KR101209233B1

KR101209233B1 - 피브린 결합능을 가진 생리활성 펩타이드가 함유된 피브린 수화젤

Info

Publication number: KR101209233B1
Application number: KR1020110014955A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 정종평; 최영숙
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2012-12-06
Also published as: KR20120095562A

Abstract

본 발명은 피브린 결합 부위 및 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드, 이를 함유하는 피브린 수화젤 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 피브린 결합 부위 및 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 피브린 수화젤에 적용하여 피브린 수화젤 구조의 안정화와 세포의 부착 및 증식을 유도하는 피브린 수화젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주요 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드는 피브린과 결합하여 안정한 상태로 존재가 가능하여 피부와 연골 재생에 적용될 수 있으며, 조직 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 부착을 촉진하여 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있고, 생체 내에 이식하였을 때 펩타이드 활성을 유지한 채로 안정하게 존재할 수 있어 고분자 지지체를 이용한 조직 재생 치료기술의 발전에 유용하고, 피브린 결합부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 적용한 피브린 수화젤은 그 안에 분산된 세포를 포함할 수 있어 생체 내에서 성장 중인 세포를 지지할 수 있으며 생분해되어 조직 재생에 탁월한 효과가 있다.

Description

피브린 결합능을 가진 생리활성 펩타이드가 함유된 피브린 수화젤 {Fibrin-Binding Bio-Active Peptide Loaded Fibrin Hydrogel}

본 발명은 피브린 결합 부위 및 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드, 이를 함유하는 피브린 수화젤 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 피브린 결합 부위 및 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 피브린 수화젤에 적용하여 피브린 수화젤 구조의 안정화와 세포의 부착 및 증식을 유도하는 피브린 수화젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

생체조직공학(tissue engineering)은 질병 또는 사고로 인하여 생체조직이나 장기의 손상을 입은 환자들에게 인공의 생체조직이나 장기를 공급할 수 있는 방법이다. 이 방법에 따르면 세포들을 3차원 구조의 다공성 고분자 지지체와 함께 바이오 리엑터에서 생체조직으로 성장된 후 외과적 수술을 통해 이식된다. 이 방법에서 사용되는 고분자 지지체는 체내 조직의 세포 외 기질에 많은 역할을 모방하게 되며, 생체적합성, 세포친화성, 기계적 성질, 생분해성 등이 생체조직공학용 지지체에서 요구되는 조건이라 할 수 있다.

피브린은 경단백질의 일종으로 혈장 속의 피브리노겐에 효소 트롬빈이 작용하여 생기는 불용성 단백질이고, 상온에서 트롬빈의 존재 하에 피브리노겐의 효소적 중합반응에 의해 수화젤(Hydrogel)을 형성한다. 수화젤은 양호한 생체적 합성을 제공하고 혈전증, 가피 형성 및 염증을 일으키는 경향이 적은 가교된 수용성의 함수 중합체로서, 조직 공학 목적에 이상적인 후보 물질이다. 피브린 젤은 체내에서 독성이 없고, 면역반응이 거의 없다고 알려져, 이와 같이 형성된 피브린 젤은 손상된 조직 및 장기의 복원에 초점을 맞춘 조직 공학 분야에서 있어서 중요한 의의가 있으며, 특히 성장 인자 단백질의 전달이 용이하여, 뼈, 피부 혈관, 연골 등의 생체 조직 재생 분야에서 피브린 젤과 관련한 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 피브린 젤 역시 제한된 범위의 기계적 강도를 가지는 단점이 있다.

피브로넥틴(fibronectin)은 세포 외 기질의 주요 당 단백의 하나로 세포부착에 관여하는 인테그린(integrin)과 결합하여 extracellular signaling kinase(ERK 1/2)를 자극하며, 그 결과 세포의 생존, 성장, 사멸, 분화 등 다양한 세포 반응을 조절하게 된다. 피브로넥틴의 다양한 결합 부위 중에서도 아미노 말단에 가까운 글루타민(Glutaminly-Gln) 잔기는 활성화된 혈액응고인자 factor 13의 트랜스글루타미네이션(transglutamination) 위치로 작용하여 피브로넥틴을 피브린, 피브리노겐, 피브로넥틴과 결합하도록 유도한다. 플라즈마 피브로넥틴은 혈액응고 과정에서 피브린과 함께 일시적인 지지체(scaffold) 역할을 하는 피브린-피브로넥틴 매트릭스의 주요 구성원이자 조직 재생과정에서 이 기질을 대체하는 육아조직의 기본 요소로 작용하며, 이때 피브로넥틴과 피브린 간 결합이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 피브로넥틴은 1980년대 이후 피브로넥틴의 전체 분자를 이용한 조직 재생술에 많이 이용되어 왔으나, 거대 분자를 사용하는 경우는 면역반응, 분해효소에 의한 무작위 분절화 등의 문제점들이 지적되었다.

이에 본 발명자들은 피브로넥틴이 가지는 면역반응, 무작위 분절화 등의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 피브로넥틴에서 주요 세포부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 발굴하여 피브린젤에 도입함으로써, 1회의 적용으로 피브린 수화젤에 세포 부착을 유도하는 생리활성 펩타이드를 결합하여 수화젤이 안정한 상태로 존재할 수 있고 세포부착을 촉진하여 조직 재생력을 극대화시킬 수 있으며, 조직 재생에 높은 치료효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 피브로넥틴에서 주요 세포부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 발굴하여 피브린 젤에 도입함으로써, 1회의 적용으로 피브린 수화젤에 세포 부착을 유도하는 생리활성 펩타이드를 결합하여 수화젤이 안정한 상태로 존재할 수 있고 세포부착을 촉진하여 조직 재생력을 극대화하며, 조직 재생에 높은 효과를 나타내는 피브린 수화젤을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 유효성분으로 함유하는 피브린 수화젤을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 혼합하는 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 주요 세포 부착 부위를 포함하는 생리활성 펩타이드는 피브린과 결합하여 안정한 상태로 존재가 가능하여 피부와 연골 재생에 적용될 수 있으며, 조직 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 부착을 촉진하여 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있고, 생체 내에 이식하였을 때 펩타이드 활성을 유지한 채로 안정하게 존재할 수 있어 고분자 지지체를 이용한 조직 재생 치료기술의 발전에 유용하고, 피브린 결합부위를 포함하는 생리활성 펩타이드를 적용한 피브린 수화젤은 그 안에 분산된 세포를 포함할 수 있어 생체 내에서 성장 중인 세포를 지지할 수 있으며 생분해되어 조직 재생에 탁월한 효과가 있다.

도 1은 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 굳는 정도를 측정하여 수치화한 그래프이다.
도 2는 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 분해 정도를 15일 동안 관찰한 것이다.
도 3은 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 파이버 형태 및 3차원적 구조를 원자현미경으로 관찰하고, 파이버의 굵기를 측정한 것이다.
도 4는 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 파이버 형태를 전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 5는 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤을 구성하는 파이버의 굵기를 측정해 도식화한 것이다.
도 6은 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤 표면에 각질형성세포(keratinocyte cell)를 배양하여 세포의 부착 정도를 전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 7은 세포 부착유도 생리활성 펩타이드를 각질형성세포(keratinocyte cell)에 10분간 처리하였을 때, 세포부착단백질(FAK)의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 8은 세포 부착유도 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤 표면에 세포 부착 정도를 15일 동안 관찰하며 DNA를 정량적으로 분석한 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 세포 부착능을 가지는 펩타이드는 피브로넥틴 (fibronectin)의 57-68위치의 아미노산 서열 KHYQINQQWERT(서열번호 1), 103-115 위치의 아미노산 서열 GNTYRVGDTYERP(서열번호 2), 193-204 위치의 아미노산 서열 TSYVVGETWEKP(서열번호 3), 219-230 위치의 아미노산 서열 GSGRITCTSRNR(서열번호 4), 233-249 위치의 아미노산 서열 DQDTRTSYRIGDTWSKK(서열번호 5), 256-270 위치의 아미노산 서열 LQCICTGNGRGEWKC(서열번호 6), 241-266 위치의 아미노산 서열 RIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGNGRG(서열번호 7), 1402-1415 위치의 아미노산 서열 REDRVPHSRNSITL(서열번호 8), 1517-1532 위치의 아미노산 서열 VYAVTGRGDSPASSK(서열번호 9)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드이다.

다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 유효성분으로 함유하는 피브린 수화젤에 관한 것이다.

본 발명의 상기 피브린 수화젤과 결합하는 세포 부착능을 가지는 펩타이드는 피브린 수화젤과 결합하여 구조적 안정성을 이루는 세포부착용 생체 재료에 관한 것이며, 세포 부착용 생체 재료란 금속, 천연고분자 및 합성고분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 또한, 세포 부착능을 가지는 펩타이드를 피브린 수화젤 생체 재료에 침적시켜 결합시킬 수 있으며, 결합을 형성하기 위해서 화학적인 가교제가 필요하지 않은 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피브리노겐 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 0.1~100㎎/㎖ 인 것을 특징으로 할 수 있고, 피브리노겐의 함량이 0.1㎎/㎖미만일 경우에는 젤의 형태가 제대로 유지되지 못하며, 100㎎/㎖를 초과하였을 경우에는 젤의 형태가 매우 단단해져 수화젤의 기능을 상실하는 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 트롬빈의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 0.5~50NIH 인 것을 특징으로 할 수 있으며, 트롬빈의 함량이 0.5NIH 미만일 경우에는 젤의 형태가 유지되지 못하며, 50NIH를 초과하였을 경우에는 젤이 매우 단단해지는 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 1~100μM인 것을 특징으로 할 수 있고, 펩타이드의 함량이 1μM 미만일 경우에는 적용 농도가 적어 피브린 수화젤에서 펩타이드로서의 역할을 하지 못하며, 100μM를 초과하였을 경우에는 반응하는 펩타이드의 농도가 증가하여 세포 톡성을 일으킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 칼슘염의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 1~100mM 인 것을 특징으로 할 수 있으며, 칼슘염 함량이 1mM 미만일 경우에는 칼슘 공여가 제대로 이루어지지 못하여 수화젤이 형성되지 못하며, 100mM을 초과하였을 경우에는 잉여의 칼슘으로 인해 수화젤 주변의 pH가 산성이 되는 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 칼슘염은 인산3칼슘, 알파인산3칼슘, 베타인산3칼슘, 인산칼슘, 인산칼슘의 다형체, 히드록시아파타이트, 탄산칼슘, 황산칼슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 혼합하는 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 피브린 수화젤에 결합하는 세포 부착능을 가지는 펩타이드는 피브린 수화젤에 안정적으로 고정됨으로써, 펩타이드의 안정성이 증가하고 장기간 동안 활성을 유지할 수 있어서, 체내에 이식하였을 때 이식된 국소에서 안정하게 유지되어 구조적인 지지체의 역할을 하고, 펩타이드에 의한 조직재생 효과가 지속될 수 있으며 이는 피부조직 및 연골 재생 치료에 적합한 특징이 있다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 9의 세포 부착능을 가지는 펩타이드를 제작하고, 제작된 펩타이드가 피브린 수화젤에 안정적으로 결합하는지를 확인하였으며, 피브린 수화젤에 상기 펩타이드가 안정적으로 함유된 지지체의 물성 실험 및 피브린 수화젤에서의 세포 부착력을 확인하였다.

본 발명의 일 양태에서, 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤을 제조하고, 이들의 물리적 특성을 테스트 결과, 육안 검사시, 통상의 피브린 수화젤과 유사하게 백색의 불투명한 젤형태를 띄고 있었고, 피브리노겐, 트롬빈, 칼슘, 생리활성 펩타이드를 간단히 혼합하여 젤화하였고, 젤화되는 시간은 넣어주는 생리활성 펩타이드의 종류에 따라 다소 차이를 보였으며, 대부분 혼합한 후 2분이 지나면서 불투명성을 보이고 혼합 40분 이내에 젤화 되었다. 넣어준 생리활성 펩타이드가 피브린 수화젤 구조에 미치는 영향을 열중량분석기를 이용하여 측정한 결과, 구조적으로 안정되거나 공유결합이 많이 되어있을수록 높은 온도에서 분해되는 양상을 보인 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 양태에서, 펩타이드를 넣지 않은 대조군과, 넣어준 펩타이드의 무게감소 온도를 측정한 결과, 생리활성 펩타이드를 넣지 않은 대조군에 비해 생리활성 펩타이드를 넣은 피브린 수화젤의 무게감소 온도가 더 높은 것으로 나타나 생리활성 펩타이드가 피브린 수화젤의 구조적 안정화에 도움을 주고 있는 것을 확인하였다. 또한, 세포생존 환경에서 피브린 수화젤의 분해능을 확인하였고, 다중웰에 만든 피브린 수화젤에 세포를 심어 이산화탄소 환경의 세포 배양기에서 세포를 배양하며 15일 동안 분해의 정도를 확인한 결과, 서열번호 9의 펩타이드를 제외한, 대조군과 서열번호 1의 펩타이드 내지 서열번호 8의 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤은 분해가 되지 않고 그 형태를 유지하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 세포부착능 확인하기 위하여, 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤을 다중웰(multi-well) 평판의 웰에서 제조한 후에 젤화시켜 제조하였고, 이 수화젤들은 각질형성세포(keratinocyte cell)를 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤에 배양시켜 세포의 부착정도와 증식정도를 확인하였다. 현미경 관찰결과, 대조군의 세포부착양상은 구형으로 불안정하게 부착되어있거나 부착된 세포를 거의 찾을 수 없는 반면, 생리활성 펩타이드를 첨가한 피브린 수화젤 군에서 세포의 부착이 좋을 때 나타나는 형태학적 모습인 방추 형태를 유지하는 것을 확인하였다. 세포 배양 4시간 후에 이미 대부분의 실험군의 세포에서 세포질의 신장이 관찰되는 등 안정적인 세포부착이 관찰되었다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 생리활성 펩타이드가 세포 부착에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양된 각질형성세포에 생리활성 펩타이드를 첨가하여 세포 부착마커 단백질 발현을 확인하였다. 펩타이드를 사용하지 않은 대조군은 세포부착 단백질의 발현이 거의 나타나지 않았으며, 생리활성 펩타이드 중 서열번호 1의 펩타이드, 서열번호 2의 펩타이드, 서열번호 8의 펩타이드 및 서열번호 9의 펩타이드에서 FAK의 발현이 현저하게 증가하였다. 이로 인해 피브로넥틴 유래 생리활성 펩타이드가 세포의 세포 부착을 유도시키는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 생리활성 펩타이드가 첨가된 피브린 수화젤이 세포의 증식에 어떠한 영향 미치는지 확인하기 위하여, 배양된 각질형성세포(keratinocyte cell)를 피브린 수화젤에 접종한 후 배양하여, 세포의 DNA량을 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 생리활성 펩타이드로 수식되지 않은 피브린 수화젤 보다 생리활성 펩타이드가 수식된 피브린 수화젤의 부착 정도가 현저히 증가하였으며, 이러한 증가도는 배양기간에 비례하며 서열번호 9번이 첨가된 피브린 수화젤의 경우 15일부터 생분해되는 양상을 보이면서 세포가 줄어드는 것처럼 나타났다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

피브린 수화젤에 특이적으로 결합하는 세포 부착능을 가진 생리활성 펩타이드의 제조

N 말단으로부터 순서대로 피브로넥틴에서 유래된 세포부착 효과가 있는 서열번호 1(KHYQINQQWERT), 서열번호 2(GNTYRVGDTYERP), 서열번호 3(TSYVVGETWEKP), 서열번호 4(GSGRITCTSRNR), 서열번호 5(DQDTRTSYRIGDTWSKK), 서열번호 6(LQCICTGNGRGEWKC), 서열번호 7(RIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGNGRG), 서열번호 8(REDRVPHSRNSITL) 및 서열번호 9(VYAVTGRGDSPASSK)를 펩타이드 합성장치를 이용하여 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다. 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin(0.075m㏖/g, 100~200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50㎎의 Rink resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후, Fmoc-group의 제거를 위하여, 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C말단부터 서열대로 0.5M 아미노산 용액(용매: DMF), 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP), 0.5M HBTU(용매: DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 NMP로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후, 디프로텍션(deprotection)을 하여 Fmoc-group을 제거하였다.

닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하여 합성을 확인하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 resin은 THF나 DCM으로 건조시킨 후 TFA cleavage cocktail을 resin 1g당 20㎖의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후, 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 진공증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 제거한 후 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주거나 펩타이드가 녹아있는 TFA cocktail용액에 직접 콜드 에테르를 과량 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리하였다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 TFA cocktail을 완전히 제거하였고, 이렇게 해서 얻어진 펩타이드는 증류수에 녹여 동결 건조하였다.

합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제되었다. 정제된 펩타이드는 MALDI 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.

피브로넥틴 I 유래의 아미노산 서열

이름	아미노산 서열	유래
서열번호 1	KHYQINQQWERT	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 2	GNTYRVGDTYERP	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 3	TSYVVGETWEKP	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 4	GSGRITCTSRNR	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 5	DQDTRTSYRIGDTWSKK	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 6	LQCICTGNGRGEWKC	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 7	RIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGNGRG	피브로넥틴Ⅰ
서열번호 8	REDRVPHSRNSITL	피브로넥틴Ⅲ
서열번호 9	VYAVTGRGDSPASSK	피브로넥틴Ⅲ

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤 제조

피브리노겐을 투석하여 기타 불순물 및 염을 제거한 후 동결건조 하여 피브리노겐 분말을 얻어 생리식염수에 3.6㎎/㎖의 농도로 녹이고, 0.22μM 필터를 통해 여과함으로써 멸균하였다. 트롬빈은 멸균된 증류수를 이용해 1NIH/㎕를 최종 적용 농도로 하고, 칼슘의 공여자인 칼슘클로라이드(CaCl₂)는 50 mM의 농도로 만들어 0.22μM 필터를 통해 여과함으로써 멸균하였다. 분리 정제되어 분자량을 확인한 생리활성 펩타이드는 40μM의 농도로 만들어 준비하였다. 3.6㎎/㎖의 피브리노겐, 1NIH의 트롬빈, 50mM의 칼슘 및 40μM의 생리활성 펩타이드를 균질화하여 상온에 두었더니 약 2분 후 백색의 반투명한 피브린 수화젤을 형성하였다. 경화의 정도는 450㎚에서 흡광도를 측정하였다 (도 1).

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 물리적 특성

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 제조하였다. 이 수화젤들은 다중웰(multi-well) 평판의 웰에서 제조한 후, 젤화 시켰으며, 웰로부터 피브린 수화젤을 제거한 후, 이들의 물리적 특성을 테스트하였다. 육안 검사시, 통상의 피브린 수화젤과 유사하게 백색의 불투명한 젤 형태를 띄고 있었고, 3.6㎎/㎖의 피브리노겐, 1NIH의 트롬빈, 50mM의 칼슘, 40μM의 생리활성 펩타이드를 간단히 혼합하여 젤화 시킬 수 있었다. 젤화되는 시간은 넣어주는 생리활성 펩타이드의 종류에 따라 다소 차이를 보였으며, 대부분 혼합 2분이 지나면서 불투명성을 보이고 혼합 40분 이내에 젤화 되었다 (도 1). 넣어준 생리활성 펩타이드가 피브린 수화젤 구조에 미치는 영향을 알아보기 위해 열중량분석기 (Thermogravimetric Analysis ; TGA)를 이용해 측정하였고, 열중량분석기는 시료에 40-700℃의 온도 프로그램을 가하여 시료의 질량변화를 시간이나 온도의 함수로써 측정하여, 구조적으로 안정되거나 공유결합이 많이 되어있을수록 높은 온도에서 분해되는 양상을 보인 것을 확인할 수 있었다.

이름	무게감소 온도(℃)
대조군	260.98
서열번호 1	290.66
서열번호 2	269.53
서열번호 3	276.67
서열번호 4	274.35
서열번호 5	278.24
서열번호 6	275.99
서열번호 7	278.23
서열번호 8	284.19
서열번호 9	296.91

대조군은 펩타이드를 넣지 않고, 넣어주는 펩타이드의 부피와 동일한 물을 넣어주고 젤화시킨 것이며, 동일한 부피의 물을 넣어주는 이유는 펩타이드를 녹일 때 물을 사용하였으므로, 동일한 조건을 맞춰주기 위함이다. 생리활성 펩타이드를 넣지 않은 대조군에 비해 생리활성 펩타이드를 넣은 피브린 수화젤의 무게감소 온도가 더 높은 것으로 나타나 생리활성 펩타이드가 피브린 수화젤의 구조적 안정화에 도움을 주고 있는 것을 확인하였다.

세포생존 환경에서 피브린 수화젤의 분해능을 확인하였고, 다중웰 (multi-well)에 만든 피브린 수화젤에 세포를 심어 37℃, 5% 이산화탄소 환경의 세포 배양기에서 세포를 배양하며 15일 동안 분해정도를 확인하였다. 그 결과 서열번호 9의 펩타이드를 제외한, 대조군과 서열번호 1의 펩타이드 내지 서열번호 8의 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤은 분해가 되지 않고 그 형태를 유지하였다 (도 2). 이를 조직공학에 적용하였을 때, 피브린 수화젤은 조직이 재생되는 동안 분해되지 않고 구조적 지지체의 역할을 수행한 후 생분해될 것이라 예상할 수 있다.

원자현미경(Atomic force microscope; AFM)과 전자 현미경(Scanning electron microscope; SEM)을 이용하여 피브린 수화젤을 구성하고 있는 피브린 파이버의 형태와 두께를 측정하였다. 피브린 수화젤은 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)에 3시간 처리하고, 1% 사산화 오스뮴 (osmium tetroxide)에서 후고정하였고, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100%의 알코올로 탈수시켜 현미경의 시편을 만들었다. 원자현미경은 날카로운 탐침(Tip)이 표면에 수 이내로 접근하며 Scanning이 이루어지며 (도 3), 이때 표면과 탐침 사이의 측정 변수를 전자적인 피드백 함수로 제어함으로써 표면 이미지가 얻어졌다. 주사전자현미경은 고체상태에서 미세조직과 형상을 관찰하는 데에 가장 다양하게 쓰이는 분석기로, 전자선을 조사해 미소한 점으로 초점을 맞추고, 검출기로 미소점에서의 변화된 신호량의 대소를 브라운관 점의 명암으로써 영상시키는 방식으로 50Å 정도의 해상력을 지닌다 (도 4).

또한, 도 3, 4 및 5와 같이, 생리활성 펩타이드 대신 물을 넣은 대조군은 파이버의 굵기가 굵고, 뭉쳐져서 있는 반면 생리활성 펩타이드를 넣은 피브린 수화젤의 경우 파이버의 크기가 130-180㎚ 내외로 세포에 넓은 표면적을 제공해 줄 수 있는 것을 확인하였다.

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤의 세포부착능 확인

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤을 상기 실시예 2와 같은 방법으로 제조하였다. 이 수화젤들은 다중웰(multi-well) 평판의 웰에서 제조한 후에 젤화 시켰다. 각질형성세포(keratinocyte cell)를 생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤에 배양시켜 세포의 부착정도와 증식정도를 확인하였다.

생리활성 펩타이드가 포함된 피브린 수화젤에 각질형성세포를 4시간 동안 배양하고 세포의 배지를 제거한 후, 생리식염수 용액으로 피브린 수화젤을 세척해 부착되지 않은 세포를 제거하였으며, 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)에 3시간 처리하고, 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)에서 후고정하여 70%, 80%, 90%, 95% 및 100%의 알코올로 탈수시켜 주사전자현미경의 시편을 만들었다. 현미경 관찰결과, 도 6에서 대조군의 세포부착양상은 구형으로 불안정하게 부착되어 있거나 부착되어진 세포를 거의 찾을 수 없는 반면, 생리활성 펩타이드를 첨가한 피브린 수화젤 군에서 세포의 부착이 좋을 때 나타나는 형태학적 모습인 방추 형태를 유지하는 것을 확인하였다. 세포 배양 4시간 후에 이미 대부분의 실험군의 세포에서 세포질의 신장이 관찰되는 등 안정적인 세포부착이 관찰되었다.

생리활성 펩타이드가 세포 부착에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양된 각질형성세포(keratinocyte cell)에 생리활성 펩타이드를 첨가하여 세포 부착마커 단백질 발현을 확인하였다. 확인한 세포 부착마커 단백질은 초점 접착력 키나아제(Focal adhesion kinase; FAK)로 이 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 확인하였다. 배양된 각질형성세포에 생리활성 펩타이드를 10분간 처리하고, 세척 후 세포내의 총 단백질을 추출하여 이의 양을 280㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이 중 2㎍/㎖의 단백질용액 40㎕를 취하여 8% 아크릴아마이드 젤에 전기영동 시킨 후, 부착마커 단백질인 FAK의 항체와 반응시켰다. 이후 항체와 결합하는 2차 항체를 표지자로 표지하여 반응시키고, 상기 젤을 현상하여 나타나는 단백질 밴드를 관찰하고 그 밀도를 측정하였다. 밀도를 측정한 결과, 펩타이드를 사용하지 않은 대조군은 세포부착 단백질의 발현이 거의 나타나지 않았으며, 생리활성 펩타이드 중 서열번호 1의 펩타이드, 서열번호 2의 펩타이드, 서열번호 8의 펩타이드 및 서열번호 9의 펩타이드에서 FAK의 발현이 현저하게 증가하였다. 이로 인해 피브로넥틴 유래 생리활성 펩타이드가 세포의 세포 부착을 유도시키는 것을 알 수 있었다 (도 7).

생리활성 펩타이드가 첨가된 피브린 수화젤이 세포의 증식에 어떠한 영향 미치는지 확인하기 위하여, 배양된 각질형성세포(keratinocyte cell)를 피브린 수화젤에 접종한 후 15일간 배양하여, 3일에 한번 씩 세포의 DNA량을 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 생리활성 펩타이드로 수식되지 않은 피브린 수화젤보다 생리활성 펩타이드가 수식된 피브린 수화젤의 부착 정도가 현저히 증가하였으며, 이러한 증가도는 배양기간에 비례하며 서열번호 9의 펩타이드가 첨가된 피브린 수화젤의 경우 15일부터 생분해되는 양상을 보이면서 세포가 줄어드는 것처럼 나타났다 (도 8).

본 발명에서는 서열번호 1 내지 9의 세포 부착능을 가지는 펩타이드를 제작하고, 피브린 수화젤에 상기 펩타이드가 안정적으로 함유된 지지체의 피브린 수화젤의 분해능, 세포 부착능 등을 확인한 결과, 펩타이드는 피브린 수화젤에 안정적으로 고정됨으로써, 펩타이드의 안정성이 증가하고 장기간 동안 활성을 유지할 수 있어서, 체내에 이식하였을 때 이식된 국소에서 안정하게 유지되어 구조적인 지지체의 역할을 하고, 펩타이드에 의한 조직재생 효과가 지속될 수 있을 것으로 확인하여, 이는 피부조직 및 연골 재생 치료에 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드.
서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 유효성분으로 함유하는 피브린 수화젤.
제2항에 있어서, 상기 피브리노겐 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 0.1~100㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤.
제2항에 있어서, 상기 트롬빈의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 0.5~50 NIH인 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤.
제 2항에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 1~100μM인 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤.
제2항에 있어서, 상기 칼슘염의 함량은 피브린 수화젤 부피 1㎖ 당 1~100mM인 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤.
제2항에 있어서, 상기 칼슘염은 인산3칼슘, 알파인산3칼슘, 베타인산3칼슘, 인산칼슘, 인산칼슘의 다형체, 히드록시아파타이트, 탄산칼슘, 황산칼슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤.
서열번호 1 내지 서열번호 9의 아미노산 서열에서 선택되는, 피브린에 결합하고 세포 부착능이 있는 펩타이드와 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘염을 혼합하는 것을 특징으로 하는 피브린 수화젤의 제조방법.