以是任何脂肪族基团，无论是烷基、烯基还是炔基，其主链包括1至5、至10、至15或至20个碳原子。烯基原子团(radical)的例子是直链或支链烃原子团，其含有一个或多个双键。烯基原子团一般含有约两个至约二十个碳原子以及一个或多个例如两个双键，例如约两个至约十个碳原子和一个双键。炔基原子团通常含有约两个至约二十个碳原子以及一个或多个例如两个三键，优选例如两个至十个碳原子和一个三键。炔基原子团的例子是直链或支链烃原子团，其含有一个或多个三键。烷基的例子是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，这些原子团的正异构体，异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3二甲基丁基。
如本文一般使用的，术语“类肽”意指模拟肽的分子，即“拟肽”。因此，这些术语在本文中可互换使用。通常，“拟肽”或“类肽”模拟肽的行为和/或结构，因为正如肽，它可以具有形成氢键的能力，并且因此具有采取以与肽相同或相似方式的二级结构。取决于其序列，“类肽”或“拟肽”可以采取肽典型的二级结构，例如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和/或其组合。
在一些具体实施方案中，类肽可以是寡(N-烷基)甘氨酸，其类似于与肽的α碳原子连接的侧链(参见下文)，在酰胺氮处携带在本发明中是脂肪族部分的部分。相应地，在其中-NHR1基团(同上)包括在氨基酸中并且α碳原子包括在-CH2-基团中的实施方案中，偶联多个此类氨基酸的反应产物可以被称为类肽。类肽还可以不同于肽，因为它在酰胺氮处而不是在α碳原子处携带其侧链。类肽通常对蛋白酶及其他修饰酶抗性，并且可以具有比肽高得多的细胞渗透性(参见例如Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。
术语“氨基酸”包括其中羧酸基团通过以下述形式的保护基团屏蔽的化合物：酯(包括原酸酯)、甲硅烷酯、酰胺、酰肼、噁唑、1,3-噁唑啉或5-氧代-1,3,-噁唑烷。术语“氨基酸”还包括其中具有形式-NH2或-NHR1(同上)的氨基通过保护基团屏蔽的化合物。合适的氨基保护基团包括但不限于氨基甲酸酯、酰胺、磺酰胺、亚胺、酰亚胺、组氨酸、N-2,5,-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二硅烷基氮杂环戊烷加合物、N-1,1,3,3-四甲基-1,3-二硅异吲哚啉(disilisoindoline)、N-二苯基硅烷基二乙烯、1,3,5-二噁嗪、N-[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲胺、N-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺，N-二-4,4,4-三氟-3-氧代-1-丁烯胺、N-9-硼双环壬烷和硝胺。还可以存在例如以2,2-二甲基-4-烷基-2-硅杂-5-氧代-1,3-噁唑烷形式的保护基团，其屏蔽氨基和羧酸基团两者。氨基酸的α碳原子通常进一步携带氢原子。附着至α碳原子的所谓的“侧链”(其事实上是羧酸的连续主链)是可以为线性或分支的脂肪族部分。术语“侧链”指肽中的氨基酸的存在(同上)，其中主链通过偶联多个氨基酸形成。在此类肽中包括的与氨基酸的α碳原子键合的脂肪族部分随后限定相对于主链的侧链。如上所述，这同样应用于与氨基酸的氨基键合的脂肪族部分，其同样限定相对于类肽主链的侧链。
除非另有说明，否则术语“脂肪族”意指直链或支链烃链，其可以是饱和或者单或多不饱和的且包括杂原子。如本文使用的，术语“杂原子”意指除碳或氢外的任何元素的原子。不饱和的脂肪族基团含有一个或多个双键和/或三键(烯基或炔基部分)。烃链的分支可以包括线性链以及非芳香族环状元件。除非另有说明，否则烃链可以具有任何长度且含有任何数目的分支。通常，烃(主)链包括1至5、至10、至15或至20个碳原子。烯基原子团的例子是直链或支链烃原子团，其含有一个或多个双键。烯基原子团一般含有约两个至约二十个碳原子以及一个或多个例如两个双键，例如约两个至约十个碳原子和一个双键。炔基原子团通常含有约两个至约二十个碳原子以及一个或多个例如两个三键，优选例如两个至十个碳原子和一个三键。炔基原子团的例子是直链或支链烃原子团，其含有一个或多个三键。烷基的例子是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，这些原子团的正异构体，异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3二甲基丁基。主链以及分支两者均可另外含有杂原子例如N、O、S、Se或Si，或者碳原子可以替换为这些杂原子。
脂肪族部分可以由一个或多个官能团取代或未取代。取代基可以是任何官能团，例如但不限于氨基、酰氨基、叠氮基、羰基、羧基、酮基、氰基、异氰基、二噻烷、卤素、羟基、硝基、有机金属、有机硼、硒基、甲硅烷基、硅基(silano)、磺酰基、硫基、硫氰基、三氟甲基磺酰基、对甲苯磺酰、溴苯磺酰基、硝基苯磺酰基和甲磺酰基。
如由上文显而易见的，本文描述的肽/类肽中的氨基酸侧链可以具有0至约5、至约10、至约15或至约20碳原子的长度。它可以是分支的且包括不饱和碳-碳键。在一些实施方案中，一种或多种天然氨基酸包括在肽或类肽中。此类天然氨基酸可以是天然存在的蛋白质的20种构件块之一。
在肽或类肽包括本文公开的肽或类肽中，各氨基酸经由在第一个氨基酸的羧酸基团和第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键共价偶联。本文公开的肽和/或类肽是非重复的，从而使得彼此偶联的两个氨基酸始终彼此不同。
术语两亲性的指在极性和非极性流体两者中均可溶的化合物。它还涵盖多相化合物。肽和/或类肽的两亲性性质是由于在同一肽和/或类肽内的极性和非极性部分两者的存在。在这点上，肽和/或类肽可以具有表面活性剂性质。相应地，根据本发明的一个实施方案的肽和/或类肽的极性特性基于极性部分。两种此类部分是-COOH侧基，特别是荷电COO-基团形式和氨基。进一步的此类部分是C末端-COOH基团，如果它以游离、未保护形式存在。一般地，表面活性剂分子包括极性(通常为亲水的)首基，其附着至非极性(通常为烃)部分。肽或类肽的非极性部分包括不携带官能团的烃链。
在本发明的一个实施方案的肽和/或类肽中包括的两亲性线性序列因此包括极性部分和非极性部分。极性部分包括脂肪族氨基酸，其携带极性基团，例如羟基、硫醇基、硒基、氨基、酰胺基、醚基、硫醚基或硒醚基。相应地，极性部分可以包括氨基酸，其携带具有质子的极性官能团，例如羟基、硫醇、硒、胺或酰胺。极性部分还可以包括肽和/或类肽的C末端或N末端。在此类情况下，C末端或N末端可以分别以游离羧基或氨基的形式(即，不含保护基团)存在。
一般地，本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽的线性两亲性序列的极性部分通过与肽/类肽的非极性部分偶联的单个氨基酸、两个连续氨基酸或三个连续氨基酸限定。相应地，在一些实施方案中，肽/类肽的极性部分由经由酰胺键共价偶联的两个氨基酸组成，两个氨基酸均携带极性肽/类肽侧链。这两个氨基酸之一可以是肽/类肽的末端氨基酸，限定其N或C末端。在一些实施方案中，两亲性肽/类肽具有含极性侧链的单个氨基酸，而肽/类肽的残留部分限定非极性部分。在一些实施方案中，两亲性肽/类肽具有含极性侧链的两个氨基酸，而肽/类肽的剩余部分限定非极性部分。作为分别的极性侧链的三个举例说明性例子可以是4-甲基-4-硫代戊基、6-乙氧羰基-4,5-二甲基己基和6-羟基-4-(1-羟乙基)-己基。如本文使用的，相应的肽/类肽侧链的编号在碳原子处以“1”开始，所述碳原子分别与氨基酸的α-碳原子或氨基酸的氨基共价键合。在极性部分中包括的氨基酸可以是或包括但不限于天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、4-氟-谷氨酸、2-氨基己二酸、γ-羧基谷氨酸、4-叔丁基天冬氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、5-羟赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸。任何此类氨基酸均可以L-或D-型存在。
本发明的一个实施方案的两亲性肽/类肽的两亲性线性序列可以定义为具有n个氨基酸。当具有极性侧链的单个氨基酸包括在两亲性线性序列中时，非极性部分随后可以具有n-1个氨基酸。在这种情况下，极性部分由确切地一个氨基酸组成，此类氨基酸选自前述段落的任何氨基酸。当具有极性侧链的两个连续氨基酸包括在肽/类肽的两亲性线性序列中时，非极性部分随后可以具有n-2个氨基酸。在这种情况下，极性部分由确切地两个氨基酸组成。当具有极性侧链的三个连续氨基酸包括在两亲性线性序列中时，非极性部分随后可以具有n-3个氨基酸。在这种情况下，极性部分由确切地三个氨基酸组成。在其中极性部分由两个氨基酸组成的实施方案中，极性部分可以具有选自下述的序列：Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-Asp、Thr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu、Cys-Asp、Cys-Lys、Cys-Ser、Cys-Thr、Cys-Orn、Cys-Dab、Cys-Dap、Lys-Lys、Lys-Ser、Lys-Thr、Lys-Orn、Lys-Dab、Lys-Dap、Ser-Lys、Ser-Orn、Ser-Dab、Ser-Dap、Orn-Lys、Orn-Orn、Orn-Ser、Orn-Thr、Orn-Dab、Orn-Dap、Dab-Lys、Dab-Ser、Dab-Thr、Dab-Orn、Dab-Dab、Dab-Dap、Dap-Lys、Dap-Ser、Dap-Thr、Dap-Orn、Dap-Dab、Dap-Dap。在其中极性部分由三个氨基酸组成的实施方案中，极性部分可以具有选自下述的序列：Asn-Asn-Asn、Asn-Asn-Asp、Asn-Asp-Asn、Asp-Asn-Asn、Asp-Asp-Asn、Asp-Asn-Asp、Asp-Asp-Asp、Asn-Asn-Glu、Asn-Asn-Gln、Asn-Glu-Asn、Asn-Gln-Asn、Glu-Glu-Glu、Gln-Gln-Gln、Asn-Gln-Gln、Asn-Glu-Gln、Asp-Asn-Glu、Gln-Asn-Asn、Gln-Asn-Asn、Glu-Asp-Gln、Asp-Gln-Asp、Asn-Glu-Asp、Glu-Asn-Gln、Asp-Glu-Gln、Asn-Glu-Gln、Glu-Asp-Asn和Gln-Asp-Asn、Thr-Thr-Thr、Ser-Ser-Ser、Asn-Thr-Thr、Asn-Ser-SerAsn-Ser-Thr、Asn-Thr-SerAsp-Asn-Ser、Ser-Asn-Asn、Thr-Asn-Asn、Ser-Asp-Thr，仅举几个例子。
肽/类肽的两亲性线性序列在生理学pH下具有净电荷。术语“生理学pH”本领域技术人员已知指血液的pH值，其通常具有约7.4的pH值。在其中两亲性线性序列排列在肽/类肽的C或N末端处的实施方案中，分别的末端可以提供相应的净电荷。在其中两亲性线性序列不排列在肽/类肽的C或N末端处的实施方案中，两亲性线性序列的极性部分包括一个或多个氨基酸，其具有含官能团的侧链，所述官能团在生理学pH下是荷电的。分别的官能团的举例说明性例子包括氨基、硝基、胍基、酯基、磺酰基或羧基。在一些实施方案中，两亲性线性序列的净电荷作为正电荷或负电荷等于或小于其极性部分中包括的氨基酸数目。在一些实施方案中，两亲性线性序列的净电荷是-3、-2或-1之一。在一些实施方案中，两亲性线性序列的净电荷是+1、+2或+3。
与氨基酸的α-碳原子(同上)和/或其氨基偶联的极性部分的氨基酸的各极性侧链，通常可以通过主链限定，所述主链包括1至约20，包括1至约15、1至约10或1至约5个碳原子。为了清楚起见，叙述术语“侧链”相对于肽和/或类肽的主链使用。这种肽和/或类肽侧链可以是分支的，并且因此通过主链和分支限定。肽和/或类肽的主链和分支(如果存在的话)两者均可包括一个或多个双键或三键(同上)。侧链的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丙烯基、丙炔基、丁基、丁烯基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、新戊基、异戊基、戊基、己基、3,3二甲基丁基、庚基、辛基、壬基或癸基基团。极性官能团与这种肽和/或类肽侧链键合。
在一些实施方案中，两亲性线性序列的极性部分包括两个相同的氨基酸。当这些氨基酸是天然存在的氨基酸时，它们可例如限定序列Lys-Lys、Gln-Gln、Glu-Glu、Asp-Asp、Asn-Asn、Met-Met、Thr-Thr、Arg-Arg或Ser-Ser之一。在这种背景下，术语“天然存在的”指遗传密码通过任何生物直接翻译的20种氨基酸。此类两个相同的极性氨基酸可以例如与非极性部分邻接。
在一些实施方案中，肽/类肽的两亲性线性序列具有脂肪族氨基酸的疏水尾和至少一个极性的包括荷电的氨基酸首基。
非极性部分包括具有烃链的氨基酸，一般为至少两个氨基酸，所述烃链不携带官能团。与氨基酸的α-碳原子偶联(同上)的各侧链可以具有主链，其包括0至约20或1至约20，包括0至约15、1至约15、0至约10、1至约10、1至约5或0至约5个碳原子。非极性部分因此可以包括不含侧链的氨基酸，即甘氨酸。肽和/或类肽侧链可以是分支的(同上)，并且包括一个或多个双键或三键(同上)。肽和/或类肽侧链的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丙烯基、丙炔基、丁基、丁烯基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、新戊基、异戊基、戊基、己基、3,3二甲基丁基、庚基、辛基、壬基或癸基群体。作为几个举例说明性例子，非极性部分可以包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-(甲基氨基)-异丁酸、2-氨基-5-己炔酸的氨基酸。此类氨基酸可以以任何所需构型存在。与非极性部分的键合还可以是肽/类肽的C末端或N末端。通常，C末端或N末端在此类情况下通过保护基团(同上)屏蔽。
在一些实施方案中，非极性部分包括以递减或递增尺寸排列的氨基酸序列。因此，非极性部分的氨基酸部分可以以递减或递增尺寸的一般序列排列。相对于从N末端到C末端或从C末端到N末端的方向，这种一般序列因此可以具有递减尺寸。术语递减或递增尺寸的“一般序列”意指包括的实施方案，其中邻接氨基酸具有大约相同的尺寸，只要存在尺寸中的一般减少或增加。在尺寸递减的一般序列内，非极性部分的邻接氨基酸的尺寸相应地在尺寸递减的一般序列的方向上相同或更小。在一些实施方案中，尺寸递减或递增的一般序列是非重复序列。
作为举例说明性例子，当各部分的氨基酸是五个氨基酸的序列时，第一个氨基酸可以具有3,4-二甲基-己基侧链。第二个氨基酸可以具有新戊基侧链。第三个氨基酸可以具有戊基侧链。第四个氨基酸可以具有丁基侧链。第五个氨基酸可以是甘氨酸，即不含侧链。尽管新戊基和戊基侧链具有相同尺寸，但此类非极性肽部分的一般序列尺寸递减。作为在非极性部分中尺寸递减的一般序列的进一步举例说明例子，非极性部分可以是具有三个氨基酸的序列。第一个氨基酸可以具有正壬基侧链。第二个氨基酸可以具有3-乙基-2-甲基-戊基侧链。第三个氨基酸可以具有叔丁基侧链。作为在非极性部分中尺寸递减的一般序列的再进一步举例说明性例子，非极性部分可以是九个氨基酸的序列。第一个氨基酸可以具有4-丙基-壬基侧链。第二个氨基酸可以具有正十二烷基侧链。第三个氨基酸可以具有6,6-二乙基-3-辛烯基侧链。正十二烷基侧链和6,6-二乙基-3-辛烯基侧链两者均具有12个碳原子，并且因此再次具有可比较的尺寸。然而，6,6-二乙基-3-辛烯基包括不饱和碳-碳双键，并且因此具有比十二烷基略微更小的尺寸。第四个氨基酸可以具有2-甲基-壬基侧链。第五个氨基酸可以具有3-丙基-己基侧链。第六个氨基酸可以具有正己基侧链。第七个氨基酸可以具有2-丁炔基侧链。第8个氨基酸可以具有异丙基侧链。第九个氨基酸可以具有甲基侧链。
当以尺寸递减(或递增)的一般序列排列的非极性部分的氨基酸部分仅含有天然存在的氨基酸(无论以D-还是L-型)时，它可以例如具有五个氨基酸的长度，例如序列亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸或异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸。仅具有天然氨基酸的尺寸递减的一般序列还可以具有四个氨基酸的长度。举例说明性例子包括异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸或异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸。仅具有天然氨基酸的尺寸递减的一般序列还可以具有三个氨基酸的长度。举例说明性例子包括序列异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸、异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸、亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸或异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸。仅具有天然氨基酸的尺寸递减的一般序列还可以具有两个氨基酸的长度。举例说明性例子包括序列异亮氨酸-缬氨酸、亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-丙氨酸、亮氨酸-甘氨酸、异亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-甘氨酸或丙氨酸-甘氨酸。
在一些实施方案中，尺寸递减的一般序列的上文限定的尺寸递减方向是针对两亲性线性序列的极性部分的方向。相应地，在此类实施方案中，在非极性部分的这个部分内的邻接氨基酸的尺寸相应地在极性部分的方向上相同或更小。因此，作为此类实施方案中的一般趋势，越接近于两亲性线性序列的极性部分，在尺寸递减的分别一般序列自始至终越小的是肽和/或类肽侧链的总体尺寸。在具有正壬基、3-乙基-2-甲基戊基和叔丁基侧链的三个氨基酸的一般序列的上文举例说明性例子中，下一个氨基酸可以是极性的，因为它携带具有极性官能团的肽/类肽侧链。作为举例说明性例子，与肽/类肽内的叔丁基侧链邻接，可以存在3-羧基-正丁基侧链。
在一些实施方案中，两亲性线性肽和/或类肽或两亲性线性序列的整个非极性部分分别由尺寸递减(或递增)的一般序列组成。在此类实施方案中，尺寸递减(或递增)的一般序列可以具有n-m个氨基酸的长度(参照上文)。在一些实施方案中，递减或递增尺寸的一般序列的侧翼是肽/类肽的另外的非极性侧链。在一个实施方案中，尺寸递减(或递增)的一般序列具有n-m-1个氨基酸的长度。在这个实施方案中，存在在肽/类肽中包括的另一个氨基酸，提供非极性肽/类肽侧链。该氨基酸可以位于尺寸递减(或递增)的一般序列和极性氨基酸之间，该极性氨基酸可以位于该另外的非极性氨基酸和尺寸递减(或递增)的一般序列之间，或尺寸递减(或递增)的一般序列可以位于极性氨基酸和该另外的非极性氨基酸之间。通常，尺寸递减(或递增)的一般序列位于极性氨基酸和该另外的非极性氨基酸之间。另外的非极性氨基酸可以例如限定肽/类型的N末端，其可以通过保护基团例如酰胺，例如丙酰基或乙酰基屏蔽。连同如上定义的尺寸递减(或递增)的一般序列，它可以限定肽/类肽的非极性部分。极性氨基酸可以限定肽/类肽的C末端。在这个例子中，尺寸递减(或递增)的一般序列的侧翼因此在一侧是极性氨基酸，且在另一侧是另外的非极性氨基酸。在一个实施方案中，在实施方案中尺寸递减(或递增)的一般序列具有n-m-1个氨基酸的长度，n-m个氨基酸的非极性部分的剩余非极性氨基酸是丙氨酸和甘氨酸之一。
如上所述，在一些实施方案中，两亲性线性序列的极性部分可以通过两个或三个连续氨基酸限定。极性部分包括m个脂肪族氨基酸。m个脂肪族氨基酸各自独立地选择且携带独立地选择的极性基团。符号m代表选自1、2和3的整数。至少基本上非极性部分(同上)相应地具有n-m的数目，即n-1、n-2或n-3个氨基酸。在一些实施方案中，n等于或大于m+2。在此类实施方案中，m因此可以代表n-2或更小的数目。
在其中两亲性线性肽和/或类肽的整个非极性部分由尺寸递减(或递增)的一般序列(同上)组成的一个实施方案中，该非极性部分因此可以具有n-2或n-3个氨基酸的长度。在其中两亲性线性肽和/或类肽具有除尺寸递减(或递增)的非极性部分之外的另外的非极性侧链的一个实施方案中，该另外的非极性侧链可以包括在与尺寸递减(或递增)的一般序列的氨基酸直接键合的氨基酸中。非极性部分因此可以通过尺寸递减(或递增)的非极性部分和具有非极性侧链的分别的进一步的氨基酸限定。在其中m＝1的一个此类实施方案中，非极性部分因此可以具有n-2个氨基酸的长度，其中尺寸递减(或递增)的非极性部分具有n-3个氨基酸的长度。尺寸递减(或递增)的一般序列可以位于两个极性氨基酸和该另外的非极性氨基酸之间，或另外的非极性氨基酸可以位于尺寸递减(或递增)的一般序列和两个极性氨基酸之间。通常，尺寸递减(或递增)的一般序列位于两个极性氨基酸和该另外的非极性氨基酸之间。如上所述，两个极性氨基酸之一可以限定肽/类肽的C末端。在这个例子中，尺寸递减(或递增)的一般序列的侧翼因此可以在一侧是两个连续的极性氨基酸，且在另一侧是另外的非极性氨基酸。再次，在其中m＝1的一些实施方案中，两个连续的极性氨基酸还可以位于尺寸递减(或递增)的一般序列和另外的非极性氨基酸之间，在所述情况下，非极性部分具有长度为n-3个氨基酸的第一部分和一个氨基酸的进一步部分。
如上定义的两亲性线性序列包括两亲性线性肽和/或类肽之间的静电力、氢键和范德华力导致这些两亲性线性序列彼此偶联。不受理论束缚，从而发生交联效应，其允许水凝胶形成。在这点上，本发明人已观察到基于螺旋结构的纤维形成。
本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽的两亲性线性序列形成的纤维通常显示高机械强度，这致使其可特别用于组织再生应用，例如损伤组织的置换。已观察到本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽一般组装成类似胶原纤维的纤维结构。胶原(动物和人体中的软组织的组分)是提供组织的大部分拉伸强度的纤维蛋白质。已发现本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽的纤维的机械强度通常比胶原和明胶(胶原的水解形式)的机械强度高得多。本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽因此可以包括在水凝胶中，所述水凝胶用作损伤或患病组织的永久或暂时的假体置换。
已发现可以代表整个两亲性肽/类肽(同上)的肽/类肽的两亲性线性序列在生理条件下，甚至在高温下也显示惊人的稳定性。在一些实施方案中，它在水溶液中在生理条件下在环境温度下稳定范围为1天到1个月或更久的时间段。在一些实施方案中，它在水溶液中在生理条件下在90℃下稳定至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时或至少5小时。
本发明的一个实施方案的两亲性肽和/或类肽的两亲性线性序列，包括两亲性线性肽和/或类肽，能够提供在水溶液中在生理条件下自组装的α-螺旋纤维。L-或D-型的肽/类肽(通常为3-7聚体)可以自组装成超分子螺旋纤维，其组构成模拟生物物质例如胶原的网样结构。先前在X射线晶体学中已观察到长度为3-6个氨基酸具有重复含丙氨酸的序列和乙酰化的C末端的肽采取螺旋构象(Hatakeyama,Y等人，Angew.Chem.Int.Ed.(2009)8695-8698)。使用具有本发明的一个实施方案的两亲性序列的肽，AcLD6(L)，聚集物的形成已例如在0.1mg/ml下观察到。随着肽的浓度增至1mg/ml，发现肽单体对齐以形成纤维结构。随着在生理条件下在低于2mM的浓度下发生的纤维形成，本发明的一个实施方案的肽/类肽非常适合作为可注射的水凝胶材料，其可以在生理条件下形成水凝胶。本发明的一个实施方案因此还涉及用于组织工程以及组织工程方法的如上定义的两亲性线性肽和/或类肽，所述组织工程方法涉及应用(包括注射)各两亲性线性肽和/或类肽。
根据本发明的一个实施方案的水凝胶通常的特征在于惊人的刚性，并且一般是生物相容性和无毒的。取决于所选肽/类肽序列，这些水凝胶可以显示热应答性或触变特征。依赖肽/类肽组装条件，纤维在厚度和长度上不同。一般地，获得刚性水凝胶，其非常适合于培养多种原代细胞，提供可以用于不同组织的修复和置换的肽/类肽骨架。还公开了制备这些水凝胶的方法。描述了这些水凝胶在诸如细胞培养、组织工程、骨科手术、美容/整形手术、药物和疫苗递送、经口应用、化妆品、包装等应用中的示例性用途，以及用于技术应用，例如用于可以包括太阳能或燃料电池的电子装置中的示例性用途。
作为肽/类肽的两亲性线性序列，本发明的一个实施方案的水凝胶在生理条件下，甚至在高温下也显示高稳定性。在一些实施方案中，此类水凝胶在水溶液中在环境温度下稳定至少7天、至少14天、至少一个月或更久，例如至少1至约6个月的时期。
在一些实施方案中，本文公开的水凝胶与具有特征性光谱或荧光特性的分子或颗粒(包括量子点)偶联，例如标记物，包括荧光染料和MRI造影剂。各分子可以例如允许监控水凝胶的命运、位置和/或完整性。在一些实施方案中，本文公开的水凝胶与对于选定的靶分子具有结合亲和力的分子偶联，所述选定的靶分子例如微生物、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、肽、寡糖、多糖、无机分子、合成聚合物、有机小分子、药物或细胞。
如本文使用的，术语“核酸”或“核酸分子”指以任何可能构型的任何核酸，例如单链、双链或其组合。核酸包括例如DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物或使用核酸化学生成的DNA或RNA的类似物、锁核酸(LNA)和蛋白质核酸分子(PNA)。DNA或RNA可以具有基因组或合成起源，并且可以是单链或双链的。在本发明的一个实施方案的方法中，通常(但不一定)使用RNA或DNA分子。此类核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。各核酸可以另外含有非天然核苷酸类似物和/或连接至亲和标签或标记。在一些实施方案中，核酸分子可以是分离、富集或纯化的。核酸分子可以例如通过DNA克隆或差减杂交从天然来源中分离。天然来源可以是哺乳动物，例如人、血液、精液或组织。核酸还可以例如通过三酯法或通过使用自动化DNA合成仪进行合成。
许多核苷酸类似物是已知的，并且可以用于本发明的示例性实施方案的方法中使用的核酸和寡核苷酸中。核苷酸类似物是含有在例如碱基、糖或磷酸盐部分处的修饰的核苷酸。在碱基部分处的修饰包括A、C、G和T/U的天然和合成修饰，不同嘌呤或嘧啶碱基，例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基，以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基。其他核苷酸类似物充当通用碱基。通用碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够与任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰通常可以与例如糖修饰例如2'-O-甲氧乙基组合，例如以实现独特特性例如增加的双链体稳定性。
肽可以具有合成起源或通过本领域众所周知的方法从天然来源中分离。天然来源可以是哺乳动物，例如人、血液、精液或组织。肽包括多肽可以例如使用自动化多肽合成仪进行合成。多肽的举例说明性例子是抗体、其片段和具有抗体样功能的蛋白质性质结合分子。(重组)抗体片段的例子是Fap片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双抗体、三抗体(Iliades,P.,等人，FEBSLett(1997)409,437-441)、十抗体(decabodies)(Stone,E.,等人，JournalofImmunologicalMethods(2007)318,88–94)及其他结构域抗体(Holt,L.J.,等人，TrendsBiotechnol.(2003),21,11,484-490)。具有抗体样功能的蛋白质结合分子的例子是基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白质(WO03/029462,Beste等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂质运载蛋白例如胆色素结合蛋白质、人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、人载脂蛋白D或妊娠相关蛋白质(glycodelin)，具有可以进行修饰的天然配体结合位点，从而使得它们与选定的称为半抗原的小蛋白质区域结合。其他蛋白质结合分子的例子是所谓的glubodies(参见例如国际专利申请WO96/23879)、基于锚蛋白骨架(Mosavi,L.K.,等人，ProteinScience(2004)13,6,1435-1448)或结晶骨架(例如国际专利申请WO01/04144)的蛋白质、Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所述的蛋白质、AdNectins、四连接素和高亲和性多聚体(avimers)。高亲和性多聚体含有所谓的A结构域，其作为多个结构域串在几种细胞表面受体中出现(Silverman,J.,等人，NatureBiotechnology(2005)23,1556-1561)。衍生自人纤连蛋白的结构域的Adnectins含有三个环，其可以进行改造用于与靶的免疫球蛋白样结合(Gill,D.S.&Damle,N.K.,CurrentOpinioninBiotechnology(2006)17,653-658)。衍生自分别的人同源三聚体蛋白质的四连接素同样含有在C型凝集素结构域中的环区，其可以就所需结合进行改造(同前)。需要时，可以使用改性剂，其进一步增加各部分对于靶物质的任何或某一形式、种类等的亲和力。
具有抗体样功能的核酸分子的例子是适体。适体折叠成限定的三维基序，并且对于给定靶结构显示高亲和力。使用本领域的标准技术例如固相合成，可以相应地形成对于某一靶具有亲和力的适体，且固定到本发明的实施方案的空心颗粒上。
作为进一步的举例说明性例子，连接部分例如亲和标签可以用于固定各分子。此类连接部分可以是分子，例如基于烃(包括聚合物)的分子，其包括含氮、磷、含硫、碳(carben-)、卤素或拟卤素基团、或其一部分。作为举例说明性例子，在水凝胶中包括的肽/类肽可以包括例如在肽/类肽的侧链上的官能团，其允许生物分子的共价附着，所述生物分子例如分子例如蛋白质、核酸分子、多糖或其任何组合。各官能团可以以通过保护基团保护的被屏蔽形式提供，所述保护基团可以在所需条件下释放。各官能团的例子包括但不限于氨基、醛基、硫醇基、羧基、酯、酸酐、磺酸盐、磺酸酯酯、酰亚胺酯、甲硅烷卤化物、环氧化物、氮丙啶、亚磷酰胺和重氮烷。
亲和标签的例子包括但不限于生物素、二硝基苯酚或地高辛、寡组氨酸、聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG'肽、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹病毒糖蛋白D具有序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp的HSV表位、序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的血凝素(HA)表位、序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的转录因子c-myc的“myc”表位、或寡核苷酸标签。此类寡核苷酸标签可以例如用于与具有互补序列的经固定的寡核苷酸杂交。连接部分的进一步例子是抗体、其片段或具有抗体样功能的蛋白质结合分子(还参见上文)。
连接部分的进一步例子是葫芦脲(cucurbituril)或能够与葫芦脲形成复合物的部分。葫芦脲是包括甘脲单位的大环化合物，通常由甘脲和甲醛的催化缩合反应自组装。包括n个甘脲单位的葫芦脲[n](CB[n])通常具有含极性脲基羰基的两个门。经由这些脲基羰基，葫芦脲可以结合目的离子和分子。作为举例说明性例子，葫芦脲[7](CB[7])可以与二茂铁基甲基铵或金刚烷铵离子形成强复合物。葫芦脲[7]或例如二茂铁基甲基铵可以附着至生物分子，而剩余结合配偶体(例如分别的二茂铁基甲基铵或葫芦脲[7])可以与所选表面结合。使生物分子与表面接触随后导致生物分子的固定。经由烷基硫醇与金表面结合的官能化的CB[7]单位例如已显示促使携带二茂铁基甲基铵单位的蛋白质的固定(Hwang,I.,等人，J.Am.Chem.Soc.(2007)129,4170-4171)。
连接部分的进一步例子包括但不限于寡糖、寡肽、生物素、二硝基苯酚、地高辛和金属螯合剂(还参照下文)。作为举例说明性例子，分别的金属螯合物例如乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N、N-双(羧甲基)甘氨酸(也称为次氮基三乙酸，NTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巯基-1-丙醇(二巯基丙醇)、卟吩或血红素可以用于其中靶分子是金属离子的情况下。例如，EDTA与大多数单价、二价、三价和四价金属离子形成复合物，例如银(Ag+)、钙(Ca2+)、锰(Mn2+)、铜(Cu2+)、铁(Fe2+)、钴(Co3+)和锆(Zr4+)，而BAPTA对于Ca2+特异性。在一些实施方案中，在与金属离子的复合物中的金属螯合剂限定所述连接部分。此类复合物例如是关于限定序列的肽的受体分子，其也可以包括在蛋白质中。作为举例说明性例子，本领域使用的标准方法是寡核苷酸标签和铜(Cu2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)或锌(Zn2+)离子之间的络合物形成，其借助于螯合剂次氮基三乙酸(NTA)存在。
抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可以例如用于固定生物素化的核酸，或可以采用含有生物素的单层金(Shumaker-Parry,J.S.,等人，Anal.Chem.(2004)76,918)。作为另外一个举例说明性例子，生物分子可以例如通过扫描电化学显微镜，例如经由吡咯-寡核苷酸模式局部沉积(例如Fortin,E.,等人，Electroanalysis(2005)17,495)。在特别是其中生物分子是核酸的其他实施方案中，生物分子可以在固定单元的表面上直接合成，例如使用光活化和失活。作为举例说明性例子，可以使用电极，使用电化学反应进行在所选表面积上的核酸或寡核苷酸合成(所谓的“固相”合成)。如通过Egeland&Southern(NucleicAcidsResearch(2005)33,14,e125)描述的电化学去封闭步骤可以例如用于此目的。合适的电化学合成也已公开于美国专利申请US2006/0275927中。在一些实施方案中，可以进行光指导的生物分子特别是核酸分子合成，包括UV连接或光依赖性5’-脱保护。
对于选定的靶分子具有结合亲和力的分子可以通过任何方式固定到纳米晶体上。作为举例说明性例子，寡肽或多肽(包括各部分)可以经由硫醚键，例如通过使用官能化的硫醇，共价连接至纳米晶体的表面。能够将本发明的一个实施方案的纳米晶体连接至具有所选结合亲和力的分子的任何合适分子可以用于将其固定到纳米晶体上。例如，可以使用(双功能)连接试剂，例如乙基-3-二甲基氨基碳二亚胺、N-(3-氨基丙基)-3-巯基苯甲酰胺、3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺、或3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-酰肼。在与连接试剂反应前，纳米晶体的表面可以例如通过用冰状巯基乙酸处理进行修饰，以便生成游离巯基乙酸基团，其随后可以用于经由连接试剂与分析物结合配偶体共价偶联。
本发明的实施方案还包括水凝胶，其可以是水膨胀的水不溶性聚合物材料。水凝胶包括如上定义的肽和/或类肽，包括含有如上定义的肽和/或类肽和由如上定义的肽和/或类肽组成。因为水凝胶维持三维结构，所以本发明的一个实施方案的水凝胶可以用于多种应用。因为水凝胶具有高含水量且包括氨基酸，所以它通常具有极佳的生物相容性。
根据本发明的一个实施方案的水凝胶通常通过自组装形成。本发明人已观察到组装成纤维的肽/类肽形成网样结构。不受理论束缚，在本发明的一个实施方案的肽/类肽的非极性部分之间的疏水性相互作用考虑帮助此类自组装过程。
形成水凝胶的方法包括将肽/类肽溶解于水溶液中。搅动，包括混合例如搅拌，和/或超声处理可以用于促进溶解肽/类肽。在一些实施方案中，在其中具有肽/类肽的水溶液暴露于低于环境温度的温度，例如选自约2℃至约15℃的温度。在一些实施方案中，在其中具有肽/类肽的水溶液暴露于高温，即高于环境温度的温度。通常，允许水溶液达到它所暴露于的温度。水溶液可以例如暴露于约25℃至约85℃或更高的温度，例如约25℃至约75℃、约25℃至约70℃、约30℃至约70℃、约35℃至约70℃、约25℃至约60℃、约30℃至约60℃、约25℃至约50℃、约30℃至约50℃或约40℃至约65℃，例如约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃或约65℃的温度。在其中具有肽/类肽的水溶液可以在该温度下维持约5分钟至约10小时或更久的时期，例如约10分钟至约6小时、约10分钟至约4小时、约10分钟至约2.5小时、约5分钟至约2.5小时、约10分钟至约1.5小时或约10分钟至约1小时，例如约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟或约40分钟。
根据本发明的一个实施方案的水凝胶可以包括在燃料电池中，在其中它可以例如提供在阳极和阴极之间的底物，液体电解质可以通过水凝胶包围。同样地，根据本发明的一个实施方案的水凝胶可以提供在电泳仪中的两个电极之间的底物。水凝胶还可以是导电的。水凝胶还可以作用于增强电荷分离状态的效率和/或减慢电荷再组合。水凝胶因此可以应用于任何形式的光伏电池包括太阳能电池中。
在一些实施方案中，本文公开的水凝胶是生物相容性的，包括药学可接受的水凝胶。如本文使用的，术语“生物相容性”(其也可以被称为“组织相容性”)是当水凝胶在体内使用时，产生很少(如果存在的话)的不利生物应答。该术语因此一般指水凝胶无法促进在细胞中包括在动物包括人体内可测量的不利生物应答。生物相容性水凝胶可以具有下述特性中的一种或多种：无毒、非诱变性、非变应性、非致癌性和/或非刺激性。最低限度地，生物相容性水凝胶可以是无害的且由分别的细胞和/或机体耐受。生物相容性水凝胶单独还可以改善在体内的一种或多种功能。
取决于在水凝胶中包括的肽/类肽中包括的氨基酸，水凝胶可以是生物可降解的。在一段时间内例如在数月或数年内，生物可降解的水凝胶逐步崩解或在体内吸收。崩解可以例如经由水解发生，可以通过酶催化，且可以通过水凝胶在人或动物体内，包括其组织、血管或细胞中所暴露于的条件得到辅助。当肽完全由天然氨基酸构成时，肽通常可以通过人/动物机体的酶降解。
根据本发明的一个实施方案的水凝胶还可以充当药学活性化合物例如药物和/或微粒和纳米颗粒的储库。根据本发明的一个实施方案的水凝胶可以设计为模拟生物例如人或动物机体的天然细胞外基质。由本发明的一个实施方案的肽/类肽形成的纤维，包括水凝胶，可以充当生物学骨架。本发明的一个实施方案的水凝胶可以包括在植入物、隐形眼镜中，或可以用于组织工程中。在一个实施方案中，肽通常由3-7个氨基酸组成，并且当溶解于水或水溶液中时，能够自组装成复杂的视为水凝胶的纤维骨架。这些水凝胶可以保留高达99.9％的水，并且具有足够高的机械强度。因此，这些水凝胶可以充当用于多种天然组织的人工替代物，而无免疫原性的危险。依照本发明的水凝胶可以用于培养合适的原代细胞，并且因此建立可注射的细胞基质化合物，以便在体内植入或再植入新近形成的细胞基质。因此，依照本发明的水凝胶可特别用于组织再生或组织工程应用。如本文使用的，提及“植入物”或“植入”指用于将含水凝胶装置(或原位胶凝的肽溶液)手术或关节镜植入或注射到人或动物例如哺乳动物机体或肢体内的用途和应用。关节镜技术在本文中视为外科技术的亚集，并且对手术、外科等的任何提及包括关节镜技术、方法和装置。包括根据本发明的实施方案的水凝胶的手术植入物可以包括肽和/或类肽骨架。这种肽和/或类肽骨架可以通过分别的水凝胶限定。本发明的一个实施方案的水凝胶还可以包括在伤口覆盖物例如纱布或片或膜或乳膏或喷雾剂中，作用于将伤口维持在湿润状态以促进愈合。
取决于在肽/类肽中使用的氨基酸序列，水凝胶可以是温度敏感的。它可以例如具有较的临界溶液温度或对应于此较低的临界溶液温度的温度范围，超过该温度则凝胶崩溃，因为当水分子从凝胶中释放时，水分子的氢键被释放。
所公开的主题还提供改善手性的两亲性的基于天然的肽和/或类肽，其组装为具有非常有利的材料特性的肽/类肽水凝胶。这些肽/类肽水凝胶的优点在于它们被多种不同的原代人细胞接受，因此提供可以用于不同组织的修复和置换的肽骨架。取决于肽单体的手性，水凝胶的特征可以设计为更稳定且更不易于降解的，不过仍是生物相容性的。
本文描述的水凝胶和/或肽/类肽可以施用于生物体，包括人患者自身，或在药物组合物中施用，在所述药物组合物中，所述水凝胶和/或肽/类肽可以包括药学活性成分或合适的载体或赋形剂，或者与药学活性成分或合适的载体或赋形剂混合。水凝胶或肽/类肽的配制和施用技术类似于或等同于本领域充分确定的低分子量化合物的那些。示例性途径包括但不限于经口、经皮和肠胃外递送。水凝胶或肽/类肽可以用于填充胶囊或管，或者可以以压缩形式作为片剂提供。肽/类肽或水凝胶还可以以可注射或可喷雾形式，例如作为肽/类肽的悬浮液使用。
本发明的一个实施方案的水凝胶可以例如应用到皮肤或伤口上。进一步合适的施用途径可以例如包括储库、经口、直肠、经粘膜或肠内施用；肠胃外递送，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在这点上应指出，为了施用微粒，不需要手术操作。当微粒包括生物可降解的聚合物时，不存在在抗癌剂释放后的装置取出。然而，微粒可以包括在支架、包衣、贴剂、复合材料、凝胶或石膏中或上。
在一些实施方案中，可以以局部而不是全身方式(例如经由注射)施用水凝胶和/或肽/类肽。
包括本发明的一个实施方案的水凝胶和/或肽/类肽的药物组合物可以通过本身已知的方式进行制造，例如借助于常规的混合、溶解、制粒、制锭、水飞、乳化、包封、捕收(entrapping)或冻干过程。
依照本发明的一个实施方案使用的药物组合物因此可以以常规方式进行配制，使用一种或多种生理学可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其促进水凝胶和/或肽/类肽加工成可以药学使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，本发明的一个实施方案的肽/类肽可以在水溶液中配制，所述水溶液例如生理学相容的缓冲液，例如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜施用，对待渗透的屏障而言是适当的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂是本领域一般已知的。
对于经口施用，水凝胶和/或肽/类肽可以通过将其与本领域众所周知的药学可接受的载体组合容易地配制。此类载体允许水凝胶和/或肽/类肽以及药学活性化合物配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆料、悬浮液等，用于通过待治疗的患者经口摄入。经口使用的肠胃外制剂可以通过下述获得：添加固体赋形剂，任选研磨所得到的混合物，且需要时，在添加合适助剂后，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂核心。合适的赋形剂特别是填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
糖锭剂核心与合适的包衣一起提供。为此，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以加入片剂或糖锭剂包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的压入混合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。压入混合胶囊可以含有与下述混合的活性成分：填料如乳糖，粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂。在软胶囊中，肽/类肽可以悬浮于合适液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。所有经口施用的制剂应在适合于此类施用的剂量中。对于含服施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
水凝胶和/或肽/类肽可以配制用于通过注射肠胃外施用，例如通过肌内注射或推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型呈现，例如在安瓿或多剂量容器中，具有添加的防腐剂。分别的组合物可以采取此类形式如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
水凝胶和/或肽/类肽可以配制用于其他药物递送系统如植入物、或经皮贴剂或支架。
超短肽水凝胶(单独的肽或聚合物-肽复合物)可以作为多用途制剂应用，所述多用途制剂提供生物活性组分的持续和控制释放。
目的生物活性部分包括(但不限于)：
-抗生素(小分子、离子、纳米颗粒和微粒)，
-抗真菌剂，
-抗炎剂，
-镇痛剂，
-抗体，
-抗原，
-佐剂，
-美容剂，例如血清蛋白质、抗衰老剂、增白剂、润滑剂、防晒剂，
-维生素和小分子化合物(例如维生素E、视黄酸、α-羟酸)
-纳米颗粒和微粒例如银(用于抗菌特性)、氧化锌(抗菌)和氧化钛(防晒)，以及包封上述生物活性部分的聚合物纳米颗粒和微粒，
-细胞包括血小板、造血干细胞、成体间充质干细胞、脐带血细胞、脂肪干细胞、诱导多能干细胞、角化细胞、软骨和成纤维细胞。
生物活性部分和细胞通过在胶凝过程期间混合而包封到水凝胶内。可替代地，生物活性部分可以缀合至待掺入复合聚合物-肽水凝胶中的肽或非肽聚合物(图17)。
用于伤口愈合、化妆品和皮肤护理应用的用途
屏障功能
当根据本发明的肽自组装成纳米纤维多孔骨架时，它们形成针对外部环境的屏障，并且可以保护不受降解和感染且还阻止流血。因为水凝胶是软生物材料，所以对再生组织的创伤降到最低。如果伤口需要频繁的敷料更换，则这是特别重要的。传统纱布敷料的主要缺点是恢复组织被纱布纤维纠缠。因此，在敷料更换期间，恢复组织通常再受伤，引起显著疼痛和不适。根据本发明的水凝胶的另外优点是其透明性–可以监控伤口恢复无需完全清洁或去除伤口的敷料。此外，由于水凝胶吸收或释放水的倾向，有效管理伤口渗出液。
止血能力
除形成密封渗漏血管的物理屏障之外，含有赖氨酸和相似氨基酸作为极性首基的肽亚类可以潜在促进止血。赖氨酸的类似物和衍生物例如ε-氨基己酸和氨甲环酸(transexamicacid)是抗纤溶剂，其通过完全抑制纤溶酶原至纤溶酶的活化来阻止过度失血。相互作用机制涉及对纤维蛋白中的赖氨酸残基提供替代酶促结合位点，从而阻止血块的分解。换言之，这些水胶凝止血肽还可以潜在地用于密封开放性和手术伤口。
伤口愈合
根据本发明的超短肽水凝胶的应用加速二度烧伤伤口的恢复。它们组合商业水凝胶敷料与纳米纤维骨架在提供组织再生的形貌线索(topographicalcue)中的优点。它们的光透明性有利于伤口观察，而无需去除主要敷料。如损伤程度所需要的再频繁的更换也不对恢复组织施加创伤，因为软生物材料可以用纱布简单地擦去。当用作伤口敷料时，根据本发明的水凝胶(1)形成屏障以阻止细菌和真菌孢子进入伤口，(2)形成物理屏障以阻止细胞渗出受损伤的血管(止血功能)，(3)限制组织的脱水，(4)提供针对机械应力和擦伤的保护，和(5)提供用于细胞和组织再生的机械线索(仿生骨架)。具有赖氨酸和相似含伯胺的极性首基的肽/类肽亚类可以结合由死亡和损伤细胞释放的核酸。这些核酸包括ssRNA、dsRNA和未甲基化的DNA，其结合核酸感测toll-样受体，并且随后活化宿主的先天性免疫系统。通过充当分子清除剂(Lee等人，PNAS2011)，这个肽/类肽亚类可以潜在阻断细胞外核酸的免疫刺激效应，所述免疫刺激效应诱导病理性炎症应答。像这样，肽水凝胶可以潜在显著降低由于烧伤后损伤炎症应答的组织创伤。
水合的维持和自溶性清创的诱导
由于根据本发明的水凝胶的高含水量，其下面的组织保持水合，这对于化妆品应用和伤口处理特别有吸引力。特别地，使用水凝胶作为伤口敷料的关键优点是其诱导坏死性焦痂组织的自溶性清创的倾向。自溶性清创比物理方法(例如刮去、手术切除和用纱布清洁)优选，所述物理方法损伤已开始恢复的组织部分。通过加速坏死组织的自溶性去除，根据本发明的超短肽水凝胶产生空间用于细胞浸润损伤区域且开始组织再生。
皮肤替代物
根据本发明的超短肽水凝胶可以潜在地作为合成皮肤替代物应用。它们的纳米纤维大分子体系结构类似细胞外基质，并且因此可以作为骨架代替(供体和尸体)皮肤移植物应用。商购可得的皮肤替代物通常具有动物(牛和猪)和细菌起源，并且可以存在免疫原性问题和社会(宗教)反对。皮肤替代物制剂可以进一步通过掺入再生因子和干细胞得到增强。
多用途制剂
自组装的超短肽水凝胶可以作为局部敷料(水凝胶和有机凝胶)、喷雾剂、水凝胶贴剂和可以再水合成水凝胶的膜应用(图20)。半粘稠的肽溶液(与细胞或小分子治疗剂混合)可以作为局部凝胶或乳膏、喷雾剂、水凝胶片、贴剂或膜应用。特别地，喷雾剂、局部凝胶和乳膏可以与邻接组织物理混合，从而允许包封的治疗剂的均匀分散。当应用的肽溶液加温(至体温)时，胶凝得到增强。对于含有酰胺化的赖氨酸(由Ac-LIVAGK-NH2例示)和酰胺化的赖氨酸取代基作为极性首基的肽亚类，在增加的盐浓度的存在下，例如在正常和磷酸盐缓冲盐水中，观察到刺激应答性胶凝(图21)。刺激应答性胶凝行为促进喷雾剂的开发，因为胶凝可以通过盐浓度中的变化进行刺激。例如，可以配制其中流体肽溶液最初与胶凝触发试剂分离的喷雾剂。在分散后，溶液混合且胶凝发生。这还简化递送装置，因为肽溶液在更低的盐浓度下明显更不粘稠。胶凝过程是吸热的且不释放任何热。
水凝胶的纳米纤维网络可以用于使活性成分维持悬浮，阻止在一段时间内的聚集或沉淀，从而增加贮存期限。高含水量还可以用于维持组织水合，同时允许气态渗透性。因为水凝胶(在低浓度下)是澄清和透明的，所以它们不显著影响物理外观。
肽水凝胶在体外和体内是生物相容性的，并且可以潜在促进天然细胞的再生。在临床背景下，原位胶凝(在体腔内)可以生成纳米纤维骨架，以置换损伤或缺失组织。仿生纳米形貌可以潜在提供细胞迁移、再生的线索，并且增强共递送的细胞的生长。原位胶凝还可以应用于形成止血栓子，并且因此阻止在外科手术期间的失血。
肽还对酶的降解具有抗性，并且因此将是更耐久的。材料还可以通过UV暴露或高压灭菌进行灭菌，而不损害肽干粉的分子结构。由于超短肽的小尺寸(3-7个氨基酸)，它们可以潜在地扩散穿过完整皮肤，并且渗透下层组织以形成用于组织再生的骨架。
考虑在室温下贮存的密封的肽的长贮存期限稳定性，“仅加水”制剂也是可能的。水凝胶可以通过在应用点时将固定体积的干净水加入冻干的肽粉末进行重构，并且随后作为凝胶、喷雾剂或贴剂施用。这种制剂设计极大降低运输成本，从而促进作为特别是在战争地区和第三世界国家中的基本急救包的部分的采用。这种开发可以潜在地改革急诊医学，提供对于二度烧伤损伤的方便的、易于使用的第一线治疗，并且填充被目前在市场上可获得的商业皮肤替代物和局部水凝胶敷料严重忽视的市场。
作为可注射疗法以治疗椎间盘退变性疾病或尿失禁的用途和作为真皮 和/或脂肪填料的用途
自组装和刺激应答性质
肽在水溶液中的自组装行为允许开发可注射疗法，其中肽溶液被注射且随后原位胶凝成水凝胶。半粘稠的肽溶液(与细胞或小分子治疗剂混合)可以注射到体内的小腔内，并且因此是最低限度侵入性的。流体还可以与邻接组织物理混合，从而允许细胞或治疗试剂的均匀分散。椎间盘退变性疾病的目前治疗选项是高度侵入性的，并且需要使用金属或陶瓷植入物以脊柱融合或椎间盘置换形式的手术干预。因此，可注射疗法是明显更少侵入性的，并且提供用于不适合手术的患者的替代治疗。
刺激应答性胶凝行为促进可注射疗法的开发，因为胶凝可以通过温度或盐浓度中的变化进行刺激。这允许临床医生在胶凝发生前放置针且注射溶液的时间。作为冷或室温溶液注射，当水性混合物在体内加温至体温时，一些肽原位胶凝。可替代地，与高盐含量溶液共注射(例如经由共轴注射器或T型接头针)也刺激盐敏感的肽的胶凝。胶凝过程是吸热的且不释放任何热。
刚性和可调节的机械特性
肽水凝胶具有高机械强度，其可以提供用于损伤和恢复组织的临时机械支持。当应用于治疗椎间盘退变性疾病时，可注射疗法将原位胶凝且增加椎间盘的高度，从而增加椎骨的缓冲效应且缓解对脊神经的挤压。
通过改变肽序列，溶液的组成、浓度、抗衡离子和盐浓度，可以进一步调节水凝胶的机械特性，以匹配天然组织的机械特性。肽水凝胶已证实良好的生物相容性、稳定性和对酶促降解的抗性，并且因此在组织中持续几个月。因此，治疗效应预期持续数月，降低重复治疗的需要。
生物相容性和脂肪组织再生
肽水凝胶是生物相容性的，并且可以支持注射的天然细胞或干细胞的增殖。这将促进组织的再生。通过缀合或包封小分子、短肽基序、细胞因子、生长因子和寡核苷酸(DNA、mRNA、shRNA和siRNA)，可以潜在地增强细胞附着、增殖和分化。
实施例
已进行实验以举例说明本发明的示例性实施方案的技术方面。下述实施例在实验方法和结果中描述。技术人员将容易地认识到实施例旨在是举例说明性的，并且不旨在限制本发明的范围。
实验方法和结果
肽
肽序列设计为代表含有亲水首基和疏水尾的两亲性肽结构。肽设计的原理是制备类似锥形结构的尺寸递减的肽单体。疏水尾通过使用不同的脂肪族氨基酸而不同。它由下述脂肪族氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成，并且亲水首基由一个或两个极性或荷电氨基酸组成。疏水尾的序列次序通过使用不同的脂肪族氨基酸而不同。肽由GLBiochem,Shanghai，中国商业合成。为了验证肽水凝胶形成行为的重现性，肽还由其他公司(BiomatikCorp.,Anaspec.Inc,AmericanPeptideCompany,USA)合成。通过高效液相色谱(HPLC)和质谱法验证的，肽具有等于或高于95％的纯度。肽原液以5-10mg/ml溶解于水中。大多数肽在N末端处是乙酰化的。
基于肽的水凝胶制备
所有肽(GLBiochem,Shanghai，中国，≥98％纯度)均新鲜制备，以便避免过早的肽聚集。将肽溶解于水中且在室温下静置，以形成水凝胶。取决于肽浓度，自组装过程立即发生，在数小时或甚至数天内发生(胶凝的实验时帧)。对于更高的肽浓度，通过涡旋将肽溶解于milliQ水中。如果需要被迫且加速的水凝胶制备，则对肽溶液实施在水浴中的超声处理(BarnsteadLabline9319UltrasonicLC60H)。在经由自组装产生的水凝胶和其组装通过超声处理促进的那些水凝胶之间，未观察到显著的结构差异。少数肽在升高的温度下即在50℃下更容易形成水凝胶。
为了研究浓度变化的效应，如上所述用不同浓度制备AcLD6(L)和AcID3(L)水凝胶两者。为了研究单价和二价阳离子的效应，通过将肽溶解于10、50、100和150mMNaCl和CaCl2溶液中，制备AcLD6(L)水凝胶。进一步进行FESEM和流变学研究，以表征这些水凝胶的形态和强度。
明胶和胶原凝胶的制备：明胶(A型，G1890；SigmaAldrich)水凝胶通过下述进行制备：首先通过加热将明胶溶解于milliQ水中，随后冷却，直至观察到胶凝。胶原(来自牛的I型，AdvancedBiomatrix,USA)用PBS缓冲液稀释至1.5mg/ml的浓度，并且使用0.1MNaOH滴定至pH7.4。胶凝通过将溶液在37℃下温育1小时来实现。
圆二色性(CD)光谱学
通过使用Aviv圆二色性光谱仪，型号410测量椭圆光谱来分析二级肽结构。CD样品通过在水中稀释肽原液(5-10mg/ml)进行制备。将稀释的肽溶液填充到具有1mm径长的比色杯内，并且获得光谱。使用水作为空白参考，并且在计算摩尔椭圆率之前，从原始数据中扣除参考。计算基于下式：[θ]λ＝θobsx1/(10Lcn)，其中[θ]λ是以degcm2d/mol表示的在λ处的摩尔椭圆率，是以mdeg表示的在λ处观察到的椭圆率，L是以cm表示的径长，c是以M表示的肽浓度，并且n是肽中的氨基酸数目。二级结构分析使用CDNN软件完成。
环境扫描电子显微镜(ESEM)
将样品置于FEIQuanta200环境扫描电子显微镜的样品架上。随后使用10kV的加速电压，在4℃的温度下检查目的表面。
场发射扫描电子显微镜(FESEM)
将样品在-20℃下冷冻且随后冷冻至-80℃。将冷冻样品进一步冷冻干燥。使用导电胶带将冷冻干燥的样品固定到样品架上，并且在JEOLJFC-1600HighResolutionSputterCoater中，从顶部和侧面两者用铂溅镀(sputtered)。使用的包被电流为30mA，并且该过程持续60秒。随后使用5-10kV的加速电压，使用JEOLJSM-7400F场发射扫描电子显微镜系统来检查目的表面。
流变学测量
为了测定基于肽的水凝胶的粘弹性特性，使用ARES-G2流变仪(TAInstruments,Piscataway,NJ)，以及25.0mm直径钛平行板几何学和0.8mm间隙距离，对水凝胶实施动态时间、应力和频率扫描实验。进行振荡频率研究，以比较具有不同肽浓度的基于肽的水凝胶的强度，或用于在单价或二价离子的存在下的肽。在25℃和50℃下，以0.1-100rad/s频率和0.1％应力进行振荡频率扫描研究。
[A]Ac-LD 6 [L]：
肽序列：Ac-LIVAGD-COOH
分子量：629.56
(1)Ac-LD6(L)的温度扫描研究：
(a)随后将肽混合物置于流变仪较低板上。优化下述参数：
两块板之间的间隙：1mm
应力：10％
频率：6.28rad/秒
温度扫描：4℃至60℃
样品体积：500μl
(2)Ac-LD6(L)的频率扫描研究：
进行频率扫描研究所需的优化参数
两块板之间的间隙：0.8mm
应力：0.1％
温度：25和50℃
样品体积：1ml
频率扫描：0.1rad/秒至100rad/秒
水凝胶中的Ac-LD-6(L)浓度：10mg/ml
(3)Ac-LD6(L)的浓度变化对凝胶强度的作用：
进行用于测量凝胶强度的频率扫描研究所需的优化参数如下：
两块板之间的间隙：0.8mm
应力：0.1％
温度：25和50℃
样品体积：1ml
频率扫描：0.1rad/秒至100rad/秒
水凝胶中的Ac-LD-6(L)浓度：在水中5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml和30mg/ml
(4)氯化钠(NaCl)对Ac-LD6(L)的凝胶强度的作用：
通过对水凝胶进行频率扫描研究来研究氯化钠对基于Ac-LD6(L)的水凝胶的作用，所述水凝胶通过将10mgAc-LD-6(L)分散于不同浓度的NaCl溶液(例如10mM、50mM、100mM和150mMNaCl溶液)中进行制备，使用优化操作来形成水凝胶。在NaCl的存在下，执行测量凝胶强度的频率扫描研究所需的优化参数如下：
两块板之间的间隙：0.5mm和0.8mm
应力：分别为10％和0.1％
温度：25℃和50℃
样品体积：1ml
频率扫描：0.1rad/秒至100rad/秒
用于制备10mg/mlAc-LD-6(L)水凝胶的NaCl溶液浓度：10mM、50mM、100mM、150mMNaCl溶液。
细胞生长实验
为了发现肽水凝胶是否可以充当用于组织工程的骨架，研究它的生物相容性。将不同的原代人细胞种植到在6孔、24孔或96孔培养板中的组织培养基(不含血清的DMEM)中胶凝后的水凝胶之上，参见下文培养条件。在接下来2-4天期间，不需要培养基更换，但最后将新鲜培养基加入孔中。细胞就活力进行分析。
原代人肾近端小管细胞(HPTC)和原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)得自ScienCellResearchLaboratories(Carlsbad,CA,USA)。HPTC在基础上皮细胞培养基中进行培养，所述培养基补充有2％胎牛血清(FBS)和1％上皮细胞生长补充物(所有组分均得自ScienCellResearchLaboratories)。用于HUVEC的培养基是含有5％FBS和1％内皮细胞生长补充物的内皮细胞培养基(ScienCellResearchLaboratories)。使用的所有细胞培养基均补充有1％青霉素/链霉素溶液(ScienCellResearchLaboratories)，并且所有细胞均在37℃下在5％CO2大气中进行培养。细胞的种植密度为约5x104细胞/cm2。然而，因为HUVEC比HPTC大，所以细胞数目将略微低于HPTC细胞的数目(～4.5x104细胞/cm2)。两个细胞类型在种植后均具有在孔中约80％的汇合。
肽水凝胶伤口敷料加速大鼠模型中的二度烧伤伤口的愈合。
将两种超短肽候选物Ac-ILVAGK-NH2(AcIK6)和Ac-LIVAGK-NH2(AcLK6)配制成25mm直径和1.5mm厚的水凝胶贴剂。胶凝在数分钟内发生，产生可根据操作修正的稳定水凝胶。从该研究中选择的两种肽候选物均含有赖氨酸作为极性首基，其可以潜在促进开放性伤口的止血，且降低由死亡和损伤细胞释放的细胞外核酸引起的炎症。赖氨酸的类似物和衍生物例如ε-氨基己酸和氨甲环酸是抗纤溶剂，其通过完全抑制纤溶酶原至纤溶酶的活化来阻止过度失血。相互作用机制涉及对纤维蛋白中的赖氨酸残基提供替代酶促结合位点，从而阻止血块的分解(图23)。赖氨酸上存在的伯胺基团还可以充当分子清除剂，以结合细胞外核酸(例如ssRNA、dsRNA和未甲基化的DNA)，并且因此阻断其免疫刺激效应(图22)。水凝胶贴剂在大鼠二度烧伤模型中进行评估。护理标准治疗用作对照，所述是由硅树脂包被以阻碍再生组织的粘附的柔性聚酰胺网。
因为烧伤施加技术在大鼠模型中很少描述，所以通过改变使用加热的不锈钢杆的温度和接触持续时间，评估且优化在剃毛的大鼠背部生成一致的二度烧伤的操作。实验在由DefenseScienceOrganization,Singapore批准的IACUC方案下进行。简言之，对在沸水中加热至100℃共5分钟的1cm直径不锈钢杆的10秒暴露，在剃毛的大鼠背部生成一致的中度二度烧伤。对每只大鼠(n＝11)施加的三个损伤用超短肽水凝胶Ac-ILVAGK-NH2和Ac-LIVAGK-NH2、以及硅树脂包被的聚酰胺网进行敷料。聚二甲基硅氧烷支持物用于维持软的盘状水凝胶的完整性。在放置敷料后，防水TegardermTM粘性膜、纱布和弹性绷带用于固定敷料。为了评估愈合速率，每隔一天使用数字化测面积法定量评价伤口大小、肉芽形成和再上皮化，共14天。获取伤口的照片(参见图26a)，并且使用程序Pro分析图像，以测定在不同时间点的再上皮化和肉芽形成面积(参见图26b)。使用在第10、12和14天时的再上皮化和肉芽形成面积(绝对值和百分比)，进行用于重复测量的一般线性模型。该模型允许我们探究再上皮化和肉芽形成的时间趋势，以及通过不同处理引起的对该时间趋势的作用，同时针对总伤口大小调整。在7或14天后，对动物实施安乐死并且从不同烧伤损伤收集皮肤样品。每种样品的一半在10％福尔马林中保存，而另一半在液氮中速冻。福尔马林保存的样品随后在石蜡中包埋，切片且用苏木精与伊红染色。这些样品随后使用OlympusBX51显微镜进行组织学评估。
两种水凝胶均刺激自溶性清创。与对照样品的第10天相比较，对于所有动物到第8天时均观察到水凝胶处理的伤口的清创开始(图18A)。比较水凝胶处理的样品和对照样品，焦痂的完全清创大约延迟2天。在第7天时获取的皮肤样品的组织学分析确认用肽水凝胶敷料的伤口的自溶性清创完成。如通过图18B中的红色箭头标记的，对于用Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶处理的烧伤区域的坏死的表皮层的丧失，与对于用敷料的伤口的附着至真皮的表皮组织的残留部分形成对比。通过加速坏死组织的自溶性去除，超短肽水凝胶产生空间用于细胞浸润损伤区域且开始组织再生。
伤口关闭部分通过自溶性清创的快速开始得到促进。因此，与相比较，用水凝胶处理的烧伤损伤以更高速率收缩并不令人惊讶(图18C)。使用数字测面积法定量伤口面积(图18D)，到第10天时，对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶，分别观察到56.96％和55.16％的伤口挛缩。相比之下，对于敷料的伤口，仅46.67％的伤口面积已愈合。到第14天时，对于水凝胶达到85.09％和92.95％的烧伤覆盖，这明显高于敷料的62.46％(混合模型分析，p<0.05)。
损伤的组织学分析提示使用的技术一致地生成深二度烧伤。组织的结构完整性显著改变，产生真皮中更紊乱的细胞外基质和毛干囊的丧失，以及一些样品中的表皮脱离。在受损和健康组织的界面处还存在广泛的淋巴细胞浸润。即使在7天后，损伤也延伸穿过真皮超过50％。如图19A中举例说明的，对于敷料的样品观察到坏死的表皮组织，而对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶敷料的损伤，观察到焦痂表皮组织的完全清创。虽然细胞外基质重塑在真皮中仍未发生，但存在一些恢复征兆，如通过在周围健康组织中的毛干囊增殖证实的。在更高放大率下，对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶敷料的损伤，在受损和健康组织的边界处(图19B)，观察到健康基底细胞从表皮-真皮连接和邻接的未损伤毛干浸润到损伤组织内。基底细胞是负责损伤后的皮肤组织再生的干细胞。到第14天时(图19C)，对于Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶处理的伤口，表皮的再生几乎完成。在表皮-真皮界面处的基底细胞也已开始穿透真皮，以形成毛干囊前体。这由从肉眼检查收集的观察良好确认。相比之下，敷料的伤口中的表皮组织更薄且更脆弱。水凝胶处理的伤口也证实真皮中更大程度的基质重塑。对于用Ac-IK6和Ac-LK6水凝胶敷料的伤口，在损伤部位的边界处(图19D)，显著更高程度的细胞复制已在位于毛囊的基底细胞中发生。相比之下，敷料的伤口中的毛干囊再生是最低限度的。
细胞因子多路ELISA：
使用在ProcartaCellLysis缓冲液中的无菌金属珠，将冷冻的皮肤样品单独地匀浆化。随后将样品离心且分离上清液用于分析。根据制造商的说明书，进行Procarta免疫测定(AffymetrixInc,CA,USA)。简言之，使细胞裂解产物与抗体磁珠一式两份地进行温育。评价十种不同的细胞因子和生长因子的表达，即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素1-α(IL-1α)、白细胞介素1-β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF-A)(还参见图27和28)。在应用检测抗体和链霉抗生物素蛋白缀合的R-藻红蛋白(检测物分子)后，使用MasterPlexCTv1.0.0.2(MiraiBio,CA,USA)阅读荧光强度。使用针对已知标准拟合的4参数逻辑曲线，使用MasterPlexQTv2.0.0.59(MiraiBio,CA,USA)，计算细胞因子的浓度(pg/ml)。细胞因子浓度针对给定样品的总蛋白质含量(使用二辛可宁酸(BCA)测定测量)进行标准化。对于测试的细胞因子中的每一种，对于在第7和14天时标准化的细胞因子表达，分开进行单因素方差分析。平均细胞因子表达在三个处理组中进行比较，以获得p值。p<0.05的组，即GM-CSF、IL-4、IL-6和TNF-α，进行另外的事后检验，以突出显示在任何两个样品之间的统计学差异。
用于椎间盘退变性疾病的可注射疗法
肽Ac-LK6(Ac-LIVAGK-NH2)用于配制可注射疗法，以治疗兔模型中的椎间盘退变性疾病(图24)。评估两种处理：肽水凝胶(包封MRI造影剂)和包封兔髓核细胞的水凝胶(用氧化铁纳米颗粒进行标记)。所有动物对处理响应良好，并且不经历任何不利的免疫或生理反应。在2个月后，将动物处死，并且收集其脊椎用于离体MRI成像。存在最低限度的MRI造影剂从髓核空间中的渗漏，指示水凝胶即使在2个月后也仍存在。在椎间盘解剖中，对于用细胞处理的几个样品，观察到髓核质量的增加。
用于脂肪组织再生的真皮填料和骨架
使用C57BL6小鼠在体内评估不同肽的相容性。皮下植入30uL水凝胶，并且在1和2个月后，评估免疫应答(图25)。有趣的是，水凝胶作为在骨骼肌层下的无定形嗜酸性(粉红色)、可极化异物材料观察到。注意到以多核巨细胞组织细胞的形式的最低限度至轻度免疫应答，但归于植入手术。水凝胶即使在2个月后也持续，证实良好的体内稳定性。
将包封人脂肪衍生的干细胞的Ac-LIVAGK-NH2水凝胶植入SCID小鼠中。植入后6周，将小鼠处死且在植入部位处、在肌肉和皮下空间中存在的天然脂肪组织下观察到脂肪垫。因为这在用人间充质干细胞植入的部位没有观察到，所以这个结果提示肽水凝胶可以潜在支持脂肪前体细胞的增殖，并且降低在脂肪细胞移植后的细胞坏死和迁移。
抗原性/免疫原性分析(还参见图29)：
将30μL水凝胶样品皮下植入雄性C57BL6小鼠中多达两个月。在不同时间点收集血清样品。在该研究中评估来自两周时间点的血清样品，因为它预期生成峰抗体应答。在加强免疫应答的尝试中，超短肽Ac-LIVAGK-NH2与完全弗氏佐剂(CFA)和辅助HBVcCD4128-140共施用于BALB/c小鼠。用CFA和辅助HBVcCD4128-140佐剂化(adjuvanted)的受照射的伯氏疟原虫孢子用作阳性对照，因为它们生成高滴度的特异性抗体。在两周后，收集血清以测定所有动物的抗体滴度。实验在由A*STAR’sBiologicalResourceFacility批准的IACUC方案下进行。为了测定特异性抗体的滴度，用由目的肽或抗原包被(过夜)的板进行ELISA。测定UV吸光度且可以与抗体滴度关联。
在本说明书中先前公开的文件的列表或讨论不应视为承认该文件是现有技术的部分或是一般常识。所有列出的文件均为了所有目的在此整体通过引用引入本文。
本文举例说明性描述的本发明的示例性实施方案可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种局限性的情况下进行实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应广泛地而非限制性地阅读。另外，本文采用的术语和表达已用作描述性而不是限制性术语，并且不预期在此类术语和表达的使用中排除所示且所述特点及其一部分的任何等价物，但应认识到不同修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过示例性实施方案和任选的特点具体公开，但本领域技术人员可以采用公开的本文具体表达的修改和变化，并且此类修改和变化视为在本发明范围内。
本发明已在本文中广泛地且一般性描述。落入一般公开内容内的更窄的具体概念和亚上位分组各自也构成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，其被条件性或负面限制而从上位概念中去除任何主题，与去除的材料在本文中是否具体叙述无关。
其他实施方案在下述权利要求内。另外，当本发明的特点或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照Markush组的任何个体成员或成员亚组进行描述。

Claims (99)

1.一种能够自组装成三维大分子纳米纤维网络的两亲性肽和/或类肽，所述三维大分子纳米纤维网络束缚水且形成水凝胶，所述两亲性肽和/或类肽包含由下述组成的两亲性序列：
n个脂肪族氨基酸的疏水性序列段，其中n是2-15的整数，和
与所述疏水性序列段连接且具有酸性、中性或碱性的极性部分的亲水性序列段，所述极性部分包含m个邻接的亲水性氨基酸，其中m是1-5的整数。
2.权利要求1的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽具有C末端和N末端，其中所述N末端被N末端保护基团保护。
3.权利要求1或2的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽具有C末端和N末端，其中所述C末端被C末端保护基团保护。
4.权利要求2的两亲性肽和/或类肽，其中所述N末端保护基团具有通式–C(O)–R，其中R选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
5.权利要求4的两亲性肽和/或类肽，其中所述N末端保护基团是乙酰基。
6.权利要求2的两亲性肽和/或类肽，其中所述N末端保护基团是拟肽分子，包括天然和合成的氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的N末端可以用选自下述的官能团进行修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、马来酰亚胺、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐和硅烷。
7.权利要求3的两亲性肽和/或类肽，其中所述C末端保护基团是酰胺基。
8.权利要求7的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽的C末端具有式-CONHR或-CONRR’，其中R和R’选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
9.权利要求3的两亲性肽和/或类肽，其中所述C末端保护基团是酯基。
10.权利要求9的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽的C末端具有式–CO2R，其中R选自H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。
11.权利要求3的两亲性肽和/或类肽，其中所述C末端保护基团是拟肽分子，包括天然和合成氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的C末端可以用选自下述的官能团进行修饰：羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、硫醇、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、硝酸盐、马来酰亚胺、乙烯基砜、叠氮化物、炔、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、硫酯、芳基、酮、亚硫酸盐、亚硝酸盐、膦酸盐和硅烷。
12.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中n是2-6，优选2-5的整数。
13.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中m是1-2的整数。
14.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽由o个如前述权利要求中任一项中定义的两亲性序列组成，所述两亲性序列彼此连接，o是1-50的整数。
15.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中对于给定两亲性肽和/或类肽，所述脂肪族氨基酸和所述亲水性氨基酸是D-氨基酸或L-氨基酸。
16.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述亲水性氨基酸各自具有极性基团，其独立地选自羟基、醚、羧基、亚氨基、酰氨基、酯、氨基、胍基、硫基、硫醚、硒基和碲基。
17.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述亲水性序列段的所述极性部分包含m个邻接的亲水性氨基酸，m如权利要求1-13中任一项中定义，所述亲水性氨基酸选自天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸)、瓜氨酸、硫代瓜氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸、乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、苏氨酸、别-苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、赖氨酸和N(6)-羧基-甲基赖氨酸、组氨酸，并且其中所述疏水性序列段包含n个脂肪族氨基酸，n如权利要求1-12中任一项中定义，所述脂肪族氨基酸选自异亮氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、高烯丙基甘氨酸和高炔丙基甘氨酸。
18.权利要求17的两亲性肽和/或类肽，其中m是1或2。
19.权利要求18的两亲性肽和/或类肽，其中m是2并且其中所述极性部分包含两个相同的氨基酸，或其中m是1并且其中所述极性部分包含天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)和组氨酸中的任何一个。
20.权利要求19的两亲性肽和/或类肽，其中所述极性部分与n个脂肪族氨基酸的疏水性序列段邻接。
21.权利要求18-20中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述极性部分具有选自下述的序列：Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Met、Lys、Orn、Dab、Dap、His、Asn-Asn、Asp-Asp、Glu-Glu、Gln-Gln、Asn-Gln、Gln-Asn、Asp-Gln、Gln-Asp、Asn-Glu、Glu-Asn、Asp-Glu、Glu-Asp、Gln-Glu、Glu-Gln、Asp-Asn、Asn-AspThr-Thr、Ser-Ser、Thr-Ser、Ser-Thr、Asp-Ser、Ser-Asp、Ser-Asn、Asn-Ser、Gln-Ser、Ser-Gln、Glu-Ser、Ser-Glu、Asp-Thr、Thr-Asp、Thr-Asn、Asn-Thr、Gln-Thr、Thr-Gln、Glu-Thr、Thr-Glu、Cys-Asp、Cys-Lys、Cys-Ser、Cys-Thr、Cys-Orn、Cys-Dab、Cys-Dap、Lys-Lys、Lys-Ser、Lys-Thr、Lys-Orn、Lys-Dab、Lys-Dap、Ser-Lys、Ser-Orn、Ser-Dab、Ser-Dap、Orn-Lys、Orn-Orn、Orn-Ser、Orn-Thr、Orn-Dab、Orn-Dap、Dab-Lys、Dab-Ser、Dab-Thr、Dab-Orn、Dab-Dab、Dab-Dap、Dap-Lys、Dap-Ser、Dap-Thr、Dap-Orn、Dap-Dab、Dap-Dap。
22.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述极性部分包含所述两亲性肽和/或类肽的C末端，或其中所述极性部分包含所述两亲性肽和/或类肽的N末端。
23.权利要求22的两亲性肽和/或类肽，其中所述极性部分包含所述两亲性肽和/或类肽的C末端。
24.权利要求1-23中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述极性部分由位于所述两亲性肽和/或类肽的C末端处的至少一个氨基酸组成。
25.权利要求1-24中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述疏水性序列段包含和/或形成所述两亲性肽和/或类肽的N末端。
26.权利要求1-25中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述疏水性序列段的脂肪族氨基酸的全部或一部分以氨基酸尺寸递减的次序排列在所述两亲性肽和/或类肽从N末端到C末端的方向上，其中所述脂肪族氨基酸的尺寸定义为I＝L>V>A>G。
27.权利要求26的两亲性肽和/或类肽，其中以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有其为重复或非重复序列的序列。
28.权利要求26和27中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-7、优选2-6、更优选2-5个氨基酸的序列。
29.权利要求26-28中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中以氨基酸尺寸递减的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LIVAG、ILVAG、LIVAA、LAVAG、IVAG、LIVA、LIVG、IVA和IV的序列，其中任选地，此序列前N末端处存在A。
30.权利要求1-25中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述疏水性序列段的脂肪族氨基酸的全部或一部分以相同氨基酸尺寸的次序排列在所述两亲性肽和/或类肽中。
31.权利要求30的两亲性肽和/或类肽，其中以相同氨基酸尺寸的次序排列的所述脂肪族氨基酸具有长度为2-4个氨基酸的序列。
32.权利要求30和31中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中以相同尺寸次序排列的所述脂肪族氨基酸具有选自LLLL、LLL、LL、IIII、III、II、VVVV、VVV、VV、AAAA、AAA、AA、GGGG、GGG和GG的序列。
33.权利要求1-32中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性序列在自组装期间经历构象变化，优选从无规卷曲构象到螺旋中间结构到最终β构象的构象变化。
34.权利要求33的两亲性肽和/或类肽，其中所述构象变化取决于所述两亲性肽和/或类肽的浓度，取决于离子环境，取决于pH和/或取决于温度。
35.权利要求1-34中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性线性序列包含单个亲水性氨基酸和至少两个脂肪族氨基酸。
36.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性序列是SEQIDNO:1-86之一。
37.权利要求1-36中任一项的两亲性肽和/或类肽，其在水溶液中在生理条件下在环境温度下稳定一段时间，所述一段时间范围为1天到至少6个月，优选到至少8个月，更优选到至少12个月。
38.权利要求1-37中任一项的两亲性肽和/或类肽，其在水溶液中在生理条件下在高达90℃的温度下稳定至少1小时。
39.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其具有通式：
Zp-(X)n-(Y)m-Z’q，
其中
Z是N末端保护基团，
X在每种情况下独立地选自脂肪族氨基酸，
Y在每种情况下独立地选自亲水性氨基酸，
Z’是C末端保护基团，
n是选自2-6，优选2-5的整数，
m选自1-2，其中优选地，m是1，
并且p和q独立地选自0和1，其中优选地，p是1。
40.前述权利要求中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽的C末端氨基酸选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)和2,3-二氨基丙酸(Dap)。
41.权利要求40的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽具有选自下述的序列：LIVAGK(SEQIDNO:19或39)、LIVAG(Orn)(SEQIDNO:43或44)、LIVAG(Dab)(SEQIDNO:45或46)、LIVAG(Dap)(SEQIDNO:47或48)、ILVAGK(SEQIDNO:49或50)、ILVAG(Orn)(SEQIDNO:51或52)、ILVAG(Dab)(SEQIDNO:53或54)、ILVAG(Dap)(SEQIDNO:55或56)、AIVAGK(SEQIDNO:57或58)、AIVAG(Orn)(SEQIDNO:59或60)、AIVAG(Dab)(SEQIDNO:61或62)、AIVAG(Dap)(SEQIDNO:63或64)、IIIK(SEQIDNO:27或28)、III(Orn)(SEQIDNO:65或66)、III(Dab)(SEQIDNO:67或68)、III(Dap)(SEQIDNO:69或70)、IVK(SEQIDNO:71或72)、IV(Orn)(SEQIDNO:73或74)、IV(Dab)(SEQIDNO:75或76)、IV(Dap)(SEQIDNO:77或78)、LVK(SEQIDNO:79或80)、LV(Orn)(SEQIDNO:81或82)、LV(Dab)(SEQIDNO:83或84)和LV(Dap)(SEQIDNO:85或86)。
42.权利要求40和41中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽具有酰胺化C末端。
43.权利要求40-42中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽具有乙酰化N末端。
44.权利要求40-43中任一项的两亲性肽和/或类肽，其中所述两亲性肽和/或类肽的N末端氨基酸是异亮氨酸(I)。
45.一种水凝胶，其包含权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，优选权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽。
46.权利要求45的水凝胶，其中所述水凝胶在水溶液中在环境温度下稳定至少7天、优选至少2至4周、更优选至少1至6个月的时期。
47.权利要求45和46中任一项的水凝胶，其中所述水凝胶的特征在于储能模量G’与损耗模量G”的比率大于2。
48.权利要求45-47中任一项的水凝胶，其中所述水凝胶的特征在于在范围为0.02Hz-16Hz的频率下100Pa-80000Pa的储能模量G’。
49.权利要求45-48中任一项的水凝胶，其中所述水凝胶具有比胶原或其水解形式(明胶)更高的机械强度。
50.权利要求45-49中任一项的水凝胶，其进一步包含非肽聚合物。
51.权利要求45-50中任一项的水凝胶，其包含权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽的纤维，所述纤维限定出能够束缚下述中的至少一种的网络：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
52.权利要求51的水凝胶，其中所述水凝胶包含被所述两亲性肽和/或类肽的纤维网络所束缚的下述中的至少一种：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
53.权利要求52的水凝胶，其中所述两亲性肽和/或类肽的纤维与下述中的至少一种偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
54.权利要求52的水凝胶，其中下述中的至少一种与所述非肽聚合物偶联：微生物、细胞、病毒颗粒、肽、类肽、蛋白质、核酸、寡糖、多糖、维生素、无机分子、纳米颗粒或微粒、合成聚合物、有机小分子、美容剂或药学活性化合物。
55.权利要求51-54中任一项的水凝胶，其中所述药学活性化合物选自止血剂、抗生素、抗微生物剂、抗真菌剂、抗炎剂、镇痛剂、抗凝血剂、抗体、抗原、生长因子和细胞因子。
56.权利要求45-55中任一项的水凝胶，其中所述水凝胶以可注射形式提供且原位胶凝。
57.权利要求45-56中任一项的水凝胶，其中所述水凝胶被包含于下述至少一种中：燃料电池、太阳能电池、电子电池、生物传感装置、医疗装置、植入物、伤口敷料、药物组合物和化妆品组合物。
58.权利要求57的水凝胶，其中所述药物组合物或所述化妆品组合物以局部凝胶或乳膏、喷雾剂、粉末或片、贴剂或膜的形式提供。
59.权利要求57的水凝胶，其中所述药物组合物或所述化妆品组合物以可注射溶液的形式提供。
60.权利要求45-56中任一项的水凝胶，其用于下述中的至少一种中：药学活性化合物的释放、医学工具试剂盒、燃料电池、太阳能电池、电子电池、组织再生、组织置换、伤口愈合、皮肤护理、干细胞治疗和基因治疗。
61.一种制备水凝胶的方法，所述方法包括将权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽溶解于水溶液中。
62.权利要求61的方法，其中使所述在水溶液中溶解的至少一种两亲性肽和/或类肽进一步暴露于温度，其中所述温度范围为20℃至90℃，优选20℃至70℃。
63.权利要求62的方法，其中使所述在水溶液中溶解的至少一种两亲性肽和/或类肽暴露于范围为35℃至40℃的温度。
64.权利要求61-63中任一项的方法，其中所述至少一种两亲性肽和/或类肽以0.01μg/ml-100mg/ml的浓度、优选以1mg/ml-50mg/ml的浓度、更优选以约1mg/ml-约20mg/ml的浓度溶解。
65.权利要求61-64中任一项的方法，其进一步包括下述步骤中的至少一个：
-添加至少一种生物活性剂；
-添加至少一种非肽聚合物；
-添加至少一种胶凝增强剂；
-添加至少一种缓冲液，优选至少一种生理学可接受的缓冲液。
66.权利要求65的方法，其中所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
67.权利要求65的方法，其中所述胶凝增强剂是交联剂。
68.权利要求65的方法，其中所述添加至少一种非肽聚合物进一步包括将所述至少一种非肽聚合物与所述至少一种两亲性肽和/或类肽混合或交联。
69.一种手术植入物或支架，其包含肽和/或类肽骨架，其中所述肽和/或类肽骨架由权利要求45-56中任一项的水凝胶形成。
70.一种药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医学装置和/或电子装置，其包含权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，优选权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，或权利要求45-56中任一项的水凝胶。
71.权利要求70的药物组合物和/或化妆品组合物和/或生物医学装置和/或电子装置，其进一步包含药学活性化合物。
72.权利要求70或71的药物组合物和/或化妆品组合物，其进一步包含药学可接受的载体。
73.权利要求70-72中任一项的药物组合物和/或化妆品组合物，其是可注射的。
74.一种试剂盒，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器具有权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，优选权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，所述第二容器具有水溶液。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述第二容器的水溶液进一步包含药学活性化合物。
76.权利要求74或75的试剂盒，其中具有至少一种两亲性肽和/或类肽的所述第一容器进一步包含药学活性化合物。
77.权利要求74-76中任一项的试剂盒，其进一步包含具有胶凝增强剂的第三容器。
78.权利要求77的试剂盒，其中所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
79.权利要求74-78中任一项的试剂盒，其中所述第一、第二或第三容器中的至少一个作为喷雾瓶或注射器提供。
80.一种试剂盒，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器具有权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，优选权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽的水溶液，所述第二容器具有胶凝增强剂。
81.权利要求80的试剂盒，其中所述第一容器进一步包含药学活性化合物。
82.权利要求80或81的试剂盒，其中所述胶凝增强剂是盐或盐溶液。
83.权利要求80-82中任一项的试剂盒，其中所述第一和所述第二容器中的至少一个作为喷雾瓶或注射器提供。
84.一种组织再生或组织置换的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供如权利要求45-56中任一项中定义的水凝胶；
b)使所述水凝胶暴露于形成再生组织的细胞；
c)允许所述细胞在所述水凝胶上或在所述水凝胶中生长。
85.权利要求84的方法，其在体外或在体内或离体进行。
86.权利要求85的方法，其在体内进行，其中在步骤a)中，在患者体内期望组织再生或组织置换的位置处提供所述水凝胶。
87.权利要求86的方法，其中所述组织选自皮肤组织、在椎间盘中的髓核、软骨组织、滑液和在膀胱颈中的粘膜下结缔组织。
88.权利要求86或87的方法，其中通过将所述水凝胶或权利要求1-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽，优选权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽的溶液注射到患者体内期望组织再生或组织置换的位置处来进行所述步骤a)。
89.权利要求88的方法，其中所述步骤a)进一步包括共同注射胶凝增强剂，优选盐溶液。
90.权利要求85的方法，其离体进行，其中在步骤a)或b)中，将来自患者或供体的细胞与所述水凝胶混合，并且在患者体内期望组织再生或组织置换的位置处提供所得到的混合物。
91.权利要求84-90中任一项的方法，其中所述水凝胶包含一种或多种生物活性治疗剂，其刺激再生过程和/或调节免疫应答。
92.一种伤口处理方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供如权利要求45-56中任一项中定义的水凝胶；
b)使所述水凝胶暴露于所述伤口。
93.权利要求92的方法，其中所述伤口是烧伤伤口。
94.权利要求92或93的方法，其中所述水凝胶诱导自溶性清创。
95.权利要求92-94中任一项的方法，其中所述水凝胶包含权利要求40-44中任一项的至少一种两亲性肽和/或类肽。
96.权利要求95的方法，其中所述水凝胶充当止血剂。
97.权利要求95或96的方法，其中所述水凝胶充当抗炎剂，其通过清除刺激先天性免疫系统的细胞外核酸起作用。
98.权利要求92-97中任一项的方法，其中在步骤a)中，将所述水凝胶与重新填充所述伤口且加速伤口愈合的细胞混合。
99.权利要求92-98中任一项的方法，其中所述水凝胶包含一种或多种生物活性治疗剂，其扩散到所述伤口内，并且通过调节炎症应答和/或刺激再生过程来促进愈合应答。
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