CN101054409B

CN101054409B - 两亲型短肽及其用途

Info

Publication number: CN101054409B
Application number: CN2007100490481A
Authority: CN
Inventors: 罗忠礼; 赵晓军; 张曙光
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2007-05-09
Filing date: 2007-05-09
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2027-05-09
Also published as: CN101054409A

Abstract

一种两亲型短肽，命名为D-EAK，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。实验表明，本发明所述两亲型短肽可在制备温控型、酸碱性分子器件或者生物分子探针中应用，可在制备保湿锁水剂中应用，可在细胞培养中应用。实验还表明，本发明所述两亲型短肽对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌具有较好的抑菌作用，可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂制成适于临床使用的抑菌药物。

Description

两亲型短肽及其用途

技术领域

本发明属于自组装短肽领域，特别涉及一种两亲型短肽及其用途。

背景技术

自张曙光博士(S.Zhang)于1992年在美国麻省理工学院从酵母蛋白中发现了一组异乎寻常的自组装离子短肽后，开拓了一个分子自组装技术的新领域。分子自组装作为化学合成、纳米技术、高分子材料和工程等技术的一种新方法，得到了快速发展，10多年来，已有一系列可自组装的离子短肽问世。现有自组装短肽可分为以下几类：1、“分子积木”肽，具有性质截然不同的表面，即亲水与憎水表面像积木块的楔和孔一样，能自组装成不同的结构。2、“分子开关”肽，能在外界条件改变时发生结构突变，在分子元件中可以利用此结构突变控制其开关。3、“分子墨水”肽，能在材料表面自组装形成一层覆盖层，为细胞生长和细胞与其它分子的作用提供一种物质基础。4、“蛋白质表面活性剂”肽，主要功能是在一定的条件下能稳定膜蛋白，比如稳定光合作用蛋白等。研究表明，上述类型的短肽都是利用L型氨基酸进行分子自组装。

发明内容

本发明的目的在于提供一种两亲型短肽，以增加自组装短肽的类型，促进自组装短肽的应用。

本发明利用D型氨基酸建构开发了新一代自组装短肽——两亲型短肽，原理是分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。本发明所述两亲型短肽命名为D-EAK，分子量为1656.8，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

实验表明，可以通过改变温度、酸碱性来调整本发明所述两亲型短肽D-EAK的二级结构，因此，此种短肽可在制备温控型、酸碱性分子器件或者生物分子探针中应用。

实验表明，本发明所述两亲型短肽D-EAK能形成非常优良的水凝胶，肽与水的质量比可达1∶99，因此，此种短肽是一种高效的锁水性物质，可在制备保湿锁水剂中应用。

实验表明，本发明所述两亲型短肽D-EAK形成的水凝胶呈纤维形态结构，细胞可以在短肽D-EAK面三维黏附、生长，因此，此种短肽可在细胞培养中应用。

实验表明，本发明所述两亲型短肽D-EAK对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌具有较好的抑菌作用，因此，可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂制成适于临床使用的抑菌药物。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了一种新型结构的自组装短肽，增加了自组装短肽的类型。

2、提供了一种新型的自组装材料，此种材料具有广阔的应用前景，明显的社会效益和经济效益。

3、提供了一种新型的抑菌药物，有利于疾病的预防和治疗。

附图说明

图1是本发明所述两亲型短肽的分子结构示意图，图中，碳原子为青色，氧原子为红色，氮原子为蓝色，氢原子为白色，该图表明本发明所述两亲型短肽具有稳定β结构。

图2A是本发明所述两亲型短肽的高效液相(HPLC)色谱图，图2B是本发明所述两亲型短肽的质谱(MS)图。

图3是本发明所述两亲型短肽的圆二色(CD)谱图，该图表明温度对两亲型短肽D-EAK结构的影响。

图4是本发明所述两亲型短肽的圆二色(CD)谱图，该图表明酸碱性对两亲型短肽D-EAK结构的影响。

图5是本发明所述两亲型短肽的圆二色(CD)谱图，该图表明不同盐浓度对两亲型短肽D-EAK结构的影响。

图6是本发明所述两亲型短肽的圆二色(CD)谱图，该图表明变性剂对两亲型短肽D-EAK结构的影响。

图7是本发明所述两亲型短肽形成的水凝胶的光学图片(×40)，刚果红染色。

图8是本发明所述两亲型短肽形成的水凝胶的扫描电镜图(SEM)，其中，A图的放大倍数(×10000)，B图的放大倍数(×20000)，C图的放大倍数(×40000)。

图9是本发明所述两亲型短肽的原子力显微图(AFM)。

图10是SMMC7721细胞在本发明所述两亲型短肽上的形态学图(×40)，图A是在三维培养第一天的形态学图，图B是在三维培养第6天的形态学图。

图11是本发明所述两亲型短肽D-EAK和L-EAK对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌圈大小示意图；其中，图A为不同浓度的D-EAK的抑菌圈的大小示意图，图B为不同浓度的L-EAK的抑菌圈的大小示意图；图A中，1、2、3、4处的D-EAK浓度分别为0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml，中间5处为对照(头孢哌酮抗生素药敏纸片)；图B中，1、2、3、4处的L-EAK浓度分别为0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml，中间5处为对照(头孢哌酮抗生素药敏纸片)。

具体实施方式

实施例1：两亲型短肽的制备

1、材料

Fmoc-D-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(芴甲氧羰酰基D-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Lys(Boc)-Rink amide Resin(芴甲氧羰酰基-D-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基-瑞克酰氨树脂)、Fmoc-D-Glu(OtBμ)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-谷氨酸-γ-叔丁酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)购自四川盛鑫生物药业有限公司；哌啶，乙酸酐，溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、DCM(二氯甲烷)、NMM(N-甲基吗啉)购自成都傲飞生物化学品有限公司。

2、制备方法

采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，工艺步骤如下：

(1)称取0.5mmol/gRink amide resin 20g于肽合成器皿中，用200ml DMF溶涨resin30分钟，抽滤，再用300mlDMF分三次洗涤树脂，每次洗涤时间为2分钟，抽滤干洗涤液，向合成器中加入100ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应也中加入原料：

Fmoc-D-Lys(Boc)-OH 18.72g

HBTU 15.16g

HOBT 5.40g

NMM 4.39ml

DMF 160ml

上原料加完后，震荡反应30分钟，反应结束后，用400mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

上述原料加完后，反应40min，抽滤，用30ml DMF洗涤树脂4次，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(2)向合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用40mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

(a)Fmoc-D-Ala-OH 12.44g

(b)HOBT 15.16mg

(c)NMM 4.39ml

(d)DMF 160ml

上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(3)变换步骤(2)中的(a)原料，(b)(c)(d)原料及加入量不变，重复步骤(2)的操作；步骤(2)中的(a)原料依次替换为Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(18.72g)、Fmoc-D-Ala-OH(12.44g)、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(17.00g)、Fmoc-D-Ala-OH(12.44g)、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(17.00g)、Fmoc-D-Ala-OH(12.44g)；

(4)再重复一次(1)(2)(3)步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；

最后一个D-Ala合成结束后，脱出Fmoc-保护基，20％哌啶/DMF(哌啶的体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加160ml 50％乙酸酐/DMF(乙酸酐的体积浓度)反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥8小时。将50ml 90％TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加乙醚，析出白色固体，抽滤出固体，即得粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥即得本发明所述两亲型短肽D-EAK，氨基酸序列为序列表中SEQID NO.1所述。

实施例2：两亲型短肽的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

将实施例1制备的两亲型短肽D-EAK采用高效液相色谱(HPLC)检测，检测结果见图2A，根据图2A中的谱峰面积确定其纯度达到了95％。

将实施例1制备的两亲型短肽D-EAK采用质谱(MS)检测，检测结果见图2B，根据图2B可确定其理论分子量为1656.8是正确的。

对实施例1制备的两亲型短肽D-EAK采用普通画图软件基于能量最小化原理绘制三维分子模型示意图，所绘制的三维分子模型示意图见图1，通过该示意图，清楚的知道其氨基酸的空间分布。

实施例3：两亲型短肽的圆二色性(CD)检测

1、温度对两亲型短肽D-EAK结构的影响

采用圆二色仪(AVIV 400 CD spectrometer)对实施例1制备的两亲型短肽D-EAK进行CD检测，步骤如下：

(1)取储存于4℃的D-EAK样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用18.2KΩ/cm²的水稀释至100μmol/l；

(2)每次测定前用20～100μl步骤(1)配制的D-EAK溶液润洗石英杯3次，每次测定时向石英杯中加入不少于500μl步骤(1)配制的D-EAK溶液；

(3)测定温度从4℃至110℃、再从110℃到4℃，其中温度步长为2.00℃，误差为0.10℃，平衡时间为30秒，测定时，波长间隔为3秒，在100～110℃时，为防止水蒸气蒸发导致被测D-EAK溶液浓度变化，用矿物油进行覆盖。

测定结果见图3，表明：在10℃到60℃，两亲型短肽D-EAK保持了相当的稳定性；两亲型短肽D-EAK的二级结构在70℃有一定的变化，即α到β或者β到α的变化，在90℃时，这种变化倾向不再明显。

上述测定结果提示，可以通过改变温度来调节本发明所述两亲型短肽D-EAK的二级结构，因此，此种短肽可望在制备温控型分子器件(如制造温控变化的分子开关)中应用。

2、酸碱性对两亲型短肽D-EAK结构的影响

(3)测定温度25℃，测定时，波长间隔为3秒，被测D-EAK溶液用1mol/l盐酸调节或者1mol/l氢氧化钠调节pH，使用普通pH计测定。

测定结果见图4，表明：在被测D-EAK溶液的pH为0.76、3.7、6.1、7.2、10.5和12.0时，本发明所述两亲型短肽D-EAK具有不同的稳定性，在pH 7.2时，短肽D-EAK是比较稳定的，但是在酸性和碱性条件下，短肽D-EAK有一定的α到β和β到α的结构变化，也就是说短肽D-EAK对酸和碱都具有敏感性。

上述测定结果提示，可以通过改变酸碱性来调整本发明所述两亲型短肽D-EAK的二级结构，因此，此种短肽可望在制备酸碱性分子器件或者生物分子探针中应用。

3、盐浓度对两亲型短肽D-EAK结构的影响

(3)盐选用NaCl，其浓度用容量瓶配制而成1000mmol/l，再加18.2KΩ/cm²的水进行稀释配成如下的浓度：1mmol/l、10mmol/l、100mmol/l、250mmol/l、500mmol/l、750mmol/l；

(4)测定温度在25℃，测定时，波长间隔为3秒。

测定结果见图5，表明：不同浓度的NaCl(如1mmol/l、10mmol/l、100mmol/l、250mmol/l、500mmol/l、750mmol/l和1000mmol/l)对本发明所述两亲型短肽D-EAK的构象变化的影响不明显，也就是说，在盐的作用下短肽D-EAK具有稳定的β二级结构。

上述测定结果提示，本发明所述两亲型短肽D-EAK在盐的作用下可以稳定存在。

4、变性剂对两亲型短肽D-EAK结构的影响

(1)取储存于4℃的D-EAK样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用18.2KΩ/cm²的水稀释至100mmol/l；

(3)变性剂采用SDS(十二烷基苯磺酸钠)的浓度0.1％(质量浓度)，用18.2KΩ/cm²的水配制而成；

(4)测定温度在25℃，测定时的波长间隔为3秒。

测定结果见图6，表明：在0.1％SDS作用下，在不同时间2分钟，10分钟，32小时和56小时，短肽D-EAK的二级结构也没有发生显著变化。

上述测定结果提示，本发明所述两亲型短肽D-EAK即使是在变性剂作用下，β二级结构也是比较稳定的。

实施例4：两亲型短肽在不同条件下形成水凝胶

1、两亲型短肽在不同盐作用下形成水凝胶

(1)取储存于4℃的D-EAK样品制备成浓度1.0mg/ml的溶液，用18.2KΩ/cm²的水稀释至500mmol/l或者1000mmol/l；

(2)在NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃、KCl、CsCl、CaCl₂、ZnCl₂，、CuCl₂、FeCl₃、AgNO₃、NaHPO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄中的一种或者多种盐作用下；

(3)在上述盐的不同浓度下，如0.001mol/l、0.01mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l、0.5mol/l、0.75mol/l、1mol/l；

(4)自组装时间至少为12小时。

2、两亲型短肽在生理条件下形成水凝胶

(1)取含胎牛血清8～10％的培养基(如DMEM或MEM或RPMI-1640等)100μl滴入96孔板；

(2)在步骤(1)的溶液中再加入质量浓度为1％的两亲型短肽D-EAK溶液100μl；

(3)玻璃吸管或者200μl枪头快速吹打混匀；

(4)置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中培养1天。

在上述两种条件下，本发明所述两亲型短肽均能自组装形成透明水凝胶，所形成的水凝胶在肉眼下为透明胶体；在光学显微镜下观察，刚果红染色，如图7所示。

3、锁水性能

在上述1、2条件下，将本发明所述两亲型短肽10mg溶解于1ml 18.2KΩ/cm²水中，可形成稳定水凝胶，此时短肽D-EAK与水的质量比可达1∶99，是一种高效的锁水性物质。

实施例5：两亲型短肽的形态检测

1、电子显微镜(SEM)检测

取实施例4制备的任一种水凝胶进行检测。

(1)把上述水凝胶首先用5％(体积比)的戊二醛于4℃固定在18×18cm²的玻璃片上30～60分钟；

(2)用体积浓度20％、50％、70％、90％和100％乙醇梯度脱水

(3)经过CO₂临界干燥4小时；

(4)喷金；

(5)使用扫描电子显微镜(JSM-5900，JEOL，Japan)观察。

电子显微镜(SEM)下的形态图见图8，其中，A图的放大倍数(×10000)，B图的放大倍数(×20000)，C图的放大倍数(×40000)。图8表明，本发明所述两亲型短肽形成的水凝胶的微观形态呈纤维状，纤维大小约30～80nm；纤维之间的孔径约为50～80nm，上述结果提示，本发明所述两亲型短肽可望在细胞三维培养中应用。

2、原子力显微镜(AFM)检测

取实施例4制备的任一种水凝胶进行检测。

(1)将5～10μl水凝胶滴于干净云母片上；

(2)水平静置30～60秒；

(3)使用100μl 18.2KΩ/cm²水冲洗至少三次；

(4)放置含检测样品的云母片于超净工作台自然凉干；

(5)采用原子力显微镜(SPM400，Japan)，以模式为敲打模式(Tapping Mode)，观察。

原子力显微镜(AFM)下的形态图见图9，表明，本发明所述两亲型短肽形成的水凝胶的微观形态结构呈纳米纤维结构。

上述结果进一步提示，本发明所述两亲型短肽可在细胞三维培养中应用。

实施例6：细胞在两亲型短肽中的三维生长实验

将人肝癌细胞株SMMC-7721(四川大学移植免疫实验室购买)和正常肝细胞L02(四川大学移植免疫实验室购买)从液氮罐中取出，置于37℃水浴中迅速溶解，再加入RPMI-1640(Gibco公司)培养液，悬浮离心沉淀的细胞，然后接种于25cm²培养瓶中，再加入培养液为RPMI-1640的完全培养基，其主要成份为1％双抗溶液(青链霉素)，8-10％(体积浓度)胎牛血清(Gibco公司)。把培养瓶置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中培养，每2天换液一次。待细胞贴壁生长铺满培养瓶后即可将细胞分瓶传代。传代时在超净台内先将培养瓶内培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25％的胰酶1ml使贴壁细胞游离，可以适当振荡。显微镜下观察见细胞不再贴壁已经悬浮，加入1～2ml RPMI-1640的完全培养基终止胰酶作用。将培养瓶中液体移入离心管中，800转/分，8分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用RPMI-1640的完全培养基培养液悬浮细胞，分瓶接种。

细胞生长至对数生长期常规胰酶消化传代共8瓶，培养细胞6天后，使用倒置相差显微镜进行形态对比观察细胞是否可以在本发明所述两亲型短肽中三维生长。

三维培养模式如下：

(1)将实施例1制备的两亲型短肽D-EAK用18.2KΩ/cm²的水配制成浓度1％(质量浓度)的溶液，取100μl备用；

(2)准备A溶液100μl，所述A溶液可以是D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-乳糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-麦牙糖、L-阿拉伯糖、蔗糖、L-山犁糖、D-核酮糖中的一种或者几种的混合，质量浓度为5％、10％、20％、40％、60％中的一种；

(3)将上述培养好的细胞用0.25％胰酶消化，移入离心管中，800rmp/min，8min离心沉淀细胞，弃去上清液，加入A溶液记数到5×10⁵个/ml，取100μl备用；

(4)将步骤(2)配制的A溶液与步骤(3)获得的细胞液混合后迅速加入步骤(1)配制的短肽D-EAK溶液中；

(5)迅速取步骤(4)获得的溶液50μl于24孔板，加入5μl完全培养基，放置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中，等待时间为T₁分钟(T₁是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、120分钟中的一种)，保持一定的角度，此时的角度倾斜为10度、20度、30度、40度、50度、60度、180度中的一种；

(6)取出24孔板，轻轻加入50μl完全培养基RPMI-1640，放置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中等待时间为T₂分钟(T₂时间可以是10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、100分钟、120分钟、200分钟、300分钟中的一种)；

(7)取出24孔板，轻轻加入200μl完全培养基RPMI-1640，放置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中等待时间为T₃分钟(T₃是30分钟、60分钟、120分钟、240分钟、600分钟、1200分钟、2400分钟、4800分钟中的一种)，保持一定的角度，此时的角度倾斜为10度、20度、30度、40度、50度、60度、180度中的一种；

(8)经过上述T₁、T₂、T₃时间后，吸出原培养基，加入完全培养基RPMI-1640，放置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中。此后，通常每2天换一次完全培养基，常规培养，直至所需。

倒置相差显微镜下的形态图见图10，其中，图A是在三维培养第一天的形态学图，图B是在三维培养第6天的形态学图，图10表明，细胞可以在本发明所述两亲型短肽D-EAK面三维黏附、生长。

上述结果提示，本发明所述两亲型短肽可望作为细胞培养的支架材料，在细胞三维培养中应用。

实施例7：两亲型短肽在制备抑菌药物中的应用

1、试验药物

受试样品：本发明所述两亲型短肽D-EAK；现有短肽AC-A₁-E₁-A₁-E₁-A₁-K₁-A₁-K₁-A₁-E₁-A₁-E₁-A₁-K₁-A₁-K₁-NH2，其中A₁、E₁、K₁全部为L型氨基酸，简称L-EAK(Zhang，S.，Holmes，T.，Lockshin，C.& Rich，A.(1993)Spontaneoμs assembly of a self-complementaryoligopeptide to form a stable macroscopic membrane.Proc.Natl.Acad.Sci.MSA 90，3334-3338.)。受试样品均为无色透明液体，含量为1mg/ml。理化性状：易溶于水。

对照药物(抗生素纸片)：头孢哌酮纸片(75μg/片)，购自中国药品生物制品检定所。

2、试验菌株

标准质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单孢菌ATCC27853(四川抗菌素研究所)。

3、培养基及培养条件

金黄色葡萄球菌在MH培养基(含2％的NaCl)，35℃孵育18小时；其它革兰氏阴性杆菌均为MH培养基，35℃培养16～18小时；

4、试验方法

采用琼脂扩散法测定其对受试菌的抑菌环。根据抑菌环大小再判断其抑菌活性强弱，抑菌环直径≥12mm表明有抗菌活性。最低抑菌浓度(MIC)的判断，以受试样品出现抑菌环(直径≥12mm)的最低稀释浓度判定为MIC值。配制方法是用无菌双蒸水将受试样品D-EAK和L-EAK稀释至0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml的溶液备用。试验前新鲜配制。

测试方法：实验时，分别取直径为6mm(内径)的不锈钢牛津小杯，分别滴加入上述配制好的受试样品溶液各300μl，每个浓度作双份。

受试菌液的制备：试验前一天复苏试验菌株，试验时挑取生长良好的单菌落，用生理盐水稀释至0.5#麦氏比浊管浊度，再稀释1000倍，菌液终浓度约为10⁵cfu/ml备用。

5、对受试菌的抑菌环的测定方法

先分别吸取15ml的MH培养基倾倒入直径为9cm的灭菌平皿内，待冷却后，分别用灭菌棉签粘取上述步骤4中制备的受试菌液，轻轻均匀地涂抹于各琼脂平皿表面。待菌液干后，在琼脂平皿表面放上不锈钢牛津小杯和待测抗生素纸片。然后再依次将配制好的D-EAK、L-EAK溶液滴加入不锈钢小杯内，同时贴上阳性对照药纸片(头孢哌酮纸片)。作好标记，每个琼脂平皿内加入测试样品的顺序上下、左右分别为待测样品浓度1、2；中间为头孢哌酮纸片(即每个平皿内放4个牛津小杯，上下为同一浓度，左右为同一浓度样品，中间放置头孢哌酮纸片)。

样品加好后，将各琼脂平皿盖盖好，置35℃孵育18小时，观察各受试药液周围有无抑菌环，用游标卡尺量取抑菌环大小。按对照用抗生素纸片的敏感、耐药判断标准(NCCLS2004)和待测样品D-EAK、L-EAK的抑菌环大小判断其抑菌活性的强弱。

6判断标准

参阅试验中所用抗生素的敏感性判断标准进行判断。

待测样品周围出现清晰抑菌环，抑菌环直径≥10～12mm为敏感，表明有抗菌活性。

下表为头孢哌酮抗生素药敏纸片的敏感性判断标准(NCCLS2002～2004)

7、对标准菌株的测试结果

在本次实验条件下，D-EAK、L-EAK对所试的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单孢菌ATCC27853均具有强弱不同的抗菌活性。

对照药物头孢哌酮纸片(75μg/片)的抑菌环直径范围26～27mm(图11A、B)。

短肽D-EAK的各个浓度对所试金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌的抑菌作用较好。D-EAK浓度依次分别是0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌环直径分别为24mm、26mm、27mm、27mm(图11A)；其对大肠埃希菌的抑菌环直径范围分别为13mm、18mm、16mm、25mm；其对铜绿假单孢菌的抑菌环直径范围分别为24mm、20mm、19mm、18mm。

短肽L-EAK对所试金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好，0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml浓度出现抑菌圈的直径分别是18mm、28mm、27mm、27mm(图11B)；其对大肠埃希菌的抑菌作用较差，其出现抑菌圈的直径范围为7～12mm；L-EAK在0.1mg/ml浓度对铜绿假单孢菌基本无抑菌作用，抑菌环直径为8mm。但在0.01mg/ml、0.001mg/ml和0.0001mg/ml浓度有较强的抑菌作用，其抑菌环直径分别为30mm、30mm、26mm。

当D-EAK和L-EAK空白测试即浓度为0.0mg/ml时，所有的测试菌株的抑菌圈未出现清晰抑菌环，抑菌环直径≤10～12mm。

SEQMENCE LISTINE

<110>四川大学

<120>两亲型短肽及其用途

<160>1

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>16

<213>人工合成

<220>

<223>其它描述：描述这段人工合成序列：这段序列是人工合成。它们由发明者发明，来源于左听蛋白(Zuotin)的序列(310-325)

<400>1

AC D-Ala D-Glu D-Ala D-Glu D-Ala D-Lys D-Ala D-Lys D-Ala D-Glu

1 5 10

D-Ala D-Glu D-Ala D-Lys D-Ala D-Lys NH₂

15

Claims

1.一种两亲型短肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

2.权利要求1所述两亲型短肽在制备保湿锁水剂中的应用。

3.权利要求1所述两亲型短肽在细胞培养中的应用。

4.权利要求1所述两亲型短肽在制备抑制金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌或铜绿假单孢菌药物中的应用。