CN104892727B - 具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含三唑结构链接子的新型组合抗菌肽及其制备方法，属于生化技术领域。本发明以含炔丙基甘氨酸和叠氮基赖氨酸的前体肽为底物，CuSO4.5H2O为催化剂，抗坏血酸钠为抗氧化剂，水‑叔丁醇为混合溶剂，采用点击化学的1,3‑偶极环加成反应24~28小时，产生一个1,4‑二取代‑1H‑1,2,3‑三唑结构，将上述前体肽链接而得。通过对常见的标准菌以及临床分离的耐药菌的抗菌实验，表明本发明合成的J‑AR肽和J‑RR肽具有较强的抗菌活性、抗耐药菌活性，同时扫描电镜实验观察侧链链接组合抗菌肽可以引起大肠杆菌菌膜的破坏。因此，本发明公开的含三唑结构链接子的新型组合抗菌肽在制备临床治疗药物方面具有很好的应用前景。

Description

具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽及其合成 方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种具有很好的抗耐药菌活性的组合抗菌肽，尤其涉及一种具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽及其制备合成方法。
背景技术
近年来，滥用抗生素产生的耐药性问题日益严重，对人类疾病造成了巨大的威胁。寻找新的可替代抗生素的新药迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides），是生物体经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，来源广泛，其分子量小，大约在 3~6 kD 之间，有耐热、 耐酸性强，水溶性好，快速的杀菌能力等特点（Hancock REW， Scott MG. ProcNatl AcadSci USA，2000，97（16）：8856~ 8861）。抗菌肽的抗菌机制不同于普通抗生素，抗菌机制一般包括①快速破坏菌膜，使菌体内容物泄露，细菌死亡②抗菌肽与细菌细胞内容物（如DNA或RNA）作用，干扰细菌细胞正常的合成和代谢，导致菌体死亡（刘立伟，邓磊. 抗菌肽作用机制研究进展[J].河北化工，2012,35（7）：13-15）。所以，抗菌肽不易诱导耐药性的产生，使其成为生物医药领域的热门研究内容。但是，部分天然抗菌肽也存在抗菌活性弱，对耐药菌作用无效等缺点，将限制抗菌肽的发展。
点击化学主要用于研发和制造可用于医学诊断和新药开发的新型生化标记物。目前，它被认为是一项非常理想的技术，已经被应用于药物开发。点击化学的代表是Cu催化的叠氮基和炔基的1,3-偶极环加成反应。产物有1,4-二取代-1,2,3-三唑结构，其中1,4-二取代-1,2,3-三唑结构被认为是一种新型的药效团，有极大地潜力可以将其运用到抗癌，抗菌，HIV酶抑制剂等研究中（Agalave SG, Maujan SR, Pore VS，et al.Click chemistry: 1,2,3-triazoles as pharmacophores[J].Chem Asian J，2011，6(10)：2696-2718.）。有报道将抗菌肽以点击化学的方法进行侧链连接有助于提高抗菌肽对细胞膜的穿透能力（Christopher J.etal, Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/Oligomeric Antimicrobial Peptides,Biochemistry 2007, 46, 13437-13442）。因此，我们采用点击化学的方法，用1,2,3-三唑结构作为链接子，侧链链接抗菌肽，合成出抗菌活性增强的新型组合抗菌肽，以期具有良好的抗耐药菌活性，扩宽抗菌谱的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有新型结构的含三唑结构链接子的组合抗菌肽；
本发明的另一目的是提供一种上述含三唑结构链接子的组合抗菌肽的合成方法。
一、具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽
本发明具有抗耐药性的组合抗菌肽的结构式如下所示：
或
二、具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备
本发明具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备方法，是以含炔丙基甘氨酸和叠氮基赖氨酸的前体肽为底物，以CuSO4.5H2O为催化剂，以抗坏血酸钠为抗氧化剂，以水-叔丁醇为混合溶剂，采用点击化学的1,3-偶极环加成反应24~28小时，产生一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构将上述前体肽链接而得。
所述含炔丙基甘氨酸的前体肽序列为AC-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2或AC-Pra-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-NH2；含炔丙基甘氨酸（Pra）和含叠氮基赖氨酸[Lys(N3)]的前体肽的摩尔比为1:1~1:2。
催化剂CuSO4.5H2O的用量为叠氮基赖氨酸的前体肽摩尔量的5~10倍。
抗氧化剂抗坏血酸钠的用量为叠氮基赖氨酸的前体肽摩尔量的15~25倍。
混合溶剂水-叔丁醇中，水与叔丁醇的体积比为1:0.1~1:10。
上述反应式如下：
图1、2分别为上述方法合成的含三唑结构链接子的组合抗菌肽J-AR、J-RR的质谱图。J-AR和J-RR的分子量等于它们各自前体肽分子量之和，经计算为：J-AR的分子量为2492，J-RR的分子量为2342，从图1、2 可以看出，J-AR和J-RR的分子量和我们理论计算的结果一致，证明我们合成的产物与我们设计的抗菌肽结构一致。
三、目标肽J-AR和J-RR的体外抑菌实验
1. 对标准菌株的抑菌实验
采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的、平行实验。结果见表1。
2. 对耐药菌株的最低抑菌浓度
采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的、平行实验。结果见表2。
表1、2的结果表明，新型组合抗菌肽J-AR和J-RR抗菌活性显著提高，同时产生良好的对抗耐药菌的活性，对临床分离的耐药菌株均不产生耐药性。临床上常见的抗生素作用耐药菌均出现耐药性，对其不产生抗菌作用。
3．组合抗菌肽J-AR、J-RR的扫描电镜试验
该方法可以从形态学上直观的观察抗菌肽作用于细菌后其对细菌细胞膜的作用效果。 图1为大肠杆菌扫描电镜：A) Anoplin组、B) RW组、C) J-AR组、D) J-RR组、E)阴性对照组（大肠杆菌）。图3的结果显示，组合链接后并不改变母肽原有的破膜机制，当其与菌作用时，造成菌膜形态发生变形凹陷，细菌内容泄露，菌体死亡。
综上所述，经过生物活性筛选结果显示，本发明合成的目标物组合抗菌肽J-AR、J-RR具有很强的抗菌活性，对测试的标准的菌株具有很强的抗菌活性，而且对临床分离的耐药菌株也有强的抗菌活性。同时扫描电镜实验观察侧链链接组合抗菌肽可以引起大肠杆菌菌膜的破坏。因此，含三唑链接子的新型组合抗菌肽具有优良的应用前景。
附图说明
图1为J-AR的质谱图。
图2为J-RR的质谱图。
图3 为不同抗菌肽的扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明组合抗菌肽的合成作进一步说明。
实施例1、组合抗菌肽J-AR的合成
以H2O和t-BuOH（1:1，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的5倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的18倍），分别将纯化的肽AC-pra-Anoplin与肽AC-Nle(N3)- RW以1:1的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-AR，产率为25.2%。产物质谱图见图2。
实施例2组合抗菌肽J-AR的合成
以H2O和t-BuOH（1:5，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的8倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂，（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的15倍），分别将纯化的肽AC-pra-Anoplin与肽AC-Nle(N3)- RW以1:2的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h~28h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-AR，产率为25.6%。产物质谱图见图2。
实施例3、合抗菌肽J-AR的合成
以H2O和t-BuOH（1:0.1，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的10倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的25倍），分别将纯化的肽AC-pra-Anoplin与肽AC-Nle(N3)- RW以1:1.5的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h~28h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-AR，产率为25.3%。产物质谱图见图2。
实施例4、组合抗菌肽J-RR的合成
以H2O和t-BuOH（1:1，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的10倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的15倍），分别将纯化的肽AC-pra-RW与肽AC-Nle(N3)- RW以1:1的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h~28h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-RR，产率为28.4%。产物质谱图见图3。
实施例5、组合抗菌肽J-RR的合成
以H2O和t-BuOH（1:10，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的8倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的20倍），分别将纯化的肽AC-pra-RW与肽AC-Nle(N3)- RW以1:1.3的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h~28h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-RR，产率为28.3%。产物质谱图见图3。
实施例6、组合抗菌肽J-RR的合成
以H2O和t-BuOH（1:0.1，V/V)为反应介质，CuSO4.5H2O为催化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的5倍），抗坏血酸钠为抗氧化剂（用量是肽AC-Nle(N3)- RW摩尔量的25倍），分别将纯化的肽AC-pra-RW与肽AC-Nle(N3)- RW以1:2的摩尔比在室温下快速搅拌反应24h~28h后，将反应液用水稀释终止反应后送冻干，冻干粉末经RP-HPLC纯化得到目标肽J-RR，产率为27.9%。产物质谱图见图3。

Claims (5)

1.具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽，其结构式如下所示：
或
。
2.如权利要求1所述具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备方法，以含炔丙基甘氨酸和叠氮基赖氨酸的前体肽为底物，以CuSO4.5H2O为催化剂，以抗坏血酸钠为抗氧化剂，以水-叔丁醇为混合溶剂，采用点击化学的1,3-偶极环加成反应24~28小时，产生一个1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑结构将上述叠氮基赖氨酸的前体肽链接而得；所述含炔丙基甘氨酸的前体肽序列为AC-Pra-Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2或AC-Pra-Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-Phe-NH2，所述含炔丙基甘氨酸和含叠氮基赖氨酸的前体肽的摩尔比为1:1~1:2。
3.权利要求2所述具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备方法，其特征在于：催化剂CuSO4.5H2O的用量为叠氮基赖氨酸的前体肽摩尔量的5~10倍。
4.权利要求2所述具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备方法，其特征在于：抗氧化剂抗坏血酸钠的用量为叠氮基赖氨酸的前体肽摩尔量的15~25倍。
5.权利要求2所述具有抗耐药性的含三唑结构链接子的组合抗菌肽的制备方法，其特征在于：混合溶剂水-叔丁醇中，水与叔丁醇的体积比为1:0.1~1:10。
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