CN102827250A - 脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽及其应用，其序列的通式如下:C_n-X₁-Leu-Ile-X₂-X₃-Val-X₃-X₂-Ile-Leu-X₁-NH₂，其中X₁、X₂、X₃为极性带正电荷的氨基酸，且全为L型氨基酸，C_n为不同长度的脂肪酸链。本多肽自组装原理是其分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。多肽序列N端修饰加上的脂肪酸长链可以增强自组装过程的疏水相互作用，促进自组装。发明所述脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，可用于研制新型纳米抗菌药物，也可作为分子传感器用于检测微环境的变化。

Description

脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽及其应用

技术领域

本发明属于自组装多肽领域，具体涉及一类脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽及其作为抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物及检测微环境变化的分子传感器的应用。

背景技术

肽分子自组装技术是近年来的研究热点，通过分子设计和固相合成等手段可以得到成千上万种结构相异的肽分子，肽分子自组装后形成的纳米尺寸材料具有广泛的潜在用途。国内外已有多肽材料应用于纳米生物医学领域的报道，包括用于3D细胞培养、组织修复、药物运输以及止血等，但目前现有技术公开的能自组装形成纳米尺寸材料用于上述领域的多肽在结构上多具有全程或半程电荷匹配的特点（唐丽丽，何道航^*．广东化工，2011，38(1)：76-79.）。对于阳离子多肽，作为具有抗菌作用的多肽有望克服临床上日益严重的细菌耐药性，国内外报道多用于构建抗菌剂。本发明设计出了一类脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽，它们的结构与上述多肽不同，可以应用于检测微环境变化，具有抗菌作用，通过脂肪酸修饰还可以调节抗菌活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽，以增加自组装多肽的类型，促进自组装多肽的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一类脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽，其序列的通式如下:C_n-X₁-Leu-Ile-X₂-X₃-Val-X₃-X₂-Ile-Leu-X₁-NH₂，其中C_n表示N端脂肪酸修饰，NH₂表示C端氨基化，X₁、X₂、X₃为极性带正电荷的氨基酸，且全为L型氨基酸，C_n为不同长度的脂肪酸链。

所述极性带正电荷的氨基酸为Arg、Lys或His。

所述C_n优选为月桂酸（C₁₂）、肉豆蔻酸（C₁₄）、棕榈酸（C₁₆）、硬脂酸（C₁₈）或花生酸（C₂₀）。

所述两亲性阳离子自组装多肽序列优选为C₁₆-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₄-KLIRKVKRILK-NH₂、C₁₂-KLIKKVKKILK-NH₂、C₁₈-HLIKKVKKILH-NH₂、C₂₀-HLIHKVKHILH-NH₂、C₂₀-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₈-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₄-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₂-RLIRKVKRILR-NH₂或C₁₂-RLIRRVRRILR-NH₂。

所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。

所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。

多肽自组装原理是其分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。多肽序列N端修饰加上的脂肪酸长链可以增强自组装过程的疏水相互作用，促进自组装。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

（1）本发明所述的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽在不同的环境条件下会发生不同的结构变化，因此，此种多肽可以在制备检测微环境变化的分子传感器中应用。不同的环境条件是指不同肽浓度、温度、NaCl浓度、SDS浓度及TFE体积分数的溶液。

（2）本发明所述的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，因此，可以用于研制适于临床上使用的新型纳米抗菌药物，有利于感染疾病的预防和治疗。

（3）本发明提供了一类新型结构的自组装多肽，增加了自组装多肽的类型，且可用作新型的分子传感器。

附图说明

图1是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的三维分子结构示意图。

图2是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的高效液相（HPLC）色谱图，结果显示它的纯度是95.2％。

图3是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的质谱（MS）图，结果显示它的分子量为1688.3。

图4是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅的浓度是0.4mg/ml。

图5是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽在0.1M NaCl溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅的浓度是0.4mg/ml。

图6是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明肽浓度对脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅结构的影响。

图7是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明温度对脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅结构的影响。

图8是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同NaCl浓度对脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅结构的影响。

图9是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同十二烷基硫酸钠（SDS）浓度对脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅结构的影响。

图10是本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同三氟乙醇（TFE）体积分数对脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅结构的影响。

图11是本发明所述不同浓度的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小示意图，图中，1、2、3处的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅的浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

当X₁为Arg，X₂为Arg，X₃为Lys，C_n为棕榈酸长链时，序列如下：

①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂

脂肪酸修饰自组装多肽①的合成：

1、材料

Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH（N-芴甲氧羰酰基-亮氨酸）、Fmoc-Ile-OH（N-芴甲氧羰酰基-异亮氨酸）、Fmoc-Lys(Boc)-OH(N-芴甲氧羰酰基-N′-叔丁氧羰酰基-赖氨酸)、Fmoc-Val-OH（N-芴甲氧羰酰基-缬氨酸）、棕榈酸、Rink Amide-MBHA Resin（树脂）、HBTU（O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂）和HOBT（1-羟基苯并三氮唑）购自杭州中肽生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、TFA（三氟乙酸）、NMM（N-甲基吗啉）、乙醚、甲醇、DCM（二氯甲烷）购自天津市富宇精细化工有限公司。

2、制备方法

采用Fmoc（芴甲氧羰酰基）保护的固相合成法，其工艺步骤如下：

（1）称取20g 0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin于肽合成器皿中，取200mlDMF溶涨树脂30min，然后抽滤，再取用300mlDMF洗涤树脂，分三次进行，每次的洗涤时间为2min，抽滤干洗涤液后向肽合成器中加入100ml 20％哌啶/DMF（V∶V）震荡反应30min，反应结束后，再抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成器皿中加入以下原料：

上述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。

（2）向肽合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF（V∶V）震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，结果树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

（a）Fmoc-Leu-OH           14.14g

（b）HBTU                  15.16g

（c）HOBT                  5.40g

（d）NMM                   4.39ml

（e）DMF                   160ml

上述原料加完后，震荡反应40min，反应结束后，用40mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间为2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

（3）变换步骤（2）中的（a）原料，（b）（c）（d）（e）原料及加入量不变，重复步骤（2）的操作；（a）原料依次替换为Fmoc-Ile-OH（14.14g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）、Fmoc-Lys(Boc)-OH（18.74g）、Fmoc-Val-OH（13.58g）、Fmoc-Lys(Boc)-OH（18.74g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）、Fmoc-Ile-OH（14.14g）、Fmoc-Leu-OH（14.14g）、Fmoc-Arg（pbf）-OH（25.95g）。即每重复一次步骤（2）的操作，变换一种（a）原料，直至将上述原料都使用一次为止，接着加入5eq.棕榈酸，完成N端修饰；

（4）再重复一次（1）（2）（3）步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；最后加入20％哌啶/DMF（V∶V）反应30min，洗净树脂，加入160ml 50％醋酸酐/DMF（V∶V）反应30min，用40mlDMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂8次，除去DMF。氮气吹干后，用TFA（三氟乙酸）/DCM强酸裂解液，裂解3小时，将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即得合成肽的粗品。合成肽粗品经HPLC（高效液相色谱）纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标合成肽。

3、本发明所述其他的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽可以通过替换上述1中的氨基酸及脂肪酸，按照上述2所述制备方法合成纯化得到。在此过程中不同的合成实验参数如下表1所示：

表1本发明所述部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的不同合成实验参数

实施例2：脂肪酸修饰自组装多肽①

C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

将实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①采用高效液相色谱（HPLC）检测，检测结果见图2，根据图2中的结果确定其纯度达到95.2％。

将实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①采用质谱（MS）检测，检测结果见图3，结果显示其分子量为1688.3。

对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①经分子模拟即基于能量最低原则绘制三维分子模型示意图，所绘制的示意图如图1所示，通过该图可知其氨基酸及脂肪酸链的空间分布。图中可见，多肽N端为棕榈酸修饰，C端氨基化。

本发明所述部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的高效液相色谱和质谱检测数据见表2：

表2本发明所述部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的纯度和分子量

实施例3：原子力显微镜（AFM）检测脂肪酸修饰自组装多肽①的纳米结构

1、原子力显微镜（AFM）检测脂肪酸修饰自组装多肽①在超纯水溶液中形成的纳米结构

取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml，进行AFM检测。

（1）取10μl样品溶液均匀置于新揭云母片上；

（2）每个样品在云母片表面停留约30～60s以便吸附；

（3）使用100μl Milli-Q超纯水冲洗云母片表面以除去未吸附样品；

（4）置于有盖培养皿中空气干燥，同时避免污染，放置过夜；

（5）在室温下，使用NanoscopeI lla(Digital Instruments，USA)在轻敲模式下扫描云母表面观察样品的纳米形貌。

AFM的形态图见图4，表明本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①在水溶液中可以形成球形聚集体。

2、原子力显微镜（AFM）检测脂肪酸修饰自组装多肽①在盐溶液中自组装形成的纳米结构

实验操作如上述1，只是在测试溶液中加入一定量的NaCl，使得最终的溶液中NaCl浓度为0.1M，多肽的浓度为0.4mg/ml。

AFM的形态图见图5，表明本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①在0.1MNaCl溶液中可以自组装形成不规则形状的纳米粒子。

实施例4：脂肪酸修饰自组装多肽①在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用通过圆二色性（CD）检测发现，本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽的结构对溶液环境的变化比较敏感，在不同的环境条件下会发生不同的结构变化，因此可用于制备检测微环境变化的分子传感器。不同溶液环境下的CD检测步骤及其结果如下：

1、利用CD检测脂肪酸修饰自组装多肽①在不同肽浓度溶液中的结构变化

采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至不同的浓度，浓度范围0.01～1.0mg/ml；

(2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

(3)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

测定结果如图6所示，表明随着肽浓度的升高，脂肪酸修饰自组装多肽①逐渐呈现出β-折叠的变化倾向。

2、利用CD检测脂肪酸修饰自组装多肽①在不同温度下的结构变化

采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml；

(2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

(3)CD扫描的数据采集范围是190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，以2℃/min的速率升温，在25～95℃温度范围内进行扫描，每10℃扫描一次，在每一温度下允许30s的平衡时间，误差0.1℃。升温之后，冷却降回25℃再次测试。

测定结果如图7所示，表明随着温度的升高，脂肪酸修饰自组装多肽①逐渐变得更加有序。

3、利用CD检测脂肪酸修饰自组装多肽①在不同NaCl浓度溶液中的结构变化

采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

(2)先用容量瓶配制成0.5mol/l的NaCl溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度：0.01mol/l，0.02mol/l，0.05mol/l，0.1mol/l，0.2mol/l和0.3mol/l，不同NaCl浓度的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

(3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

(4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

测定结果如图8所示，表明随着NaCl浓度的升高，本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①的二级结构从低浓度时的无规卷曲变为高浓度时的a-螺旋，说明本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①的构象变化对NaCl敏感。

4、利用CD检测脂肪酸修饰自组装多肽①在不同十二烷基硫酸钠（SDS）浓度溶液中的结构变化

采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

(2)先用容量瓶配制成0.3mol/l的SDS溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度：1mmol/l，2mmol/l，4mmol/l，8mmol/l，10mmol/l，30mmol/l，60mmol/l和180mmol/l，不同SDS浓度的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

(3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

(4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

测定结果如图9所示，表明在1mmol/l的SDS溶液当中，本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①主要以无规卷曲的形式存在，随着SDS浓度升高，脂肪酸修饰自组装多肽①出现无规卷曲到a-螺旋的结构变化，且在不同高浓度的SDS溶液中，自组装多肽①的a-螺旋二级结构谱线形状也有所区别，说明本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①的构象变化对SDS很敏感，同时可以抵抗SDS对蛋白的变性作用。

5、利用CD检测脂肪酸修饰自组装多肽①在不同三氟乙醇（TFE）浓度溶液中的结构变化

采用圆二色光谱仪(Chirascan Circular Dichroism Spectrometer)对实施例1制备的脂肪酸修饰自组装多肽①C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；

(2)吸取不同体积的TFE溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下不同的体积分数：10％、20％、30％、40％、50％和60％，不同TFE体积分数的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；

(3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；

(4)在25℃条件下进行CD扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。

测定结果如图10所示，表明在10％的TFE溶液当中，本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①主要以无规卷曲的形式存在，随着TFE体积分数的升高，脂肪酸修饰自组装多肽①出现无规卷曲到a-螺旋的结构变化，说明本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①的构象变化对TFE敏感。

上述所有测定结果提示，本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽①对溶液环境的变化比较敏感，可以根据不同的溶液环境发生不同的结构变化，因此，此种多肽可望在制备检测微环境变化的分子传感器中应用。

实施例5：本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽在制备新型纳米抗菌药物中的应用

1、脂肪酸修饰自组装多肽①

C₁₆H₃₁O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH₂在制备新型纳米抗菌药物中的应用

（1）试验菌株

金黄色葡萄球菌CMCC26003（广东微生物种质资源库）。

（2）试验方法

采用牛津杯法测定本发明所述脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对受试菌的抑菌圈，根据抑菌圈大小判断其抑菌活性强弱。抑菌圈直径≥12mm表明样品有抗菌活性。

本试验中所用的脂肪酸修饰自组装多肽①溶液使用无菌Milli-Q超纯水新鲜配制，浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml，备用。

本试验中所用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，受试菌液终浓度约为10⁶CFU/ml，备用。

（3）测定受试菌的抑菌圈

将约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入直径为9cm的灭菌培养皿内，待冷却后，用移液枪吸取0.1ml上述步骤（2）中制备的受试菌液，加入培养皿中，用涂布棒轻轻均匀地涂抹于各琼脂平皿表面。待菌液干后，在琼脂平皿表面放上直径为6mm(内径)的不锈钢牛津小杯并做好标记。用移液枪吸取200μl上述配制好的受试样品溶液，分别滴加入牛津杯中，每个浓度作三个平行样，以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照。

样品加完后，将各琼脂平皿盖好，置于37℃孵育24小时，观察不同浓度的各受试药液周围有无抑菌圈，将每个抑菌圈按三个不同方向测量其直径，三次测量的平均值即为该抑菌圈直径的大小。各药物的三组数据统计完后，取其抑菌圈大小的平均值作为该浓度下受试药液的抑菌能力大小判断数值。按药物敏感实验判定标准和受试样品脂肪酸修饰自组装多肽①的抑菌圈大小判断其抑菌活性强弱。

（4）判断标准

待测样品周围出现清晰抑菌圈，抑菌圈直径≥12mm为敏感，表明样品有抗菌活性。药物敏感实验判定标准见表3。

表3药物敏感实验判定标准

（5）对金黄色葡萄球菌的测试结果

根据抑菌圈大小可知，脂肪酸修饰自组装多肽①对金黄色葡萄球菌CMCC26003具有较好的抗菌活性。图11是不同浓度的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小示意图，图中，1、2、3处的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽C₁₆-P₅VP₅的浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml。脂肪酸修饰自组装多肽①浓度为0.01mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径＜10mm，此时抑菌活性较差；脂肪酸修饰自组装多肽①浓度为0.1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为17mm；脂肪酸修饰自组装多肽①浓度为1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为20mm。结果表明，脂肪酸修饰自组装多肽①的浓度在0.1mg/ml及1mg/ml时对受试的金黄色葡萄球菌的抑菌作用很强。当脂肪酸修饰自组装多肽①的浓度为O.Omg/ml，即以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照测试时，受试的金黄色葡萄球菌未出现清晰的抑菌圈。

2、脂肪酸修饰自组装多肽②

C₁₄H₂₇O-Lys-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Lys-NH₂在制备新型纳米抗菌药物中的应用

抑菌活性实验操作如上述1，将脂肪酸修饰自组装多肽①换为脂肪酸修饰自组装多肽②，测试其抑菌圈大小。

根据抑菌圈大小可知，脂肪酸修饰自组装多肽②对金黄色葡萄球菌CMCC26003具有较好的抗菌活性。

脂肪酸修饰自组装多肽②浓度为0.01mg/ml 时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径＜10mm，此时抑菌活性较差；脂肪酸修饰自组装多肽②浓度为0.1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15mm；脂肪酸修饰自组装多肽②浓度为1mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为19mm。结果表明，脂肪酸修饰自组装多肽②的浓度在0.1mg/ml及1mg/ml时对受试的金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强。

当脂肪酸修饰自组装多肽②的浓度为0.0mg/ml即以无菌Milli-Q超纯水作为空白对照测试时，受试的金黄色葡萄球菌未出现清晰的抑菌圈。

3、本发明所述部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度

本发明所述部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度结果见表4。

表4部分脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌敏感度

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一类脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽，其特征在于，其序列的通式如下:

C_n-X₁-Leu-Ile-X₂-X₃-Val-X₃-X₂-Ile-Leu-X₁-NH₂，其中C_n表示N端脂肪酸修饰，NH2表示C端氨基化，X₁、X₂、X₃为极性带正电荷的氨基酸，且全为L型氨基酸，C_n为不同长度的脂肪酸链。

2.根据权利要求1所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽，其特征在于，所述C_n优选为月桂酸（C₁₂）、肉豆蔻酸（C₁₄）、棕榈酸（C₁₆）、硬脂酸（C₁₈）或花生酸（C₂₀）。

3.根据权利要求2所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽，其特征在于，所述两亲性阳离子自组装多肽序列优选为C₁₆-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₄-KLIRKVKRILK-NH₂、C₁₂-KLIKKVKKILK-NH₂、C₁₈-HLIKKVKKILH-NH₂、C₂₀-HLIHKVKHILH-NH₂、C₂₀-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₈-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₄-RLIRKVKRILR-NH₂、C₁₂-RLIRKVKRILR-NH₂或C₁₂-RLIRRVRRILR-NH₂。

4.权利要求1中所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽在制备抑制金黄色葡萄球菌新型纳米抗菌药物中的应用。

5.权利要求1中所述的脂肪酸修饰的两亲性阳离子自组装多肽在制备检测微环境变化的分子传感器中的应用。

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