CN109265518A - 具有高酶解稳定性和强抗菌活性的n-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 - Google Patents

具有高酶解稳定性和强抗菌活性的n-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明设计合成了具有高酶解稳定性和强抗菌活性的新型N‑末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其是对天然抗菌肽Anoplin的部分D型替换类似物Anoplin‑D4,7的N‑末端进行脂肪酸修饰，得到全新结构的单体抗菌肽类似物Cn‑D4,7，n＝2‑18；将前体肽Cn‑Pra‑D4,7，n＝2‑18与Ac‑Lys(N3)‑D4,7经“点击化学”的1，3‑偶极环加成反应进行分子间侧链连接，得到新型结构二聚体抗菌肽类似物J‑AA‑(Cn‑D4,7+D4,7)，n＝2‑18。体外抑菌实验、PI染色法流式细胞术实验、诱导细菌耐药实验和酶解稳定性实验均表明，本发明设计合成的N‑末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物具有高酶解稳定性和强抗菌活性；相比于传统抗生素，本发明得到的新型抗菌肽在临床抗菌药物的开发方面具有很好的应用前景。

Description

具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽 类似物及其合成和应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，涉及一类全新结构的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用，特别涉及一类具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用。
背景技术
上个世纪初，多马克首次发现了磺胺类药物的前身“百浪多息”(Lakartidningen，1993，90(14)：1401-1402)。同一时期，亚历山大·弗莱明发现了“青霉素”，青霉素的出现成为许多细菌感染性疾病的“克星”，使第二次世界大战期间数千受死亡威胁的生命得以幸存(J.Antibiot，Toky，2009，62(1)：5-16)。随后，链霉素、氯霉素、红霉素等许多抗生素也相继问世，为临床治疗细菌感染性疾病提供了新型药物。近年来，随着抗生素的不断发展和大量使用，临床细菌耐药性不断出现，严重威胁着人类健康(Biotechnol Adv，2011，29(1)：67-74)。我们迫切需要寻找新的抗菌药物来控制和治疗这些病原菌引起的感染，而抗菌肽(AMPs)作为一种新型的抗菌药物，由于其不易产生耐药性的独特抗菌机制，被业界广泛关注。
AMPs是一种广泛存在于自然界的小分子活性肽，也称宿主防御肽，主要来自于昆虫、植物、动物和细菌等生物有机体，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性。如mellitin、cecropin和magainin，均已被证明具有较好的抗菌活性。天然存在的AMPs通常由12-50个氨基酸残基组成，虽然其大小，序列和二级结构特征各不相同，但具有共同特征：净正电荷和疏水性。净正电荷有助于抗菌肽分子附着到细菌细胞膜的负电荷表面而非真核细胞膜表面(Crit Rev Microbiol，2013，39(2)：180-95)。疏水性在促进细菌细胞裂解作用中起关键作用(Biotechnol Bioeng，2014，111(1)：37-49)。AMPs具有独特的作用机制：能使细菌细胞膜快速破坏和使细菌内容物泄漏，导致细菌死亡，这与针对病原体特定分子受体的抗生素作用机制明显不同；此外，AMPs还可以与细菌细胞内容物(如DNA或RNA)相互作用，干扰细菌的正常合成和代谢，从而导致细菌死亡。因此，AMPs因上述难以诱导细菌产生耐药性的作用机制，成为替代传统抗生素药物的理想选择(Biomaterials，2014，35(27)：8028-39)。
然而，虽然AMPs为克服细菌耐药性带来了希望和机会，但由于天然抗菌肽酶解稳定性差，半衰期短，抗菌活性不强等不足，仍然限制了其进一步的临床应用和发展。研究表明，脂肪酸作为生物膜磷脂的重要组成部分，具有较高的疏水性，将其引入AMPs中，有利于通过增加AMPs的疏水性而增强AMPs对细菌细胞膜的亲和力，从而增强其抗菌活性；脂肪酸还可以减少蛋白酶的降解，增强抗菌肽的酶解稳定性，延长抗菌肽体内作用时间(BiochemJ，2005，385(Pt 1)：135-43；Biophys Chem，2015，199：25-33)。与此同时，由于含有D-氨基酸残基的多肽不被抗原呈递细胞识别，若将脂肪酸与非天然D型氨基酸的引入技术相结合，能够显著降低抗菌肽对蛋白酶的敏感性，并且可因此降低其相关免疫原性(AntimicrobAgents Chemother，2004，48(8)：3127-3129)。另外，研究结果表明，采用分子间二聚化修饰可以显著提高抗菌肽的抗菌活性、稳定性和溶解度，且“叠氮基”和“炔丙基”通过点击化学形成的三唑结构有助于增强抗菌肽对细菌细胞膜的穿透能力，进而提高抗菌活性(FrontMicrobiol，2018，9：329；Peptides，2017，88：115-125)。
发明内容
本发明的目的之一：提供一类全新结构的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的新型N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物。
本发明的目的之二：提供上述具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。
本发明的目的之三：提供上述具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法。
(一)具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物
本发明具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物，包括单体抗菌肽类似物和二聚体抗菌肽类似物，单体抗菌肽类似物是在母肽Anoplin的部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7的N-末端进行不同长度的脂肪酸(Cn，n＝2-18)修饰，得到新型结构的N-末端脂肪酸修饰单体抗菌肽类似物Cn-D4,7，n＝2-18；二聚体抗菌肽类似物是在类似物Anoplin-D4,7的N-末端分别引入非天然的特殊氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH和Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH，得到前体肽Cn-Pra-D4,7(Cn，n＝2-18)和Ac-Lys(N3)-D4,7，然后通过“点击化学”，进行前体肽分子间侧链连接，得到N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。
Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)的结构式分别如下所示：
1、N-末端脂肪酸修饰单体抗菌肽类似物：
Cn-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2
其中，n＝2-18，命名为Cn-D4,7；
2、N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物：
其中，n＝2-18，命名为J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)。
本发明N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：
1、N-末端脂肪酸修饰单体抗菌肽类似物的合成
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，然后在Anoplin-D4,7-resin的N-末端进行不同长度脂肪酸修饰(Cn，n＝2-18)，切割、纯化后得到抗菌肽类似物Cn-D4,7，n＝2-18。其具体合成工艺如下：
(1)Fmoc-Anoplin-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Anoplin-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
(2)Cn-D4,7的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-resin，用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-resin进行缩合反应，得到Cn-D4,7-resin；将Cn-D4,7-resin切割、纯化得到单体抗菌肽类似物Cn-D4,7，n＝2-18；所述脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，脂肪酸、HOBT、HBTU与Anoplin-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1-3:1，DIEA与Anoplin-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1；
2、N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物的合成
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，再在Anoplin-D4,7-resin的N末端插入非天然氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH，然后进行脂肪酸修饰，切割、纯化后得到前体肽Cn-Pra-D4,7，n＝2-18；
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，再在Anoplin-D4,7-resin的N末端插入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，然后引入乙酸酐进行乙酰化，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin；对Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化后得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；
利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Cn-Pra-D4,7侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。其具体合成工艺为：
(1)Cn-Pra-D4,7的合成
a)Fmoc-Pra-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，Propargylgly(Pra)，得到Fmoc-Pra-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Pra-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
b)Cn-Pra-D4,7的合成
将上述得到的Fmoc-Pra-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Pra-D4,7-resin，然后分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA与DMF混匀，并与Pra-D4,7-resin混合，进行缩合反应，得到Cn-Pra-D4,7-resin；将Cn-Pra-D4,7-resin切割、纯化得到前体肽Cn-Pra-D4,7，n＝2-18；所述脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，脂肪酸、HOBT、HBTU与Pra-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1-3:1，DIEA与Pra-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1；
(2)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
a)Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，Lys(Mtt)，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
b)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
将上述得到的Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰。其中侧链叠氮化的方法为：将叠氮化钠(NaN3)与三氟甲磺酸酐(Tf2O)在水和DCM的混合液中室温反应2-2.5h，经DCM、无水碳酸钠和无水硫酸钠除水得到含三氟叠氮(TfN3)的DCM溶液；Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin脱去Mtt保护基的MBHA树脂经DCM和甲醇压缩膨胀，真空抽干后，与硫酸铜、碳酸钾和甲醇混合，再与三氟叠氮(TfN3)的DCM溶液室温反应48h，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D4,7-resin，最后再经切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；所述水与DCM的体积比为1:2，NaN3、Tf2O在水与DCM混合液中的浓度分别为：3-4mg/ml、100-200mg/ml，硫酸铜、碳酸钾与脱去Mtt保护基的Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin摩尔质量比分别0.1:1-0.3:1、0.3:1-0.5:1；
(3)J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)的合成
将前体肽Cn-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D4,7溶解于水中，加入含5％DMF的硫酸铜水溶液，以抗坏血酸钠作为抗氧化剂，室温避光反应24-28h，得到最终反应液；经RP-HPLC纯化，得到二聚体抗菌肽类似物J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。所述前体肽Cn-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D4,7的摩尔质量比为1:1-1.3:1，在水中的浓度均为8-10mg/ml，硫酸铜、抗坏血酸钠与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7的摩尔质量比分别为3:1-10:1、10:1-20:1；其反应过程如下：
以上所述切割试剂为TFA、三异丙基硅烷和水以体积比9.5:0.25:0.25形成的混合溶液。
所述纯化过程为，先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.1％TFA的水溶液)，流动相B：0.1％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
经质谱鉴定，本发明方法成功合成了新型结构的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。
(二)N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物体外活性研究
1、抑菌实验
采用经典的二倍微量稀释法测定抗菌肽类似物的最小抑菌浓度，即MIC值。将实验细菌分别于MH培养基中培养至对数期，并稀释成1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽类似物溶解于无菌水中，以二倍稀释法将其配成128μmol/L的溶液，与上述细菌悬浮液等体积混合，加于96孔培养板中，37℃孵育18h，观察，肉眼可见无细菌生长的最小浓度即为最小抑菌浓度MIC；抗生素Rifampicin、Penicillin、Polymyxin B作阳性对照药；平行重复三次上述实验，结果如表1。
表1对抗常见菌株的最小抑菌浓度
表1结果表明，N-末端脂肪酸修饰新型抗菌肽类似物Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)对常见细菌菌株以及耐药菌株MRSA具有良好的抗菌活性，其抗菌活性相比于母肽Anoplin有明显提高；随着脂肪酸链长度的增加，其抗菌活性显著增强，并且相同长度脂肪酸链修饰的二聚体抗菌肽类似物的抗菌活性优于单体抗菌肽类似物。
2、流式细胞术实验
采用大肠杆菌(ATCC25922)标准菌株，将其培养至对数期，稀释至10×108CFU/mL，经PBS(pH7.4)洗涤后，半体积重悬；将抗菌肽类似物溶解于PBS(pH7.4)，使其浓度为8×MIC，并与上述细菌悬浮液等体积混合，于37℃共孵育1h，经碘化吡啶(PI)避光染色15min后，洗涤除去多余染料，经流式细胞仪检测PI荧光的摄取能力，进而定量分析抗菌肽类似物对细菌细胞膜的破裂能力，结果如图11。
图11结果表明，N-末端脂肪酸修饰新型抗菌肽类似物Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，以及母肽Anoplin均具有较好的细菌细胞膜破坏能力；当n≥8时，N-末端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物对细菌细胞膜的破坏能力明显强于母肽Anoplin，可以为上述抗菌活性的显著增强做出解释，并且相同长度脂肪酸链修饰二聚体抗菌肽类似物的细菌膜破坏能力强于单体抗菌肽类似物。
4、诱导细菌耐药实验
采用大肠杆菌(ATCC25922)标准菌株，与上述抑菌实验方法相似，测抗菌肽类似物的最小抑菌浓度MIC，然后将1/2×MIC组分别再接种于MH培养基中培养至对数期，测抗菌肽类似物在该菌液中的MIC，以此类推，以相同的方法重复15次，观察最低抑菌浓度MIC值的变化，反应抗菌肽类似物诱导细菌产生耐药特性的能力，结果如图12。
图12结果表明，N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，以及母肽Anoplin均不易诱导细菌产生耐药性，但抗生素对照药Rifampicin容易诱导细菌产生耐药性，表明N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物优于传统抗生素。
5、酶解稳定性实验
将胰蛋白酶溶解于PBS(pH7.4)中，分别稀释至不同浓度(2000-0.2μg/ml)；将抗菌肽类似物溶解于PBS(PH7.4)中，使其浓度为1000μM，并分别与上述不同浓度胰酶溶液以1:4的体积比混合，37℃孵育6h；60℃灭活15min，将共孵物稀释，使抗菌肽类似物的浓度为2×MIC，并与1×10^6CFU/mL浓度的大肠杆菌(ATCC25922)悬浮液等体积混合，37℃孵育18h，测其600nm波长处的吸收值，并通过公式：Survival rate％＝OD600(peptides)/OD600(negative control),计算细菌在不同浓度胰蛋白酶环境下的存活率，进而反应抗菌肽类似物在不同浓度胰蛋白酶环境下的稳定性，结果如图13。
图13结果表明，母肽Anoplin在较低浓度的胰蛋白酶环境下丧失抗菌活性，即稳定性差，但N-末端脂肪酸修饰新型抗菌肽类似物Cn-D4,7和J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)在高浓度胰蛋白酶环境中均未丧失抗菌活性，说明N-末端脂肪酸修饰新型抗菌肽类似物在胰蛋白酶环境下具有高稳定性，稳定性明显优于母肽。
综上，本发明是在天然抗菌肽Anoplin部分D型氨基酸替换类似物Anoplin-D4,7的基础上，对其N-末端进行不同长度的脂肪酸修饰，并且通过点击化学进行分子间侧链连接，得到一类全新结构的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物。体外活性研究结果显示，该N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物具有高酶解稳定性和强抗菌活性，在临床抗菌药物开发中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为C4-D4,7质谱图；
图2为C8-D4,7质谱图；
图3为C12-D4,7质谱图；
图4为C4-Pra-D4,7质谱图；
图5为Ac-N3-D4,7质谱图；
图6为J-AA-(C4-D4,7+D4,7)质谱图；
图7为C8-Pra-D4,7质谱图；
图8为J-AA-(C8-D4,7+D4,7)质谱图；
图9位C12-Pra-D4,7质谱图；
图10为J-AA-(C12-D4,7+D4,7)质谱图；
图11为抗菌肽类似物PI流式细胞术实验结果图；图中以左到右，上到下的顺序依次为对照组、Anoplin组、J-AA-(C4-D4,7+D4,7)组、C8-D4,7组、J-AA-(C8-D4,7+D4,7)组、C12-D4,7组和J-AA-(C12-D4,7+D4,7)组。
图12为抗菌肽类似物诱导细菌耐药实验结果图；
图13为抗菌肽类似物酶解稳定性结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明全新结构的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的新型N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法作进一步说明。
实施例1：单体抗菌肽类似物C4-D4,7的合成
(1)树脂的活化及预处理
准确称取0.7g的MBHA树脂(0.43mmol/g)，加入多肽固相合成仪中，经DCM溶液充分溶胀30-40min后，茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明树脂正常。
(2)Fmoc-Anoplin-D4,7-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基；将Fmoc-Leu-OH(399mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，则表明缩合成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Leu(399mg)、Thr(360mg)、D-Lys(423mg)、Ile(399mg)、Arg(585mg)、D-Lys(423mg)、Leu(399mg)、Leu(399mg)、Gly(270mg)，HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Anoplin-D4,7-resin；
(3)C4-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将丁酸酐(Cn，n＝4；1.31ml)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Anoplin-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C4-D4,7-resin；
(4)多肽切割
将C4-D4,7-resin进行切割，切割试剂为TFA、三异丙基硅烷和水体积比9.5:0.25:0.25的混合溶液，经乙醚和水萃取后，冷冻干燥；
(5)多肽纯化
先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥，经质谱鉴定得单体抗菌肽类似物C4-D4,7，分子量为1223Da，质谱图见图1；其中，RP-HPLC纯化条件：流动相A:0.1％TFA/水；流动相B:0.1％TFA/乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
实施例2：单体抗菌肽类似物C8-D4,7的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Anoplin-D4,7-resin的合成
同实施例1。
(3)C8-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将辛酸酐(Cn，n＝8；2.3ml)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Anoplin-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C8-D4,7-resin。
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得到单体抗菌肽类似物C8-D4,7，分子量为1279Da，质谱图见图2。
实施例3：单体抗菌肽类似物C12-D4,7的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-Anoplin-D4,7-resin的合成
同实施例1。
(3)C12-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将月桂酸(Cn，n＝12；360mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Anoplin-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C12-D4,7-resin；
(4)多肽切割
同实施例1。
(5)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得单体抗菌肽类似物C12-D4,7，分子量为1335Da，质谱图见图3。
实施例4：N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C4-D4,7+D4,7)的合成
(1)C4-Pra-D4,7的合成
a)树脂的活化及预处理
同实施例1。
b)Fmoc-Pra-D4,7-resin的合成
方法同实施例1中(2)所述，将上述检验正常的MBHA树脂用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基；将Fmoc-Leu-OH(399mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，则表明缩合成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Leu(399mg)、Thr(360mg)、D-Lys(423mg)、Ile(399mg)、Arg(585mg)、D-Lys(423mg)、Leu(399mg)、Leu(399mg)、Gly(270mg)、Propargylgly(Pra)(302mg)，HOBT、HBTU和DIEA加入量同上，得到Fmoc-Pra-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Pra-D4,7-resin；
c)C4-Pra-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Pra-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将丁酸酐(Cn，n＝4；1.31ml)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Pra-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C4-Pra-D4,7-resin。
d)多肽切割
同实施例1
e)多肽纯化
同实施例1。经质谱鉴定得到前体肽C4-Pra-D4,7，分子量分别为1318Da，质谱图见图4。
(2)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
a)树脂的活化及预处理
同实施例1。
b)Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin的合成
方法同实施例1中(2)所述，将上述检验正常的MBHA树脂用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基；将Fmoc-Leu-OH(399mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的MBHA树脂混合，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，则表明缩合成功，得到Fmoc-Leu-resin；方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Leu(399mg)、Thr(360mg)、D-Lys(423mg)、Ile(399mg)、Arg(585mg)、D-Lys(423mg)、Leu(399mg)、Leu(399mg)、Gly(270mg)、Lys(Mtt)(563mg)，HOBT、HBTU和DIEA加入量同上，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin。
c)Ac-Lys(N3)-D4,7-resin的合成
将上述得到的Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰。其中侧链叠氮化的方法为：将3.9g的叠氮化钠(NaN3)与1.7ml的三氟甲磺酸酐(Tf2O)在10ml水和20ml DCM的混合液中室温反应2-2.5h，经DCM、无水碳酸钠和无水硫酸钠除水得到含三氟叠氮(TfN3)的DCM溶液；Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin脱去Mtt保护基的MBHA树脂经DCM和甲醇压缩膨胀，真空抽干后，与15mg硫酸铜、10mg碳酸钾、4ml甲醇混合，再与上述得到的含TfN3的DCM溶液室温反应48h，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D4,7-resin。
d)多肽切割
同实施例1。
e)多肽纯化
同实施例1。经质谱鉴定得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7，分子量为1349Da，质谱图见图5。
(3)J-AA-(C4-D4,7+D4,7)的合成
以前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7为基准，将14.19mg C4-Pra-D4,7和13.20mg Ac-Lys(N3)-D4,7溶解于2739μl水溶液中，使肽浓度为10mg/ml，加入1222μl含5％DMF的硫酸铜水溶液，38.82mg抗坏血酸钠作抗氧化剂，室温避光反应24h-28h，得到最终反应液；冷冻干燥，助溶剂TFE助溶后，经RP-HPLC纯化，最终经质谱鉴定得到二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C4-D4,7+D4,7)，分子量分别为2667Da，质谱图见图6。
实施例5：N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C8-D4,7+D4,7)的合成
(1)C8-Pra-D4,7的合成
a)树脂的活化及预处理
同实施例1。
b)Fmoc-Pra-D4,7-resin的合成
同实施例4。
c)C8-Pra-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Pra-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将辛酸(Cn，n＝8；2.3ml)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8mlDMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Pra-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C8-Pra-D4,7-resin。
d)多肽切割
同实施例1
e)多肽纯化
同实施例1。经质谱鉴定得到前体肽C8-Pra-D4,7，分子量分别为1374Da，质谱图见图7。
(2)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
同实施例4，经质谱鉴定得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7，分子量为1349Da，质谱图见5。
(3)J-AA-(C8-D4,7+D4,7)的合成
以前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7为基准，将14.80mg C8-Pra-D4,7和13.21mg Ac-Lys(N3)-D4,7溶解于2801μl水溶液中，使肽浓度为10mg/ml，加入1222μl含5％DMF的硫酸铜水溶液，38.80mg抗坏血酸钠作抗氧化剂，室温避光反应24h-28h，得到最终反应液；冷冻干燥，助溶剂TFE助溶后，经RP-HPLC纯化，最终经质谱鉴定得到二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C8-D4,7+D4,7)，分子量分别为2723Da，质谱图见图8。
实施例6：N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C12-D4,7+D4,7)的合成
(1)C12-Pra-D4,7的合成
a)树脂的活化及预处理
同实施例1。
b)Fmoc-Pra-D4,7-resin的合成
同实施例4。
c)C12-Pra-D4,7-resin的合成
将上述得到的Fmoc-Pra-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，分别将月桂酸(Cn，n＝12；360mg)、HOBT(123mg)、HBTU(342mg)、DIEA(0.3ml)于8ml DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Pra-D4,7-resin树脂混合，缩合反应1.5h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色，表明缩合反应完全，得到C12-Pra-D4,7-resin。
d)多肽切割
同实施例1
e)多肽纯化
同实施例1。经质谱鉴定得到前体肽C12-Pra-D4,7，分子量分别为1431Da，质谱图见图9。
(2)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
同实施例4，经质谱鉴定得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7，分子量为1349Da，质谱图见图5。
(3)J-AA-(C12-D4,7+D4,7)的合成
以前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7为基准，将15.45mg C8-Pra-D4,7和13.25mg Ac-Lys(N3)-D4,7溶解于2870μl水溶液中，使肽浓度为10mg/ml，加入1226μl含5％DMF的硫酸铜水溶液，38.92mg抗坏血酸钠作抗氧化剂，室温避光反应24h-28h，得到最终反应液；冷冻干燥，助溶剂TFE助溶后，经RP-HPLC纯化，最终经质谱鉴定得到二聚体抗菌肽类似物J-AA-(C12-D4,7+D4,7)，分子量分别为2780Da，质谱图见图10。

Claims (7)

1.具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物，其特征是，该抗菌肽类似物包括单体抗菌肽类似物和二聚体抗菌肽类似物，其结构式为：
Cn-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-D-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2
Cn-D4,7，n＝2-18；
或
J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。
2.如权利要求1所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物在临床抗菌药物开发中的应用。
3.如权利要求1所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是：
(1)N-末端脂肪酸修饰单体抗菌肽类似物的合成
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，然后在Anoplin-D4,7-resin的N-末端进行脂肪酸修饰，切割、纯化后得到抗菌肽类似物Cn-D4,7，n＝2-18；
(2)N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物的合成
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，再在Anoplin-D4,7-resin的N末端插入非天然氨基酸Fmoc-L-Propargylgly-OH，然后进行脂肪酸修饰，切割、纯化后得到前体肽Cn-Pra-D4,7，n＝2-18；
采用经典固相合成方法合成Anoplin-D4,7-resin，再在Anoplin-D4,7-resin的N末端插入非天然氨基酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH，然后引入乙酸酐进行乙酰化，得到Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin；对Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin进行侧链叠氮化修饰，切割、纯化后得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；
利用点击化学的1,3-偶极环加成反应，使前体肽Cn-Pra-D4,7侧链的“炔基”官能团分别与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7侧链的“叠氮基”官能团反应，将两条前体肽进行分子间侧链连接，得到N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18。
4.如权利要求3所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述N-末端脂肪酸修饰单体抗菌肽类似物的合成方法具体为：
(1)Fmoc-Anoplin-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Anoplin-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
(2)Cn-D4,7的合成
将上述得到的Fmoc-Anoplin-D4,7-resin，用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Anoplin-D4,7-resin；分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Anoplin-D4,7-resin进行缩合反应，得到Cn-D4,7-resin；将Cn-D4,7-resin切割、纯化得到单体抗菌肽类似物Cn-D4,7，n＝2-18；所述脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，脂肪酸、HOBT、HBTU与Anoplin-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1-3:1，DIEA与Anoplin-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1。
5.如权利要求3所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述N-末端脂肪酸修饰二聚体抗菌肽类似物的合成方法具体为：
(1)Cn-Pra-D4,7的合成
a)Fmoc-Pra-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，Pra，得到Fmoc-Pra-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin，即为Fmoc-Pra-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
b)Cn-Pra-D4,7的合成
将上述得到的Fmoc-Pra-D4,7-resin，同样用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Pra-D4,7-resin，然后分别将脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA与DMF混匀，并与Pra-D4,7-resin混合，进行缩合反应，得到Cn-Pra-D4,7-resin；将Cn-Pra-D4,7-resin切割、纯化得到前体肽Cn-Pra-D4,7，n＝2-18；所述脂肪酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，脂肪酸、HOBT、HBTU与Pra-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1-3:1，DIEA与Pra-D4,7-resin的摩尔质量比为6:1；
(2)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
a)Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin的合成
将Fmoc-Leu-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Leu-resin；同法依次缩合反应氨基酸Leu、Thr、D-Lys、Ile、Arg、D-Lys、Leu、Leu、Gly，Lys(Mtt)，得到Fmoc-Lys(Mtt)-Gly-Leu-Leu-D-Lys-Arg-Ile-D-Lys-Thr-Leu-Leu-resin即为Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin；所述各氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA在DMF中的浓度分别为40-100mg/ml，10-40mg/ml，30-50mg/ml，20-60mg/ml，各氨基酸、HOBT、HBTU与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比均为6:1-3:1，DIEA与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂的摩尔质量比为6:1；
b)Ac-Lys(N3)-D4,7的合成
将上述得到的Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin用含有1％TFA的DCM溶液脱去侧链Mtt保护基，并进行侧链叠氮化修饰。其中侧链叠氮化的方法为：将NaN3与Tf2O在水和DCM的混合液中室温反应2-2.5h，经DCM、无水碳酸钠和无水硫酸钠除水得到含TfN3的DCM溶液；Ac-Lys(Mtt)-D4,7-resin脱去Mtt保护基的MBHA树脂经DCM和甲醇压缩膨胀，真空抽干后，与硫酸铜、碳酸钾和甲醇混合，再与TfN3的DCM溶液室温反应48h，得到侧链叠氮化合物Ac-Lys(N3)-D4,7-resin，最后再经切割、纯化得到前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7；所述水与DCM的体积比为1:2，NaN3、Tf2O在水与DCM混合液中的浓度分别为：3-4mg/ml、100-200mg/ml，硫酸铜、碳酸钾与脱去Mtt保护基的Fmoc-Lys(Mtt)-D4,7-resin摩尔质量比分别0.1:1-0.3:1、0.3:1-0.5:1；
(3)J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)的合成
将前体肽Cn-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D4,7溶于水中，加入含5％DMF的硫酸铜水溶液，以抗坏血酸钠作为抗氧化剂，室温避光反应24～28h，得到最终反应液；该最终反应液经RP-HPLC纯化，得到二聚体抗菌肽类似物J-AA-(Cn-D4,7+D4,7)，n＝2-18；所述前体肽Cn-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D4,7的摩尔质量比为1:1-1.3:1，在水中的浓度均为8-10mg/ml，硫酸铜、抗坏血酸钠与前体肽Ac-Lys(N3)-D4,7的摩尔质量比分别为3:1-10:1、10:1-20:1；
6.如权利要求3-5任一项所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述切割试剂为TFA、三异丙基硅烷和水以体积比9.5:0.25:0.25形成的混合溶液。
7.如权利要求3-5任一项所述的具有高酶解稳定性和强抗菌活性的N-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，其特征是，所述纯化过程为，先进行RP-HPLC分离，然后冷冻干燥；RP-HPLC纯化条件为，流动相A：0.1％TFA的水溶液)，流动相B：0.1％TFA的乙腈溶液；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
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