DE102015000363A1 - Neue modular funktionalisierbare Peptid-Hydrogele - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue, Hydrogele bildende Peptide, deren Struktur auf den biomimetischen Prinzipien des natürlichen immunologischen Codes für die MHC-vermittelte Immunantwort basiert sowie intelligenten Gelbildungsprotokolle und Applikationsstrategien für die kontrollierte Gelbildung in Form von Scaffolds, Matrizes, Beschichtungen und in situ. Die außergewöhnlich stabile Gelbildungstendenz der neuen Peptide ermöglicht vielfältige Formen der Funktionalisierung in den Aminosäure-Seitenketten und/oder an den Termini unter weitgehender Beibehaltung der Gelbildungseigenschaften des gelierenden Grundsystems. Modifizierungen des Peptid-Grundgerüstes ermöglichen die Herstellung neutraler Gele. In Verbindung mit einer flexiblen Funktionalisierungsstrategie eignen sich die neuen Peptide insbesondere als Basis für ein modular aufgebautes Sol-Gel-System, dessen Eigenschaften und Zusammensetzung im Sinne eines Baukastensystems für vielfältige Anwendungen angepasst werden können. Die neuen injizierbaren Hydrogele sind unter physiologischen Bedingungen stabil und weisen eine sehr gute Biokompatibilität auf. Insbesondere als Kultursubstrate, 3-dimensionale Wachstumsmatrizes, Transport- und Depotmatrizes sowie als Füllstoffe eröffnen sie ganz neue Möglichkeiten für Anwendungen in der Biologie und Medizin. Die große Bandbreite der gezielt einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften der neuen Hydrogele begründet zudem ein weitreichendes Anwendungspotential auch außerhalb der Lebenswissenschaften.

Description

• Technisches Gebiet
• Die vorliegende Erfindung betrifft neue, Hydrogele bildende Peptide, deren Struktur auf den biomimetischen Prinzipien des natürlichen immunologischen Codes für die MHC-vermittelte Immunantwort basiert, und die aufgrund ihrer außergewöhnlich stabilen Gelbildungstendenz vielfältige Formen der Funktionalisierung, unter weitgehender Beibehaltung der Gelbildungseigenschaften des gelierenden Grundsystems, ermöglichen.
• Neue Strategien zur Modifizierung des Peptid-Grundgerüstes, insbesondere der Ladungsverteilung, ermöglichen erstmals die Herstellung von vollständig neutralisierten Hydrogelen. Funktionale Moleküle in den Aminosäure-Seitenketten und/oder an den Termini, aktivieren die Faseroberfläche der nanostrukturierten Hydrogele für die Herstellung funktioneller Gel-Matrizes. Durch den Einbau von nicht natürlichen Aminosäuren und/oder die Abschirmung von funktionellen Gruppen und Termini, kann die (Bio-)Abbaubarkeit der Hydrogele gesteuert werden. In Verbindung mit einer flexiblen Funktionalisierungsstrategie sowie der Einbettung weiterer anwendungsrelevanter Gastspezies, eignen sich die neuen Peptide insbesondere als Basis für ein modular aufgebautes Sol-Gel-System, dessen Eigenschaften und Zusammensetzung im Sinne eines Baukastensystems für vielfältige Anwendungen angepasst werden können.
• Die neuen injizierbaren Hydrogele sind unter physiologischen Bedingungen stabil und weisen eine sehr gute Biokompatibilität auf. Insbesondere als Kultursubstrate, 3-dimensionale Wachstumsmatrizes, Transport- und Depotmatrizes sowie als Füllstoffe, eröffnen sie ganz neue Möglichkeiten für Anwendungen in der Biologie und Medizin. Die große Bandbreite der gezielt einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften der neuen Hydrogele begründet zudem ein weitreichendes Anwendungspotential auch außerhalb der Lebenswissenschaften.
• Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung und modularen Funktionalisierung der gelbildenden Peptide sowie intelligente Gelbildungsprotokolle und Applikationsstrategien für die kontrollierte Gelbildung, die die Herstellung von gel-basierten Scaffolds, Matrizes, Beschichtungen sowie die in situ Bildung der Hydrogele nach Injektion in eine Elektrolyt-Lösung, ein Zellkulturmedium oder direkt in das Gewebe, ermöglichen.
• Ein auf den der Erfindung zugrundeliegenden biomimetischen Prinzipien basierendes Screening-Verfahren zur Identifizierung weiterer gelbildender Peptide wird beschrieben. Erste Vermarktungsmöglichkeiten bestehen in Form von maßgeschneiderten Kits zur Herstellung von anwendungsbezogen funktionalisierten Hydrogelen sowie zur Bestimmung von Enzymaktivitäten.
• Stand der Technik
• Die Fortschritte in der regenerativen Medizin führen unter anderem zu einem steigenden Interesse an neuen biokompatiblen Materialien für 3-dimensionale Kultursysteme, die die natürliche Umgebung von Zellen, Mikroben, Geweben und Organsystemen möglichst naturgetreu simulieren können.
• In der Forschung können solche Systeme wesentlich dazu beitragen, natürliche Mechanismen der Regulation von Wachstum und Differenzierung von Zellen sowie der Entwicklung und Regeneration von Organen und Gewebe besser zu verstehen. Mikrobielle Kulturen können realitätsnah durchgeführt werden. Als zell-besiedelte Implantate, Beschichtungen, Füllstoffe oder Regenerationsmatrizes würden bioabbaubare, idealerweise injizierbare Matrizes mit wachstumsfördernden Eigenschaften, das Einwachsen von Ersatzmaterialien sowie die Heilung von Knochen- und Gewebedefekten wesentlich unterstützen. Zudem erfordern moderne, hochspezifische und oftmals wenig stabile Wirkstoffe neue Applikationsstrategien. Maßgeschneiderte Matrizes für Drug-Delivery-Systeme sollen die Wirkstoffe oder auch Zellen kontrolliert, in stabilisierter Form und in ausreichend hoher Dosis an einen festgelegten Wirkort bringen und dort mit einem definierten Freisetzungsprofil abgeben.
• Hydrogele sind, aufgrund ihres hohen Wassergehaltes, ihrer 3-dimensionalen Faserstruktur und ihrer viskoelastischen Eigenschaften für solche Anwendungen, z. B. als Basis für Kultursubstrate für die Mikrobiologie, als Wachstumsmatrizes für die Gewebe- und Zellkultur sowie als Transport- und Depotmatrizes für Organismen, Zellen und Wirkstoffe, gut geeignet.
• Zahlreiche Anstrengungen wurden unternommen, um aus tierischen Quellen extrahierte gelbildende Proteine, Proteoglycane und Polysaccharide, wie z. B. Kollagen oder Hyaluronsäuren, nutzbar zu machen. Auch kollagen-basierte, flüssig injizierbare Hydrogele wurden entwickelt ( WO 2012/107174 ). Jedoch sind damit stets auch Risiken durch die Kontamination mit Antigenen, Pathogenen, Pyrogenen u. a. verbunden. Aufgrund der natürlichen Schwankungsbreite von Zusammensetzung, Kettenlänge und Vernetzungsgrad der Biopolymere sowie der darin enthaltenen Wachstumsfaktoren und weiteren Proteine der extrazellulären Matrix, kann die Chargen-Konsistenz für solche Materialien, auch bei einem engmaschigen Kontrollnetz, nicht gewährleistet werden. Veränderungen der Materialien während der Verarbeitungs- und Sterilisationsprozesse sind unvermeidbar. Versuche zur rekombinanten Herstellung solcher natürlichen Matrizes resultieren in Schwierigkeiten bei der Aufreinigung durch Rückstände, die Denaturierung und den Abbau der Makromoleküle. Zudem sind die chemisch-physikalischen Eigenschaften solcher natürlicher Materialien entscheidend von der Zusammensetzung sowie von den Umgebungsbedingungen abhängig und damit nur in geringem Maße einstellbar bzw. schwer zu kontrollieren.
• Demgegenüber wurde eine Vielzahl von synthetischen, nicht proteinogenen Polymermaterialien als Matrizes für die Zellkultur und das Tissue Engineering entwickelt, bei denen diese Probleme durch die Anwendungen standardisierter Protokolle und eine strenge Kontrolle der Produktionsprozesse ausgeschlossen werden. Weit verbreitet sind hierbei Systeme, die auf quervernetzten Copolymeren und Modifikationen von Polylactid-co-Glycoliden, Methacrylaten, Polyethylen(propylen)-glykolen oder Poly-N-isopropylacrylamid basieren. Ein wesentlicher Nachteil dieser Systeme liegt in der kovalenten Verknüpfung des Polymer-Netzwerkes, resultierend in einer engen Maschenweite, einem unkontrollierbaren Quellverhalten und Schwierigkeiten bei der Zellrückgewinnung aus den Kulturmatrizes. Durch enzymsensitive Spaltstellen kann nur teilweise Abhilfe geschaffen werden. Zudem behindern nicht zell-kompatible Reaktionsprodukte und -bedingungen sowie die sauren Abbauprodukte der Hydroester die Entwicklung der kultivierten Spezies. Der Spielraum für die Einbringung zusätzlicher Funktionalitäten zur Modifikation der etablierten Systeme ist meist gering. In der Regel werden diese polymer-basierten Hydrogele separat geformt und die Scaffolds oder Oberflächen anschließend mit Zellen besiedelt. Diese Bedingungen entsprechen jedoch eher einer 2D-Kultur und sind mit der natürlichen Umgebung nicht vergleichbar.
• In situ formbare synthetische polymer-basierte Kulturmatrizes, die die Zellen oder Gewebe in die Matrix einschließen, ermöglichen demgegenüber eine echte 3D-Kultur. Zwei derartige, auf chemisch vernetzter Hyaluronsäure basierende Systeme werden unter den Handelsnamen AuxiGel^TM und HyStem^TM vertrieben. Auf vernetzen Polyethylenglykolen bzw. Polyvinylalkoholen basieren die Gel-Matrizes von QGel^TM und Cellendes^©. Die Konstituierung dieser Matrizes erfolgt durch eine chemische Vernetzungsreaktion, die nach dem Mischen der mit Linker-Molekülen funktionalisierten Polymere mit den dazu komplementären Crosslinkern einsetzt. Damit trotz des gebildeten starren und engen Netzwerkes eine Migration der in diese Matrizes eingeschlossenen Zellen möglich ist, werden S-S-Brücken oder enzymatisch spaltbare Peptide in die Crosslinker eingebaut, die von den Zellen abgebaut werden können. Jedoch schränken sehr schnelle Reaktionszeiten, in einem engen Bereich definierte Reaktionsbedingungen sowie teilweise hochviskose Polymer-Lösungen, die breite Nutzung dieser gelbildenden Systeme, vor allem als injizierbare Gel-Matrizes, ein.
• Besser geeignet wären Hydrogele mit größeren Porenweiten, deren Bildung auf physikalischen Wechselwirkungen beruht, sodass die Zellen sich nahezu frei bewegen können. Insbesondere peptid-basierte Hydrogele finden, aufgrund ihrer Rolle als strukturelle Elemente von biologischen Systemen, der umfangreichen Möglichkeiten zu ihrer chemischen und biologischen Ausgestaltung bzw. Funktionalisierung, der einstellbaren Bioabbaubarkeit sowie der einfachen Synthese und Handhabung, zunehmend Anwendungen als biokompatible Wachstums- und Differenzierungsmatrizes.
• Amphiphile Peptide z. B. bilden sequenzabhängig selbstorganisierende Nanofasern, die sich ihrerseits zu einem verzweigten 3-dimensionalen Netzwerk zusammenlagern, welches große Mengen an Wasser einschließt und makroskopisch als Hydrogel erscheint. Dieses Gel ist leicht zu handhaben, biokompatibel und kann durch vielfältige Variationen der Aminosäure-Sequenz in Struktur, Oberfläche und Stabilität modifiziert werden. Auf diese Weise lassen sich z. B. der für den Übergang von der Flüssig- in die Gelphase notwendige pH-Wert bzw. die erforderliche Elektrolyt-Konzentration zielgenau einstellen. Da die Vernetzung ausschließlich auf physikalischen Wechselwirkungen beruht, sind diese Hydrogele für die Zellen und deren Fortsätze leichter penetrierbar. In der Regel weisen sie eine mit der der extrazellulären Matrix vergleichbare Porengröße auf. Erste Matrizes, wie z. B. PuraMatrix^TM und HydroMatrix^TM, sind inzwischen kommerziell erhältlich.
• Die bisher beschriebenen amphiphilen gelbildenden Peptide basieren in der Regel auf künstlichen, aus bestimmten hypothetischen Gelbildungsmodellen abgeleiteten Strukturen, die meist regelmäßig wechselnde komplementäre Aminosäure-Anordnungen und/oder ausgeprägte hydrophobe Abschnitte aufweisen. In mehreren Studien wurden Fragmente natürlicher Proteine untersucht.
• Die effektive Länge solcher Strukturen liegt im Bereich von 11 bis 16 Aminosäuren. Auch kürzere gelbildende Peptide wurden beschrieben. Jedoch werden die Gelbildungseigenschaften derart kurzer Peptide bereits durch den Austausch oder die Positionierung einzelner Aminosäuren komplett verändert, sodass eine Funktionalisierung dieser Gele sowie die Übertragung der abgeleiteten Design-Prinzipien auf längere Peptide nicht möglich sind. Z. B. haben Frederix et al. (2015) einen Algorithmus für die Vorhersage des Aggregationspotentials von Tripeptiden veröffentlicht.
• Daneben wurden zahlreiche anwendungsspezifische Systeme mit hochkomplexen Bauprinzipien entwickelt. So beschreibt die Arbeitsgruppe um Woolfson (Banwell et al. 2009) eine optimierte synthetische α-Helix. Ghadiri et al. (1993) beschreiben zyklische Oktapeptide mit regelmäßigem Wechsel der L- und D-Isomere. Bei den u. a. von der Arbeitsgruppe um Ulijn (Toledano et al. 2006, Adams 2011, Tang et al. 2013) beschriebenen Fmoc-Oligopeptiden, wird die Gelbildung durch die π-π-Wechselwirkung der aromatischen Fmoc-Schutzgruppen bewirkt.
• Die Ausbildung von β-Faltblattstrukturen bei Peptiden mit regelmäßig wechselnden aromatischen und polaren Aminosäuren, unterstützt durch die elektrostatische Anziehung zweier flankierender entgegengesetzt geladener Aminosäuren, beschreiben die Arbeitsgruppen um Aggeli (Aggeli et al. 1997, Riley et al. 2009), Collier/Messersmith (2003) und Jung (et al. 2009). Die Arbeitsgruppe um Hartgerink (Aulisa et al. 2009) beschreibt darauf aufbauend Peptide mit regelmäßig wechselnden polaren und aliphatischen Aminosäuren bei gleichen Ladungen der flankierenden Aminosäuren. Eine Struktur mit regelmäßig wechselnden hydrophoben und gleich geladenen ionischen Aminosäuren, ohne die Unterstützung von ionischen Endgruppen, beschreiben Feng et al. (2011) sowie Pochan und Kollegen (Haines-Butterick et al. 2007). Eine Besonderheit des zweiten Systems liegt in den beiden Prolinen in der Mitte der Sequenz, die durch die Faltung des linearen Peptides die Gelbildung einleiten und für eine ausgeprägte Thixotropie der Hydrogele gegenüber Scherbelastungen sorgen.
• Eine Mischung aus β-Faltblattstruktur und elektrostatischer Anziehung für 12- oder 16-mer Peptide mit regelmäßig abwechselnden hydrophoben und ionischen Aminosäuren, wobei die letzteren im Wechsel positiv und negativ geladene Seitenketten aufweisen, beschreibt die Arbeitsgruppe um Zhang (Caplan et al. 2002). Dieses von einem natürlichen Protein abgeleitete Strukturprinzip ist auch Grundlage des kommerziellen Produktes PuraMatrix^TM.
• Demgegenüber liegt den von der Arbeitsgruppe um Stupp (Silva et al. 2004, Cui et al. 2010) beschriebenen Peptiden ein den Tensiden ähnliches Prinzip zugrunde. Eine hydrophobe aliphatische Kette als Schwanz sowie ein hydrophiles Peptid als Kopf, führen zur Mizellenbildung im wässrigen Medium. Die β-Faltblattstrukturen formende Aminosäure-Sequenz als Zwischenglied und eine geladene Aminosäure als Abstandshalter, vermitteln die seitliche Zusammenlagerung der linearen Moleküle zu langen Röhren. Diese „Fasern” bilden ein Netzwerk, das makroskopisch als Hydrogel erscheint. Zur Stabilisierung der gebildeten Hydrogele wurden Strategien zur zusätzlichen kovalenten Vernetzung der benachbarten Moleküle über S-S-Brücken oder Diacetylen-Polymerisation entwickelt.
• Die beiden letztgenannten Konzepte sind die in der Entwicklung am weitesten fortgeschrittenen Systeme zur Herstellung von peptid-basierten Hydrogelen. Ausgehend von den Basis-Patenten ( US 6,800,481 und WO 2003/070749 ) wurden hierzu inzwischen zahlreiche Anwendungen für die regenerative Medizin und die Nanotechnologie entwickelt ( US 7,449,180 , WO 2002/062969 , WO 2003/096972 , WO 2004/007683 , WO 2005/014615 , US 7,846,891 , WO 2006/014570 , WO 2006/116524 , WO 2008/039483 , WO 2008/073392 , US 2011/0200560 , WO 2012/008967 , und WO 2003/054146 , WO 2003/084980 , WO 2004/018628 , WO 2004/072104 , WO 2004/106359 , WO 2005/056039 , WO 2005/056576 , WO 2006/079036 , WO 2006/096614 , WO 2008/061014 , WO 2008/063808 , WO 2008/067145 , WO 2008/101104 , WO 2008/121447 , WO 2009/026233 , WO 2010/120830 , US 2011/0280944 , US 2012/0294902 , WO 2012/149515 ).
• Ein Nachteil der bisher publizierten peptidischen Hydrogele besteht darin, dass der gelbildende Sequenzabschnitt eine Länge von mehr als 15 Aminosäuren aufweisen muss, um im Falle von Modifizierungen eine ausreichende Stabilität der Gele zu gewährleisten. Zudem wurden Funktionalisierungen in der Regel nur an den Termini und sehr selten mittig in der linearen Aminosäure-Sequenz toleriert. Mehrfache Funktionalisierungen und Funktionalisierungen unter Nutzung der Seitenketten waren nicht erfolgreich. Zum anderen schränkt der pH-abhängige Gelbildungsmechanismus die Biokompatibilität der Gele ein. Neutrale, Hydrogele bildende amphiphile Peptide weisen oft eine eingeschränkte Löslichkeit bzw. Stabilität der Peptid-Lösungen in neutralen wässrigen Medien auf. So werden PuraMatrix^TM und HydroMatrix^TM als saure Lösungen mit pH 2 eingesetzt. Komplementär dazu erfordern die im Neutralen löslichen amphiphilen Peptide, je nach Ladung, basische oder saure Bedingungen oder ein zweites entgegengesetzt geladenes Peptid für die Gelbildung (Niece et al. 2003). Teilweise zeigen bereits die Lösungen eine erhebliche Viskosität.
• Einen umfassenden Überblick über peptidische gelbildende Systeme und deren Anwendung erhält man in der Fachliteratur (Hirst et al. 2008, Jung et al. 2010, Loo et al. 2012, Matson/Stupp 2012, Fichman 2014).
• Technische Aufgabe
• Ausgehend vom Stand der Technik und den aktuellen Entwicklungen, insbesondere auf den Gebieten des Tissue Engineering, der regenerativen Medizin, der Werkstoffwissenschaften und der Nanotechnologie, besteht weiterhin ein großer Bedarf nach neuen, biokompatiblen und flexibel modifizierbaren Hydrogelen. Insbesondere unter physiologischen Bedingungen und in situ formbare neutrale Gele werden benötigt, um einerseits Organismen, Zellen, Wirkstoffe und/oder Partikel in die Trägermatrix einzuschließen und andererseits flüssig injizierbare Implantate und Füllstoffe für minimal-invasive chirurgische Verfahren zu entwickeln.
• Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein modular aufgebautes biokompatibles Sol-Gel-System zur Herstellung stabiler, nanostrukturierter Hydrogele bereitzustellen, dessen Eigenschaftsprofil im Sinne eines Baukastensystems durch verschiedene, beliebig kombinierbare Funktionalisierungen und Struktur-Modifikationen über einen breiten Einsatzbereich an die jeweilige Anwendung in Biologie, Medizin, Medizintechnik, Kosmetik, Chemie, Physik sowie Elektronik angepasst werden kann.
• Gleichzeitig sollen entsprechende Methoden zur kontrollierten Gelbildung, zur Einstellung der Gelbildungskinetik, zur Einbettung von gelösten und partikulären Komponenten sowie zur Handhabung der Hydrogele bereitgestellt werden. Intelligente Gelbildungsprotokolle und Applikationsstrategien sollen, unter Berücksichtigung der benötigten Zeitfenster, die Verarbeitung und insbesondere die Injizierbarkeit der Hydrogele gewährleisten.
• Die Aufgabe wird gelöst durch eine neue Klasse von kurzen, Hydrogele bildenden biomimetischen Peptiden, wie sie in den Ansprüchen 1 und 2 beschrieben sind, und die ein völlig neues, von bisherigen synthetischen Matrizes unabhängiges Strukturprinzip für peptidische Gelbildner begründen. Diese non-permissiven Gelbildner wurden zu den in den Ansprüchen 3 bis 5 aufgezeigten, modular aufgebauten, multifunktionalen gelbildenden Peptide bzw. den entsprechenden Precursoren gemäß Anspruch 6 weiterentwickelt. Die Kombination dieser Verbindungen mit weiteren funktionalen Komponenten und Gastspezies, resultiert in einem komplexen Sol-Gel-System, wie es in Anspruch 7 beschrieben ist. Anspruch 8 beinhaltet ein mehrstufiges Verfahren zur Herstellung der Hydrogele, das auch die Möglichkeit der in situ Gelbildung nach der Injektion flüssiger Peptid-Lösungen berücksichtigt, während in Anspruch 9 ein Schnelltest zur Identifizierung weiterer erfindungsgemäßer Peptide offenbart wird. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Hydrogele für die Bestimmung von Enzymaktivitäten sowie die Vermarktung der Erfindung in maßgeschneiderten Kits zur Herstellung von anwendungsspezifisch funktionalisierten Hydrogelen, sind Gegenstand der Ansprüche 10 und 11.
• Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
• Detaillierte Beschreibung
• Diese Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass einige biomimetische Peptide gelartige Aggregate bilden. Im Rahmen einer immunologischen Studie mit einer Serie von T-Zell-Epitopen, konnte völlig unerwartet beobachtet werden, dass diese Peptide in Verbindung mit elektrolyt-haltigen Lösungen eine besonders hohe Gelbildungstendenz aufweisen. Bei der Zugabe von Zellkulturmedium oder physiologischen Salz-Lösungen im millimolaren Bereich, gelierten die Peptid-Lösungen unter Bildung transparenter homogener Hydrogele, die unter den Zellkulturbedingungen stabil waren.
• Diese Beobachtung war umso mehr überraschend, als dass bisher nicht bekannt war, dass solche kurzen Peptide mit 8 oder 9 Aminosäuren in der Lage sind, durch Selbstorganisation derart stabile makroskopische Strukturen auszubilden, ohne dass sie einem theoretisch abgeleiteten Bauprinzip folgen.
• Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen peptidischen Hydrogelbildnern, handelt es sich bei den der Beobachtung zugrunde liegenden Peptiden um völlig neue Strukturen auf der Basis biomimetischer Ansätze. Eine auf bestimmte Gelbildungsmechanismen abgestimmte Aminosäure-Sequenz oder ein logisches Strukturmuster waren nicht erkennbar. Keines der bisher auf amphiphilen Peptiden basierenden Gelbildungskonzepte schließt diese Strukturen ein.
• Diese Beobachtung war so überraschend, dass wir das Phänomen und die diesem zugrundeliegenden Mechanismen weiter untersucht haben.
• Zunächst wurde versucht, aus der Analyse der Struktur-Eigenschafts-Beziehungen der der beschriebenen Beobachtung zugrunde liegenden Peptide, allgemeine Strukturprinzipien abzuleiten und auf dieser Basis weitere, Hydrogele bildende Peptide zu identifizieren.
• Bei den beschriebenen Peptiden handelt es sich um Epitope zur Stimulation zytotoxischer Effektor-T-Zellen (CTL), die an MHC-Klasse-I-Proteine binden. Hierfür typische Peptide sind kurze Sequenzen aus 8 bis 11 Aminosäuren, die in der Bindungstasche des MHC-Proteinkomplexes eine gestreckte Sekundärstruktur annehmen. Mit Hilfe struktur-basierter Suchprogramme konnten weitere MHC-bindende Epitope, die ein hohes Potential zur Gelbildung aufweisen, identifiziert werden.
• Des Weiteren wurde beobachtet, dass bei der Struktursuche identifizierte Peptide, die keine geladenen Aminosäuren enthalten, aufgrund einer unzureichenden Löslichkeit in wässrigen Medien zur Agglomeration neigen. Dagegen weisen Peptide mit einzelnen basischen und/oder sauren Aminosäuren, eine gute Löslichkeit auf, insbesondere wenn der pH-Wert des Mediums auf die Nettoladung des Peptides abgestimmt wird. Aus diesen klaren Lösungen lassen sich durch die Zugabe von Elektrolyten und/oder durch pH-Verschiebung homogene Gele bilden.
• Bei Aufhebung der terminalen Ladungen durch Acetylierung des N-Terminus und/oder Amidierung des C-Terminus, konnte eine Verstärkung der Gelbildungstendenz beobachtet werden. Zudem konnten durch Modifizierungen einzelner Positionen der Aminosäure-Sequenz, insbesondere durch Verschiebung der Ladungsbilanz und der Ladungsverteilung, die Gelbildungskinetik und die Steifigkeit der gebildeten Hydrogele variiert sowie der für die Gelbildung optimale pH-Wert verschoben werden.
• Die Bewertung dieser Beobachtungen führte zu einem Arbeitsmodell für den Gelbildungsmechanismus.
• Allen identifizierten Gelbildnern liegt das biomimetische Prinzip des immunologischen Codes MHC-bindender Moleküle zugrunde. Aufgrund der Länge und Struktur der Aminosäure-Sequenz, kann die Ausbildung von β-Faltblattstrukturen oder α-Helices ausgeschlossen werden. Eine komplementäre Anordnung regelmäßiger Strukturen ist ebenfalls nicht naheliegend.
• Es wird vermutet, dass sich im ersten Schritt, vermittelt durch intermolekulare ionische und hydrophobe Wechselwirkungen der Aminosäure-Seitenketten und Termini, die Peptidketten in einer parallelen oder antiparallelen Anordnung zusammenlagern. Die Gelbildung wird dabei durch die Einlagerung einer von der Struktur der Peptide bestimmten Anzahl von Wassermolekülen zwischen den Peptidketten stabilisiert. Ähnliche Prozesse finden bei der Einlagerung in die Bindungstaschen der Rezeptoren des Immunsystems statt. Die Primäraggregate organisieren sich anschließend zu einem 3-dimensionalen Netzwerk, das weiteres Wasser einschließt.
• Wird der pH-Wert des Lösungsmittels so eingestellt, dass die Peptide eine effektive Nettoladung aufweisen, liegen diese Peptide in einer klaren wässrigen Lösung vor. Durch Verschiebung des pH-Wertes in Richtung des isoelektrischen Punktes, nimmt die Nettoladung der Peptide und damit ihre Löslichkeit in polaren Medien ab. Dies resultiert meist in der Präzipitation des Peptides.
• Die Feinstruktur der Oberfläche wird dennoch von den Seitenketten der einzelnen Aminosäuren bestimmt. Bei den der Beobachtung zugrunde liegenden Peptiden führt das, aufgrund der besonderen biomimetischen Struktur der Peptide, insbesondere der Position, Verteilung und Anzahl geladener Aminosäuren, dazu, dass die Moleküle weiterhin von einer stabilen Hydrat-Hülle umgeben sind, die das üblicherweise beobachtete Ausfällen der Peptide verhindern.
• Im Bereich des isoelektrischen Punktes nimmt zudem die elektrostatische Abstoßung der Peptidketten ab. Der Anteil der hydrophoben Wechselwirkungen wird stärker und führt bei entsprechend komplementärer und strukturell kompatibler Anordnung der Aminosäuren zur Aggregation der Peptidketten, wobei die gebundenen Wassermoleküle eingelagert werden.
• Der gleiche Effekt kann erzielt werden, wenn zu den Peptid-Lösungen, mindestens im stöchiometrischen Verhältnis, ein Elektrolyt gegeben wird. Die Abstoßungskräfte zwischen gleich geladenen ionischen Gruppen werden hier aufgrund der Abschirmung durch entgegengesetzt geladene Elektrolyt-Ionen vermindert.
• Es ist davon auszugehen, dass die Gelbildung durch Verschiebung des pH-Wertes schneller erfolgt, allgemein aber zu einem weicheren Gel führt. Die Elektrolyt-Ionen weisen, im Vergleich zum Oxonium-Ion, einen größeren hydrodynamischen Radius, zweiwertige Ionen zudem eine höhere Oberflächenladung auf. Durch die damit verbundene geringere Diffusionsgeschwindigkeit der Ionen in dem sich bildenden Hydrogel, erfolgt die Gelbildung etwas langsamer, resultiert aber in einem festeren und gegenüber Schwankungen in der Medienzusammensetzung sowie pH-Änderungen stabileren Gel.
• Aus diesen Erkenntnissen wurden die charakteristischen Strukturmerkmale und Eigenschaften für die von der Erfindung umfassten, Hydrogele bildenden Peptide abgeleitet. Die erfindungsgemäßen Hydrogelbildner sind demnach charakterisiert durch:
  eine lineare Aminosäure-Sequenz mit amphiphiler Struktur,
• • bestehend aus 7–12, bevorzugt 8–11 und besonders bevorzugt 8–9 Aminosäuren,
• • die 1 oder 2 nicht benachbarte basische und/oder saure Aminosäuren und mindestens eine Aminosäure mit aromatischer Seitenkettenfunktionalität sowie weitere polare und unpolare Aminosäuren in einer komplementären und strukturell kompatiblen Anordnung enthält, und
• • die im pH-Bereich zwischen 6 und 8 eine Nettoladung von +1, –1 oder 0 aufweist,
mit den folgenden Eigenschaften:
• • amphiphil,
• • Löslichkeit in wässrigen Medien,
• • auf der Selbstorganisation der Moleküle basierende Bildung homogener Hydrogele aus 0,1 bis 5%igen wässrigen Lösungen, ausgelöst durch die Zugabe von Elektrolyten, die Abspaltung von die Wasserlöslichkeit vermittelnden Schutzgruppen und/oder eine pH-Verschiebung,
• • Stabilität der gebildeten Hydrogele in neutralen wässrigen Medien, in physiologischen Salz- und Puffer-Lösungen sowie unter Zellkulturbedingungen,
• • weitgehender Erhalt der Gelbildungseigenschaften bei Funktionalisierungen mit kleinen Molekülen bis zu einer Molmasse von ca. 1.500 g/mol sowie bei der Modifizierung oder dem Austausch einzelner Aminosäuren.
• Hierbei, wie auch im Rest der Beschreibung, steht der Terminus „Aminosäuren” vorzugsweise für natürliche Aminosäuren. Jedoch werden auch nicht natürliche Aminosäuren, wie z. B. β- oder γ-Aminosäuren oder solche mit ungewöhnlichen Seitenketten, eingeschlossen. Durch den Einbau ähnlicher Verbindungen, wie z. B. Hydroxysäuren, können sich im Peptid-Grundgerüst ungewöhnliche Peptid-Bindungen, wie z. B. Ester-Bindungen, ergeben. Die Steuerung der Bioabbaubarkeit durch den gezielten Einbau von D-Aminosäuren in das Peptid-Grundgerüst, ist ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung.
• Besonders bevorzugte erfindungsgemäße, Hydrogele bildenden Peptide, sind in der folgenden Tab. 1 zusammengestellt. Weitere bevorzugte Ausführungsformen werden in den Unteransprüchen sowie in den Ausführungsbeispielen beschrieben. Tab. 1: Sequenzen bevorzugter Hydrogele bildender Peptide.

  Sequenz	Ident-Code
  SIINFEKL	SEQ ID NO 01
  siinfekl (Peptid aus D-Aminosäuren)	SEQ ID NO 02
  LKEFNIIS (retro Sequenz)	SEQ ID NO 03
  lkefniis (retro Sequenz aus D-Aminosäuren)	SEQ ID NO 04
  ASNENMETM	SEQ ID NO 05
  GILGFVFTL	SEQ ID NO 06
  WDFKFDSV	SEQ ID NO 07
  KFLYNFTQI	SEQ ID NO 08
  VGNWAKVLV	SEQ ID NO 09

• Die Zusammenstellung in Tab. 1 hat rein exemplarischen Charakter. Es ist dem Fachmann leicht verständlich, dass weitere Peptide mit ähnlichen Strukturen in der Erfindung eingeschlossen sind. So konnte in unseren Untersuchungen bestätigt werden, dass punktuelle Modifikationen der Aminosäure-Sequenzen die Gelbildungstendenz nur wenig beeinflussen, solange die oben abgeleiteten charakteristischen Strukturmerkmale, insbesondere die Ladungsbilanz und -verteilung, erhalten bleiben. Das betrifft insbesondere die folgenden Modifikationen:
• • Austausch, Einfügen oder Auslassen einzelner Aminosäuren,
• • Verlängerung oder Verkürzung um 1–3 Aminosäuren,
• • Bildung entsprechender Multimere, bevorzugt eines Dimers, mit oder ohne Spacer-Einbau,
• • Austausch aller oder einzelner L-Aminosäuren durch die entsprechenden D-Aminosäuren,
• • Invertierung, Retro-Invertierung oder Zyklisierung der Sequenz,
• • Konjugation der Termini mit kleinen Molekülen zu ungeladenen Endgruppen,
• • Austausch einzelner Aminosäuren durch ähnliche Bausteine, wie z. B. Hydroxysäuren, oder
• • eine beliebige Kombination daraus.
• Im Hinblick auf mögliche vorteilhafte Anwendungen der erfindungsgemäßen Hydrogele, vor allem als Biomaterial, wurde in weiteren Untersuchungen getestet, inwieweit Funktionalisierungen der Aminosäure-Seitenketten und/oder der Termini möglich sind, ohne dass die Fähigkeit der Peptide zur Gelbildung verloren geht.
• Funktionalisierungen der Termini der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide mit einem Cystein, vorbereitend als Linker für die weitere Funktionalisierung, sowie mit biomimetischen Epitopen mit bis zu 10 Aminosäuren, wie z. B. den Laminin-Epitopen IKVAV oder IKVSV, verschiedenen RGD-Sequenz-Motiven oder kleinen Molekülen, wie z. B. Fluorescein, Rhodamin oder Biotin, zeigten die außergewöhnliche Tendenz dieser Peptide zur Bildung stabiler Gele. Auch an den Aminosäure-Seitenketten konnten kleinere Moleküle, wie z. B. Fluorescein konjugiert werden.
• Durch die direkte Kopplung der funktionalen Moleküle an die Hydrogel-Matrix kann, in Abhängigkeit von der Anwendung, eine zusätzliche Verstärkung und/oder Verlängerung der Effekte der funktionalen Moleküle erzielt werden. Einerseits werden die funktionalen Moleküle vor dem Auswaschen und teilweise auch dem biologischen Abbau geschützt. Andererseits ermöglichen multiple Funktionalisierungen der Hydrogele eine gleichzeitige und räumlich koordinierte Aktivierung mehrerer Effektoren, sodass synergistische Effekte erzielt werden können. Über gebundene Adhäsionsfaktoren können Zellen, Gewebe und Organismen an den Faseroberflächen und somit in hochwirksamer räumlicher Nähe zu den aktiven Molekülen organisiert werden, um lokale Prozesse auszulösen.
• Basierend auf den derzeitigen und zukünftigen Anwendungsfeldern für Hydrogele, sind die folgenden funktionalen Moleküle, für die (Bio-)Funktionalisierung der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide besonders vorteilhaft, unabhängig davon, ob es sich dabei um Oligopeptide, Oligonukleotide, Strukturabschnitte natürlicher Proteine oder kleine organische Moleküle, wie z. B. Zucker-Derivate, (hetero-)zyklische Verbindungen, oder Naturstoff-Derivate handelt. Dabei erhebt diese Auflistung keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
• • Epitope, abgeleitet von Proteinen der extrazellulären Matrix, wie z. B. von Laminin, Kollagen, Elastin oder Fibronektin,
• • Mimetika von Wachstumsfaktoren, angiogenen Faktoren oder biologischen Signalmolekülen,
• • Erkennungssequenzen für Rezeptoren zur Bindung von Zellen und zur chemotaktischen Steuerung von Wachstums- und Differenzierungsprozessen,
• • immunologisch aktive Epitope und Liganden, wie z. B. B- und T-Zell-Epitope, pathogene Partialsequenzen und Erkennungsmuster, Polyepitope oder ähnliche Träger antigener Informationen,
• • funktionelle Abschnitte, die das Targeting von Zellen, Geweben, Organen und Organsystemen oder krankheitsrelevanten Proteinen und Biomarkern ermöglichen,
• • Bindungs-, Adhäsions- und Ankermoleküle, z. B. für Zellen, Rezeptoren, Signalmoleküle, Wachstumsfaktoren, Heparine, Integrine, humorale Faktoren, Wirkstoffe, Biomarker, Organismen und andere Gastspezies,
• • Enzyme, Coenzyme, Vitamine, Naturstoff-Derivate oder pharmazeutische Wirkstoffe,
• • Ankergruppen, wie z. B. Biotin oder synthetische Linker-Moleküle,
• • funktionelle Gruppen zur Quervernetzung der aggregierten Peptidketten,
• • Schutzgruppen zur Verhinderung des enzymatischen Abbaus oder im Sinne von Precursoren zur stimuli-responsiven Initiierung der Gelbildung,
• • Marker-Moleküle, wie z. B. Fluorophore, radioaktive Labels oder Tags,
• • elektrisch leitfähige Gruppen,
• • wasserbindende Gruppen, wie z. B. Polysaccharide,
• • hydrophile Gruppen, wie z. B. Phosphate, Sulfate oder synthetische Oligomere (u. a. PEG),
• • hydrophobe Gruppen, wie z. B. Aliphaten, Aromaten mit 6 bis 26 C-Atomen, Lipide oder Adamantyl-Gruppen, sowie
• • weitere, die Aktivität, Funktionalität und Oberflächeneigenschaften der Hydrogele beeinflussende Moleküle und Motive von technischer oder biologischer Relevanz.
• Die Begrenzung der Größe der funktionalen Moleküle ist dabei abhängig von der Sequenz des gelbildenden Peptides, der Position des Liganden am Peptid sowie den Eigenschaften des Moleküls selbst. Sie muss im Einzelfall geprüft werden. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass Peptide mit bis zu 10 Aminosäuren bzw. Moleküle mit bis zu 1.500 g/mol problemlos mit den erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptiden zu konjugieren sind.
• Ferner schließt die Erfindung ausdrücklich multifunktionale Matrizes mit mehreren, auch verschiedenen, konjugierten funktionalen Molekülen ein. Je nach Kombination der eingesetzten funktionalen Moleküle ergeben sich dadurch völlig neue Einsatzgebiete für die erfindungsgemäßen Hydrogele.
• Für die Konjugation von funktionalen Molekülen mit besonders ungünstigen Eigenschaften, wie z. B. einem großen hydrodynamischen Radius, einer hohen Polarität oder einer ungünstigen Ladungsverteilung, konnte durch die Dimerisierung der gelbildenden Sequenzen eine Zunahme der Gelbildungstendenz und damit eine Stabilisierung der Hydrogele erzielt werden.
• Als für die biomedizinische Anwendung der erfindungsgemäßen Hydrogele besonders vorteilhaft, hat sich die Integration von Epitopen, die von Proteinen der extrazellulären Matrix abgeleitet sind, erwiesen. Z. B. spielt die RGD-Sequenz aus dem Fibronektin eine entscheidende Rolle bei der Integrin-vermittelten Zelladhäsion von Osteoblasten, Fibroblasten, Epithelzellen, u. a. Das Epitop IKVAV aus der α-Protein-Kette des Laminins wird als entscheidender Faktor für die Proliferation, Differenzierung und das axonale Aussprossen von Nervenzellen beschrieben. YIGSR aus der β-Protein-Kette des Laminins gilt als Faktor für die Adhäsion neuronaler und anderer Zelltypen. Die Epitope LRKKLGKa und LLGARKKK werden als Heparin-bindende Sequenzen beschrieben, die die Angiogenese von regeneriertem Gewebe unterstützen. Die Funktionalisierung mit Phosphoserinen fördert die Mineralisation bei der Knochenneubildung. Zahlreiche Effekte im Umfeld der Regeneration von Nerven, Knochen und Knorpel werden den Bone Marrow Homing Peptiden (BMHP) zugeschrieben.
• Weitere in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung vorteilhaft anwendbare Sequenzen und deren Funktionen sind dem Fachmann über die entsprechende wissenschaftliche und Patentliteratur zugänglich. Umfassende Auflistungen üblicherweise in Verbindung mit Hydrogelen verwendeter Epitope sind z. B. in WO 2012/008967 , US 2011/0200560 , WO 2008/039483 oder US 7,713,923 enthalten. Sie werden hiermit durch Bezugnahme zum Bestandteil der Beschreibung gemacht.
• Für die Funktionalisierung der Hydrogele bildenden Peptide werden die üblichen Ligationsmethoden der Peptid-Chemie unter Nutzung der terminalen und Seitenkettenfunktionalitäten, gegebenenfalls über Crosslinker und Spacer-Moleküle, bevorzugt. Prinzipiell ist hierfür jede funktionelle Gruppe geeignet. Etabliert sind v. a. lineare oder verzweigte Aminosäure-Spacer, Dicarbonsäure-Derivate, Hydrazine, Hydrazide, Diole, Diamine, Epoxide, Maleinsäure-Derivate, Glutardialdehyd sowie sonstige der Fachwelt bekannte Moleküle mit mehreren für das Crosslinking geeigneten Funktionalitäten. Des Weiteren sind die modernen Ligationsstrategien der Click-Chemie eine geeignete Alternative. Nach Modifizierung der gelbildenden Peptide sowie der funktionalen Moleküle mit entsprechenden reaktiven Gruppen, erfolgt die Konjugation durch das Vermischen der Reaktionspartner. Die meist milden Reaktionsbedingungen erlauben sogar die bioorthogonale Durchführung der Konjugationen unter Anwesenheit weiterer Komponenten und Gastspezies, wie z. B. und lebenden Zellen und Organismen.
• Über einen unverzweigten Terminus werden die Spacer-Moleküle mit dem Hydrogele bildenden Peptid, bevorzugt über dessen Amino-, Carboxy- oder Thiol-Gruppen in den Termini bzw. den Aminosäure-Seitenketten, konjugiert. Während der andere, gegebenenfalls verzweigte Terminus die Konjugation eines oder mehrerer funktionaler Moleküle vermittelt.
• Struktur und Ladung der Spacer-Moleküle müssen jeweils anwendungsspezifisch optimiert werden, sodass weder die Gelbildung gestört, noch die Aktivität und Zugänglichkeit der funktionalen Moleküle beeinträchtigt wird. Eine universelle Struktur lässt sich hierfür nicht angeben, jedoch sind lineare oder verzweigte Aminosäure-Spacer, bestehend aus 1–10, bevorzugt aus 1–6 natürlichen und/oder nicht natürlichen Aminosäuren vorteilhaft. Besonders bevorzugt sind multiple Glycin-Spacer, ε-Aminocapronsäure, 8-Amino-3,6-di-oxa-Oktansäure oder Polyethylenglykole.
• Eine spezielle Ausführungsform sind Spacer-Moleküle, die zusätzlich enzymatisch oder chemisch spaltbare Bindungen, Gruppen oder Sequenzen enthalten. Die dadurch ermöglichte kontrollierte Freisetzung von funktionalen Molekülen direkt aus dem Hydrogel, ist besonders für Anwendungen als Depot- und Transportmatrix in der Medizin und Pharmazie vorteilhaft. Die Abspaltung lösungsstabilisierender Schutzgruppen, meist stark polarer oder voluminöser sterisch hinderlicher Moleküle, ermöglicht die stimuli-responsive bzw. die biokatalysierte Hydrogel-Bildung. Entsprechend funktionalisierte erfindungsgemäße Peptide können als Precursoren für die in situ Bildung der Hydrogele eingesetzt werden. Auch können solche Systeme zu einfachen Assays zur Messung der Enzymaktivität verwendet werden. Besonders relevante Enzyme, die im Zielorganismus bzw. von den kultivierten Zellen selbst gebildet werden können, sind Proteasen, Endopeptidasen, Esterasen, Lipasen, Kinasen und Phosphatasen.
• Wie die Struktur der Spacer-Moleküle, ist auch die Position des Liganden am Grundgerüst des Hydrogele bildenden Peptides abhängig von seiner Struktur und Funktion.
• Für funktionale Moleküle, die die Oberflächenaktivität der Hydrogele beeinflussen, sind die Termini bevorzugt. Ausgehend vom Gelbildungsmodell mit einer (anti-)parallelen Anlagerung der Peptidketten, ermöglicht diese Position die Exponierung der funktionalen Moleküle an der Faseroberfläche und somit die freie Zugänglichkeit für Zellen, Partikel, Grenzflächen und andere lösliche und partikuläre Komponenten. Zudem ist die Aktivität der multifunktionalen Hydrogele von der Dichte der zugänglichen funktionalen Moleküle abhängig, die über den Funktionalisierungsgrad leicht eingestellt werden kann. Durch Zyklisierung der funktionalen Moleküle können die aktiven Molekülabschnitte zusätzlich exponiert werden.
• Zur Modifizierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Hydrogele sind neben der Modifikation des Grundgerüstes des Hydrogele bildenden Peptides auch Modifikationen in den Seitenketten vorteilhaft. Dies betrifft u. a. das Einführen oder Eliminieren voluminöser polarer oder hydrophober Gruppen, die die Interaktion zwischen den Peptidketten beeinflussen.
• Eine nachträgliche Quervernetzung zwischen den multifunktionalen gelbildenden Peptiden, z. B. über S-S-Brücken, Thioether-Bildung, Transglutaminase-vermittelte Reaktionen oder hydrophobe Wechselwirkungen, kann zur Stabilisierung der 3-dimensionalen Struktur der durch die Aggregation der Peptidketten gebildeten Fasern beitragen. Entsprechende Crosslinker können an den Termini oder in den Seitenketten eingeführt werden.
• Ein weiterer Aspekt ist die Anpassung der Stabilität der erfindungsgemäßen gelbildenden Peptide, bzw. deren Schutz vor enzymatischem Abbau und/oder Verdau. Durch die gezielte Steuerung der (Bio-)Abbaubarkeit, können die erfindungsgemäßen multifunktionalen gelbildenden Peptide bzw. die daraus aufgebauten modularen Sol-Gel-Systeme, die ihrer Anwendung entsprechenden Funktionen temporär, z. B. zur Unterstützung bzw. Überbrückung bestimmter Wachstums- und Entwicklungsprozesse, oder auch nahezu permanent, z. B. als Füllstoff oder technisches Material, ausfüllen. Zudem kann die Zersetzungsgeschwindigkeit der Hydrogele als Maß für die Aktivität bestimmter Enzyme eingesetzt werden.
• Geeignete Modifikationen des linearen Peptid-Grundgerüstes betreffen u. a. den Austausch einzelner oder aller L-Aminosäuren durch die entsprechenden D-Isomere (inverso-Peptide), die Invertierung der Aminosäure-Folge (retro-Peptide), eine Kombination der beiden vorhergehenden Modifikationen (retro-inverse Peptide) oder die Einführung ungewöhnlicher Peptid-Bindungen, wie z. B. Ester-Bindungen. Des Weiteren behindern hydrophobe Substituenten, wie z. B. Adamantyl-Gruppen oder aliphatische Ketten, hydrophile sterisch hinderliche Substituenten, wie z. B. Polysaccharide, oder ionische Substituenten, wie z. B. Sulfat-Gruppen, an den Termini und Seitenketten der Peptide den Zugriff von Enzymen auf das Peptid-Grundgerüst bzw. dessen chemischen Verdau. Der Abbau durch Exopeptidasen wird durch terminale Modifizierungen reguliert. Demgegenüber kann durch den Einbau von enzymatisch spaltbaren Gruppen und/oder die Einbindung entsprechender Enzyme in die Hydrogel-Matrix, der Abbau beschleunigt werden.
• Trotz der aufgezeigten Grundprinzipien muss die Modifizierung der multifunktionalen gelbildenden Peptide auf die konkrete Konstellation aus Hydrogele bildendem Peptid, Liganden-Struktur und Liganden-Kombination abgestimmt werden. Bei dieser Abstimmung der Komponenten ist es vorteilhaft, wenn die gelbildenden Peptide in neutralen wässrigen Medien eine geringe Nettoladung aufweisen. Bevorzugt sind Funktionalisierungen mit peptidischen Liganden, die sich besonders gut in das Peptid-Grundgerüst der gelbildenden Sequenz integrieren und eine gute Bioverträglichkeit erwarten lassen.
• Ausgehend von den vorstehend beschriebenen Überlegungen, Untersuchungen und Anwendungsmöglichkeiten, wurden die erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide zu einem flexibel funktionalisierbaren System erweitert. Die Erfindung umfasst demnach:
  Multifunktionale gelbildende Peptide mit modularem Aufbau,
  enthaltend die Komponenten:
• a) Hydrogele bildendes Peptid,
• b) funktionale Moleküle,
• c) flexible Spacer-Moleküle,
wobei
• • Art und Anzahl der funktionalen Moleküle, je nach Anwendung, beliebig miteinander kombiniert werden können,
• • die funktionalen Moleküle mittels geeigneter Spacer-Moleküle oder direkt mit den Seitenkettenfunktionalitäten und/oder den terminalen Endgruppen des Hydrogele bildenden Peptides konjugiert sind,
• • zur Verbesserung der Gelbildungseigenschaften die gelbildende Sequenz auch, konjugiert durch einen Peptid-Spacer, vorzugsweise einen G₃-Spacer, dimerisiert werden kann.
• Darin eingeschlossen sind nicht funktionalisierte, Hydrogele bildende Peptide, die als biologisch inaktive und chemisch inerte Basis-Gele Verwendung finden können.
• Eine prinzipielle Strukturvariante für diese multifunktionalen gelbildenden Peptide ist in 1 schematisch dargestellt, während in den 2a–c konkrete Strukturformeln für einige der untersuchten gelbildenden Peptide aufgezeigt sind.
• Im nächsten Schritt erfolgte die Erweiterung der Erfindung zu einem modularen Sol-Gel-System mit flexibel einstellbaren Funktionalitäten und integrierten Gastspezies. Aufbauend auf den erfindungsgemäßen multifunktionalen gelbildenden Peptiden besteht dieses, im Sinne eines Baukastensystems, aus einer Vielzahl von funktionellen Komponenten, wobei die grundlegende Eigenschaft, die Bildung von stabilen Hydrogelen, erhalten bleibt.
• Als gelbildende Komponente können hierbei ein oder mehrere erfindungsgemäße multifunktionale gelbildende Peptide und/oder deren Precursoren enthalten sein. Gegebenenfalls werden diese durch weitere synthetische und/oder proteinogene Gelbildner, wie z. B. Methacrylate, Polyethylenglycole, Polylactide, Hyaluronsäuren oder Kollagen zu einer Hybrid-Matrix ergänzt, um zusätzliche Strukturgeber und/oder biologische Adhäsionsfaktoren in das Hydrogel zu integrieren.
• Ergänzend zur kovalenten Funktionalisierung der gelbildenden Peptide kann das erfindungsgemäße Sol-Gel-System in seiner Funktion als aktives Kultursubstrat, Wachstumsmatrix sowie als Transport- und Depotmatrix, weitere lösliche und partikuläre Komponenten, sogenannte Gastspezies enthalten, die in das Hydrogel eingebettet oder über einen gegebenenfalls spaltbaren Crosslinker darin immobilisiert sind. Für die Anwendung der Hydrogele als Biomaterial in der Medizin und Pharmazie sind insbesondere die folgenden Komponenten und Verbindungen vorteilhaft, wobei Kombination, Anzahl und Konzentration der enthaltenen Stoffe, Organismen und Partikel je nach Anwendung variabel sind:
• a) lebende Zellen, Gewebe und Organsysteme, wie beispielsweise embryonale, fötale, neonatale und adulte Stammzellen, pluripotente und multipotente Stammzellen, Vorläuferzellen, differenzierte und ausgereifte Zellen, Immunzellen, Insulin produzierende Zellen, Wachstumsfaktoren produzierende Zellen, Zellen, die Komponenten der extrazellulären Matrix oder andere Wirkstoffe sezernieren, insbesondere mesenchymale oder neuronale Stammzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, epidermale Zellen, ectodermale Zellen, Myoblasten, Myozyten, Osteoblasten, Osteozyten, Chondrozyten, Periostzellen, perichondriale Zellen, Keratinozyten, Basalzellen, Fibroblasten, Fibromyoblasten, Pankreaszellen, Hepatozyten, Gallenzellen, urogenitale Zellen, Lungenzellen, kardiovaskuläre Zellen, Knochenmarkzellen, Adipozyten, Keimzellen, neuronale Zellen, Gliazellen oder entsprechende Gewebeteile,
• b) lebende mikrobielle Organismen, wie beispielsweise Pilze, Hefen, Bakterien, Viren oder andere ein- und mehrzellige Mikroorganismen,
• c) strukturgebende Proteine der extrazellulären Matrix, wie beispielsweise Laminin, Fibrin, Fibronektin, Kollagen oder Elastin und deren Epitope,
• d) Wachstumsfaktoren, angiogene und humorale Faktoren, wie beispielsweise Epidermal Growth Factor (EGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Fibroblast Growth Factors (FGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Keratinocyte Growth Factor (KGF), Cartilage-Derived Growth Factor, Transforming Growth Factors-ß (TGF-ß), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Insulin-Like Growth Factors (IGF), Nerve Growth Factors (NGF), Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF), Neurotrophine (NT-3,-4,-5), Bone Morphogenetic Proteins (BMP), Bone Marrow Homing Proteins (BMHP), Heparin und entsprechende Mimetika,
• e) therapierelevante pharmazeutische Wirkstoffe und Naturstoff-Derivate, wie beispielsweise Antibiotika, antivirale und antifungische Verbindungen, Entzündungshemmer, Antihistaminika, Zytostatika, Chemotherapeutika, Analgetika, Signal-, Rezeptor- und Ankermoleküle, Insulin, Hormone, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Enzymsubstrate, Toxine, biologisch aktive Naturstoffe, regenerationsfördernde Wirkstoffe oder Vitamine,
• f) immunogene Antigen-Determinanten, wie beispielsweise Proteine oder Partialsequenzen von Proteinen zugehörig zu einem Pathogen, CTL-, T-Helfer- und B-Zell-Epitope, Polyepitope, Nukleinsäuren wie DNA, RNA, mRNA oder siRNA, (Oligo-)Nukleotide, Nukleoside, rekombinante Proteine, Biopolymere, Peptide, Haptene, Glycoproteine, Glycolipide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Mikroorganismen oder Mikroorganismen-Teile oder ähnliche Träger antigener Informationen und entsprechende Mimetika,
• g) für die Biomineralisation verwertbare Ausgangsstoffe und feste Biomaterialien, wie beispielsweise Phosphate, Calcium-Salze oder Hydroxyapatit, sowie
• h) weitere Trägermaterialien, Hilfs- und Zusatzstoffe, wie beispielsweise Adjuvantien, Penetrationsvermittler, Vektoren, Ankergruppen, Rezeptoragonisten, Antikörper, Nährmedien, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Farbstoffe, Pigmente, Fluorophore, Marker-Moleküle, Kontrastmittel, Trägerpartikel, Liposomen oder Füllstoffe.
• Wird das Gesamtsystem aus Peptid-Grundgerüst, funktionalen Molekülen, Spacern und Gastspezies sorgfältig aufeinander abgestimmt, können die Eigenschaften hinsichtlich Aktivität, Funktionalität und Geleigenschaften in einem sehr breiten Bereich variiert und für das jeweilige Zielsystem in einem weiten Anwendungsbereich optimiert werden. Im Hinblick auf die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten und Einsatzbereiche von Hydrogelen, kann diese Aufzählung deshalb nicht abschließend sein. Jede Anwendung erfordert eine spezifische Modifikation der Hydrogele, entsprechend auch der Art, Anzahl und Konzentration der eingeschlossenen Komponenten.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide sowie deren Modifizierung mit den funktionalen Molekülen. Die Peptide können synthetisch hergestellt oder aus natürlichen oder rekombinanten Quellen gewonnen werden. Bei einigen Peptiden ist ein Reinheitsgrad von mehr als 95% erforderlich, da ihre Gelbildungstendenz stark von Nebenprodukten beeinflusst wird. Andere zeigen bereits als Rohpeptide eine ausgeprägte Gelbildung. Erforderlich ist in jedem Fall die Reduzierung des Salzgehaltes deutlich unter 1%.
• Die Synthese der gelbildenden Peptide erfolgt vorteilhafterweise unter Nutzung der in der Peptid-Chemie üblichen Präparationstechniken, bevorzugt der Standard-Methoden der automatisierten Festphasensynthese mit einer Fmoc-basierten orthogonalen Schutzgruppenstrategie. Nach der Abspaltung vom Syntheseharz werden die Rohpeptide durch eine Ether-Fällung isoliert und, falls notwendig, mit den in der Peptid-Chemie üblichen Verfahren gereinigt.
• Terminal konjugierte lineare peptidische Spacer und funktionale Moleküle werden in der Synthese als Bestandteile des Peptid-Grundgerüstes behandelt. Modifikationen des gelbildenden Peptides mit nicht-peptidischen funktionalen Molekülen und Spacern, erfolgen bevorzugt in Lösung. Hierzu werden die dem Fachmann bekannten Methoden der Peptid-Chemie unter Nutzung der Seitenkettenfunktionalitäten und Termini des Peptid-Grundgerüstes, bevorzugt der Carboxy-, Amino- und Thiol-Gruppen, sowie der Click-Chemie unter Nutzung von eingeführten reaktiven Gruppen, bevorzugt Azid- und Alkin-Funktionalitäten, angewandt. Zur Integration verzweigter Seitenketten für dendrimere peptidische Spacer oder für Mehrfachfunktionalisierungen sind dabei intelligente, verbindungsspezifisch optimierte Schutzgruppenstrategien erforderlich.
• Die weitere Aufreinigung der Syntheseprodukte erfolgt mit chromatographischen Verfahren, die speziell an die Erfordernisse gelbildender Verbindungen angepasst wurden. Durch einen Dialyse-Schritt zur Entfernung von Salzen und niedermolekularen Nebenprodukten wird die Reinheit der Produkte weiter erhöht.
• Für die Sterilisation der erfindungsgemäßen multifunktionalen gelbildenden Peptide können die allgemein bekannten Methoden angewandt werden. Unter Berücksichtigung der Stabilität der funktionalen Liganden, ist die Sterilisation durch Filtration, durch Elektronenstrahlen oder mit radiochemischen Methoden besonders bevorzugt.
• Die mit den erfindungsgemäßen multifunktionalen gelbildenden Peptiden hergestellten Hydrogele sind unter sterilen Bedingungen bei 4°C mindestens 1 Jahr stabil. Bevorzugt erfolgt die Lagerung jedoch als Lyophilisate, die bei Raumtemperatur über mehrere Jahre stabil sind.
• Um die Ladungsverteilung im Peptid zu optimieren, kann die terminale Carboxy-Gruppe der gelbildenden Peptide amidiert oder verestert werden.
• Für die Amidierung kommen, außer dem besonders bevorzugten unsubstituierten Amid, insbesondere solche in Betracht, die sich von einem niederen aliphatischen primären oder sekundären Amin mit 1-5 C-Atomen, wie z. B. Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Hydroxyethyl-, Dimethyl- oder Diethylamin, von aromatischen insbesondere monozyklischen Aminen, wie z. B. Anilin oder Toluidin, von arylaliphatischen Aminen, wie z. B. Benzylamin, oder von heterozyklischen Aminen, wie z. B. den Aminopyridinen, ableiten. Bei den sekundären aliphatischen Aminen kann es sich auch um ring-geschlossene Stickstoffbasen, wie z. B. Pyrrolidin, Piperidin oder Piperazin, handeln.
• Bei den veresterten terminalen Carboxy-Gruppen leitet sich die Alkoholkomponente vorzugsweise von niederen aliphatischen Alkoholen mit 1-5 C-Atomen, wie z. B. Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl- oder den Butylalkoholen ab. Auch mehrwertige Alkohole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Glycerin, arylaliphatische Alkohole, insbesondere monozyklische niederaliphatische Alkohole mit 1-5 C-Atomen im aliphatischen Teil, wie z. B. Benzylalkohol, oder heterozyklische Alkohole, wie z. B. Tetrahydrofuranol oder Tetrahydropyranol, können für die Veresterung verwendet werden.
• In Analogie zur Modifikation der terminalen Carboxy-Gruppe kann auch eine Substitution des N-Terminus der gelbildenden Peptide, bevorzugt eine Acylierung, vorteilhaft sein. Insbesondere die Bildung niederer aliphatischer Amide mit 1-7 C-Atomen, wie z. B. eine Acetylierung, eine Methylierung oder eine Dimethylierung der Amino-Gruppe, sind geeignete Ausführungsformen.
• Je nach der Art der Substituenten bzw. der Funktionalitäten in den Aminosäure-Seitenketten, bilden die erfindungsgemäßen gelbildenden Peptide Salze. Saure Gruppen bilden Salze mit Basen oder mit Alkali- und Erdalkalimetallen. Basische Gruppen bilden Säureadditionssalze, insbesondere mit anorganischen Säuren, organischen Säuren, wie z. B. Carbonsäuren und Sulfonsäuren, ferner auch andere Säureadditionssalze, die als Zwischenprodukte bei der Herstellung und Reinigung der freien Verbindungen entstehen, wie z. B. Trifluoracetate oder Acetate, oder die bei der Charakterisierung verwendet werden können, wie z. B. solche mit Pikrin-, Pikrolon-, Flavian-, Phosphorwolfram-, Phosphormolybdän-, Chlorplatin-, Reinecke- oder Perchlorsäure.
• Im Zusammenhang mit der Verwendung als Biomaterialien ist die Formulierung der erfindungsgemäßen, multifunktionalen gelbildenden Peptide als pharmazeutisch verwendbare nicht-toxische Salze, bevorzugt als Essigsäure- oder HCl-Salze oder Salze von sauren bzw. basischen Aminosäuren, besonders bevorzugt als Acetate, vorteilhaft. Das Umsalzen der üblicherweise als TFA-Salze vorliegenden Syntheseprodukte kann durch einen chromatographischen Schritt oder durch Digerieren mit einem Überschuss der bevorzugten Säure/Base erfolgen.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Methoden zur Konstituierung der Hydrogele aus den Komponenten des erfindungsgemäßen Sol-Gel-Systems. Dies schließt intelligente Gelbildungsprotokolle und Applikationsstrategien zur kontrollierten Gelbildung, zur Einstellung der Gelbildungskinetik, zur Einbettung gelöster und partikulärer Komponenten sowie zur Herstellung neutraler und insbesondere injizierbarer Gele ein.
• Die Gelbildung kann sowohl aus Lösungen der reinen gelbildenden Peptide als auch aus Mischungen mit weiteren erfindungsgemäßen Peptiden oder anderen bekannten gelbildenden Verbindungen und Polymeren synthetischen und natürlichen Ursprungs erfolgen.
• Ausgehend von den der Erfindung zugrunde liegenden Beobachtungen und dem daraus abgeleiteten hypothetischen Gelbildungsmodell, lassen sich folgende grundlegende Schritte definieren:
• a) Lösen der gelbildenden Peptide,
• b) Einbringen der Gastspezies,
• c) Initiieren der Gelbildung,
• d) Aushärten und Äquilibrieren der Gele.
• Das Lösen der Peptide ist ein entscheidender Schritt bei den Gelbildungsverfahren. Nur vollständig gelöste Peptide sind in der Lage, homogene Hydrogele zu bilden. Zum Lösen der Peptide werden polare Medien mit Elektrolyt-Gehalten unterhalb von 500 μM, bevorzugt Reinstwasser, verwendet. Der pH-Wert wird entsprechend der Nettoladung der gelbildenden Peptide eingestellt. Durch die Anwendung von Hitze und Ultraschall werden die intermolekularen Wechselwirkungen zusätzlich abgeschwächt, sodass eine klare Lösung entsteht.
• Anschließend werden die Peptid-Lösungen mit den ebenfalls salzfreien Lösungen weiterer Gelbildner und Zusatzkomponenten gemischt. Einzuschließende Gastspezies werden bevorzugt unter die Peptid-Lösungen gemischt. In Einzelfällen, bevorzugt bei sehr empfindlichen Spezies, kann die Einbettung auch durch Zumischen zu den Trigger-Lösungen, die für das Initiieren der Gelbildung verwendet werden, erfolgen, wobei hier auf eine gute Homogenisierung der noch flüssigen getriggerten Hydrogele geachtet werden muss. Wenn erforderlich, kann der pH-Wert der Peptid-Lösungen vor dem Einbringen der Gastspezies bzw. der Applikation in das biologische System, in die Nähe des neutralen Bereiches verschoben werden.
• Die Gelbildung wird durch die Zugabe von Elektrolyten und/oder die Verschiebung des pH-Wertes erreicht. Obwohl diese Trigger, ausgehend vom abgeleiteten hypothetischen Gelbildungsmodell, in einer additiven Wirkung resultieren, sind sie aufgrund ihrer unterschiedlichen Effektivität für die Gelbildung nur bedingt gegeneinander austauschbar. Für die Herstellung der Hydrogele werden, je nach Anwendung, verschiedene Szenarien unterschieden, die wahlweise per Hand oder mit einem Pipettierroboter ausgeführt werden können. Dabei hat sich für die meisten Anwendungen ein zweistufiges Protokoll bewährt, bei dem zunächst sehr weiche, gut verarbeitbare Gele hergestellt und anschließend nachgehärtet werden.
• Zum Herstellen von Hydrogel-Scaffolds, die für die Zellkultur oder als Implantat verwendet werden können, wird die Gelbildung vorteilhafterweise durch das Mischen mit einer verdünnten Trigger-Lösung initiiert. Nach der Bildung eines zunächst weichen Gels, erfolgt das Aushärten durch Überschichten mit einer konzentrierteren Elektrolyt-Lösung, vorzugsweise dem verwendeten Zellkulturmedium oder einer physiologischen Salz-Lösung. Alternativ kann eine kleine Menge einer konzentrierten Trigger-Lösung überschichtet werden, die in die Peptid-Lösung diffundiert und die Gelbildung initiiert. Entsprechend ist die Gelbildung auch durch Lagerung einer Peptid-Lösung unter einer sauren bzw. basischen Dampfphase möglich. Unregelmäßige Scaffolds werden erhalten, wenn man die Peptid-Lösung in eine Trigger-Lösung injiziert.
• Für die Beschichtung von Oberflächen werden bevorzugt getriggerte Peptid-Lösungen aufgetragen und nachfolgend mit einer konzentrierteren Trigger-Lösung überschichtet oder bedampft. Alternativ kann die reine Peptid-Lösung auf eine mit der Trigger-Lösung benetzte Oberfläche aufgetragen werden. Durch Eintrocknen einer ausgestrichenen getriggerten oder ungetriggerten Peptid-Lösung und nachfolgendes Quellen im Zielmedium, kann ebenfalls eine gel-beschichtete Oberfläche erhalten werden.
• Sollen die Hydrogele im Rahmen einer in vivo Anwendung injiziert werden, ist die Injektion der sterilen Peptid-Lösung besonders vorteilhaft. Die Gelbildung erfolgt in situ durch den Kontakt mit den körpereigenen Flüssigkeiten. Wie anhand von Injektionen der Peptid-Lösungen in Zellkulturmedien gezeigt werden konnte, findet dabei keine Verdünnung durch Vermischen mit den Körperflüssigkeiten, sondern die unmittelbare Bildung einer festen Geloberfläche statt. Zur Erhöhung der Zellverträglichkeit der Peptid-Lösungen können diese unmittelbar vor der Injektion durch Zusatz von geringen Mengen eines Puffers und/oder physiologischer Salze bzw. anderer die Vitalität der Zellen schützender Zusatzstoffe, wie z. B. Glukose, modifiziert werden. Auch frische, mit verdünnten Lösungen getriggerte Gele, sind injizierbar. Die eigentliche Gelbildung und Aushärtung erfolgt dann, wie oben dargestellt, in situ. Ähnliche Verfahren sind für die Anwendung als Wundverschluss geeignet, indem bevorzugt die getriggerte Peptid-Lösung auf das Gewebe aufgetragen wird.
• Die Zusammensetzung der Trigger-Lösung wird bevorzugt an der nachfolgenden Anwendung des gebildeten Hydrogels orientiert. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung gepufferter Elektrolyt-Lösungen, deren Zusammensetzung den physiologischen Verhältnissen im Gewebe bzw. der Zusammensetzung des Kulturmediums entspricht. Möglich ist auch die Triggerung durch eine salzhaltige und/oder gepufferte Lösung der Gastspezies. Aufgrund der guten Durchlässigkeit der Hydrogele ist dies jedoch nicht zwingend, da eine nachträgliche Äquilibrierung der Hydrogele durch Überschichten und mehrfachen Austausch des Zielmediums möglich ist.
• Die Endfestigkeit und Gelzeit der gebildeten Hydrogele ist einerseits von der Struktur und Ladungsverteilung des gelbildenden Peptides abhängig. Dies ermöglicht einen großen Spielraum für die anwendungsgerechte Einstellung der Geleigenschaften durch gezielte Modifikationen der Aminosäure-Sequenz und der Termini.
• Andererseits werden Endfestigkeit und Gelzeit durch eine Kombination aus Peptid- und Elektrolyt-Konzentration bestimmt. Für die erfindungsgemäßen multifunktionalen gelbildenden Peptide liegt der bevorzugte Bereich zur Bildung homogener und stabiler Hydrogele bei einem Peptid-Gehalt zwischen 0,1 und 5%, bevorzugt zwischen 0,1 und 1%.
• Untersuchungen der Gelbildungskinetik ergaben, dass für die Geschwindigkeit der Gelbildung, bei vorgegebener Konzentration eines bestimmten Peptides, lediglich die Endkonzentration der Trigger-Komponenten maßgeblich ist. Versuche mit einer gepufferten physiologischen Salzlösung zeigten eine Variabilität von weniger als 1 min bis zu mehreren Stunden. Dabei ist der Einfluss auf die Kinetik der Gelbildung zwischen verschiedenen Trigger-Lösungen nicht übertragbar und muss jeweils neu kalibriert werden. Die durch Untermischen verdünnter Lösungen erzielten Ergebnisse waren dabei adäquat zu den Resultaten beim Überschichten konzentrierter Lösungen (3). Das Mischen mit konzentrierten Lösungen ist dagegen nicht vorteilhaft.
• Auf Basis dieser allgemeinen Prinzipien kann das Gelbildungsprotokoll bezüglich Kinetik und Endfestigkeit spezifisch angepasst werden. Bei einer durch die Anwendung vorgegebenen Zusammensetzung des Zielmediums wird die Steifigkeit der gebildeten Hydrogele durch die Struktur und Konzentration der gelbildenden Peptide eingestellt, während die Kinetik durch die Zusammensetzung und Konzentration der Trigger-Lösung bestimmt wird.
• Wie im Ausführungsbeispiel C dargestellt, wurden für besonders sensible Anwendungen auch Strategien zur Herstellung neutraler Gele entwickelt, die jedoch jeweils spezifisch auf die Eigenschaften des multifunktionalen gelbildenden Peptides abgestimmt werden müssen.
• Die frisch gebildeten Hydrogele sind noch flexibel und die Diffusionsvorgänge zur Erlangung einer homogenen Gleichgewichtsverteilung der Elektrolyte, Peptide und Wassermoleküle im Gel sind noch nicht abgeschlossen. Dieser Prozess der Aushärtung nimmt einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen in Anspruch. Eine Volumenzunahme wurde dabei nicht beobachtet.
• Innerhalb der ersten Stunde durch Scherbelastungen oder Ultraschall verursachte geringfügige Störungen der Gelstruktur, die in einer Erweichung der Gele sichtbar werden, können regeneriert werden. Somit sind frische Gele noch einige Zeit pipettierbar bzw. injizierbar. Größere Defekte sind jedoch nicht reparabel. Diese Eigenschaft kann besonders vorteilhaft für die Rückgewinnung eingeschlossener Gastsspezies genutzt werden. Durch einfache mechanische Beanspruchung der Gel-Matrix, wie z. B. starkes Schütteln oder Rühren, können z. B. lebende Zellen ohne Beeinträchtigung der Vitalität extrahiert und für die nächsten Kulturschritte verwendet werden.
• Insgesamt sind homogene Gele sehr stabil. In Simulationstests zur Beständigkeit der erfindungsgemäßen Hydrogele gegenüber den physiologisch relevanten Bedingungen, bei Temperaturbelastungen bis zu 80°C sowie nach Überschichten mit den gängigen Zellkulturmedien, Seren, Reinstwasser, Puffer-Lösungen, Säuren und Laugen mittlerer Konzentration, Alkoholen, organischen Lösungsmitteln und Detergenzien, wurde über mehrere Monate keine Beeinträchtigung der Gelkonsistenz beobachtet. Zudem waren die erfindungsgemäßen Hydrogele stabil gegenüber den für die histologische Aufarbeitung von Gewebeschnitten häufig genutzten Reagenzien sowie gegenüber wiederholten Auftauzyklen. Auch moderate mechanische Belastungen oder Ultraschall wurden toleriert. Demgegenüber sind inhomogene Gele nicht stabil. Unter Absonderung von Wasser bilden sie Klumpen und lösen sich später unter Bildung eines Niederschlages ganz auf.
• Es ist deshalb davon auszugehen, dass die erfindungsgemäßen gelbildenden Peptide in biologischen Kultursystemen, wie auch im lebenden Organismus, mit Ausnahme von Enzymaktivitäten, stabil sind. Die Stabilität in den Verfahren zur histologischen Aufarbeitung qualifiziert die Hydrogele auch als Kulturmatrix für Forschungsanwendungen. Ebenso sollte für Anwendungen in den Materialwissenschaften eine ausreichende Stabilität vorliegen.
• Die Biostabilität in physiologischen Medien und Geweben ist abhängig vom Spektrum der vorhandenen bzw. von den eingebetteten Zellen sezernierten Enzyme. Für aus natürlichen Aminosäuren aufgebaute Hydrogele geht man allgemein, je nach Volumen und Oberfläche der Gel-Matrix sowie Gewebetyp, von einer Verweildauer im Organismus von 2 bis 4 Wochen aus. Mit dem Fachmann bekannten und den oben beschriebenen Modifikationen des Peptid-Grundgerüstes und/oder der Termini kann die Biostabilität erheblich verlängert werden. Andersherum kann der Bioabbau durch die Einbettung von Enzymen als Gastspezies und/oder die Integration von spaltbaren Peptid-Bindungen bzw. Aminosäure-Sequenzen in das Peptid-Grundgerüst beschleunigt werden. Diese Eigenschaft ist für den Aufbau von Assays zur Messung der Enzymaktivität vorteilhaft nutzbar, die die Hydrogele als Testmaterialien verwenden.
• Ein weiteres Kriterium für die Anwendung der erfindungsgemäßen Hydrogele als Biomaterialien und Kulturmatrizes sind deren Transporteigenschaften. Für die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen, CO₂ und Sauerstoff, die Entsorgung von Metaboliten sowie die Freisetzung von Wirkstoffen, ist ein effizientes Diffusions-basiertes Transportsystem erforderlich. Zudem ist für die Mobilität, Aussprossung und Vernetzung eingebetteter Zellen und Partikel, eine gute Penetrierbarkeit notwendig. Die faserförmige Mikrostruktur der erfindungsgemäßen Hydrogele in Verbindung mit den wechselnden Polaritäten der Moleküloberflächen, resultiert in einer guten Durchlässigkeit für Medien und Nährstoffe, wie in Simulationen mit Farbstoffen und Salz-Lösungen bestätigt werden konnte. Die Diffusionskoeffizienten sind, neben den Geleigenschaften, auch vom hydrodynamischen Radius, der Hydrophobie und der Ladungsverteilung der diffundierenden Moleküle abhängig und im Einzelfall zu ermitteln.
• Ausgehend vom Gelbildungsmechanismus wird erwartet, dass die Faserstruktur der erfindungsgemäßen Hydrogele sehr ähnlich zu der des natürlichen Kollagens ist. Faser-Durchmesser von 3 bis 20 nm, Porenweiten im Bereich von 30 bis 250 nm sowie eine nicht-kovalente Konjugation der Peptidketten, sind für die Kultur von Mikroorganismen, Geweben und Zellen besonders vorteilhaft. Die Migration und Vernetzung der Zellen, wie auch eine Orientierung des Wachstums durch mechanische Unterstützung, sind unter diesen Bedingungen gut möglich.
• Zudem lässt der überwiegend peptidische Charakter der Hydrogele, d. h. deren Aufbau aus natürlichen Bestandteilen, eine sehr gute Biokompatibilität der erfindungsgemäßen Hydrogele und ihrer Abbauprodukte erwarten, wie in Kulturversuchen mit neuronalen Zellen gezeigt werden konnte. Toxische Effekte durch die Gele konnten nicht beobachtet werden. In Bezug auf die Anwendung der erfindungsgemäßen Hydrogele als biologisierte Implantate, erwarten wir keine effektiven Immunreaktionen. Zwar werden die Hydrogele bildenden Peptide aufgrund ihrer auf immunologischen Codes basierenden Struktur vom Immunsystem erkannt, eine Aktivierung der Immunzellen erfolgt jedoch nicht, da die Sequenzlänge der Peptide für die Stimulation der entsprechenden T-Helfer-Zellen nicht ausreicht.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur systematischen Suche nach weiteren potentiell Hydrogele bildenden Peptiden, denen die beschriebenen biomimetischen Prinzipien zugrunde liegen, in Kombination mit einem standardisierten Testverfahren.
• Die Auswahl von aussichtsreichen Aminosäure-Sequenzen und die Prüfung der Kompatibilität mit den Prinzipien des natürlichen immunologischen Codes MHC-bindender Moleküle, erfolgt vorzugsweise anhand eines Strukturvergleiches mit den bisher bekannten erfindungsgemäßen Gelbildnern, unterstützt durch struktur-basierte Suchprogramme.
• In einem zweiten Schritt werden die identifizierten Peptide in hoher Reinheit hergestellt und deren Gelbildungstendenz experimentell getestet. Dazu werden die aufgereinigten Lyophilisate in einem elektrolyt-armen polaren Medium, bevorzugt Reinstwasser, gelöst. Gegebenenfalls kann der Löseprozess durch eine Verschiebung des pH-Wertes entsprechend der Nettoladung des Peptides sowie durch die Anwendung von Ultraschall und Wärme unterstützt werden. Danach wird die klare Peptid-Lösung bis kurz vor den Beginn der Gelbildung neutralisiert.
• Die Initiierung der Gelbildung erfolgt durch Überschichten der neutralisierten Peptid-Lösung mit einer neutralen Elektrolyt-Lösung, vorzugsweise mit 10% vol. einer 1 M CaCl₂-Lösung, oder mit einer entsprechend konzentrierten Vollelektrolyt-Lösung. Die Konzentrationsverhältnisse werden so gewählt, dass eine finale Peptid-Konzentration von 0,25–3% erreicht wird. In regelmäßigen Abständen wird die Fließfähigkeit der Mischung visuell bewertet.
• Dieser Schnelltest dient zu einer ersten Orientierung über die Gelbildungstendenz der Peptide. Ein geeignetes, gegebenenfalls biokompatibles Verfahren zur Gelbildung, kann nachfolgend, individuell bezogen auf das jeweilige Hydrogele bildende Peptid, seine Funktionalisierung und die beabsichtigte Anwendung, entwickelt werden.
• Wesentliche Merkmale und vorteilhafte Wirkungen
• Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung neuer, Hydrogele bildender Peptide, deren Struktur auf einem biomimetischen Prinzip basiert, und die trotz ihrer geringen Sequenzlänge eine außergewöhnlich hohe Gelbildungstendenz aufweisen.
• Bereits aus 0,1–1%igen Lösungen der erfindungsgemäßen gelbildenden Peptide können durch Zugabe von Elektrolyt-Lösungen stabile transparente Hydrogele mit einer faserförmigen Mikrostruktur erhalten werden.
• Durch die Strukturvariabilität der erfindungsgemäßen, gelbildenden Peptide ist es erstmals möglich, nahezu neutrale Lösungen gelbildender Peptide herzustellen, die mit gepufferten elektrolytischen Lösungen neutrale homogene Hydrogele bilden.
• Ein besonderes Alleinstellungsmerkmal der Erfindung ist die Bereitstellung von vollständig zellkompatiblen injizierbaren Hydrogelen, die in Verbindung mit intelligenten Gelbildungsprotokollen und Applikationsstrategien die in situ Gelbildung durch den direkten Kontakt mit den Zellkulturmedien bzw. den physiologischen Flüssigkeiten ermöglichen.
• Die stabile Gelbildungstendenz der neuen Peptide ermöglicht vielfältige Formen zu deren Modifizierung und Funktionalisierung, wobei die Gelbildungseigenschaften des gelierenden Grundsystems weitgehend erhalten bleiben. Modifikationen des Peptid-Grundgerüstes ermöglichen die passgenaue Einstellung der Geleigenschaften. Die Funktionalitäten der Aminosäure-Seitenketten und der Termini eignen sich als Linker zur Konjugation von funktionalen Molekülen für die Anpassung der Oberflächeneigenschaften des im Hydrogel enthaltenen Faser-Netzwerkes. Durch den Einbau von nicht natürlichen Aminosäuren und/oder die Abschirmung von funktionellen Gruppen und Termini, kann die (Bio-)Abbaubarkeit der Hydrogele gesteuert werden.
• Die neuen in situ formbaren Hydrogele sind unter physiologischen Bedingungen stabil und weisen durch ihren Aufbau aus natürlichen Bestandteilen, eine sehr gute Biokompatibilität auf. Übliche Lösungsmittel sowie Hitze und moderate mechanische Belastung werden von den Gelen toleriert. Immunreaktionen oder toxische Effekte wurden nicht beobachtet.
• Die erfindungsgemäßen Hydrogele können auf synthetischem Weg preiswert, in großen Mengen und in reproduzierbar hoher Qualität und Reinheit bereitgestellt werden. Zudem können Dichte, Verteilung und Zugänglichkeit der funktionalen Moleküle anwendungsbezogen optimiert sowie durch Mehrfachfunktionalisierungen synergistische Effekte erzielt werden.
• Damit stellen die erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide eine weitere Klasse peptidischer Gelbildner dar, die eine leistungsfähige Alternative zu den bisher am Markt vorhandenen und größtenteils noch in der Entwicklung befindlichen Hydrogelen bieten können.
• Neben vielfältigen Applikationen als Biomaterial, erstreckt sich das Spektrum der potentiellen Anwendungen weit über den Bereich der Lebenswissenschaften hinaus. Die beschriebenen außergewöhnlichen Eigenschaften der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide sowie die aufgezeigten flexiblen Strategien zur Anpassung des Eigenschaftsprofils der daraus aufgebauten erfindungsgemäßen, multifunktionalen gelbildenden Peptide sowie des resultierenden modularen Sol-Gel-Systems, eröffnen u. a. als Kultursubstrat, Wachstumsmatrix, Strukturgeber, Transport- und Depotmatrix sowie als Filtermaterial, ganz neue Möglichkeiten für die Mikrobiologie, die Zelltherapie, das Tissue Engineering, die regenerative Medizin, das Drug-Delivery sowie die Materialwissenschaften.
• Als direkt kommerziell verwertbares Produkt umfasst die Erfindung anwendungsbezogen zusammengestellte Kits zur Herstellung von modular funktionalisierten Hydrogelen, die alle notwendigen Komponenten zur Konstituierung und Verwendung der Hydrogele, einschließlich geeigneter Lösungsmittel, Elektrolyt-Lösungen, Enzyme und Reagenzien, sowie eine Handlungsanweisung, enthalten.
• Zudem können solche Kits als Assay zur Messung der Enzymaktivität bzw. der Aktivität von Enzyminhibitoren modifiziert werden, bei denen die Struktur der multifunktionalen gelbildenden Peptide Targets für das Zielenzym enthält, sodass nach Spaltung dieser Sequenzen entweder die Verflüssigung des Hydrogels oder die Gelbildung durch Aktivierung des Precursors oder die Freisetzung eines konjugierten funktionalen Moleküls erfolgt.
• Die Vermarktung solcher Kits ist insbesondere für Standard-Anwendungen auf den Gebieten der Mikrobiologie, des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin vorteilhaft, bei denen die Kulturbedingungen bzw. geeigneten funktionalen Moleküle und Gastspezies bekannt sind. Aufgrund der breiten Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen modular funktionalisierten Hydrogele, decken diese Kits lediglich einen schmalen Bereich ab. Den größten Teil nehmen individuelle Lösungen ein, bei denen die Funktionalisierung spezifisch an die jeweilige Anwendung angepasst und optimiert wird. Im Anschluss an die Entwicklungsphase sind auch diese Lösungen als Standard-Kits kommerzialisierbar.
• Je nach Anwendung und Nutzerkreise können die multifunktionalen gelbildenden Peptide als Lyophilisat oder fertige Peptid-Lösung bereitgestellt werden, im Interesse einer langen Lagerfähigkeit vorzugsweise als Lyophilisat. Für die 2D-Kultur bietet sich auch der Versand in Form fertiger Gel-Matrizes oder als beschichtete Platten und Oberflächen an.
• Des Weiteren können die multifunktionalen gelbildenden Peptide als Einzelsubstanzen, als Systemkomponenten von Produkten oder verarbeitet, u. a. in Medizinprodukten und pharmazeutischen Präparaten, vermarktet werden.
• Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale, Vorteile und Nutzungsmöglichkeiten der Erfindung ergeben sich aus der vorangegangenen Beschreibung und den folgenden Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, Abbildungen und Referenzen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. Die folgenden Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
• Abbildungen
• 1 Schematischer Aufbau eines erfindungsgemäßen multifunktionalen, Hydrogele bildenden Peptides. Exemplarisch ist die Konjugation der funktionalen Moleküle über lineare und dendrimer verzweigte Spacer dargestellt. Die Zahl und Position der konjugierten funktionalen Moleküle, die Art des Spacers, der Substitutionsgrad sowie die realen stöchiometrischen Verhältnisse, sind entsprechend dem vorgesehenen Anwendungsbereich der Hydrogele variabel einstellbar.
• 2 Exemplarische Darstellung der chemischen Struktur einiger erfindungsgemäßer, Hydrogele bildender Peptide, mit terminaler Funktionalisierung durch ein bioaktives Epitop. Die den Komponenten des funktionalen gelbildenden Peptides zugeordneten Sequenzabschnitte wurden entsprechend gekennzeichnet.
• 2a) C-terminale Konjugation des zellbindenden Fibronektin-Epitops RGDS.
• 2b) N-terminale Konjugation des wachstumsfördernden Laminin-Epitops IKVAV.
• 2c) Stabilisierung der Hydrogele durch Dimerisierung der gelbildenden Sequenz für die N-terminale Konjugation des zellbindenden Laminin-Epitops YIGSR.
• 3 Abhängigkeit der Gelbildungskinetik von Konzentration, Menge und Endkonzentration der zugesetzten Trigger-Lösung am Beispiel der Herstellung eines 0,6%igen Hydrogels von IKVAV-GGG-SIINFEKL mit einer gepufferten physiologischen Salz-Lösung (Beispiel D).
• Literatur
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• Sequenzprotokoll – freier Text
• Tab. 2: Erläuterung der Bezeichnungen in Feld <223>.

  SEQ ID NO	<223>	Erläuterung
  01–09	Biomimetikum	Epitop-Sequenz
  02	Inverso-Peptid von SEQ ID NO 01	Sequenz aus D-Aminosäuren
  03	Retro-Peptid von SEQ ID NO 01	umgekehrte Sequenz
  04	Retro-inverso-Peptid von SEQ ID NO 01	umgekehrte Sequenz aus D-Aminosäuren

• Ausführungsbeispiele
• Beispiel A – Synthese der Hydrogele bildenden Peptide
• In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide sowie zu deren terminaler Modifizierung mit peptidischen funktionalen Molekülen und Spacern beschrieben.
• Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, literatur-bekannten Methoden, vorzugsweise in einem an der Merrifield-Synthese angelehnten automatisierten Verfahren. Die Verfahrensschritte für die Festphasensynthese sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. Aus diesem Grund wird in dem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide und/oder Aminosäuren einzugehen, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind.
• Das Peptid wird an einem Synthese-Harz unter Nutzung einer Fmoc-basierten orthogonalen Schutzgruppenstrategie aufgebaut. Terminale Modifizierungen des gelbildenden Peptides mit linearen Peptiden werden als Bestandteil des Peptid-Grundgerüstes angesehen. Funktionalisierungen in den Seitenketten oder die Konjugation nicht-peptidischer funktionaler Moleküle mit den Termini, werden im Anschluss an die Festphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Ligationsmethoden der Peptid- oder der Click-Chemie vorgenommen.
• Als Ausgangspunkt für die Herstellung von Peptiden mit freiem C-Terminus wird ein Tritylchlorid-Polystyrol-Harz und für die Herstellung der Peptid-Amide ein Rink-Amid-Harz gewählt, das mit dem Fmoc-geschützten Derivat der C-terminalen Aminosäure beladen ist.
• Das beladene Harz (8 mg; 7 μmol) wird in einen Reaktor eingewogen, und die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M in N,N-Dimethylformamid) zu 0,5 molaren Lösungen gelöst. Die befüllten Reaktoren und Vials werden auf die vorgesehenen Positionen des Pipettierroboters gestellt und das Syntheseprogramm gestartet.
• Im ersten Syntheseschritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe nach dem in Tab. 3 dargestellten Programmablauf, um die Anbindung der nächsten Aminosäure an der freigewordenen terminalen Amino-Gruppe zu ermöglichen. Die Aminosäure-Seitenketten bleiben geschützt. Anschließend wird das Peptid durch Konjugation der jeweils nächsten Aminosäure und nachfolgende Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure schrittweise aufgebaut. Der Ablauf des Syntheseprogramms ist in Tab. 4 dargestellt. Tab. 3: Zyklus zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe.

  Syntheseschritt		Reagenzien/Lösungsmittel	Volumina [μL]	Dauer [min]
  Start	Harz quellen	N,N-Dimethylformamid	800	2
  1.	Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	5
  2.	Waschen, 3×	N,N-Dimethylformamid	300	1
  3.	Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	10
  4.	Waschen, 7×	N,N-Dimethylformamid	300	1

  Tab. 4: Repetitiver Zyklus zur Synthese der Peptide.

  Syntheseschritt		Reagenzien/Lösungsmittel	Volumina [μL]	Dauer [min]
  1.	Kupplung	3 M N,N-Diisopropylethylamin 3 M N,N-Diisopropylcarbodiimid in N,N-Dimethylformamid, 0,5 M Aminosäure-Lösungen	25 25 100	120
  2.	Waschen, 3×	N,N-Dimethylformamid	300	1
  3.	Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	5
  4.	Waschen, 3×	N,N-Dimethylformamid	300	1
  5.	Deblockierung	30% Piperidin in N,N-Dimethylformamid	200	10
  6.	Waschen, 7×	N,N-Dimethylformamid	300	1
  7.	weiter bei Schritt 1.

• Nach der Kopplung der letzten Aminosäure wird das Peptid vom Syntheseharz abgespalten. Gleichzeitig werden die Schutzgruppen von den Aminosäure-Seitenketten entfernt.
• Die Abspaltlösung (Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser; 92,5:5:2,5; 300 μL) wird zu dem Harz (7 μmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen. Nach der Filtration der Abspaltlösung in ein Reagenzglas, werden weitere 200 μL Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert. Die Suspension wird nochmals 2 h bei Raumtemperatur belassen.
• Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung wird das Harz mit Dichlormethan (500 μL) gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösung werden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft.
• Der Rückstand wird mit Diethylether (3 × 300 μL) digeriert und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1; 2 mL) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h).
• Beispiel B – Funktionalisierung der Hydrogele bildenden Peptide mit Laminin-Epitopen
• Zur Verifizierung der Funktionalisierbarkeit der erfindungsgemäßen, Hydrogele bildenden Peptide sowie zum Nachweis der biologischen Aktivität der multifunktionalen gelbildenden Peptide, wurde das gelbildende Peptid SIINFEKL mit verschiedenen Laminin-Epitopen modifiziert.
• Nach Konjugation der Epitope IKVAV und IKVSV, die über einen dreifachen Glycin-Spacer an den N-Terminus gekoppelt waren (2b), konnte eine Verstärkung der Gelbildungstendenz beobachtet werden, die durch die Amidierung des C-Terminus weiter zunahm. Demgegenüber konnte nach N-terminaler Modifizierung, ebenfalls über einen dreifachen Glycin-Spacer, mit dem Epitop YIGSR kein und mit dem Epitop RNIAEIIKDI lediglich ein instabiles Gel gebildet werden.
• Durch eine Dimerisierung der gelbildenden Sequenz konnte die Stabilität der erfindungsgemäßen Hydrogele deutlich erhöht werden. Die mit den Epitopen YIGSR und RNIAEIIKD über einen einfachen Glycin-Spacer funktionalisierten Dimere (2c), zeigten eine gute Gelbildungstendenz und bildeten stabile Gele.
• Im Hinblick auf potentielle Anwendungen der erfindungsgemäßen multifunktionalen Hydrogele als Biomaterial, z. B. für die Anwendung als Wachstumsmatrix für die Gewebe- und Zellkultur, als Kultursubstrate für die Mikrobiologie sowie als biologisiertes Implantat, wurden die Gelbildungsverfahren und die Eigenschaften der gebildeten Hydrogele näher untersucht. Die folgenden Ausführungsbeispiele beziehen sich auf das erfindungsgemäße mit einem Laminin-Epitop funktionalisierte gelbildende Peptid IKVAV-GGG-SIINFEKL (2b). Die Peptid-Konzentration im Gel wurde auf 0,6% eingestellt. Als Trigger-Lösung wurde eine gepufferte physiologische Salz-Lösung mit der folgenden Zusammensetzung verwendet:

  137 mM	NaCl
  5 mM	KCl	eingestellt mit HCl/NaOH
  2 mM	CaCl2	auf pH 7,4
  1 mM	MgCl2
  10 mM	Hepes	entspricht ca. 314 mOsmol/l
  11 mM	Glucose

• Beispiel C – Protokoll zur Herstellung neutraler Hydrogele
• Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde insbesondere die Eignung des Verfahrens für die Herstellung biokompatibler und injizierbarer Hydrogele berücksichtigt. So wurde u. a. Wert auf die Löslichkeit der Peptide in nahezu neutralen wässrigen Medien, eine langsame Gelbildung sowie die Bildung neutraler Hydrogele gelegt. Als Trigger-Lösung wurde, wie oben angegeben, eine künstliche physiologische Flüssigkeit verwendet, mit der die in situ Gelbildung durch den Kontakt der injizierten Peptid-Lösungen mit den Körperflüssigkeiten oder dem Zellkulturmedium simuliert werden sollte.
• Das Protokoll besteht aus der Abfolge der folgenden Schritte:
• a) Lösen • 1,2 mg Peptid einwiegen, • 120 μL Reinstwasser zugeben, • 1 min im Ultraschallbad homogenisieren, • 10 min bei 80°C temperieren,
• b) Initiieren der Gelbildung • 2 min auf Raumtemperatur abkühlen, • 100 μL einer 1:2,5 verdünnten Trigger-Lösung untermischen,
• c) Aushärten • 4 h erschütterungsfrei ruhen lassen, • mit einfach konzentrierter Trigger-Lösung oder Zellkulturmedium überschichten, • über Nacht ruhen lassen.
• Da mit dem untersuchten Peptid nach dem oben beschriebenen Protokoll schwach saure Hydrogele (pH 4,5) erhalten wurden, wurde unter der Prämisse einer Gelzeit von mindestens einer halben Stunde, eine Optimierung der Trigger-Lösung vorgenommen.
• Als am besten geeignete Variante hat sich dabei die Herstellung der Trigger-Lösung mit Na-Hepes, ohne weitere Einstellung des pH-Wertes, erwiesen. Die Zugabe von NaOH zur Trigger-Lösung (Nachteil: benötigte Menge ist chargen-abhängig) oder die Verwendung eines 40 mM Hepes-Puffers als Trigger-Lösung (Nachteile: keine Salze im Gel, sehr schnelle Gelbildung) führen ebenfalls zur Bildung neutraler Gele.
• Diese Anpassungen der Trigger-Lösungen sind jeweils spezifisch auf die gelbildenden Sequenzen und deren Funktionalisierungen abzustimmen.
• Beispiel D – Variation der Gelbildungskinetik in Abhängigkeit von der Trigger-Konzentration
• Im Hinblick auf die Injizierbarkeit der gebildeten Hydrogele, wurden die Parameter zur Einstellung der Gelbildungskinetik sowie geeignete Applikationsmethoden untersucht, sodass für die Injektion oder Aliquotierung der getriggerten Gele ein genügend großes Zeitfenster bleibt.
• Einerseits wurde die Gelbildung durch Aufsetzen oder Untermischen von geringen Volumina mehrfach konzentrierter Trigger-Lösungen ausgelöst (10 μL auf 140 μL Peptid-Lösung). Andererseits erfolgte die Gelbildung durch Untermischen verdünnter Trigger-Lösungen (100 μL auf 100 μL Peptid-Lösung). Anschließend wurden die Gelzeiten, d. h. die Zeitdauer bis zur Ausbildung eines nicht mehr sichtbar fließfähigen Gels, gemessen.
• Es konnte gezeigt werden, dass für die Gelbildungskinetik und Steifigkeit des gebildeten Hydrogels, bei vorgegebener Peptid-Konzentration, lediglich die Endkonzentration der eingesetzten Trigger-Lösung entscheidend ist (3). Durch Überschichten mit einer konzentrierteren Elektrolyt-Lösung, vorteilhafterweise mit dem Kulturmedium bzw. direkt im Organismus durch den Kontakt mit den Körperflüssigkeiten, erfolgt eine Nachhärtung der getriggerten Gele, was zu einer weiteren Zunahme der Endsteifigkeit führt.
• Beispiel E – Stabilität der Hydrogele
• Für diese Untersuchungen wurden einerseits die üblichen Zellkulturbedingungen und andererseits die bei einer histologischen Aufarbeitung angewandten Prozeduren simuliert. Als Testmedien wurden die hierbei verwendeten Reagenzien, Lösungen und weitere übliche Lösungsmittel eingesetzt.
• Wie in Beispiel C dargestellt, wurden 200 μL Aliquots eines 0,6%igen Hydrogels hergestellt. Nach dem Aushärten mit einfach konzentrierter Trigger-Lösung, wurden die Gele mit 1 mL des jeweiligen Testmediums überschichtet und den in der Tabelle angegebenen Belastungen ausgesetzt. Die Konsistenz der Gele wurde visuell bewertet und über einen Zeitraum von einem Jahr weiter beobachtet. Tab. 5: Stabilität der Hydrogele in üblichen Medien.

  Medium	1 Jahr Lagerung bei Raumtemperatur	1 h bei 80°C	20 min Ultraschall
  Reinstwasser	stabil	stabil	stabil
  1 M NaOH	Brocken	-	-
  10 M NaOH	trübe Lösung	trübe Lösung	klare Lösung
  10% NH3	Brocken	-	-
  25% NH3	Brocken	Brocken	Niederschlag
  1 M HCl	stabil	stabil	stabil
  12 M HCl	klare Lösung	-	-
  100% ACN	stabil	stabil	stabil
  ACN/Wasser (1:1)	stabil	stabil	opaleszente Lösung
  Trifluorethanol	Brocken	Brocken	Klumpen
  DMSO	stabil	stabil	stabil
  Methanol	stabil	stabil	stabil
  Ethanol	stabil	stabil	stabil
  4% Formaldehyd in PBS	stabil	-	-
  0,25 M EDTA in PBS	stabil	-	-
  Einfrieren/Auftauen	stabil

• Beispiel F – Physikalisch-chemische Eigenschaften der Hydrogele
• Die wie in Beispiel C dargestellt hergestellten Hydrogele, weisen in Abhängigkeit von der Endkonzentration der Trigger-Lösung unterschiedliche Festigkeiten auf. Mit einer 1:2,5 verdünnten Trigger-Lösung gebildete Gele waren noch so viskos, dass sie pipettiert werden konnten und Kavitäten durch Fließen des Gels ausgefüllt wurden. Nach dem Aushärten unter einfach konzentrierter Trigger-Lösung, verschwand diese Fähigkeit. Jedoch waren auch diese Gele nicht schnittfest. Auf silikonisierte ebene Glasoberflächen aufgetragene Hydrogele behielten ihre Struktur, auch beim senkrechten Aufstellen der Platten, bei.
• Durch Ultraschall-Behandlung oder vorsichtiges Pipettieren nahm die Viskosität der homogenen Gele ab. Innerhalb von 2 Stunden konnte die Endfestigkeit wieder hergestellt werden. Starke Erschütterungen dagegen, zerstörten die Gele irreparabel. Eine Temperierung der Gele bei 37°C hatte keinen Einfluss auf die Stabilität homogener Gele. Inhomogene Gele dagegen zerfielen bei Belastung unter Abgabe von Wasser in Agglomerate.
• Mit Farbstoff-Lösungen überschichtete Gele wurden innerhalb von 4 Stunden gleichmäßig durch gefärbt. Zur Prüfung der Durchlässigkeit der Hydrogele für 2-wertige Kationen wurden verschiedene Gele mit Trigger-Lösung, NaOH oder einer Puffer-Lösung geformt und anschließend 24 Stunden unter einfach konzentrierter Trigger-Lösung ausgehärtet bzw. unter Reinstwasser belassen. In allen gehärteten sowie den mit Trigger-Lösung gebildeten Gelen konnten die Kationen direkt im Gel nachgewiesen werden. Umgekehrt wurde eine Diffusion der Kationen aus dem Gel in den wässrigen Überstand beobachtet. Demgegenüber war der Nachweis in den Vergleichsproben negativ.
• Beispiel G – Biokompatibilität der Hydrogele
• Neuronale Vorläuferzellen wurden über mehrere Tage mit durch die Konjugation von Laminin-Epitope und die Einbettung von Wachstumsfaktoren neuronal funktionalisierten, erfindungsgemäßen Hydrogelen sowie mit nicht funktionalisierten, erfindungsgemäßen Hydrogelen (Peptid-Gehalte zwischen 0,6% und 0,15%) kultiviert. Für die 2D-Kultur wurden die Zellen auf der Geloberfläche ausgesät. Für die 3D-Kultur wurden sie bei der Gelbildung in situ eingebettet. Auch wurde eine subkutane Applikation bei Mäusen vorgenommen.
• In beiden Studien konnten keine Hinweise auf eine allergische, toxische oder das Wachstum inhibierende Wirkung durch die Hydrogele beobachtet werden.
• Beispiel H – Standardisiertes Testverfahren zur Identifizierung Hydrogele bildender Peptide
• Bei der Entwicklung dieses Schnelltests wurde insbesondere die Eignung der identifizierten Hydrogele als Biomaterial berücksichtigt. So wurde u. a. Wert auf die Gelbildung in nahezu neutralen wässrigen Medien gelegt. Als Trigger-Lösung wurde eine künstliche physiologische Flüssigkeit verwendet, mit der die Gelbildung in Zellkulturmedien und Körperflüssigkeiten simuliert werden sollte.
• Das Verfahren besteht aus der Abfolge der folgenden Schritte, wobei in jedem Schritt, außer f) und g), im Ultraschallbad homogenisiert wird:
• a) 1,5 mg Peptid einwiegen,
• b) mit 120 μL Reinstwasser aufschlämmen bzw. lösen,
• c) wenn löslich, mit 105 μL Reinstwasser verdünnen,
• d) wenn nicht löslich, durch Zugabe von 60 μL 0,1 M NaOH lösen und anschließend mit bis zu 50 μL 0,1 M HCl neutralisieren, ohne dass die Gelbildung einsetzt,
• e) wenn noch nicht löslich, neu einwiegen und durch Zugabe von 60 μL 0,1 M HCl lösen und anschließend mit bis zu 50 μL 0,1 M NaOH neutralisieren, ohne dass die Gelbildung einsetzt,
• f) Gelbildung durch Aufsetzen von 25 μL einer 10-fach konzentrierten physiologischen Lösung, alternativ von 25 μL einer 1 M CaCl₂, initiieren,
• g) erschütterungsfrei stehen lassen und Veränderung der Fließfähigkeit beobachten.
• Geeignete Peptide sollten im pH-Bereich von 5 bis 8 als klare Lösungen vorliegen. Die mit der Triggerung beginnende Gelbildung sollte nach ca. 30 min bis 2 Stunden zu einem homogenen Gel führen, das in einem Gefäß, das auf dem Kopf steht, nicht nach unten fließt. Leichte Erschütterungen und kurzzeitige Behandlung im Ultraschall-Bad sollten toleriert werden.
• Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• WO 2012/107174 [0009]
• US 6800481 [0020]
• WO 2003/070749 [0020]
• US 7449180 [0020]
• WO 2002/062969 [0020]
• WO 2003/096972 [0020]
• WO 2004/007683 [0020]
• WO 2005/014615 [0020]
• US 7846891 [0020]
• WO 2006/014570 [0020]
• WO 2006/116524 [0020]
• WO 2008/039483 [0020, 0056]
• WO 2008/073392 [0020]
• US 2011/0200560 [0020, 0056]
• WO 2012/008967 [0020, 0056]
• WO 2003/054146 [0020]
• WO 2003/084980 [0020]
• WO 2004/018628 [0020]
• WO 2004/072104 [0020]
• WO 2004/106359 [0020]
• WO 2005/056039 [0020]
• WO 2005/056576 [0020]
• WO 2006/079036 [0020]
• WO 2006/096614 [0020]
• WO 2008/061014 [0020]
• WO 2008/063808 [0020]
• WO 2008/067145 [0020]
• WO 2008/101104 [0020]
• WO 2008/121447 [0020]
• WO 2009/026233 [0020]
• WO 2010/120830 [0020]
• US 2011/0280944 [0020]
• US 2012/0294902 [0020]
• WO 2012/149515 [0020]
• US 7713923 [0056]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• Frederix et al. (2015) [0015]
• Woolfson (Banwell et al. 2009) [0016]
• Ghadiri et al. (1993) [0016]
• Ulijn (Toledano et al. 2006, Adams 2011, Tang et al. 2013) [0016]
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• Collier/Messersmith (2003) [0017]
• Jung (et al. 2009) [0017]
• Hartgerink (Aulisa et al. 2009) [0017]
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• Pochan und Kollegen (Haines-Butterick et al. 2007) [0017]
• Zhang (Caplan et al. 2002) [0018]
• Stupp (Silva et al. 2004, Cui et al. 2010) [0019]
• Gelbildung (Niece et al. 2003) [0021]
• Hirst et al. 2008, Jung et al. 2010, Loo et al. 2012, Matson/Stupp 2012, Fichman 2014 [0022]

Claims (11)

1. Hydrogele bildende Peptide bestehend aus maximal 12 Aminosäuren, deren Aufbau dem biomimetischen Prinzip der Sequenzen entspricht, die bei der zellulären Immunantwort erkannt werden, vorzugsweise in gestreckter Form bindende MHC-Klasse-I-Epitope, charakterisiert durch die folgenden Eigenschaften: • amphiphil, • Löslichkeit in wässrigen Medien, • Bildung homogener Hydrogele aus den wässrigen Lösungen, ausgelöst durch die Zugabe von Elektrolyten und/oder eine pH-Verschiebung, • Stabilität der gebildeten Hydrogele in neutralen wässrigen Medien, in physiologischen Salz- und Puffer-Lösungen sowie unter Zellkulturbedingungen, • weitgehender Erhalt der Gelbildungseigenschaften bei Funktionalisierungen mit kleinen Molekülen bis zu einer Molmasse von ca. 1.500 g/mol sowie bei der Modifizierung oder dem Austausch einzelner Aminosäuren.
2. Hydrogele bildende Peptide entsprechend Anspruch 1, a) charakterisiert durch eine lineare Aminosäure-Sequenz mit amphiphiler Struktur • bestehend aus 7–12, bevorzugt 8–11 und besonders bevorzugt 8–9 Aminosäuren, • die 1 oder 2 nicht benachbarte Aminosäuren mit basischer und/oder 1 oder 2 nicht benachbarte Aminosäuren mit saurer Seitenkettenfunktionalität und mindestens eine Aminosäure mit aromatischer Seitenkettenfunktionalität sowie weitere polare und unpolare Aminosäuren in einer komplementären und strukturell kompatiblen Anordnung enthält, und • die im pH-Bereich zwischen 6 und 8 eine Nettoladung von +1, –1 oder 0 aufweist, oder b) ausgewählt aus einer der folgenden Aminosäure-Sequenzen: SIINFEKL, siinfekl, LKEFNIIS, lkefniis, ASNENMETM, GILGFVFTL, WDFKFDSV, KFLYNFTQI, VGNWAKVLV (SEQ ID NO 01–09), oder c) erhalten aus a) oder b) durch • Austausch, Einfügen oder Auslassen einzelner Aminosäuren, • Verlängerung oder Verkürzung um 1–3 Aminosäuren, • Austausch aller oder einzelner L-Aminosäuren durch die entsprechenden D-Aminosäuren, • Invertierung, Retro-Invertierung oder Zyklisierung der Sequenz, • Konjugation der Termini zu ungeladenen Endgruppen, • Austausch einzelner Aminosäuren durch ähnliche Bausteine, wie z. B. Hydroxysäuren, oder • eine beliebige Kombination daraus, wobei die sich ergebenden analogen Peptide in Bezug auf die Ausgangssequenzen einen Homologiegrad von mindestens 70%, bevorzugt etwa 80%, aufweisen, oder d) ein entsprechendes Multimer, bevorzugt ein Dimer, dieser Sequenzen, mit oder ohne Aminosäure-Spacer-Einbau.
3. Multifunktionale gelbildende Peptide mit modularem Aufbau, enthaltend die Komponenten: a) Hydrogele bildendes Peptid entsprechend den Ansprüchen 1 und 2, b) funktionale Moleküle zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften der Hydrogele, c) flexible Spacer-Moleküle zur Konjugation der funktionalen Moleküle, wobei • Art und Anzahl der funktionalen Moleküle, je nach Anwendung, beliebig miteinander kombiniert werden können, • die funktionalen Moleküle mittels geeigneter Spacer-Moleküle oder direkt mit den Seitenkettenfunktionalitäten und/oder den terminalen Endgruppen des Hydrogele bildenden Peptides konjugiert sind, • das Hydrogele bildende Peptid auch unmodifiziert vorliegen kann, • zur Verbesserung der Gelbildungseigenschaften die gelbildende Sequenz auch, konjugiert durch einen Peptid-Spacer, vorzugsweise einen G₃-Spacer, dimerisiert werden kann, und • das Konjugat weiterhin stabile und homogene Hydrogele bildet.
4. Multifunktionale gelbildende Peptide entsprechend Anspruch 3, wobei die besagten funktionalen Moleküle a) Strukturabschnitte, Epitope oder Mimetika natürlicher Proteine, Naturstoff-Derivate, pharmazeutische Wirkstoffe, Marker-, Rezeptor-, Anker- und Signalmoleküle oder andere funktionelle Moleküle mit biologischer oder technischer Relevanz darstellen, die b) aus Oligopeptiden, Oligonukleotiden oder kleinen organischen Molekülen aufgebaut sind, deren Molmasse unterhalb von 1.500 g/mol liegt, bevorzugt aus linearen Peptiden mit 5–10 Aminosäuren, und die c) • die Oberflächenaktivität, die Polarität, die Hydrophilie/Hydrophobie, den Wasser-Gehalt, die elektrische Leitfähigkeit, die Durchlässigkeit, das Freisetzungsverhalten, die biologische Aktivität, die Immunogenität, die Bindung, Adhäsion und das Targeting von Molekülen, Rezeptoren, Zellen, Geweben, Organen und Organismen, die Kompatibilität mit biologischen und physikalisch-chemischen Systemen, die biologische Abbaubarkeit sowie die Stabilität und 3-dimensionale Struktur der Hydrogele modifizieren, • die bildliche Darstellung der Hydrogele ermöglichen, und/oder • geeignet sind, die natürliche Umgebung der kultivierten Zellen, Mikroben und Gewebe zu simulieren sowie deren Proliferation und Differenzierung zu unterstützen, sowie beliebige Kombinationen daraus.
5. Multifunktionale gelbildende Peptide entsprechend Anspruch 3, wobei die besagten Spacer-Moleküle a) kleine Moleküle mit mehreren für das Crosslinking geeigneten Funktionalitäten, bevorzugt lineare oder verzweigte Aminosäure-Spacer, bestehend aus 1–6 natürlichen und/oder nicht natürlichen Aminosäuren, darstellen, die b) enzymatisch oder chemisch spaltbare Bindungen, Gruppen oder Sequenzen enthalten können, und die c) über einen unverzweigten Terminus mit den Termini oder den Aminosäure-Seitenketten des Hydrogele bildenden Peptides konjugiert werden und über den anderen, gegebenenfalls verzweigten Terminus, die Konjugation eines oder mehrerer funktionaler Moleküle vermitteln.
6. Precursor für ein multifunktionales gelbildendes Peptid entsprechend den vorhergehenden Ansprüchen 3–5, der a) eine oder mehrere Schutzgruppen enthält, die die Gelbildung durch die Erhöhung der Oberflächenladung oder das Erschweren der Aggregation der gelbildenden Sequenzen verhindern, bevorzugt eine geladene Aminosäure-Sequenz oder eine voluminöse sterisch hinderliche Gruppe, und bei dem b) nach enzymatischer oder chemischer Abspaltung dieser Schutzgruppen das gelbildende Peptid freigesetzt und die Gelbildung initiiert wird.
7. Sol-Gel-System mit modularem Aufbau, enthaltend die Komponenten: a) Lyophilisate oder wässrige Lösung eines oder mehrerer multifunktionaler gelbildender Peptide entsprechend den Ansprüchen 3–5 und/oder von deren Precursoren entsprechend Anspruch 6, b) weitere synthetische und/oder proteinogene Gelbildner, c) weitere lösliche und/oder partikuläre Komponenten als Gastspezies, wie z. B. • lebende Zellen und Gewebe, Organismen und Organismen-Teile, • Antikörper, Nukleinsäuren und Nukleotide, • strukturelle und biologisch aktive Proteine und/oder deren Mimetika, • Wachstumsfaktoren, Signalmoleküle und Rezeptoragonisten, • immunogene Antigen-Determinanten und/oder deren Mimetika, • Vitamine, Enzyme und Naturstoff-Derivate, • pharmazeutische Wirkstoffe, Marker-Moleküle und Kontrastmittel, • für die Biomineralisation verwertbare Ausgangsstoffe und feste Biomaterialien, • deren Formulierungen und Trägerpartikel, und • weitere Trägermaterialien, Hilfs- und Zusatzstoffe, d) gepufferte wässrige Lösungsmittel zur Rekonstitution der Komponenten a) bis c), e) wässrige, gepufferte oder ungepufferte Elektrolyt-Lösung zur Initiierung der Gelbildung, die wahlweise Enzyme oder Reagenzien zur Aktivierung der Precursoren enthalten können, wobei • Art, Anzahl und Konzentration der Komponenten, je nach Anwendung, beliebig miteinander kombiniert werden können, • die eingebetteten Gastspezies über zusätzliche Ankergruppen in der Gel-Matrix immobilisiert sein können, und • die multifunktionalen gelbildenden Peptide auch unmodifiziert vorliegen können.
8. Mehrstufiges Verfahren zur Herstellung stabiler Hydrogele aus den Komponenten eines Sol-Gel-Systems entsprechend Anspruch 7, bestehend aus den Schritten: a) Lösen der multifunktionalen gelbildenden Peptide und/oder von deren Precursoren in einem elektrolyt-armen polaren Medium, vorzugsweise Reinstwasser, b) optional Mischen mit Lösungen weiterer Gelbildner, c) optional Einstellen des pH-Wertes, d) optional Einbringen von salzfreien Gastspezies in die Peptid-Lösung, e) Initiieren der Gelbildung durch in-Kontakt-bringen der Peptid-Lösung mit einer Elektrolyt-Lösung, einer Puffer-Lösung, einem Zellkulturmedium oder einer physiologischen Flüssigkeit, wobei diese Lösungen weitere Gastspezies enthalten können, oder mit einer sauren bzw. basischen Dampfphase, oder durch direkte Injektion der Peptid-Lösung in das Gewebe, oder durch Freisetzen der multifunktionalen gelbildenden Peptide aus den Precursoren, f) Aushärten der Hydrogele durch Überschichten mit einer Elektrolyt-Lösung oder durch den weiteren Kontakt mit den Körperflüssigkeiten, und g) optional Äquilibrieren der Hydrogele durch Überschichten mit dem Zielmedium.
9. Verfahren zur systematischen Suche nach weiteren Peptiden mit hoher Gelbildungstendenz in neutralen wässrigen Medien entsprechend den vorhergehenden Ansprüchen, bestehend aus den Schritten: a) Auswählen einer potentiell gelbildenden Aminosäure-Sequenz, b) Prüfen der Kompatibilität mit den Prinzipien des natürlichen immunologischen Codes MHC-bindender Moleküle, c) Herstellen des Peptides in hoher Reinheit, d) Lösen des Lyophilisates in einem elektrolyt-armen polaren Medium, bevorzugt Reinstwasser, gegebenenfalls unter Zugabe von HCl bzw. NaOH, zu einer Konzentration von 0,5–5%, e) Neutralisieren der Lösung unter Zugabe von HCl bzw. NaOH, und verdünnen auf eine Konzentration von 0,3–3%, f) Zugabe von 10% vol. einer 1 M CaCl₂-Lösung, g) visuelle Bewertung der Entwicklung der Fließfähigkeit.
10. Assay zur Bestimmung der Enzymaktivität bzw. der Aktivität von Enzyminhibitoren, charakterisiert dadurch, dass durch das zu untersuchende bzw. zu inhibierende Enzym a) ein entsprechend Anspruch 8 hergestelltes Hydrogel durch die Spaltung des Peptid-Grundgerüstes des Hydrogele bildenden Peptides entsprechend den Ansprüchen 1 und 2, verflüssigt wird, oder b) aus einem Precursor entsprechend Anspruch 6 das gelbildende Peptid freigesetzt und die Gelbildung initiiert wird, oder c) aus einem entsprechend Anspruch 8 hergestellten Hydrogel funktionale Moleküle entsprechend Anspruch 4 freigesetzt werden, wobei das Peptid-Grundgerüst des Hydrogele bildenden Peptides bzw. die verwendeten Spacer für das Zielenzym spaltbare Sequenzabschnitte enthalten.
11. Kit zur Herstellung von modular funktionalisierten Hydrogelen, enthaltend a) ein Sol-Gel-System entsprechend Anspruch 7 in lyophilisierter oder gelöster Form, b) ein polares Lösungsmittel für die Rekonstitution des Sol-Gel-Systems, c) eine gepufferte Elektrolyt-Lösung als Gelbildungs-Trigger, d) oder, alternativ zu a) bis c) eine fertige Gel-Matrix, sowie e) eine Anleitung zur Herstellung, Handhabung und Verwendung der Hydrogele, wobei die Zusammensetzung und Funktionalisierung des Sol-Gel-Systems spezifisch auf die für das Kit deklarierte Anwendung zugeschnitten sind.

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