CN103254316A - 具有抗耐药菌活性的抗菌肽及其合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明设计合成了新型结构的具有抗耐药菌活性的抗菌肽，是先对天然抗菌肽Anoplin和MPI分别进行N末端的氨基酸修饰后再进行乙酰化，然后利用点击化学的1,3-偶极环加成反应以一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构分别对上述肽进行分子间的两两侧链连接而得。通过对常见的革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及临床分离的耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌的抗菌实验和碘化吡啶染色法实验表明，本发明合成的J-AM肽和J-AA肽具有较强的抗菌活性、抗耐药菌活性以及较强的细胞膜穿透能力，而且对于普通抗生素所产生的耐药现象有着明显的抗耐药优势，因此，在制备临床治疗药物方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一类新型结构的具有抗耐药菌活性的抗菌肽；本发明同时还涉及该抗菌肽的合成方法及在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
随着抗生素在人们生活中的大量使用，耐药菌株不断产生，使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效，因此寻求新的抗生素类药物对人类的发展越来越重要。抗菌肽（Antimicrobial Peptides AMPs）是指一类常带正电荷，具有广谱抗菌性，氨基酸数目在 12 ~ 50个的小分子多肽。随着分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究已经越来越成为生物医药领域中的热门课题（Hancock RE. Peptide antibiotics[J]. Lancet, 1997,349(9049):418-422.）。然而天然抗菌肽并非全部都没有缺点，部分天然抗菌肽存在活性不是很强、抗菌谱相对较窄等。另外，抗菌肽作用机制对于传统抗生素来说均不一样，一般不会产生耐药现象，但是自然界总存在着一定的病原微生物，由于十分稳定的细胞膜结构或功能性特点使之具有天生的耐药性。目前已经证明金黄色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解防御素和一些人源抗菌肽产生耐药性外（陈福，罗玉萍，龚熹．抗菌肽耐药性研究进展[J]．微生物学通报，2008，35(11)：1786-1790．），还可以通过调节vraDE和vraSR改变膜的转运作用而产生对蛙类抗菌肽temporin L和dermaseptin、K4～S4的耐药性（Pietiainen M，Francois P，Hyyrylainen H L，et a1. Transcriptome analysis Of the responses of Staphylococcus aureus to antimicrobial peptides and characterization of the roles of vraDE and vraSR in antimicrobial resistance[J]．BMC Genomics，2009，10(1)：429-431）。
点击化学主要用于研发和制造可用于医学诊断和新药开发的新型生化标记物。目前，它被认为是一项非常理想的技术，已经被应用于药物开发。特别是端基炔和叠氮化合物的1,3-偶极环加成反应已被用于一些肽类以及生物有机大分子和糖类化合物的修饰（Vogt A P。Sumerlin B S．Macromolecules，2006，39：5286-5292）。有报道将抗菌肽以点击化学的方法进行侧链连接有助于提高抗菌肽对细胞膜的穿透能力（Christopher J.etal, Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/Oligomeric Antimicrobial Peptides,Biochemistry 2007, 46, 13437-13442）。因此利用新的化学修饰的方法，来对天然抗菌肽进行结构修饰从而得到抗菌活性更好，具有抗耐药菌活性，并且具有一定的细胞内药物作用靶点载体功能的人工合成抗菌肽有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一：为增加传统的天然抗菌肽 Anoplin 和 MPI对细胞膜的穿透能力，提高抗菌活性以及抗耐药菌活性，提供了一类具有抗耐药菌活性的抗菌肽；
本发明的目的之二：提供上述具有抗耐药菌活性的抗菌肽在在制备抗菌药物中的应用。
本发明的目的之三：提供上述具有抗耐药菌活性的抗菌肽的合成方法。
（一）具有抗耐药菌活性的抗菌肽
本发明具有新结构的抗耐药菌活性的抗菌肽，是对天然抗菌肽 Anoplin 和 MPI分别先进行N末端的氨基酸修饰后再进行乙酰化，然后利用点击化学的1,3-偶极环加成反应以一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构分别对上述肽进行分子间的两两侧链连接，得到新型结构的抗菌肽J-AM和J-AA。
天然抗菌肽Anoplin 、MPI，修饰后的中间肽AC-pra-Anoplin、AC-Nle（N3）-MPI、AC-Nle（N3）-Anoplin，以及本发明抗菌肽J-AM、J-AA的结构和序列如下：
其结构式如下所示：
J-AM
J-AA
本发明抗菌肽的制备方法，包括以下工艺步骤：
（1）肽AC-pra-Anoplin的制备：采用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 Anoplin-resin，再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保护的非天然氨基酸L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin-resin；然后再对连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin-resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-pra-Anoplin-resin；切割纯化得到肽AC-pra-Anoplin。其具体制备工艺如下：
采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-Anoplin- resin；加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应，用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin；将Fmoc保护的L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1~3h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Pra-Anoplin- resin；所述Fmoc保护的L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH的摩尔量为Fmoc-Anoplin- resin的1~8倍；
将Fmoc-Pra-Anoplin- resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应，用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin- resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h~1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Pra-Anoplin- resin，切割纯化得到肽AC-Pra-Anoplin；乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Pra-Anoplin- resin的4~32倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10~1:4；所述HOBT的加入量为相应树脂重量的1~8倍；所述HBTU的加入量为相应树脂重量的1~8倍；所述DIEA的加入量为相应树脂重量的1~8倍。
（2）肽AC- Nle（N3）- Anoplin的制备：用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 Anoplin-resin，再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin-resin；再对连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin -resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin -resin；然后进行侧链叠氮化转化得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- Anoplin -resin，最后进行切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- Anoplin。其具体制备方法如下：
Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸的插入：采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-Anoplin- resin，加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin；将Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与上述脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1~2h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin - resin；
所述Fmoc-Lys（Mtt）-OH的摩尔量为Fmoc-Anoplin- resin的1~8倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10~1:4；所述HOBT的加用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；所述HBTU的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；所述DIEA的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；
N端乙酰化：将Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin - resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin - resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，后再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin - resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h~1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin；
乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin -resin的4~32倍；所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10~1:4；所述DIEA的加入量为Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin -resin重量的1~8倍；
侧链叠氮化转化：用含TFA的DCM溶液洗涤所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin，再依次用甲醇和DCM洗涤，抽干，即脱Mtt侧链保护；将叠氮化钠NaN3溶于水与DCM的混合溶液中，-10℃~0℃下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反应1~3h，用DCM萃取得三氟叠氮TfN3的DCM溶液；在所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin中加入溶有硫酸铜和碳酸钾的DCM与甲醇的混合溶液，再滴加三氟叠氮TfN3的DCM溶液，反应24~48h，然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- Anoplin - resin，最后切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- Anoplin；
所述含TFA的DCM溶液中，TFA的质量百分数为1~10%；
所述叠氮化钠的用量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的1~5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的5~10倍；所述硫酸铜的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的0.05~0.5倍；所述碳酸钾的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的0.1~0.5倍。
（3）肽AC- Nle（N3）- MPI的制备：用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 MPI-resin，再在MPI-resin的N末端插入Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI- resin；再对连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI- resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI -resin；然后进行侧链叠氮化转化得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- MPI- resin，最后切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- MPI。其具体制备工艺如下：
Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸的插入：采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-MPI- resin；加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽MPI- resin；将Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与得到所述脱保护的连有MBHA树脂的肽MPI- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1~2h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin；
所述Fmoc-Lys（Mtt）-OH的摩尔量为Fmoc-MPI- resin的1~8倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10~1:4；所述HOBT的加用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；所述HBTU的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；所述DIEA的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1~8倍；
N端乙酰化 ：将Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI - resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀后，再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI - resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h~1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin；
乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin的4~32倍；所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10~1:4；所述DIEA的加入量为Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的1~8倍；
侧链叠氮化转化：用含TFA的DCM溶液洗涤所述的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin，再依次用甲醇和DCM洗涤，抽干，即脱Mtt侧链保护；将叠氮化钠NaN3加入水和DCM混合溶液中， -10℃~0℃下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反应1~3h，用DCM萃取得三氟叠氮TfN3的DCM溶液；在所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin中加入溶有硫酸铜和碳酸钾的DCM与甲醇的混合溶液，再滴加三氟叠氮TfN3的DCM溶液，反应24~48h，然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- MPI- resin；最后进行切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- MPI；
所述含TFA的DCM溶液中，TFA的质量百分数为1~10%；
所述叠氮化钠的用量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的1~5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的5~10倍；所述硫酸铜的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的0.05~0.5倍；所述碳酸钾的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的0.1~0.5倍。
（4）目标肽J-AM、J-AA的合成：利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使肽AC-pra-Anoplin侧链的端基炔官能团与肽AC-Nle（N3）-MPI侧链的叠氮官能团或肽AC-Nle（N3）-MPI侧链的叠氮官能团连接，形成一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构的桥，得到具有抗耐药菌活性的抗菌肽J-AA或抗菌肽J-AM；
其具体制备工艺如下：
是以硫酸铜为催化剂，含DMF的水溶液为反应介质，抗坏血酸钠为保护剂，将纯化的肽AC-pra-Anoplin与肽AC-Nle(N3)- Anoplin或肽AC-Nle(N3)-MPI以2:1~3:1的摩尔比在室温下反应24h~48h后，经高效液相纯化得到目标肽J-AA、J-AM。
所述硫酸铜的用量为肽AC-Nle(N3)-MPI或肽AC-Nle(N3)- Anoplin摩尔量的2~4倍；抗坏血酸钠的用量为肽AC-Nle(N3)-MPI或肽AC-Nle(N3)- Anoplin摩尔量的3~8倍；含DMF的水溶液中，DMF的体积百分数为2%~10%。
本发明抗耐药菌活性的抗菌肽的合成路线如下：
a、AC-pra-Anoplin
b、AC-Nle（N3）-Anoplin
c、AC-Nle（N
3
）-MPI
（三）抗菌肽J-AM和J-AA的体外抑菌实验
采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。先将金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922的标准株进行挑单克隆接种，于恒温摇床内震荡，使细菌生长到达对数期。利用麦氏比浊法将菌液浓度稀释到1×106CFU/ml待用。用MH培养基将肽Anoplin、MPI、J-AM、J-AA和卡那霉素分别稀释成11个浓度：512μM、256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM，在96孔板中添加，每孔加100μl，每个浓度3个平行孔。以卡那霉素为阳性对照，空白的培养基为阴性对照，然后将稀释好的菌液混匀加入到设定好浓度的孔中，每孔100μl菌液。接种菌液的终浓度应控制在104~105CFU/ml标准范围内。最后在37℃恒温培养箱内孵育18h后肉眼观测浊度，以清晰可见的细菌生长被抑制的情况下的最小浓度即为MIC值。重复三次以上的、平行实验。结果见表1。
该抗菌肽的耐药实验采用的方法和一般体外抑菌实验相同，操作方法同上；其中菌株采用的是临床上分离的耐药金黄色葡萄球菌和耐药大肠杆菌，对照采用的是临床常用的抗生素氨苄西林。结果见表2。
表1 最小抑菌浓度
Kanamycin是卡那霉素标准品；各组与对照组相比P<0.05。
表2 对耐药菌的最小抑菌浓度
各组与对照组相比P<0.05。
表1、2的结果表明，抗菌肽J-AM和J-AA对于金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌均具有较强的抗菌活性，并且均不产生耐药，对二者的耐药菌均具有较强的杀伤能力，而氨苄西林则产生了耐药。
（四）抗菌肽J-AM和J-AA的PI染色实验
用一般微生物接种方法将大肠杆菌标准株进行挑单克隆接种，然后置于37℃恒温摇床培养至对数期，利用麦氏比浊法将菌液浓度稀释到1×108CFU/ml。然后取适量菌液装入若干只1.5ml的EP管中，在4℃下，12000g离心5min，弃上清，用PBS缓冲溶液进行洗涤，重复几次后合并离心后的沉淀，再用PBS溶液重悬。最后用1ml碘化吡啶（PI）避光染色10min，然后离心用PBS重悬后涂布在载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观测有红色荧光说明药物作用于细胞膜使其破裂，染料进入细胞内。
图1为大肠杆菌PI染色：上到下依次为空白对照组、Anoplin组、MPI组、J-AM组和J-AA组。图1的结果显示，抗菌肽J-AM和J-AA比起天然抗菌肽Anoplin和MPI，具有较强的细胞膜穿透力。
附图说明
图1 为不同药物的PI染色结果图；
图2为AC-Pra-Anoplin的质谱图；
图3为AC-Nle(N3)-Anoplin的质谱图；
图4为AC- Nle(N3)-MPI的质谱图；
图5为J-AM的质谱图；
图6为J-AA的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明新型抗菌肽及其合成作进一步说明。
实施例1 ：抗菌肽J-AM的合成
（1）树脂的活化及预处理
准确称取0.7g MBHA树脂（0.43mmol/g），加入多肽固相合成仪中，沿管壁加入DCM，至完全浸没树脂为宜，搅拌30 min，使树脂充分溶胀，然后移去搅拌器，抽干DCM（30 min）。
（2）AC-pra-Anoplin-MBHA的合成
a、Leu的耦合：将经过预处理的树脂用DMF洗涤三次，每次3 min（2 min×3次），用真空泵抽干反应器中的溶剂，加入体积分数20%的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌（2 min×4），抽干。反应完成后，用DMF洗涤3~4次，每次2 min。茚三酮显色法检定Fmoc保护基是否脱去：若为无色，Fmoc保护基未脱除，重复上述步骤；若为蓝色，Fmoc保护基脱除成功；将319mgFmoc保护的Leu溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121.9mgHOBT和344.2mg HBTU，搅拌溶解后再加入300μl DIEA，然后与上述脱除Fmoc保护的树脂混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，抽干，DMF洗涤（3 min×3）；用茚三酮显色法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Leu耦合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA ；
b、Leu的耦合：在Fmoc-Leu- MBHA中加入体积分数20%的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌使其充分反应；反应完成后，用DMF洗涤3~4次，每次2 min，得到Leu- MBHA；将Fmoc保护的Leu 319mg溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121.9mg HOBT和344.2mg HBTU，搅拌溶解后再加入300μl DIEA，然后与Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，抽干、用DMF洗涤（3 min×3），用茚三酮显色法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Leu耦合成功，得到Fmoc- Leu -Leu- MBHA；
c、Thr的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Thr的量为306.6mg，最后得到Fmoc-Thr-Leu -Leu- MBHA；
d、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
e、Ile的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Ile的量为319mg，最后得到Fmoc-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
f、Arg的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Arg的量为595.8mg，最后得到Fmoc-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
g、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
h、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为319mg，最后得到Fmoc-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
i、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为319mg，最后得到Fmoc-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
j、Gly的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Gly的量为267mg，最后得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
k、Pra的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Pra的量为301.5mg，最后得到Fmoc-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
l、N端乙酰 (AC) 化：将Fmoc-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA加入到含20%六氢吡啶的DMF混合溶液，搅拌使其充分反应共4次，每次2min；反应完成后，用DMF洗涤4次，每次2min，茚检应有颜色，得到Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；将乙酸酐0.7ml溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，后再加入300μl DIEA，然后与Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h，抽干、用DMF洗涤3次，每次3min，茚检应无色，得到AC-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
（3）AC-Nle(N3)-MPI-MBHA的合成
a、Leu的耦合：将经过预处理的树脂用DMF洗涤三次，每次3 min（2 min×3次），用真空泵抽干反应器中的溶剂，加入体积分数20%的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌（2 min×4），抽干。反应完成后，用DMF洗涤3~4次，每次2 min。茚三酮显色法检定Fmoc保护基是否脱去：若为无色，Fmoc保护基未脱除，重复上述步骤；若为蓝色，Fmoc保护基脱除成功；将319mgFmoc保护的Leu溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121.9mgHOBT和344.2mg HBTU，搅拌溶解后再加入300μl DIEA，然后与上述脱除Fmoc保护的树脂混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，抽干，DMF洗涤（3 min×3）；用茚三酮显色法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Leu耦合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA ；
b、Ile的耦合：在Fmoc-Leu- MBHA中加入体积分数20%的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌使其充分反应；反应完成后，用DMF洗涤3~4次，每次2 min，茚检有颜色，得到Leu- MBHA；将Fmoc保护的Ile 319mg溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121.9mg HOBT和344.2mg HBTU，搅拌溶解后再加入300μl DIEA，然后与Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，抽干、用DMF洗涤（3 min×3），用茚三酮显色法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Ile耦合成功，得到Fmoc- Ile -Leu- MBHA；
c、Gln的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Gln的量为331mg，最后得到Fmoc-Gln- Ile -Leu- MBHA；
d、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
e、Ala的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Ala的量为280mg，最后得到Fmoc-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
f．Ala的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Ala的量为280mg，最后得到Fmoc-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
g、Asp的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Asp的量为370mg，最后得到Fmoc-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
h、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为319mg，最后得到Fmoc-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
i、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为319mg，最后得到Fmoc-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
j、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
k、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
l、Trp的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Trp的量为473mg，最后得到Fmoc-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
m、Asp的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Asp的量为370mg，最后得到Fmoc-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
n、Ile的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Ile的量为319mg，最后得到Fmoc-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
o、Lys（Mtt）的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys（Mtt）的量为561mg，最后得到Fmoc-Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
p、N端乙酰 （AC）化：将Fmoc-Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA加入到含六氢吡啶20%的DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应共4次。每次2min；反应完成后，用DMF洗涤3次，每次2min，茚检应有颜色，得到Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；将乙酸酐0.7ml溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，后再加入300μl的DIEA，然后与Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h，抽干、用DMF洗涤3次，每次2min，茚检应无色，得到AC-Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA；
q、Nle（N3）的转化：用含TFA 1%的DCM溶液洗涤树脂AC-Lys（Mtt）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA 10次，每次3min，直到树脂发黄，再依次用甲醇和DCM洗涤数次，抽干，茚检有颜色即脱Mtt侧链保护。再将叠氮化钠（NaN3）1.9g加入水和DCM（1:2）混合溶液中， -10℃-0℃下加入三氟甲磺酸酐（Tf2O）4ml后室温反应2.5h，用DCM萃取得三氟叠氮（TfN3）的DCM溶液；将AC-Lys（NH2）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA中加入硫酸铜30mg和碳酸钾33mg的DCM与甲醇（9:1）的混合溶液，滴加TfN3的DCM溶液反应48h，然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，茚检无色得到AC- Nle（N3）-Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys- Gln- Ile -Leu- MBHA。
（4）多肽切割
将AC-pra-Anoplin-MBHA和AC--Nle(N3)-MPI-MBHA用DCM和MeOH交替洗涤树脂三次，每次3 min，彻底抽干。将配制好的切割试剂TFA:三异丙基硅烷:水=于9.5:0.25:0.25(v:v:v)，用量10ml/g树脂，加入装有肽树脂的固相合成仪中，每20 min搅拌1 min，共反应3 h。反应完毕后，反应液经砂芯过滤，用适量TFA洗涤。将反应液与滤液全部收集在烧瓶中，35 ℃减压蒸馏至体积不能再减少为止。浓缩液中加入适量冰冻乙醚沉淀多肽，待沉降2~3 h后弃去上清液，加入冰乙醚再次沉降后弃去上清液，收集沉淀。沉淀用水溶解后分装到小烧杯中，置低温冰箱冷冻，凝固后置冻干机中冻干得粗肽。
（5）多肽的纯化
a、粗肽脱盐：用体积分数20%的冰乙酸水混合溶液平衡Sephadex G-10凝胶柱，凝胶柱下端连有紫外检测器，分次上样。每次称取粗肽约50mg左右，具体量根据多肽的溶解度而定，溶解于2 ml 20%冰乙酸-水混合溶液中，加入凝胶柱，洗脱，用紫外检测器监测，收集有吸收的组分。将收集所得的精制液稀释后冷冻干燥，得到脱盐肽。
b、高效液相纯化：
RP-HPLC纯化条件：上样量：70~80 mg/次；流动相A：0.1%TFA/水；流动相B：0.1%TFA/乙腈；线性梯度为45 min，流动相B 20%~60%；色谱柱为半制备柱Waters Delta-PakC18 column (19×250 mm)；检测波长：220 nm和280nm；流速：8 mL/min。
纯化过程：称取脱盐肽，加去离子水溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液上制备型高效液相色谱仪，每次进样4 mL，集主要吸收峰的流出液，分装，冻干，收集目标肽，质谱鉴定得中间产物肽AC-Pra-Anoplin和AC-Nle(N3)-MPI；分子量为别为1290Da和1850Da。
中间产物AC-Pra-Anoplin、AC- Nle(N3)-MPI的质谱图见图2、图4。
（6）抗菌肽类似物J-AM的合成
称取AC-pra-Anoplin 8mg、AC-Nle（N3）-MPI 5mg和硫酸铜5mg，溶于含5%DMF的水溶液中，再加入抗坏血酸钠12mg，室温反应>24h，最后反应直接过HPLC，色谱条件同上。得终产物J-AM；分子量为3139Da。
产物的质谱图见图5。
实施例2 ：抗菌肽类似物J-AA的合成
（1）树脂的活化及预处理
同实施例1。
（2）AC-pra-Anoplin-MBHA的合成
同实施例1。
（3）AC-Nle(N3)-Anoplin-MBHA的合成
a、Leu的耦合：将经过预处理过的树脂用DMF洗涤3次，每次2min，抽干后，加入含20%六氢吡啶的DMF的混合溶液，搅拌使其充分反应共4次，每次2min；反应完成后，用DMF洗涤3次，每次2min，茚检应有颜色，得到脱除Fmoc保护的树脂；将Fmoc保护的Leu 319mg溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT 121.9mg和HBTU 344.2mg，搅拌溶解后再加入300ul DIEA，然后与脱除Fmoc保护的树脂混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，茚检无色后抽干，DMF洗涤3次，每次2min 得到Fmoc-Leu-MBHA ；
b、Leu的耦合：将Fmoc-Leu- MBHA加入含20%六氢吡啶的DMF的混合溶液中，搅拌使其充分反应共4次，每次2min；反应完成后，用DMF洗涤4次，每次2min；茚检应有颜色得到Leu- MBHA；将Fmoc保护的Leu 319mg溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121.9mg HOBT和344.2mg的HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA 300ul，然后与Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应1h，抽干、用DMF洗涤3次，每次2min，茚检无色后得到Fmoc- Leu -Leu- MBHA；
c、Thr的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Thr的量为306mg，最后得到Fmoc-Thr-Leu -Leu- MBHA；
d、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为421mg，最后得到Fmoc-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
e、Ile的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Ile的量为319mg，得到Fmoc-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
f、Arg的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Arg的量为595.8mg，得到Fmoc-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
g、Lys的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Lys的量为595.8mg，得到Fmoc-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
h、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为595.8mg，得到Fmoc-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
i、Leu的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Leu的量为595.8mg，得到Fmoc-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
j、Gly的耦合：方法同上，其中Fmoc保护的Gly的量为595.8mg，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
k、Lys（Mtt）的耦合：将Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA加入含20%的六氢吡啶的DMF的混合溶液，搅拌使其充分反应共4次，每次2min；反应完成后，用DMF洗涤4次，每次2min，茚检应有颜色，得到Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；将Fmoc保护的Lys（Mtt）561mg溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入121mg HOBT和344.2mg HBTU，搅拌溶解后再加入300ul DIEA，然后与Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应2h，抽干、用DMF洗涤3次，每次2min，茚检应无色得到Fmoc-Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
l、N端乙酰 (AC) 化 ：将Fmoc-Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA加入到含20%六氢吡啶的DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应共4次，每次2min；反应完成后，用DMF洗涤4次，每次2min；茚检应有颜色，得到Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；将乙酸酐0.7ml溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，后再加入300ul DIEA，然后与Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h，抽干、用DMF洗涤3次，每次2min，茚检无色后得到AC-Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA；
m、Nle（N3）的转化：用含1%TFA的DCM溶液洗涤树脂AC-Lys（Mtt）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA 10次，每次3min；直到树脂变黄，再依次用甲醇和DCM洗涤数次，抽干，茚检有颜色即脱Mtt侧链保护。再将叠氮化钠（NaN3）2.5g加入水和DCM（1:2）混合溶液中， -10℃-0℃下加入三氟甲磺酸酐（Tf2O）6ml后室温反应2.5h，用DCM萃取得三氟叠氮（TfN3）的DCM溶液将AC-Lys（NH2）-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA中加入硫酸铜35mg和碳酸钾50mg的DCM与甲醇（9:1）的混合溶液，滴加TfN3的DCM溶液反应48h然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，茚检无色得到AC-Nle（N3） -Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu -Leu- MBHA。
（4）多肽切割
同实施例1。
（5）多肽的纯化
同实施例1。最终得产物纯肽AC-Pra-Anoplin和纯肽AC-Nle(N3)-Anoplin；后者的分子量为1349Da。
中间产物AC-Nle(N3)-Anoplin的质谱图见图3。
（6）抗菌肽类似物J-AA的合成
称取AC-pra-Anoplin11mg、AC-Nle（N3）-Anoplin 10mg和硫酸铜8mg，溶于含5%DMF的水溶液中，再加入抗坏血酸钠18mg，室温反应>24h，最后反应直接过HPLC，色谱条件同上。得终产物J-AA；分子量为2639Da。
产物的质谱图见图6。
Claims (8)
1.具有抗耐药菌活性的抗菌肽，其结构特征如下所示：
2.如权利要求1所述具有抗耐药菌活性的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
3.如权利要求1所述具有抗耐药菌活性的抗菌肽的制备方法，包括以下工艺步骤：
（1）肽AC-pra-Anoplin的制备：采用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 Anoplin-resin，再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保护的非天然氨基酸L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin-resin；然后再对连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin-resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-pra-Anoplin-resin；切割纯化得到肽AC-pra-Anoplin；
（2）肽AC- Nle（N3）- Anoplin的制备：用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 Anoplin-resin，再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin-resin；再对连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin -resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin -resin；然后进行侧链叠氮化转化得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- Anoplin -resin，最后进行切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- Anoplin；
（3）肽AC- Nle（N3）- MPI的制备：用经典的固相合成方法合成连有MBHA树脂的天然抗菌肽 MPI-resin，再在MPI-resin的N末端插入Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH，脱保护得到连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI- resin；再对连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI- resin的N端乙酰化，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI -resin；然后进行侧链叠氮化转化得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- MPI- resin，最后切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- MPI；
（4）目标肽J-AM、J-AA的合成：利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使肽AC-pra-Anoplin侧链的端基炔官能团与肽AC-Nle（N3）-MPI侧链的叠氮官能团或肽AC-Nle（N3）-MPI侧链的叠氮官能团连接，形成一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构的桥，得到具有抗耐药菌活性的抗菌肽J-AA或抗菌肽J-AM。
4.如权利要求3所述具有抗耐药菌活性的抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述肽AC-pra-Anoplin的制备方法为：
采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-Anoplin- resin；加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应，用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin；将Fmoc保护的L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1～3h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Pra-Anoplin- resin；所述Fmoc保护的L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH的摩尔量为Fmoc-Anoplin- resin的1～8倍；
将Fmoc-Pra-Anoplin- resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应，用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin- resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Pra-Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h～1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Pra-Anoplin- resin，切割纯化得到肽AC-Pra-Anoplin；乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Pra-Anoplin- resin的4～32倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10～1:4；所述HOBT的加入量为相应树脂重量的1～8倍；所述HBTU的加入量为相应树脂重量的1～8倍；所述DIEA的加入量为相应树脂重量的1～8倍。
5.如权利要求3所述具有抗耐药性的抗菌肽类似物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述肽AC- Nle（N3）- Anoplin的制备方法如下：
Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸的插入：采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-Anoplin- resin，加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin；将Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与上述脱保护的连有MBHA树脂的肽Anoplin- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1～2h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin - resin；
所述Fmoc-Lys（Mtt）-OH的摩尔量为Fmoc-Anoplin- resin的1～8倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10～1:4；所述HOBT的加用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；所述HBTU的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；所述DIEA的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；
N端乙酰化：将Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin - resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin - resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀，后再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- Anoplin - resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h～1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin；
乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin -resin的4～32倍；所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10～1:4；所述DIEA的加入量为Fmoc-Lys（Mtt）- Anoplin -resin重量的1～8倍；
侧链叠氮化转化：用含TFA的DCM溶液洗涤所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin，再依次用甲醇和DCM洗涤，抽干，即脱Mtt侧链保护；将叠氮化钠NaN3溶于水与DCM的混合溶液中，-10℃～0℃下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反应1～3h，用DCM萃取得三氟叠氮TfN3的DCM溶液；在所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin中加入溶有硫酸铜和碳酸钾的DCM与甲醇的混合溶液，再滴加三氟叠氮TfN3的DCM溶液，反应24～48h，然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- Anoplin - resin，最后切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- Anoplin；
所述含TFA的DCM溶液中，TFA的质量百分数为1~10%；
所述叠氮化钠的用量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的1～5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的5～10倍；所述硫酸铜的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的0.05～0.5倍；所述碳酸钾的加入量为AC-Lys（Mtt）- Anoplin - resin重量的0.1～0.5倍。
6.如权利要求3所述具有抗耐药性的抗菌肽类似物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述肽AC- Nle（N3）- MPI的制备方法如下：
Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸的插入：采用经典的固相合成法得到连有MBHA树脂的N末端Fmoc保护的母肽Fmoc-MPI- resin；加入到六氢吡啶与DMF混合溶液中，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽MPI- resin；将Fmoc保护的侧链MTT保护的赖氨酸Fmoc-Lys（Mtt）-OH溶于DMF中，搅拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，搅拌溶解后再加入DIEA，然后与得到所述脱保护的连有MBHA树脂的肽MPI- resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应1～2h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin；
所述Fmoc-Lys（Mtt）-OH的摩尔量为Fmoc-MPI- resin的1～8倍；
所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10～1:4；所述HOBT的加用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；所述HBTU的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；所述DIEA的用量为Fmoc-Lys（Mtt）-OH重量的1～8倍；
N端乙酰化 ：将Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin加入到六氢吡啶与DMF混合溶液，搅拌使其充分反应；用DMF洗涤，得到脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI - resin；将乙酸酐溶于DMF中，搅拌使其充分混匀后，再加入DIEA，然后与所述脱保护的连有MBHA树脂的肽Lys（Mtt）- MPI - resin混合，氩气保护、室温下搅拌反应0.5h～1h，抽干、用DMF洗涤，得到连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin；
乙酸酐的摩尔量为Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin的4～32倍；所述六氢吡啶与DMF混合溶液中，六氢吡啶与DMF的体积比为1:10～1:4；所述DIEA的加入量为Fmoc-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的1～8倍；
侧链叠氮化转化：用含TFA的DCM溶液洗涤所述的连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin，再依次用甲醇和DCM洗涤，抽干，即脱Mtt侧链保护；将叠氮化钠NaN3加入水和DCM混合溶液中， -10℃～0℃下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反应1～3h，用DCM萃取得三氟叠氮TfN3的DCM溶液；在所述连有MBHA树脂的肽AC-Lys（Mtt）- MPI - resin中加入溶有硫酸铜和碳酸钾的DCM与甲醇的混合溶液，再滴加三氟叠氮TfN3的DCM溶液，反应24～48h，然后用DCM、甲醇依次洗涤后抽干，得到乙酰化的连有MBHA树脂的肽AC- Nle（N3）- MPI- resin；最后进行切割纯化得到肽AC- Nle（N3）- MPI；
所述含TFA的DCM溶液中，TFA的质量百分数为1～10%；
所述叠氮化钠的用量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的1～5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的5～10倍；所述硫酸铜的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的0.05～0.5倍；所述碳酸钾的加入量为AC-Lys（Mtt）- MPI - resin重量的0.1～0.5倍。
7.如权利要求3所述具有抗耐药性的抗菌肽类似物的制备方法，其特征在于：如步骤（4）所述具有抗耐药菌活性的抗菌肽J-AA和J-AM的制备方法，是以硫酸铜为催化剂，含DMF的水溶液为反应介质，抗坏血酸钠为保护剂，将纯化的肽AC-pra-Anoplin与肽AC-Nle(N3)- Anoplin或肽AC-Nle(N3)-MPI以2:1～3:1的摩尔比在室温下反应24h～48h后，经高效液相纯化得到目标肽J-AA、J-AM。
8.如权利要求7所述具有抗耐药性的抗菌肽类似物的制备方法，其特征在于：所述硫酸铜的用量为肽AC-Nle(N3)-MPI或肽AC-Nle(N3)- Anoplin摩尔量的2～4倍；抗坏血酸钠的用量为肽AC-Nle(N3)-MPI或肽AC-Nle(N3)- Anoplin摩尔量的3～8倍；含DMF的水溶液中，DMF的体积百分数为2%～10%。
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-
2013
- 2013-05-09 CN CN201310168658.9A patent/CN103254316B/zh active Active
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| CN103254316B (zh) | 2014-09-10 |
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