CN111420118B - 一种具有ros响应的钛基活性骨植入体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体及其制备方法，属于医用材料技术领域。该植入体的制备方法包括制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片、制备硼酸酯键、制备硼酸酯键‑成骨生长肽复合物及制备植入体四个步骤。本发明中骨植入体具有针对性、智能性，以及更优的生物相容性和骨整合性，与传统的生物材料改性方法相比，该骨植入体中Apt 19S的释放量在24h就能达到MSCs最佳招募浓度，且体内实验和体外实验都进一步证明了修饰有Apt 19S的钛基材能够将MSCs迁移至骨缺损部位，具有更好的促进骨相关细胞成骨分化的能力，加速骨修复。该具有ROS响应的钛基活性骨植入体制备方法简单易操作，适合扩大化生产。

Description

一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体及其制备方法。
背景技术
医用钛基材料基于其良好的力学性能、耐腐蚀性和生物相容性，在临床手术中被广泛应用。然而，惰性的二氧化钛表面使得其缺乏与周围骨组织的整合性，特别是在病理性植入微环境中，如对骨质疏松患者而言，由于其骨的低骨量、高脆性，更容易发生早期材料的松动和移位，导致手术失败。
为了提高植入体与周围骨组织的整合性，许多物理方法(如离子注入、物理气相沉积)、化学方法(如酸碱腐蚀、阳极氧化)和生物化学方法(如细胞外基质组分、生长因子及多肽等)被引入到骨植入体的表面改性中。但如何同时赋予钛基材料良好的生物相容性和骨诱导性则是研究者们需要解决的问题。
骨髓间充质干细胞(MSCs)具有分化成成骨细胞的特性，可为骨生长及骨修复提供成长来源。其在骨髓环境中由于骨髓本身的特性并不会直接分化成成骨相关细胞，而是需要在特定生理条件下由骨髓丰富的毛细血管转移至骨损伤部位进行分化。因此，骨组织工程中需人为促进有限数目的MSCs在骨损伤部位大量聚集并定向分化，从而达到快速修复骨损伤的目的。
Apt 19S作为一种DNA适配体可以特异性识别多能干细胞，具有捕获干细胞的能力。在骨组织中可将MSCs募集到组织缺损部位，促骨修复。但如何实现Apt 19S在组织缺损部位对MSCs的募集，实现植入体周围骨的重构及愈合，进而实现更好的骨整合，还需要做进步研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体的制备方法；目的之二在于提供一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片；
(2)制备硼酸酯键；
(3)制备硼酸酯键-成骨生长肽复合物：将步骤(2)中制备的硼酸酯键溶解后形成溶液I，将成骨生长肽溶解后形成溶液II，将所述溶液I和溶液II混合搅拌反应至少10h，经透析、冷冻干燥，即可；所述成骨生长肽氨基酸序列的3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团；
(4)将步骤(3)中制备的硼酸酯键-成骨生长肽复合物溶解后形成溶液III，将核酸适配体溶解后形成溶液IV，将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入所述溶液III中至少10h后，取出再浸入所述溶液IV中至少10h，即可；所述核酸适配体基因序列的3’端修饰有带有任一碱基的RNA分子；所述核酸适配体的基因序列如SEO ID No：1所示。
优选地，步骤(1)中，所述制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片的方法为电化学沉积法。
优选地，所述制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片的方法如下：将纯钛片依次用400#、1000#、2000#的砂纸打磨光滑，然后依次经碱液、无水乙醇、去离子水分别超声清洗20-40min，再以氟酸/硝酸溶液刻蚀至经超声清洗后的纯钛片出现表面粗糙的拓扑结构，最后以经刻蚀后的纯钛片作为电化学反应的阴极，铂片作为阳极，采用直流电在含氯化钙、磷酸二氢铵、氯化钠和柠檬酸钠的电解质溶液中阴极氧化，即可。
优选地，步骤(2)中，所述制备硼酸酯键的方法如下：
A、将对硝基苯氯甲酸酯溶解于四氢呋喃中，0℃下充氮气，获得溶液V；
B、将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺溶解于四氢呋喃中，获得溶液VI；
C、在冰浴条件下，通过10-20min将溶液V在搅拌下逐滴加入溶液VI中，然后在室温下以300-800r/min的速度搅拌反应3-4h，旋干，以二氯甲烷溶解旋干后的产物，获得黄色溶液，依次以1M的HCl、饱和NaCl溶液洗涤后再以NaHCO3溶液洗涤至所述黄色溶液的颜色变为浅黄色，最后过硅胶柱，以石油醚和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，旋干后制得硼酸酯键。
优选地，所述对硝基苯氯甲酸酯、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的质量体积比为0.47:0.5:0.04:0.6，所述质量体积比的单位为g:g:g:mL。
优选地，步骤C中，所述梯度洗脱具体为：首先以石油醚和二氯甲烷按体积比1:4形成的混合液进行洗脱，然后以石油醚和二氯甲烷按体积比3:7形成的混合液进行洗脱，最后以石油醚和二氯甲烷按体积比2:3形成的混合液进行洗脱。
优选地，步骤(3)中，所述成骨生长肽氨基酸序列如SEO ID No：2所示。
优选地，步骤(3)中，所述硼酸酯键和成骨生长肽的质量比为1:6-10。
优选地，步骤(3)中，用于溶解所述硼酸酯键的溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二氧六环或二氯甲烷中的一种；用于溶解所述成骨生长肽的溶剂为饱和NaHCO3溶液、磷酸盐缓冲溶液、三蒸水或二甲基甲酰胺中的一种。
优选地，步骤(3)中，所述透析时透析袋的截留分子量为500-1000D。
优选地，步骤(4)中，所述硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体的质量比为2:1-4:3。
优选地，步骤(4)中，用于溶解硼酸酯键-成骨生长肽复合物或核酸适配体的溶剂为饱和NaHCO3溶液、磷酸盐缓冲溶液或三蒸水中的一种。
2、由所述的方法制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体及其制备方法，本发明中骨植入体具有针对性、智能性，以及更优的生物相容性和骨整合性，与传统的生物材料改性方法相比，该骨植入体中Apt 19S的释放量在24h就能达到MSCs最佳招募浓度，且体内实验和体外实验都进一步证明了修饰有Apt 19S的钛基材能够将MSCs迁移至骨缺损部位，具有更好的促进骨相关细胞成骨分化的能力，加速骨修复。该具有ROS响应的钛基活性骨植入体制备方法简单易操作，适合扩大化生产。
该方法中具有ROS响应的钛基活性骨植入体构建示意图如图1所示，其中以硼酸酯键为桥梁，通过其一端的硼酸基团与3’端修饰有带有任一碱基的RNA分子的核酸适配体(Apt 19S)的邻位羟基配位结合，另一端的酯键与3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团的成骨生长肽氨基酰胺反应结合，将成骨生长肽与Apt 19S进行连接，然后再通过成骨生长肽5’端修饰有两个磷酸根基团与钛片表面沉积有羟基磷灰石反应，成功地将Apt19S-硼酸酯键-成骨生长肽引入到表面沉积有羟基磷灰石的钛片表面，在其表面构建了ROS响应的干细胞招募体系。由于硼酸酯键中酯键与成骨生长肽氨基酰胺反应所生成的酰胺键具有ROS响应性，当该植入体所处的环境中ROS水平较高时，在ROS的持续作用下该酰胺键断裂，从而释放出Apt 19S，实现对Apt 19S局部浓度的提升，达到其对MSCs的招募浓度，将MSCs招募至骨缺损部位，然后在成骨生长肽和羟基磷灰石协同作用下促进成骨分化，最终实现植入体周围骨的重构及愈合。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明中ROS响应的钛基活性骨植入体构建示意图；
图2为本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体在模拟骨质疏松患者病理微环境中Apt 19S的累积释放量测试结果图；
图3为实施例1中制备的Ti片、Ti/HA、Ti/HA/OGP和Ti/HA/OGP/Ap的SEM图；(图3中a为Ti片的SEM图、图3中b为Ti/HA的SEM图、图3中c为Ti/HA/OGP的SEM图、图3中d为Ti/HA/OGP/Apt的SEM图)
图4为发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体对MSCs迁移的调控能力测试结果图；
图5为本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体对MSCs成骨分化的调控能力测试结果图；(图5中A为成骨相关蛋白的WB统计图，图5中B和图5中C均为灰度值统计定量分析图)
图6为发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体诱导骨质疏松症动物模型体内骨生成测试结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备具有ROS响应的钛基活性骨植入体(Ti/HA/OGP/Apt)
(1)制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片(Ti/HA)：
将纯钛片(直径：15mm；厚度：3mm)依次用400#、1000#、2000#的砂纸打磨光滑，然后依次经碱液、无水乙醇、去离子水分别超声清洗30min，再以氟酸/硝酸溶液刻蚀3min，使经超声清洗后的纯钛片出现表面粗糙的拓扑结构，最后以经刻蚀后的纯钛片作为电化学反应的阴极，铂片作为阳极，采用直流电在含氯化钙、磷酸二氢铵、氯化钠和柠檬酸钠的电解质溶液中阴极氧化，即可；
(2)制备硼酸酯键；
A、将0.47g对硝基苯氯甲酸酯溶解于15mL四氢呋喃中，0℃下充氮气，获得溶液V；
B、将0.5g 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、0.04g 4-二甲氨基吡啶和0.6mL三乙胺溶解于5mL四氢呋喃中，获得溶液VI；
C、在冰浴条件下，通过10min将溶液V在搅拌下逐滴加入溶液VI中，然后在室温下以500r/min的速度搅拌反应4h，旋干，以二氯甲烷溶解旋干后的产物，获得黄色溶液，依次以1M的HCl、饱和NaCl溶液洗涤后再以NaHCO3溶液洗涤至所述黄色溶液的颜色变为浅黄色，最后过硅胶柱，依次以石油醚和二氯甲烷按体积比1:4形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比3:7形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比2:3形成的混合液进行梯度洗脱，旋干后制得硼酸酯键；
(3)制备硼酸酯键-成骨生长肽复合物：按步骤(2)中制备的硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)的质量比1:7准备硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)，其中，成骨生长肽(OGP)氨基酸序列的3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团，其氨基酸序列为Gly Gly Phe GlyTyr Leu Thr Arg Gly Gln Arg Lys Leu Ala Gly Gly Gly Gly，然后将硼酸酯键溶解于二甲亚砜后形成溶液I，将成骨生长肽(OGP)溶解于饱和NaHCO3溶液后形成溶液II，将溶液I和溶液II混合搅拌反应12h，经截留分子量为500D的透析袋透析、冷冻干燥，即可；
(4)按步骤(3)中制备的硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)的质量比为20:11准备硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)，其中，核酸适配体(Apt19S)基因序列的3’端修饰有带有A碱基的RNA分子，其基因序列为aggtcagatgaggagggggacttaggactgggtttatgacctatgcgtg，然后将硼酸酯键-成骨生长肽复合物溶解于磷酸盐缓冲溶液后形成溶液III，将核酸适配体(Apt 19S)溶解于磷酸盐缓冲溶液后形成溶液IV，最后将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入溶液III中12h后，取出再浸入所述溶液IV中12h，即可。
实施例2
制备具有ROS响应的钛基活性骨植入体
(1)制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片：
将纯钛片(直径：15mm；厚度：3mm)依次用400#、1000#、2000#的砂纸打磨光滑，然后依次经碱液、无水乙醇、去离子水分别超声清洗20min，再以氟酸/硝酸溶液刻蚀3min，使经超声清洗后的纯钛片出现表面粗糙的拓扑结构，最后以经刻蚀后的纯钛片作为电化学反应的阴极，铂片作为阳极，采用直流电在含氯化钙、磷酸二氢铵、氯化钠和柠檬酸钠的电解质溶液中阴极氧化，即可；
(2)制备硼酸酯键；
A、将0.47g对硝基苯氯甲酸酯溶解于15mL四氢呋喃中，0℃下充氮气，获得溶液V；
B、将0.5g 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、0.04g 4-二甲氨基吡啶和0.6mL三乙胺溶解于5mL四氢呋喃中，获得溶液VI；
C、在冰浴条件下，通过15min将溶液V在搅拌下逐滴加入溶液VI中，然后在室温下以800r/min的速度搅拌反应3h，旋干，以二氯甲烷溶解旋干后的产物，获得黄色溶液，依次以1M的HCl、饱和NaCl溶液洗涤后再以NaHCO3溶液洗涤至所述黄色溶液的颜色变为浅黄色，最后过硅胶柱，依次以石油醚和二氯甲烷按体积比1:4形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比3:7形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比2:3形成的混合液进行梯度洗脱，旋干后制得硼酸酯键；
(3)制备硼酸酯键-成骨生长肽复合物：按步骤(2)中制备的硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)的质量比1:10准备硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)，其中，成骨生长肽(OGP)氨基酸序列的3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团，其氨基酸序列为Gly Gly Phe GlyTyr Leu Thr Arg Gly Gln Arg Lys Leu Ala Gly Gly Gly Gly，然后将硼酸酯键溶解于二氯甲烷后形成溶液I，将成骨生长肽(OGP)溶解于磷酸盐缓冲溶液后形成溶液II，将溶液I和溶液II混合搅拌反应14h，经截留分子量为1000D的透析袋透析、冷冻干燥，即可；
(4)按步骤(3)中制备的硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)的质量比为4:3准备硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)，其中，核酸适配体(Apt19S)基因序列的3’端修饰有带有G碱基的RNA分子，其基因序列为aggtcagatgaggagggggacttaggactgggtttatgacctatgcgtg，然后将硼酸酯键-成骨生长肽复合物溶解于三蒸水后形成溶液III，将核酸适配体(Apt 19S)溶解于饱和NaHCO3溶液后形成溶液IV，最后将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入溶液III中14h后，取出再浸入所述溶液IV中14h，即可。
实施例3
制备具有ROS响应的钛基活性骨植入体
(1)制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片：
将纯钛片(直径：15mm；厚度：3mm)依次用400#、1000#、2000#的砂纸打磨光滑，然后依次经碱液、无水乙醇、去离子水分别超声清洗40min，再以氟酸/硝酸溶液刻蚀3min，使经超声清洗后的纯钛片出现表面粗糙的拓扑结构，最后以经刻蚀后的纯钛片作为电化学反应的阴极，铂片作为阳极，采用直流电在含氯化钙、磷酸二氢铵、氯化钠和柠檬酸钠的电解质溶液中阴极氧化，即可；
(2)制备硼酸酯键；
A、将0.47g对硝基苯氯甲酸酯溶解于15mL四氢呋喃中，0℃下充氮气，获得溶液V；
B、将0.5g 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、0.04g 4-二甲氨基吡啶和0.6mL三乙胺溶解于5mL四氢呋喃中，获得溶液VI；
C、在冰浴条件下，通过20min将溶液V在搅拌下逐滴加入溶液VI中，然后在室温下以300r/min的速度搅拌反应4h，旋干，以二氯甲烷溶解旋干后的产物，获得黄色溶液，依次以1M的HCl、饱和NaCl溶液洗涤后再以NaHCO3溶液洗涤至所述黄色溶液的颜色变为浅黄色，最后过硅胶柱，依次以石油醚和二氯甲烷按体积比1:4形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比3:7形成的混合液，石油醚和二氯甲烷按体积比2:3形成的混合液进行梯度洗脱，旋干后制得硼酸酯键；
(3)制备硼酸酯键-成骨生长肽复合物：按步骤(2)中制备的硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)的质量比1:6准备硼酸酯键和成骨生长肽(OGP)，其中，成骨生长肽(OGP)氨基酸序列的3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团，其氨基酸序列为Gly Gly Phe GlyTyr Leu Thr Arg Gly Gln Arg Lys Leu Ala Gly Gly Gly Gly，然后将硼酸酯键溶解于二甲基甲酰胺后形成溶液I，将成骨生长肽(OGP)溶解于三蒸水后形成溶液II，将溶液I和溶液II混合搅拌反应13h，经截留分子量为800D的透析袋透析、冷冻干燥，即可；
(4)按步骤(3)中制备的硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)的质量比为8:5准备硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体(Apt 19S)，其中，核酸适配体(Apt19S)基因序列的3’端修饰有带有C碱基的RNA分子，其基因序列为aggtcagatgaggagggggacttaggactgggtttatgacctatgcgtg，然后将硼酸酯键-成骨生长肽复合物溶解于磷酸盐缓冲溶液后形成溶液III，将核酸适配体(Apt 19S)溶解于三蒸水后形成溶液IV，最后将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入溶液III中13h后，取出再浸入所述溶液IV中13h，即可。
实施例4
测试本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体在模拟骨质疏松患者病理微环境中Apt 19S的累积释放量
(1)制备含FITC标记了Apt 19S的具有ROS响应的钛基活性骨植入体
与实施例1的区别在于，将步骤(4)中的Apt 19S替换为FITC标记Apt 19S(FITC-Apt19S)，制得含FITC标记了Apt 19S的具有ROS响应的钛基活性骨植入体；
(2)将步骤(1)中制备的含FITC标记了Apt 19S的具有ROS响应的钛基活性骨植入体分别置于pH为7.4的PBS缓冲溶液中和含0.3mM H2O2的PBS缓冲溶液(模拟骨质疏松患者病理微环境)中，37℃下孵育，在相应的时间点取出培养液进行荧光强度检测，根据释放荧光强度及初始的累积量做出FITC-Apt 19S的释放曲线，结果如图2所示，由图2可知，在PBS环境下FITC-Apt 19S缓慢释放且释放量极低；而在H2O2环境下，FITC-Apt 19S在前24h迅速释放，24h后释放速率减缓，其累计释放量可达88nM左右。这是由于本发明植入体中硼酸酯键中酯键与成骨生长肽氨基酰胺反应所生成的酰胺键具有ROS响应性，在H2O2条件下该酰胺键断裂，使得FITC-Apt 19S迅速大量释放，说明该植入体界面具有ROS响应性释放FITC-Apt19S的特点。
实施例5
测试本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体对MSCs迁移的调控能力
以实施例1步骤(1)中打磨后的Ti片、实施例1步骤(1)中制备的表面沉积有羟基磷灰石的钛片(Ti/HA)、实施例1步骤(4)中通过将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入溶液III中12h后形成的修饰有成骨生长肽的Ti片(Ti/HA/OGP)及实施例1中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体(Ti/HA/OGP/Apt)为测试样，各测试样的SEM图如图3所示，由图3可知，其中，图3中a为Ti片的SEM图，可知未经任何修饰的纯钛表面较为平坦，有少许划痕；图3中b为Ti/HA的SEM图，可知沉积了羟基磷灰石后，表面粗糙，有松散的颗粒状物质覆盖，且颗粒较大；图3中c为Ti/HA/OGP的SEM图，可知修饰了OGP后，表面覆盖颗粒体积小而紧实；图3中d为Ti/HA/OGP/Apt的SEM图，可知修饰了OGP和Apt后，表面更加致密。
在24孔板中，将第三代MSCs以3×104个/cm2的初始浓度接种分别接种至Ti片、Ti/HA、Ti/HA/OGP和Ti/HA/OGP/Apt表面，更换含有1％FBS的培养基，饥饿细胞12h。用10μL无菌枪头在各样本表面划出“井”字形划痕，弃掉培养基，用无菌PBS清洗3次，去除损伤细胞，然后向孔板中重新加入新鲜培养基后置于37℃，5％CO2的培养箱中分别培养0h、12h、24h。取出孔板，用罗丹明标记的鬼笔环肽染细胞骨架，Hoechst 33258染细胞核。测试结果如图4所示，细胞培养0h时，各组均存在平整的划痕缝隙；培养12h时，各组细胞均开始铺展，Ti组与Ti/HA组较0h无变化，Ti/HA/OGP组与Ti/HA/OGP/Apt组细胞开始向中间空白部位迁移；培养24h时，Ti组与Ti/HA组有少量细胞越过划痕边缘，Ti/HA/OGP组与Ti/HA/OGP/Apt组细胞较12h时均有大量聚集，其中，Ti/HA/OGP/Apt组细胞较Ti/HA/OGP组有更为显著的迁移优势。说明修饰了Apt 19S的功能性材料有十分显著的促MSCs迁移的能力。
实施例6
测试本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体对MSCs成骨分化的调控能力
在24孔板中，将第三代MSCs以2×104个/cm2的接种密度接种分别接种至TCPS及实施例5中Ti片、Ti/HA、Ti/HA/OGP和Ti/HA/OGP/Apt表面，培养7天后，收集蛋白进行组间均一化，5:1加入上样缓冲液，混匀煮沸后，冷却顺离，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，得到蛋白条带。结果如图5所示，其中，图5中A为成骨相关蛋白的WB统计图，图5中B和图5中C均为灰度值统计定量分析图，由图5可知，Ti/HA/OGP/Apt表面上的MSCs显示了高水平的成骨相关蛋白表达，包括核转录相关因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OPG)。与Ti组相比，Ti/HA/OGP/Apt组相应地上调MSCs Runx2、ColⅠ、OCN、OPN、OPG分别至1.2倍、1.85倍、1.26倍、2.26倍、1.76倍；与Ti/HA组相比，Ti/HA/OGP/Apt组的各成骨相关蛋白均有显著上调；另外Ti/HA/OGP/Apt组的蛋白表达较Ti/HA/OGP组蛋白无下调，说明Apt19S的加入不会影响OGP的成骨分化效果，且整体趋势呈现正向，说明本发明中Ti/HA/OGP/Apt有利于诱导干细胞向成骨细胞的分化，促进骨生成，即在纯钛表面构建ROS响应性释放Apt 19S的功能界面有利于诱导干细胞向成骨细胞的分化，促进骨生成。
实施例7
本发明中制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体诱导骨质疏松症动物模型体内骨生成测试
利用卵巢切除法构建SD大鼠的骨质疏松症模型。用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，给大鼠手术部位剃毛消毒后，利用手术电转(直径为1.2cm)沿着股骨平行的方向在大鼠股骨骨骺端转孔，然后将实施例5中Ti片、Ti/HA、Ti/HA/OGP和Ti/HA/OGP/Apt制成圆棒后分别插入孔中，对各植入体周围骨组织做免疫荧光染色(CD29/CD90)，观察各植入体周围骨相关细胞的成骨分化能力。结果如图6所示，由图6可知，各植入体植入3d后由于机体还处于促炎环境，各组骨组织损伤处均聚集了大量炎症相关细胞，如巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞、粒细胞等，清除损伤组织，此时的干细胞(黄色荧光)数目相对较少；各植入体植入7d后，急性炎症期已过，各植入体宿主界面处的细胞大量减少，Ti/HA与Ti/HA/OGP组观察到少量黄色荧光，而Ti/HA/OGP/Apt组较其它样本组有大量干细胞聚集，说明在骨质疏松特殊的微环境(ROS升高)下，Apt 19S招募干细胞至植入体宿主界面处；各植入体植入14d后，可明显观察到Ti/HA/OGP/Apt组的宿主界面处较其它组有更为完整的新骨形成，植入界面处更加平整，说明Ti/HA/OGP/Apt相对于其它组而言，更能促进植入体界面的骨重建，最终促进骨生成。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial)
<400> 1
aggtcagatg aggaggggga cttaggactg ggtttatgac ctatgcgtg 49
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial)
<400> 2
Gly Gly Phe Gly Tyr Leu Thr Arg Gly Gln Arg Lys Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly

Claims (6)

1.一种具有ROS响应的钛基活性骨植入体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电化学沉积法制备表面沉积有羟基磷灰石的钛片；
(2)制备硼酸酯键：所述制备硼酸酯键的方法如下：
A、将对硝基苯氯甲酸酯溶解于四氢呋喃中，0℃下充氮气，获得溶液V；
B、将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺溶解于四氢呋喃中，获得溶液VI；
C、在冰浴条件下，通过10-20min将溶液V在搅拌下逐滴加入溶液VI中，然后在室温下以300-800r/min的速度搅拌反应3-4h，旋干，以二氯甲烷溶解旋干后的产物，获得黄色溶液，依次以1M的HCl、饱和NaCl溶液洗涤后再以NaHCO3溶液洗涤至所述黄色溶液的颜色变为浅黄色，最后过硅胶柱，以石油醚和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，旋干后制得硼酸酯键；
(3)制备硼酸酯键-成骨生长肽复合物：将步骤(2)中制备的硼酸酯键溶解后形成溶液I，将成骨生长肽溶解后形成溶液II，将所述溶液I和溶液II混合搅拌反应至少10h，经透析、冷冻干燥，即可；所述成骨生长肽氨基酸序列的3’端修饰有一个氨基，5’端修饰有两个磷酸根基团，所述硼酸酯键和成骨生长肽的质量比为1:6-10；
(4)将步骤(3)中制备的硼酸酯键-成骨生长肽复合物溶解后形成溶液III，将核酸适配体溶解后形成溶液IV，将步骤(1)中制得的表面沉积有羟基磷灰石的钛片浸入所述溶液III中至少10h后，取出再浸入所述溶液IV中至少10h，即可；所述核酸适配体基因序列的3’端修饰有带有任一碱基的RNA分子；所述核酸适配体的基因序列如SEO ID No：1所示，所述硼酸酯键-成骨生长肽复合物和核酸适配体的质量比为2:1-4:3。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对硝基苯氯甲酸酯、4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的质量体积比为0.47:0.5:0.04:0.6，所述质量体积比的单位为g:g:g:mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述梯度洗脱具体为：首先以石油醚和二氯甲烷按体积比1:4形成的混合液进行洗脱，然后以石油醚和二氯甲烷按体积比3:7形成的混合液进行洗脱，最后以石油醚和二氯甲烷按体积比2:3形成的混合液进行洗脱。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，用于溶解所述硼酸酯键的溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二氧六环或二氯甲烷中的一种；用于溶解所述成骨生长肽的溶剂为饱和NaHCO3溶液、磷酸盐缓冲溶液、三蒸水或二甲基甲酰胺中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，用于溶解硼酸酯键-成骨生长肽复合物或核酸适配体的溶剂为饱和NaHCO3溶液、磷酸盐缓冲溶液或三蒸水中的一种。
6.由权利要求1-5任一项所述的方法制备的具有ROS响应的钛基活性骨植入体。
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