CN110551180A - 一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用。本发明通过将MMA在引发剂BPO参与下合成的PMMA涂附于钛基植入体表面，然后氧等离子体处理构建自组装表面，再将其与对金黄色葡萄球菌具有相应效应的新型多肽KD‑17进行自组装，得到具有响应效应的多功能植入体。本发明具有响应效应的多功能植入体通过响应片段调节新型多肽KD‑17在植入体表面的生物学性能，使得制备的多功能植入体根据金黄色葡萄球菌感染条件选择性表达抗菌或促细胞粘附性能：在无金黄色葡萄球菌感染条件下促进细胞的粘附，粘附率提高19％；当存在金黄色葡萄球菌感染时有效杀菌，杀菌率达到99％以上。

Description

一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及于医用技术领域，特别涉及一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用。
背景技术
随着人口增加、老龄化问题加剧以及人民对生活水平要求的提高，生物材料研发及其应用成为当前高科技新兴领域，受到研究者的广泛关注。随着研究的开展，传统植入体在临床应用过程中存在的缺陷日益凸显，如缺乏生物活性、离子溶出、力学不匹配以及细菌感染等，其中细菌感染成为当前植入体植入失效的重要原因之一，尤其是金黄色葡萄球菌感染。前期的抗菌植入体研究中，抗菌剂的引入使植入体表面均具有一定的细胞毒性，不利于细胞在植入体表面的粘附和铺展。因此，如何设计新型的抗菌表面，使得提高植入体表面抗菌性能和降低细菌感染风险的同时选择性表达促细胞粘附增殖性能具有显著的研究意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有响应效应的多功能植入体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的具有响应效应的多功能植入体。
本发明的再一目的在于提供上述具有响应效应的多功能植入体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有响应效应的多功能植入体的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将甲基丙烯酸甲酯(MMA)清洗，静置分层，弃去洗涤液，加入无水硫酸钠，静置，过滤，加入氯化亚铜，提纯单体MMA，加入引发剂过氧化二苯甲酰(BPO)，预聚合，终聚合，得到聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；
(2)将步骤(1)中所述的PMMA溶解，涂附于钛基植入体表面，氧等离子体处理，得到负电表面；
(3)将二氯三苯甲基树脂作为固相载体，溶胀，加入天冬氨酸、溶剂和二异丙基乙胺(DIEA)，反应，加入甲醇，继续反应，去除反应液，清洗，再加入甘氨酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA，再次反应，用吡啶和乙酸酐进行封端，清洗；重复上述步骤中加入甘氨酸、HBTU和DIEA并进行反应的步骤，将甘氨酸替换为后续氨基酸依次加入，使肽链从C端到N端合成，得到新型多肽KD-17；
(4)将步骤(3)中所述的新型多肽KD-17溶解，与步骤(2)中所述的负电表面进行自组装，得到具有响应效应的多功能植入体。
步骤(1)中所述的清洗为采用氢氧化钠溶液清洗，氢氧化钠溶液的浓度为体积比10％；用量为按其与所述的MMA的体积比为1：1～1：5配比计算。
步骤(1)中所述的无水硫酸钠的用量优选为按其与所述的MMA以5～10g：100mL配比计算。
步骤(1)中所述的氯化亚铜的用量优选为按其与所述的MMA以0.05～0.2g：100mL配比计算。
步骤(1)中所述的静置的时间为20～60min；优选为30min。
步骤(1)中所述的提纯单体MMA为蒸馏提纯，条件为：真空度9000～12000Pa，水浴温度初始为40～45℃，升温至50～65℃，升温速度为0.1℃/min。
步骤(1)中所述的预聚合的温度为70～80℃；预聚合的时间为2～4h。
步骤(1)中所述的终聚合为40℃条件下聚合24～36h，然后在80～100℃条件下聚合0.5～4h。
步骤(1)中所述的PMMA的结构式如式1所示：
步骤(2)中所述的钛基植入体采用PMMA涂附前先依次采用丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声各清洗10min。
步骤(2)中所述的溶解为采用甲苯溶解，溶解至PMMA的溶液浓度为0.1～1wt.％。
步骤(2)中所述的涂附的方法优选为旋涂。
所述的旋涂的速率为2500～5000rpm；旋涂的时间为30s。
步骤(2)中所述的氧等离子体处理的强度为20～80W；处理时间为0～10min。
步骤(3)中所述的二氯三苯甲基树脂的用量为按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：1～3配比计算；优选为按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：2配比计算。
步骤(3)中所述的反应均为氮气条件下反应。
步骤(3)中所述的溶胀所加入的溶剂为二氯甲烷(DCM)；溶胀的时间为30min，之后去除溶剂。
步骤(3)中所述的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和DCM的混合物，其中，DMF和DCM的体积比为1：1。
步骤(3)中加入天冬氨酸时，所述的DIEA的用量按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1～2：1配比计算；优选为按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：1配比计算。
步骤(3)中加入甘氨酸时，所述的DIEA、HBTU、甘基酸的用量按照摩尔比1～2：1～2：1配比计算；优选为按照摩尔比1：1：1配比计算。
步骤(3)中所述的甲醇的用量为过量。
步骤(3)中所述的吡啶的用量为过量。
步骤(3)中所述的乙酸酐的用量为过量。
步骤(3)中所述的反应的时间为50～80min；优选为60min。
步骤(3)中所述的继续反应的时间为20～40min；优选为30min。
步骤(3)中所述的再次反应的时间为20～45min；优选为30min。
步骤(3)中所述的清洗均为采用DMF清洗。
步骤(3)中所述的新型多肽KD-17的氨基酸序列为KRWWKWWRR-GPLGV-RGD(Lys-Arg-Trp-Trp-Lys-Trp-Trp-Arg-Arg-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Asp)，其结构式如式2所示：
步骤(4)中所述的新型多肽KD-17的溶解为采用去离子水溶解，得到的溶液浓度为0.1～1mM。
步骤(4)中所述的自组装的时间为30～60min；优选为60min。
步骤(4)中所述的具有响应效应的多功能植入体采用去离子水和乙醇进行清洗。
一种具有响应效应的多功能植入体，通过上述制备方法制备得到。
所述的具有响应效应的多功能植入体可根据金黄色葡萄球菌感染条件选择性表达抗菌或促细胞粘附性能：在无金黄色葡萄球菌感染条件下促进细胞的粘附，当存在金黄色葡萄球菌感染时能够响应感染，有效杀菌。
上述具有响应效应的多功能植入体在制备骨修复材料中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过响应片段GPLGV调节新型多肽KD-17在植入体表面的不同生物学性能，使得制备的多功能植入体可根据金黄色葡萄球菌感染条件选择性表达抗菌或促细胞粘附性能。在无金黄色葡萄球菌感染条件下促进细胞的粘附，粘附率提高19％；当存在金黄色葡萄球菌感染时，多肽响应细菌感染(被金黄色葡萄球菌所分泌酶降解)，可有效杀灭细菌，杀菌率达到99％以上。无响应片段的多肽自组装于负电表面后，无法响应金黄色葡萄球菌感染，虽能降低抗菌多肽的细胞毒性，但不会表达抗菌活性。
(2)金黄色葡萄球菌感染时，会在钛基植入体周围分泌特异性的酶，其中不同的酶可以特异性识别一种或多种氨基酸片段，因此，本发明根据氨基酸片段设计构建对金黄色葡萄球菌具有响应效应的新型多肽KD-17。KD-17是对金黄色葡萄球菌所分泌的明胶酶具有响应效应的短肽GPLGV结合具有优异杀菌功能的抗菌多肽KRWWKWWRR和促细胞粘附性能的活性多肽RGD得到。本发明利用抗菌多肽(正电)和活性多肽(负电)带电性差异，通过自组装的方法将新型多肽KD-17自组装于带负电性的钛基植入体表面，使抗菌多肽处于下层，活性多肽处于上层，当无金黄色葡萄球菌感染时，钛基植入体表面表现活性多肽，促进细胞粘附，提高植入体表面生物相容性能，有利于组织修复；当金黄色葡萄球菌感染时，响应片段被切断，抗菌多肽暴露出来，快速高效杀灭细菌，有效避免细菌感染。
附图说明
图1是聚甲基丙烯酸甲酯制备示意图。
图2是实施例3的条件下制备的实验组多肽高效液相色谱和质谱结果。
图3是实施例3的条件下制备的对照组多肽高效液相色谱和质谱结果。
图4是实施例3的条件下，不同自组装表面的形貌效果图。
图5是实施例3的条件下，不同自组装时间条件下制备得到的响应型多功能植入体的抗菌效果图。
图6是不同氧等离子体处理时间条件下制备得到的响应型多功能植入体负电表面对响应细菌(金黄色葡萄球菌)和非响应细菌(大肠杆菌)的抗菌效果对比图。
图7是实施例3制备得到的响应型多功能植入体的促细胞粘附效果图。
图8是实施例3制备得到的响应型多功能植入体的抗菌效果图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中所用的大肠杆菌(ATCC 8739；Multi-biofunctionalization of a titanium surface with a mixture of peptidesto achieve excellent antimicrobial activity and biocompatibility)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)购自VWR International，LLC。
实施例1
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:1混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.05g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为9000Pa，水浴温度初始为40℃，升温至50℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至70℃进行预聚合2h，然后降温至40℃聚合24h，80℃聚合0.5h，得到PMMA。聚甲基丙烯酸甲酯的制备过程见图1。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为2500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为20W，处理时间为0min。
(7)称取二氯三苯甲基树脂1mmol(济南百隆，货号：934816-82-7)加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，制备得到新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽，新型多肽溶液的浓度为0.1mM。
(9)将步骤(8)得到的多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为30min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了9％。通过琼脂板计数法(Multi-biofunctionalization of a titanium surfacewith a mixture of peptides to achieve excellent antimicrobial activity andbiocompatibility)测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，多功能植入体的自组装表面响应细菌感染所分泌酶可有效杀灭细菌，其杀菌率为84％。当存在大肠杆菌时，多功能植入体的自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例2
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:3混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.1g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为10500Pa，水浴温度初始为42℃，升温至50℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至75℃进行预聚合3h，然后降温40℃聚合30h，80℃聚合2h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.5wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为3500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为20W，处理时间为5min。
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽，新型多肽溶液的浓度为0.5mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为45min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了11％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，其杀菌率为76％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例3
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:5混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.2g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为12000Pa，水浴温度初始为45℃，升温至50℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至80℃进行预聚合4h，然后降温40℃聚合36h，80℃聚合4h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为5000rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为20W，处理时间为10min。不同氧等离子体处理时间条件下制备的负电表面对响应细菌(金黄色葡萄球菌)和非响应细菌(大肠杆菌)的抗菌效果如图6所示。
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。对照组多肽同样采用固相合成法进行制备，得到的对照组多肽为KRWWKWWRR-GGPLV-RGD，对照响应片段为GGPLV。实验组多肽和对照组多肽的高效液相色谱和质谱见图2和图3。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽和对照组多肽，多肽溶液的浓度为1mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液和对照组多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为60min，得到具有响应活性的多功能植入体和对照组。新型多肽在不同自组装时间下得到的响应型多功能植入体的抗菌效果见图5。
(10)将步骤(9)中具有响应活性的多功能植入体和对照组利用去离子水和乙醇充分清洗。空白组为步骤(6)得到的负电表面。
利用原子力显微镜(AFM)观察清洗后的具有响应活性的多功能植入体(实验组)、对照组和空白组的表面形貌，结果显示，自组装后的具有响应活性的多功能植入体和对照组表面微观形貌均发生变化，实验组形貌变化更明显，说明新型多肽KD-17在多功能植入体表面的自组装量更多(图4)。通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，所制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，多功能植入体的自组装表面(实验组)、对照组和空白组的细胞活性检测结果显示，与空白组相比，多功能植入体的自组装表面的细胞活性提高了19％(图7)。通过琼脂板计数法测试多功能植入体的自组装表面、对照组和空白组的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，多功能植入体的自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，其杀菌率为99％(图8)，而对照组没有抗菌活性，证明了无响应片段GPLGV的多肽自组装于材料表面后不会表达抗菌活性。当存在大肠杆菌时，多功能植入体的自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例4
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:3混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠7.5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.05g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为10500Pa，水浴温度初始为45℃，升温至60℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至75℃进行预聚合3h，然后降温40℃聚合36h，90℃聚合0.5h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.5wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为5000rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为50W，处理时间为10min。
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽，新型多肽溶液的浓度为0.5mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为60min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了17％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为98％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例5
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:1混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠7.5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.1g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为12000Pa，水浴温度初始为40℃，升温至60℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至75℃进行预聚合4h，然后降温40℃聚合24h，90℃聚合2h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为2500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为50W，处理时间为5min。
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽，新型多肽溶液的浓度为1mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为30min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了8％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为77％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例6
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:5混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠7.5g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.2g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为9000Pa，水浴温度初始为42℃，升温至60℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至80℃进行预聚合2h，然后降温40℃聚合30h，90℃聚合4h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为3500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为50W，处理时间为0min；
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD，新型多肽溶液的浓度为0.1mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为45min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了11％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为83％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例7
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:1混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠10g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.05g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为12000Pa，水浴温度初始为42℃，升温至65℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至70℃进行预聚合4h，然后降温40℃聚合30h，100℃聚合0.5h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为3500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为80W，处理时间为5min；
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD，新型多肽溶液的浓度为1mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为45min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了12％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为89％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例8
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:5混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠10g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.1g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为9000Pa，水浴温度初始为45℃，升温至65℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA；
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至75℃进行预聚合2h，然后降温40℃聚合36h，100℃聚合2h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.1wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为5000rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为80W，处理时间为5min；
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD，新型多肽溶液的浓度为0.1mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为10min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了17％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为98％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
实施例9
(1)将100mL MMA原料与10％(v/v)的氢氧化钠溶液以体积比1:3混合，剧烈摇荡，静置至分层后，弃去下层红色洗涤液，反复操作直至洗涤液为无色。加入无水硫酸钠10g，静置30min，用三角漏斗过滤至单颈瓶中，加入氯化亚铜0.2g，将单颈瓶装入蒸馏装置之中，调整真空度为10500Pa，水浴温度初始为40℃，升温至65℃，升温速度为0.1℃/min，蒸馏提纯单体MMA。
(2)将步骤(1)得到的MMA单体(25g)放入干燥锥形瓶中，加入引发剂BPO，封口后加热至80℃进行预聚合3h，然后降温40℃聚合24h，100℃聚合4h，得到PMMA。
(3)将钛基植入体表面依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水分别超声清洗10min。
(4)以甲苯为溶剂，溶解步骤(2)得到的PMMA分子至得到浓度为0.5wt.％的PMMA溶液。
(5)将步骤(4)得到的PMMA溶液通过旋涂的方法涂附于钛基植入体表面，旋涂速率为2500rpm，旋涂时间为30s。
(6)通过氧等离子体处理步骤(5)得到的样品，得到负电表面。氧等离子体处理时的强度为80W，处理时间为0min。
(7)称取树脂1mmol加入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，抽掉DCM，加入第一个氨基酸(天冬氨酸)2mmol，同时加入二甲基甲酰胺(DMF)、DCM和二异丙基乙胺(DIEA)各2mmol，氮气鼓泡反应60min，加入甲醇5mmol，再反应30min，抽掉反应液，用DMF洗净。然后加入第二个氨基酸(甘氨酸)2mmol、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和DIEA各2mmol，氮气反应30min，后用吡啶和乙酸酐各5mmol进行封端，清洗。重复上述步骤，依次逐个加入后续氨基酸，使肽链从C端到N端合成，最终制备新型多肽KRWWKWWRR-GPLGV-RGD。
(8)以去离子水为溶剂，溶解步骤(7)得到的新型多肽KRWWKWWRRGPLGVRGD，新型多肽溶液的浓度为0.5mM。
(9)将步骤(8)得到的新型多肽溶液加入到步骤(6)得到的负电表面，进行分子自组装，分子自组装时间为30min。
(10)将步骤(9)中自组装完成后的样品利用去离子水和乙醇充分清洗，得到具有响应活性的多功能化植入体表面。
通过CCK-8检测试剂盒(日本同仁，货号：ck-04)检测制备的多功能植入体的自组装表面在无金黄色葡萄球菌感染条件下的生物相容性和细胞活性，结果显示，多功能植入体的自组装表面具有生物相容性能，可促进细胞粘附增殖，细胞活性检测结果显示细胞活性提高了10％。通过琼脂板计数法测试自组装表面的抗菌性能，结果显示，当存在金黄色葡萄球菌感染时，自组装表面响应细菌感染所分泌酶，可有效杀灭细菌，琼脂板计数法可看出，其杀菌率为76％。当存在大肠杆菌时，自组装表面无法响应大肠杆菌，因而基本无杀菌性能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南理工大学
<120>一种具有响应效应的多功能植入体及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KD-17
<400> 1
Lys Arg Trp Trp Lys Trp Trp Arg Arg Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly
1 5 10 15
Asp

Claims (10)

1.一种具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)将MMA清洗，静置分层，弃去洗涤液，加入无水硫酸钠，静置，过滤，加入氯化亚铜，提纯单体MMA，加入引发剂BPO，预聚合，终聚合，得到PMMA；
(2)将步骤(1)中所述的PMMA溶解，涂附于钛基植入体表面，氧等离子体处理，得到负电表面；
(3)将二氯三苯甲基树脂作为固相载体，溶胀，加入天冬氨酸、溶剂和DIEA，反应，加入甲醇，继续反应，去除反应液，清洗，再加入甘氨酸、HBTU和DIEA，再次反应，用吡啶和乙酸酐进行封端，清洗；重复上述步骤中加入甘氨酸、HBTU和DIEA并进行反应的步骤，将甘氨酸替换为后续氨基酸依次加入，使肽链从C端到N端合成，得到新型多肽KD-17；
(4)将步骤(3)中所述的新型多肽KD-17溶解，与步骤(2)中所述的负电表面进行自组装，得到具有响应效应的多功能植入体；
步骤(1)中所述的PMMA的结构式如式1所示：
步骤(4)中所述的新型多肽KD-17的氨基酸序列为KRWWKWWRR-GPLGV-RGD，其结构式如式2所示：
2.根据权利要求1所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的清洗为采用氢氧化钠溶液清洗，氢氧化钠溶液的浓度为体积比10％；用量为按其与所述的MMA的体积比为1：1～1：5配比计算；
步骤(1)中所述的无水硫酸钠的用量为按其与所述的MMA以5～10g：100mL配比计算；
步骤(1)中所述的氯化亚铜的用量为按其与所述的MMA以0.05～0.2g：100mL配比计算；
步骤(1)中所述的提纯单体MMA为蒸馏提纯，条件为：真空度9000～12000Pa，水浴温度初始为40～45℃，升温至50～65℃，升温速度为0.1℃/min；
步骤(1)中所述的预聚合的温度为70～80℃；预聚合的时间为2～4h；
步骤(1)中所述的终聚合为40℃条件下聚合24～36h，然后在80～100℃条件下聚合0.5～4h。
步骤(1)中所述的静置的时间为20～60min。
3.根据权利要求1所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的钛基植入体采用PMMA涂附前先依次采用丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声各清洗10min；
步骤(2)中所述的溶解为采用甲苯溶解，溶解至PMMA的溶液浓度为0.1～1wt.％；
步骤(2)中所述的涂附的方法为旋涂；
所述的旋涂的速率为2500～5000rpm；旋涂的时间为30s；
步骤(2)中所述的氧等离子体处理的强度为20～80W；处理时间为0～10min。
4.根据权利要求1所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的二氯三苯甲基树脂的用量为按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：1～3配比计算；
步骤(3)中所述的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和DCM的混合物，其中，DMF和DCM的体积比为1：1；
步骤(3)中加入天冬氨酸时，所述的DIEA的用量按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1～2：1配比计算；
步骤(3)中加入甘氨酸时，所述的DIEA、HBTU、甘基酸的用量按照摩尔比1～2：1～2：1配比计算；
步骤(3)中所述的甲醇的用量为过量；
步骤(3)中所述的吡啶的用量为过量。
5.根据权利要求4所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的二氯三苯甲基树脂的用量为按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：2配比计算；
步骤(3)中加入天冬氨酸时，所述的DIEA的用量按其与所述的天冬氨酸的摩尔比为1：1配比计算；
步骤(3)中加入甘氨酸时，所述的DIEA、HBTU、甘基酸的用量按照摩尔比1：1：1配比计算。
6.根据权利要求1所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的溶胀所加入的溶剂为二氯甲烷(DCM)；溶胀的时间为30min，之后去除溶剂；
步骤(3)中所述的反应的时间为50～80min；
步骤(3)中所述的继续反应的时间为20～40min；
步骤(3)中所述的再次反应的时间为20～45min；
步骤(3)中所述的清洗均为采用DMF清洗；
步骤(3)中所述的反应均为氮气条件下反应。
7.根据权利要求6所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的反应的时间为60min；
步骤(3)中所述的继续反应的时间为30min；
步骤(3)中所述的再次反应的时间为30min。
8.根据权利要求1所述的具有响应效应的多功能植入体的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的新型多肽KD-17的溶解为采用去离子水溶解，得到的溶液浓度为0.1～1mM；
步骤(4)中所述的自组装的时间为30～60min；
步骤(4)中所述的具有响应效应的多功能植入体采用去离子水和乙醇进行清洗。
9.一种具有响应效应的多功能植入体，通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到；所述的具有响应效应的多功能植入体根据金黄色葡萄球菌感染条件选择性表达抗菌或促细胞粘附性能：在无金黄色葡萄球菌感染条件下促进细胞的粘附，当存在金黄色葡萄球菌感染时能够响应感染，有效杀菌。
10.权利要求9所述的具有响应效应的多功能植入体在制备骨修复材料中的应用。
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