CN102952176A - 具有促成骨生长的生物活性多肽及其制备方法 - Google Patents

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卢婷利
陈婷
马玉樊
校月红
李昱辉
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Abstract

本发明公开了一种具有促成骨生长的生物活性多肽及其制备方法，氨基氨基序列满足下列通式中的任意一种：Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2、Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2和Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；所述的多肽采用固相合成法合成。本发明可以让营养物资、生物活性分子和氧气到达所种植的细胞，生物相容性良好，突破了来源的限制，成骨生长肽能显著促进成骨分化和新生骨的形成。

Description

具有促成骨生长的生物活性多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及促成骨生长的生物活性多肽，属于生物技术多肽及医用材料领域。
背景技术
再生医学和组织工程需要两个关键因素：对机体无毒、生物相容性良好的支架材料和能有效代替受伤组织而没有副反应的适宜细胞，包括各种干细胞和祖原细胞。因此，选择适当而有效的生物活性支架来刺激和促进细胞分化，支持组织再生是组织工程的关键问题。
1992年，美国麻省理工学院的张曙光偶然从酵母蛋白中发现了能自组装的离子短肽，该离子短肽是由8～16个氨基酸构成的自组装体系，可作为细胞培养支架材料。与其他生物医学材料相比，自组装多肽孔径约5-500nm，这样的纤维网状支架材料类似于细胞外基质，有利于细胞的黏附和生长；自组装多肽材料形成的水凝胶含水量大于99%，表面积非常大，可以让营养物质、生物活性分子和氧气到达所种植的细胞；自组装多肽材料成分简单，生物相容性良好，因其在体内的降解产物为氨基酸，可被生物体吸收或代谢而无毒副作用。多肽分子自组装技术在为生物医学材料及其它领域显示出巨大的潜力，研究多肽自组装有助于更好的研究生命现象，并在微观分子水平设计新材料。通过改变氨基酸排列顺序可设计合成具有不同结构的分子自组装体，以发挥支架材料最好的功能特性。
离子型多肽具有性质截然不同的两个表面，一个亲水面，一个疏水面，它们交替排列，像积木块的楔和孔一样，代表性的多肽如EAK16和RADA16等。疏水性氨基酸Gly可由Leu、Ile、Ala、Val或Tyr替代，以增强其机械强度，更适应某种特定的硬性组织工程或组织修复，如骨组织工程。
成骨生长肽（ALKRQGRTLYGF）是骨组织修复中成骨生长的一个关键因素。生理状态下成骨生长肽(OGP)主要以结合形式，即OGP-OGP结合蛋白(OGPBP)复合物的形式大量存在于人和哺乳动物的血清中。体外实验中，成骨生长肽能显著促进新生骨形成，明显增加成骨活性蛋白碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（BGP）的浓度水平，当应用于体内实验时，成骨生长肽刺激骨生成和血细胞生成。
1979年Senger等首次报道与恶性转化有关的一种包含RGD整合素结合区的磷酸化糖蛋白与肿瘤的关系，称之为转化相关性磷酸蛋白，后将其命名为骨桥蛋白OPN。OPN是由前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞合成的，分泌到前骨质中形成骨。成骨细胞可合成44kDa的高磷酸化蛋白，能调节羟基磷灰石晶体生长，因此，OPN被认为是成骨细胞成熟分化的标志。其相对分子质量约为44kDa，约含300个氨基酸残基，其中Arg–Gly–Asp(RGD)占有很高的比例。OPN通过依赖RGD序列(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ1、α8β1)和非依赖RGD序列(α4β1、α9β1)结合存在于细胞表面上的多种整合素受体，起细胞粘附作用。
目前使用的人工合成的ECM替代物大多为聚合物（polymer）。聚乳酸（PLA）和聚羟基乙酸（PGA）是最常用的两种支架材料。近来聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物（PLGA）得到了深入的研究。具生物活性的玻璃陶瓷、羟基磷灰石（HAP）、钙磷陶瓷，即羟基磷灰石和磷酸三钙（HA/TCP）也可用于骨组织工程。公开号为CN101496911A的中国专利公开了一种在脱钙骨基质上交联肝素所得的骨支架材料，由于其是由哺乳动物的骨经脱钙再交联而得，所以来源有限，且受其生物相容性的限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供连接生物活性多肽的具有促进骨生长活性的新型结构多肽，微观方面，该类多肽的氨基酸残基间通过非共价键相互作用自发组合形成的一类结构明确，构造稳定的分子聚集体或超分子结构。宏观方面，该类多肽溶于总盐离子（含Na、K、Ca、Mg和Cl）浓度≥1mM的水溶液时形成含水量大于99%的水凝胶，可应用于组织工程。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：三种合成多肽中的任意一种，其氨基氨基序列分别满足通式：
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；
其中，Ac为乙酰化N端，
X1为L-氨基酸，氨基类型为疏水性氨基酸：Leu（亮）、Ile（异亮）、Ala（丙）、Gly（甘）或Val（缬）；
X2为L-氨基酸，氨基类型为带负电荷的酸性氨基酸：Asp（天冬）或Glu（谷）；
X3为L-氨基酸，氨基类型为带正电荷的碱性氨基酸：Lys（赖）、Arg（精）或His（组）；
X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3为重复序列，n为氨基酸重复序列的重复次数，n=1或2；
(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列的C端连接1或2个Gly，防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装；
在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。
本发明提供上述多肽的合成方法，合成的多肽可以采用固相合成法合成，包括但不限于Fmoc-SPPS方式、BOC-SPPS方式、片段缩合连接方式。
采用Fmoc-SPPS方式固相合成技术合成上述三种多肽包括以下步骤：树脂采用Fmoc-Amide-Wang Resin，置于反应柱，加入无水二氯甲烷浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，二甲基甲酰胺溶液洗涤。用质量百分比为20%的六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液作为脱帽液，脱除氨基的Fmoc保护基，采用多肽合成仪或者手工合成多肽的方式，由C端向N端分步偶联发明通式所述的所有氨基序列，采用1.5倍树脂摩尔量的HOBT或TBTU活化氨基酸的羧基，1.5-3倍树脂摩尔量DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）作为反应催化剂。称取Fmoc-氨基酸-OH，TBTU或TBTU，六氢吡啶（摩尔量比=1∶1.5∶1）溶于等摩尔量20%DMF的混合液中，加入1.5-3倍树脂摩尔量DIC催化反应进行。依次连接Fmoc-氨基酸-OH，使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，直至氨基序列全部完成。在最后一个Fmoc-氨基酸-OH脱保护后，加入1.2-2倍树脂摩尔量的乙酸酐：吡啶：二甲基甲酰胺=2:1:3(V:V)的混合溶液，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干，由于含Tyr，易产生副反应，采用10-15mL/g树脂的TFA混合液（体积百分比为95:1:2:2的TFA、TIS、EDT和H2O）切割2-4小时。导入3-6倍混合液体积的冰乙醚进行沉淀，离心2-4次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存。经过高效液相色谱（HPLC）分离纯化收集主峰，色谱柱：Spherisorb3-C18，粒径5μm，孔径
Figure BDA00001668851100031
流动相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，10%B--65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末。
本发明还将上述多肽进行自组装获得水凝胶，可用于细胞培养，有望用于组织工程及创伤修复方面的应用。
水凝胶的制备包括以下步骤：称取ELK-8，ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG四种多肽粉末（质量比为4:1:1:1），用去离子水溶解分别配制成1%w/v（10mg/mL）的储存浓度，然后将ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG分别与ELK-8以5:1～1:5（V:V）的比例混合，超声30分钟，用去离子水稀释浓度至≥0.1%，获得ELK-8、ELK-8+ELK-ALK混合液(ALK mix)、ELK-8+ELK-DGR混合液(DGR mix)、ELK-8+ELK-PRG混合液(PRG mix)四种工作液，加入1倍以上体积的总盐离子（含Na、K、Ca、Mg和Cl）浓度≥1mM引发自组装，形成水凝胶支架，应用于骨组织工程。
本发明的有益效果是：本发明的多肽具有自组装形成纳米纤维的特性，形成的水凝胶含水量大于99%，表面积非常大，可以让营养物资、生物活性分子和氧气到达所种植的细胞。生物相容性良好，在体内的降解产物为氨基酸，可被生物体吸收或代谢而无毒副作用。由于本发明的多肽均由固相合成而得，突破了来源的限制。不仅如此，原始肽ELK8的C端连接三种不同的活性多肽序列：成骨生长肽(ALK)、细胞粘附因子(DGR)和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS，其中，在体外实验中，成骨生长肽能显著促进成骨分化和新生骨的形成，明显增加碱性磷酸酶（ALP）的活性和骨钙素的浓度水平，细胞粘附因子与细胞外基质相互作用，有利于种子细胞的粘附和增殖，PRG含两个DGR氨基序列，进一步起到促进细胞粘附增殖的作用。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图说明
图1为本发明合成多肽氨基序列模型图；
图2为本发明合成多肽AFM纳米纤维结构表征图；
图3为本发明合成多肽用于小鼠前成骨细胞培养的茜素红染色图。
具体实施方式
本发明采用三种合成多肽中的任意一种，其氨基氨基序列分别满足通式：
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；
其中，Ac为乙酰化N端，
X1为L-氨基酸，氨基类型为疏水性氨基酸：Leu、Ile、Ala、Gly或Val；
X2为L-氨基酸，氨基类型为带负电荷的酸性氨基酸：Asp或Glu；
X3为L-氨基酸，氨基类型为带正电荷的碱性氨基酸：Lys、Arg或His；
X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3为重复序列，n为氨基酸重复序列的重复次数，n=1或2；
(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列的C端连接1或2个Gly，防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装；
在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。
结合计算机自由能的分析和β折叠的多肽分子设计的替换数据，发明人发现了要达到自组装成纳米纤维水凝胶支架的目的，多肽氨基序列具有如下特点：如图1所示，多肽分子中(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列具有亲水面和疏水面这两个性质截然不同的两个表面，它们交替排列。其中亲水面由带有不同性质电荷的离子型氨基酸组成，往复形成互补离子键，这对形成稳定的多肽膜是非常重要的。分子水平多肽自组装成的β-折叠二级结构非常地稳定。(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列的C端连接1或2个Gly（防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装）。在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽：成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。自组装多肽孔径约5-500nm，这样的纤维网状支架材料类似于细胞外基质，将所培养的细胞包围在其中，为细胞提供纳米级的微环境，有利于细胞的黏附和生长。
本发明合成的多肽可以采用固相合成法合成，包括但不限于Fmoc-SPPS方式，BOC-SPPS方式，片段缩合连接方式。
多肽合成：树脂采用Fmoc-Amide-Wang Resin，置于反应柱，加入无水二氯甲烷浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，二甲基甲酰胺溶液洗涤。用质量百分比为20%的六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液作为脱帽液，脱除氨基的Fmoc保护基，采用多肽合成仪或者手工合成多肽的方式，由C端向N端分步偶联发明通式所述的所有氨基序列，采用1.5倍树脂摩尔量的HOBT或TBTU活化氨基酸的羧基，2倍树脂摩尔量DIC（N,N-二异丙基碳二亚胺）作为反应催化剂。称取Fmoc-氨基酸-OH，TBTU或TBTU，六氢吡啶（摩尔量比=1:1.5:1）溶于等摩尔量20%DMF的混合液中，加入2倍树脂摩尔量DIC催化反应进行。依次连接Fmoc-氨基酸-OH，使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，直至氨基序列全部完成。在最后一个Fmoc-氨基酸-OH脱保护后，加入1.5倍树脂摩尔量的乙酸酐：吡啶：二甲基甲酰胺=2:1:3(V:V)的混合溶液，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干，由于含Tyr，易产生副反应，采用10-15mL/g树脂的TFA混合液（TFA:TIS:EDT:H2O=95:1:2:2,V:V）切割3小时。导入5倍反应液体积的冰乙醚进行沉淀，离心3次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存。经过高效液相色谱（HPLC）分离纯化收集主峰，色谱柱：Spherisorb3-C18，粒径5μm，孔径流动相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，10%B--65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末。
本发明还将上述多肽进行自组装获得水凝胶，可用于细胞培养，有望用于骨组织工程及创伤修复方面的应用。
水凝胶的制备包括以下步骤：称取ELK-8，ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG四种多肽粉末（质量比为4:1:1:1），用去离子水溶解分别配制成1%w/v（10mg/mL）的储存浓度，然后将ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG分别与ELK-8以5:1～1:5（V∶V）的比例混合，超声30分钟，用去离子水稀释浓度至≥0.1%，获得ELK-8、ELK-8+ELK-ALK混合液(ALK mix)、ELK-8+ELK-DGR混合液(DGR mix)、ELK-8+ELK-PRG混合液(PRG mix)四种工作液，加入1倍以上体积的总盐离子（含Na，K，Ca，Mg和Cl）浓度≥1mM引发自组装，形成水凝胶支架，应用于骨组织工程。
本发明合成多肽通式中重复序列(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n可替换氨基酸如下表：
Figure BDA00001668851100062
以下通过实施例对发明进行更进一步的阐述，实施例是对本发明的更进一步的解释，并不限于该实施例，其他未列出的符合氨基酸替换规则并连接三种生物活性多肽的序列化合物，制备和应用也属于本发明的保护范围。
合成实施例1：ELK8-ALK：Ac-LELELKLKGGALKRQGRTLYGF-CONH2的合成
X1为Leu，X2为Glu，X3为Lys。序列重复1次（n=1），重复序列的C端连接2个Gly（防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装）；在合成的LELELKLKGG链段的C端连接成骨生长肽，氨基序列为ALKRQGRTLYGF。
多肽的合成：称取1g Fmoc-Phe-Wang Resin，置于反应柱，加入DCM浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，DMF洗涤。称取0.75g Fmoc-Gly-OH，1.5mg TBTU，1mL六氢吡啶溶于4mL 20%DMF的混合液中，加入0.5mg DIC催化反应进行，将反应液加入到反应柱进行反应。使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，如检测有蓝色或红褐色，说明有游离氨基酸。洗涤，不加脱帽液（20%六氢吡啶/DMF混合液）重复此步操作，直至氨基序列全部完成。依次偶联Tyr，Leu，Thr，Arg，Gly，Gln，Arg，Lys，Leu，Ala，Gly，Gly，Lys，Leu，Lys，Leu，Glu，Leu，Glu，Leu。在最后一个Fmoc-Leu-OH脱保护后，加入乙酸酐：吡啶：二甲基甲酰胺=2:1:3的溶液12mL，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干。由于含Tyr，易产生副反应，采用10mL TFA混合液（TFA:TIS:EDT:H2O=95:1:2:2,V:V）切割3小时，导入20mL冰乙醚进行沉淀，离心3次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存。经过HPLC分离纯化收集主峰，色谱柱：Spherisorb3-C18，粒径5μm，孔径
Figure BDA00001668851100071
流动相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，10%B--65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末8.6g。
通过以上合成方式可以合成以下多肽：
X1为Leu，X2为Asp，X3为Arg。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-LDLDLRLR-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
X1为Leu，X2为Asp，X3为Lys。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-LDLDLKLK-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
X1为Leu，X2为Glu，X3为Lys。序列重复2次（n=2）时，氨基序列为：Ac-LELELKLKLELELKLK-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
合成实施例2：ELK8-DGR：Ac-LELELKLKGGDGRGDSVAYG-CONH2的合成
X1为Leu，X2为Glu，X3为Lys。序列重复1次（n=1），重复序列的C端连接2个Gly（防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装）；在合成的LELELKLKGG链段的C端连接细胞粘附因子，氨基序列为DGRGDSVAYG。
多肽的合成：称取0.75g Fmoc-Gly-Wang Resin，置于反应柱，加入DCM浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，DMF洗涤。称取1.5g Fmoc-Tyr-OH，1.5mg TBTU，1mL六氢吡啶溶于4mL 20%DMF的混合液中，加入0.5mg DIC催化反应进行，将反应液加入到反应柱进行反应。使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，如检测有蓝色或红褐色，说明有游离氨基酸。洗涤，不加脱帽液（20%六氢吡啶/DMF混合液）重复此步操作，直至氨基序列全部完成。依次偶联Ala，Val，Ser，Asp，Gly，Arg，Gly，Asp，Gly，Gly，Lys，Leu，Lys，Leu，Glu，Leu，Glu，Leu。在最后一个Fmoc-Leu-OH脱保护后，加入乙酸酐∶吡啶∶二甲基甲酰胺=2∶1∶3的溶液12mL，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干。采用10mLTFA混合液（TFA:TIS:EDT:H2O=95:1:2:2,V:V）切割3小时，导入20mL冰乙醚进行沉淀，离心3次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存。经过HPLC分离纯化收集主峰，色谱柱：Spherisorb3-C18，粒径5μm，孔径
Figure BDA00001668851100081
流动相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，10%B--65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末9.1g。
通过以上合成方式可以合成以下多肽：
X1为Ala，X2为Asp，X3为Arg。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-ADADARAR-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
X1为Ala，X2为Asp，X3为Lys。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-ADADAKAK-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
X1为Ala，X2为Glu，X3为Lys。序列重复2次（n=2）时，氨基序列为：Ac-AEAEAKAKAEAEAKAK-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
合成实施例3：ELK8-PRG：Ac-LELELKLKGPRGDSGYRGDS-CONH2的合成
X1为Leu，X2为Glu，X3为Lys。序列重复1次（n=1），重复序列的C端连接1个Gly（防止后续连接的生物活性肽影响重复序列的自组装）；在合成的LELELKLKGG链段的C端连接含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列为PRGDSGYRGDS。
多肽的合成：称取1g Fmoc-Ser-Wang Resin，置于反应柱，加入DCM浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，DMF洗涤。称取1.2g Fmoc-Asp-OH，1.5mg TBTU，1mL六氢吡啶溶于4mL 20%DMF的混合液中，加入0.5mg DIC催化反应进行，将反应液加入到反应柱进行反应。使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，如检测有蓝色或红褐色，说明有游离氨基酸。洗涤，不加脱帽液（20%六氢吡啶/DMF混合液）重复此步操作，直至氨基序列全部完成。依次偶联Gly，Arg，Tyr，Gly，Ser，Asp，Gly，Arg，Pro，Gly，Lys，Leu，Lys，Leu，Glu，Leu，Glu，Leu。在最后一个Fmoc-Leu-OH脱保护后，加入乙酸酐∶吡啶∶二甲基甲酰胺=2∶1∶3的溶液12mL，，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂。甲醇洗涤3次，把树脂抽干，采用10mLTFA混合液（TFA:TIS:EDT:H2O=95:1:2:2,V:V）切割3小时。导入20mL冰乙醚（纯冰乙醚溶液）进行沉淀，离心3次收集沉淀，真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存。经过HPLC分离纯化收集主峰，色谱柱：Spherisorb3-C18，粒径5μm，孔径
Figure BDA00001668851100091
流动相：A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，10%B--65%B。冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末10.04g。
通过以上合成方式可以合成以下多肽：
X1为Ile，X2为Asp，X3为Arg。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-IDIDIRIR-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
X1为Ile，X2为Asp，X3为Lys。序列重复1次（n=1）时，氨基序列为：Ac-IDIDIKIK-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
X1为Ile，X2为Glu，X3为Lys。序列重复2次（n=2）时，氨基序列为：Ac-IEIEIKIKIEIEIKIK-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
本行业的技术人员也可以很容易合成新的符合本发明的氨基序列，符合替换列表的氨基酸替换产生的所有序列，都在本发明保护范围内。
多肽合成实验材料及缩写表示：
Fmoc-SPPS：利用Fmoc-保护性氨基酸组装合成的固相多肽合成（Solid phasepeptide synthesis简写为SPPS）方法
BOC-SPPS：利用BOC-保护性氨基酸组装合成的固相多肽合成（Solid phase peptidesynthesis简写为SPPS）方法
Fmoc-：9-芴甲氧羰基
BOC-：叔丁氧羰基
Fmoc-Amide-Wang Resin：氨基肽合成树脂，购自吉尔生化（上海）有限公司
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺
TFA：三氟乙酸
TIS：苯甲硫醚
ACN：乙腈
EDT：1，2-二巯基乙醇
HOBT：1-羟基苯并三唑(HOBT)
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸
Fmoc-氨基酸（纯度98%以上，购自吉尔生化（上海）有限公司）如下：Fmoc-Leu-OH（Fmoc-亮氨酸）；Fmoc-Glu-OH（Fmoc-谷氨酸）；Fmoc-Lys-OH（Fmoc-赖氨酸）；Fmoc-Gly-OH（Fmoc-甘氨酸）；Fmoc-Ala-OH（Fmoc-丙氨酸）；Fmoc-Arg-OH（Fmoc-精氨酸）；Fmoc-Gln-OH（Fmoc-谷氨酰胺）；Fmoc-Thr-OH（Fmoc-苏氨酸）；Fmoc-Tyr-OH（Fmoc-酪氨酸）；Fmoc-Phe-OH（Fmoc-苯丙氨酸）；Fmoc-Ser-OH（Fmoc-丝氨酸）；Fmoc-Val-OH（Fmoc-缬氨酸）；Fmoc-Pro-OH（Fmoc-脯氨酸）。
凝胶制备实施例1
称取ELK-8多肽粉末80mg，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG三种多肽粉末各20mg，用去离子水溶解分别配制成1%w/v（10mg/mL）的储存浓度，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG分别和ELK-8以1:1（V:V）的比例混合，超声30分钟，去离子水稀释浓度至0.2%，获得ELK-8，ELK-8+ELK-ALK混合液(ALK mix)，ELK-8+ELK-DGR混合液(DGR mix)，ELK-8+ELK-PRG混合液(PRG mix)四种工作液，加入4倍体积的0.9%的生理盐水引发自组装，形成水凝胶支架。
凝胶制备实施例2
称取ELK-8多肽粉末80mg，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG三种多肽粉末各20mg，用去离子水溶解分别配制成1%w/v（10mg/mL）的储存浓度，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG分别和ELK-8以1:1（V:V）的比例混合，超声30分钟，去离子水稀释浓度至0.2%，获得ELK-8，ELK-8+ELK-ALK混合液(ALK mix)，ELK-8+ELK-DGR混合液(DGR mix)，ELK-8+ELK-PRG混合液(PRG mix)四种工作液，加入4倍体积的改良型α-培养基引发自组装，形成水凝胶支架。
凝胶制备实施例3
称取ELK-8多肽粉末80mg，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG三种多肽粉末各20mg，用去离子水溶解分别配制成1%w/v（10mg/mL）的储存浓度，ELK-ALK，ELK-DGR，ELK-PRG分别和ELK-8以1:1（V:V）的比例混合，超声30分钟，去离子水稀释浓度至0.2%，获得ELK-8，ELK-8+ELK-ALK混合液(ALK mix)，ELK-8+ELK-DGR混合液(DGR mix)，ELK-8+ELK-PRG混合液(PRG mix)四种工作液，加入4倍体积的10mM pH7.4PBS引发自组装，形成水凝胶支架。
应用实施例1：小鼠前成骨细胞胶上培养及增值分化实验
取200μL 0.2%各多肽水溶液至24孔板，加入培养液引发自组装，更换培养液（约2/3到3/4）两至三次来平衡pH，将平板放置于37℃培养箱中过夜，以备第二天使用。收集细胞，调节密度为2×104cell／mL，小心地将细胞悬浮液添加到水凝胶上，48h后更换成成骨培养液(基本培养液中添加10mM磷酸甘油，0.28mM Vc，0.1μmmol/L地塞米松)。每2～3d更换一次培养基，连续培养14d。用CCK-8检测细胞存活情况，碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测ALP活性，小鼠骨钙素(OT)试剂盒检测骨钙素含量，茜素红S染色检测支架上的钙质沉积。
应用实施例2：小鼠骨髓间基质干细胞在普通培养孔胶内培养及增值分化实验
将500μL 0.8%细胞培养水凝胶原液和等体积20%（w/v）的无菌蔗糖溶液配制成2×的水凝胶；离心收集胰蛋白酶消化过的细胞，用浓度10%（w/v）的无菌蔗糖溶液洗涤2次，取2×终浓度的细胞，即4×104cell／mL重新悬浮在10%的无菌蔗糖溶液中；添加等体积的0.4%的蔗糖多肽混合液到4×104cell／mL浓度的细胞悬浮液中，混合均匀；取200μL各多肽—细胞悬液至24孔板，加入培养液引发自组装，更换培养液（约2/3到3/4）两至三次来平衡pH，48h后更换成成骨培养液(基本培养液中添加10mM磷酸甘油，0.28mM Vc，0.1μmmol/L地塞米松)。每2～3d更换一次培养基，连续培养14d。用CCK-8检测细胞存活情况，碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测ALP活性，茜素红S染色检测支架上的钙质沉积。
应用实施例3：小鼠成骨细胞在嵌套式培养孔中进行胶内培养培养及增值分化实验
将500μL 0.8%细胞培养水凝胶原液和等体积20%（w/v）的无菌蔗糖溶液配制成2×的水凝胶；离心收集胰蛋白酶消化过的细胞，用浓度10%（w/v）的无菌蔗糖溶液洗涤2次，取2×终浓度的细胞，即4×104cell／mL重新悬浮在10%的无菌蔗糖溶液中；添加等体积的0.4%的蔗糖多肽混合液到4×104cell／mL浓度的细胞悬浮液中，混合均匀；取100μL培养液至嵌套式培养孔底部（24孔的BD FalconTM Cell Culture Inserts），添加等体积的各多肽—细胞悬液至嵌套式培养孔中，沿着嵌套孔边缘轻轻将培养液注入到凝胶上部以促使水凝胶凝固。更换培养液（约2/3到3/4）两至三次来平衡pH，48h后更换成成骨培养液(基本培养液中添加10mM磷酸甘油，0.28mM Vc，0.1μmmol/L地塞米松)。每2～3d更换一次培养基，连续培养14d。用CCK-8检测细胞存活情况，碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测ALP活性，小鼠骨钙素(OT)试剂盒检测骨钙素含量，茜素红S染色检测支架上的钙质沉积。
Figure IDA00002107402000011
Figure IDA00002107402000021

Claims (4)

1.一种具有促成骨生长的生物活性多肽，其特征在于：氨基氨基序列满足下列通式中的任意一种：
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-ALKRQGRTLYGF-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-GG-DGRGDSVAYG-CONH2；
Ac-(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n-G-PRGDSGYRGDS-CONH2；
其中，Ac为乙酰化N端，
X1为L-氨基酸，氨基类型为疏水性氨基酸：Leu、Ile、Ala、Gly或Val；
X2为L-氨基酸，氨基类型为带负电荷的酸性氨基酸：Asp或Glu；
X3为L-氨基酸，氨基类型为带正电荷的碱性氨基酸：Lys、Arg或His；
X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3为重复序列，n为氨基酸重复序列的重复次数，n=1或2；
(X1-X2-X1-X2-X1-X3-X1-X3)n重复序列的C端连接1或2个Gly；
在Gly的C端连接三种不同的生物活性肽成骨生长肽、细胞粘附因子和含两个DGR氨基序列的PRG，氨基序列分别为ALKRQGRTLYGF、DGRGDSVAYG和PRGDSGYRGDS。
2.一种权利要求1所述的具有促成骨生长的生物活性多肽的合成方法，其特征在于：采用固相合成法合成，包括但不限于Fmoc-SPPS方式、BOC-SPPS方式、片段缩合连接方式。
3.根据权利要求2所述的具有促成骨生长的生物活性多肽的合成方法，其特征在于所述的Fmoc-SPPS方式包括以下步骤：树脂采用Fmoc-Amide-Wang Resin，置于反应柱，加入无水二氯甲烷浸没树脂，浸泡溶胀30min后抽干，二甲基甲酰胺溶液洗涤；用质量百分比为20%的六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液作为脱帽液，由C端向N端分步偶联发明通式所述的所有氨基序列，采用1.5倍树脂摩尔量的HOBT或TBTU活化氨基酸的羧基，1.5-3倍树脂摩尔量DIC作为反应催化剂；依次连接Fmoc-氨基酸-OH，使用Kaiser方法检测每步是否连接完全，直至氨基序列全部完成；在最后一个Fmoc-氨基酸-OH脱保护后，加入1.2-2倍树脂摩尔量的乙酸酐：吡啶：二甲基甲酰胺=2:1:3(V:V)的混合溶液，摇荡30分钟，对裸露的氨基进行乙酰化保护，成为多肽树脂；甲醇洗涤3次，把树脂抽干，采用10-15mL/g树脂的TFA混合液切割2-4小时，所述TFA混合液的体积百分比为95:1:2:2的TFA、TIS、EDT和H2O；导入3-6倍混合液体积的冰乙醚进行沉淀，离心2-4次收集沉淀，真空干燥24小时；固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体即粗品，-20℃保存，冷冻干燥得到纯度95%以上的多肽粉末。
4.一种权利要求1所述的具有促成骨生长的生物活性多肽进行自组装获得水凝胶的方法，其特征在于包括以下步骤：称取ELK-8，ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG四种多肽粉末，质量比为4:1:1:1，用去离子水溶解分别配制成1%w/v的储存浓度，然后将ELK-ALK，ELK-DGR和ELK-PRG分别与ELK-8以5:1～1:5的体积比例混合，超声30分钟，用去离子水稀释浓度至≥0.1%，获得ELK-8、ELK-8+ELK-ALK混合液、ELK-8+ELK-DGR混合液、ELK-8+ELK-PRG混合液四种工作液，加入1倍以上体积的总盐离子，浓度≥1mM，引发自组装，形成水凝胶支架。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104497107A (zh) * 2014-12-08 2015-04-08 重庆医科大学 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN104693277A (zh) * 2015-03-26 2015-06-10 罗忠礼 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN108659103A (zh) * 2018-08-30 2018-10-16 安徽工程大学 一种离子互补型自组装肽及其制备方法
CN110551180A (zh) * 2019-08-21 2019-12-10 华南理工大学 一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用
CN111420118A (zh) * 2020-03-05 2020-07-17 重庆大学 一种具有ros响应的钛基活性骨植入体及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101153503A (zh) * 2006-09-28 2008-04-02 赵大予 墙用隔音隔热石塑龙骨和施工方法
WO2008039483A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modified self-assembling peptides
CN101873869A (zh) * 2007-10-26 2010-10-27 国家免疫学研究所 可生物降解的聚合物支架及其制备方法
CN102286078A (zh) * 2011-07-13 2011-12-21 中国药科大学 一种多肽hm-3的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008039483A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modified self-assembling peptides
CN101153503A (zh) * 2006-09-28 2008-04-02 赵大予 墙用隔音隔热石塑龙骨和施工方法
CN101873869A (zh) * 2007-10-26 2010-10-27 国家免疫学研究所 可生物降解的聚合物支架及其制备方法
CN102286078A (zh) * 2011-07-13 2011-12-21 中国药科大学 一种多肽hm-3的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王韵晴等: "自组装多肽支架材料的研究进展", 《材料科学与工程学报》, vol. 30, no. 2, 30 April 2012 (2012-04-30), pages 324 - 328 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104497107A (zh) * 2014-12-08 2015-04-08 重庆医科大学 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN104497107B (zh) * 2014-12-08 2017-09-19 重庆医科大学 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN104693277A (zh) * 2015-03-26 2015-06-10 罗忠礼 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN104693277B (zh) * 2015-03-26 2018-02-13 罗忠礼 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
CN108659103A (zh) * 2018-08-30 2018-10-16 安徽工程大学 一种离子互补型自组装肽及其制备方法
CN110551180A (zh) * 2019-08-21 2019-12-10 华南理工大学 一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用
CN111420118A (zh) * 2020-03-05 2020-07-17 重庆大学 一种具有ros响应的钛基活性骨植入体及其制备方法
CN111420118B (zh) * 2020-03-05 2022-05-17 重庆大学 一种具有ros响应的钛基活性骨植入体及其制备方法

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