CN107400159A - 多肽及其应用 - Google Patents

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CN107400159A CN201610330969.4A CN201610330969A CN107400159A CN 107400159 A CN107400159 A CN 107400159A CN 201610330969 A CN201610330969 A CN 201610330969A CN 107400159 A CN107400159 A CN 107400159A
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Abstract

本发明公开多肽及其应用，多肽包含式(1)所代表的序列或其盐：P1‑Ala‑Gly‑X1‑Ala‑X2‑X3‑X4‑P2，通过抑制癌细胞中APC/Asef蛋白相互作用起到抗肿瘤作用。本发明抗肿瘤肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，肽链长度短，抗肿瘤活性高，而且稳定不易失活。

Description

多肽及其应用
技术领域
本发明属于多肽领域，更具体地讲，涉及一种抗肿瘤多肽及其应用。
背景技术
细胞内特异性的蛋白质之间相互作用构成了细胞内多种多样的信号转导通路，对正常细胞及癌细胞的生存都至关重要，是一类重要的药物靶标来源。研究发现，癌细胞中存在一种特异的蛋白蛋白相互作用―截短型APC(腺瘤性息肉蛋白Adenomatous PolyposisColi)/Asef(鸟苷酸交换因子APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor)蛋白相互作用，它肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，可成为癌症治疗的新药物靶标。
APC在生理状态下参与调节细胞粘附和细胞迁移等过程。临床研究证实在结肠癌、乳腺癌、肺癌等病人中，APC基因都发生移码突变或缺失突变，表达截短型的APC蛋白。截短型APC蛋白N端的ARM结构域彻底暴露，不再发挥正常的生理功能，却能够有效的结合鸟苷酸交换因子Asef。正常生理状态下Asef处于自身抑制状态，被截短型的APC结合后，Asef蛋白构象发生变化，自身抑制被释放造成鸟苷酸交换因子活性被激活，从而激活Rho家族的GTPase-Cdc42将GTP换为GDP，使信号向下游因子传导，引发异常的细胞扁化、细胞膜皱褶化、假足产生，细胞间黏附力降低，促进细胞迁移和血管生成，形成息肉从而导致癌细胞的增殖和侵袭。进一步研究表明，Asef基因敲除后能够有效的抑制癌细胞的迁移。
近年来，通过阻断APC/Asef相互作用进行结肠癌治疗取得了一定进展，主要工作集中在恢复APC的全长功能以避免与Asef发生相互作用。Macnab等将外源野生型APC基因导入体内，使其在体内表达，替代已突变的截短型APC来破坏其与Asef的结合，但外源基因在体内的表达能否控制在适度水平等还存在一系列问题。Floquet等利用基因诱导的方法来恢复全长APC，但由于APC全长较长，不易转染，极大的限制了这种方法的应用。
基于此，人们尝试寻找特异性的活性多肽能够阻断APC/Asef相互作用，并且使这些多肽作为癌症治疗药物，以解决当前耐药性及有效治疗药物不足的现状。然而，没有文献公开本发明的肽化合物。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的多肽或其盐。
本发明的第二个目的在于提供多肽或其盐在制备APC/Asef蛋白相互作用的抑制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供多肽或其盐在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种预防或治疗肿瘤的药物组合物。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种多肽或其盐，其特征在于，包含式(1)所代表的序列或其盐：
式(1)：P1-Ala-Gly-X1-Ala-X2-X3-X4-P2
其中，P1是下式代表的基团:
-RA1，-CO-RA1，-CO-ORA1，-CO-CORA1，-SO-RA1，-SO2-RA1，-SO2-ORA1，-CO-NRA2RA3，-SO2-NRA2RA3或-C(＝NRA1)-NRA2RA3；
X1是Asn、Asp、Aib、Gln或Gly；
X2是Ala、Ile、Leu、Cha、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、αMePhe、αMeTyr或Pya(4)；
X3是Leu、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、αMePhe或αMeTyr；
X4是Aib、Asn、Asp、Gln、Gly、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、Ser、Thr或Trp；
P2是下式代表的基团:
-RA1或-NRA1RA2；
其中，RA1、RA2和RA3表示氢原子、任选取代的烃基团或任选取代的杂环基团；
Phe(P3)表示苯丙氨酸或者苯丙氨酸中苯环被任选取代的烃基团取代；
Tyr(P4)表示酪氨酸或者酪氨酸中苯环被任选取代的烃基团取代；
Pya(4)表示4-吡啶基丙氨酸。
“任选取代的烃基团”中的上述取代基的数目是，例如，1至5个取代基，优选1至3个取代基。当取代基的数目是两个或更多个时，相应的取代基可以相同或不同。“任选取代的烃基团”的例子包括任选具有选自下列取代基组的取代基的烃基团。取代基组：(1)卤素原子，(2)硝基，(3)氰基，(4)氧代，(5)羟基(6)任选卤代的C1-6烷氧基。
作为一个优选方案，P1是氢原子。
作为一个优选方案，X1是Aib、Asp或Gly。
作为一个优选方案，X2是Lys。
作为一个优选方案，X3是Lys。
作为一个优选方案，X4是Aib、Asp或Gly。
作为一个优选方案，所述多肽或其盐由式(1)所代表的序列或其盐组成。
作为一个优选方案，所述多肽或其盐的长度不多于50个氨基酸。
在优选的技术方案中，所述多肽的序列为：Ac-AGEALYE-NH2(多肽1)；Ac-AGEAIYE-NH2(多肽2)；Ac-AGESLYE-NH2(多肽3)；Ac-AGETLYE-NH2(多肽4)；Ac-GGEQLAI-NH2(多肽5)；Ac-GGESLAI-NH2(多肽6)；Ac-AGEALAD-NH2(多肽7)；Ac-AGEALAW-NH2(多肽8)；Ac-AGEAYAD-NH2(多肽9)；Ac-GGEALAD-NH2(多肽10)；Ac-GGEQIAI-NH2(多肽11)；Ac-GGEALAW-NH2(多肽12)；Ac-GGEALSD-NH2(多肽13)；Ac-GGEALTD-NH2(多肽14)；Ac-GGEALVD-NH2(多肽15)；Ac-GGEALDD-NH2(多肽16)；Ac-GGEALAA-NH2(多肽17)；Ac-GGEALAI-NH2(多肽18)；Ac-GGEQLAL-NH2(多肽19)；Ac-GGEQLAY-NH2(多肽20)；Ac-GGEQLAD-NH2(多肽21)；Ac-GGEQLAW-NH2(多肽22)；Ac-GEALA-NH2(多肽23)；Ac-GGEALYS-NH2(多肽24)；Ac-GGEALYE-NH2(多肽25)；Ac-GGEALA-NH2(多肽26)；Ac-GGEALY-NH2(多肽27)；Ac-GGDALYE-NH2(多肽28)；Ac-GGEQLAINELISD-NH2(多肽29)；Ac-GGEALYD-NH2(多肽30)；Ac-AGEALYD-NH2(多肽31)；Ac-SGEALYE-NH2(多肽32)；Ac-SGDALYE-NH2(多肽33)；Ac-AGDALYE-NH2(多肽34)；Ac-AGEALFE-NH2(多肽35)；Ac-AGEALYQ-NH2(多肽36)；AGEALYE-NH2(多肽37)；Fmoc-AGEALYE-NH2(多肽38)；Z-AGEALYE-NH2(多肽39)；Ac-AGEALWE-NH2(多肽40)；Z-AGEALY(3-Cl)E-NH2(多肽41)；Z-AGEALY(3-I)E-NH2(多肽42)；Z-AGEALY(CH3)E-NH2(多肽43)；Z-AGEDLYE-NH2(多肽44)；Z-AGEAchgYE-NH2(多肽45)；Z-AGEAchaYE-NH2(多肽46)；Z-AGEAFYE-NH2(多肽47)；Z-AGEALF(4-F)E-NH2(多肽48)；Z-AGEALF(4-NO2)E-NH2(多肽49)；Z-AGEALF(4-NH2)E-NH2(多肽50)；3-苯基丙酰-AGEALYE-NH2(多肽51)；Z-AGEAChpYE-NH2(多肽52)；Z-AGEAChrYE-NH2(多肽53)；Z-AGEAChbYE-NH2(多肽54)；Z-AGEALF(4-NHAC)E-NH2(多肽55)；Z-AGEALF(4COOtBu)E-NH2(多肽56)；Z-AGEA(b-tBu-Ala)YE-NH2(多肽57)；GG-AGEALYE-NH2(多肽58)；Ac-LAGEAChpYE-NH2(多肽59)；3-(3-氟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH2(多肽60)；3-(4-羟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH2(多肽61)；3-(4-氟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH2(多肽62)；苯乙酰氯-AGEAChpYE-NH2(多肽63)；苯甲酰氯-AGEAChpYE-NH2(多肽64)；3-(3-羟基苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH2(多肽65)；Z-AGEASLYE-NH2(多肽66)；Z-AGETLYE-NH2(多肽67)；Z-AGESChpYE-NH2(多肽68)；Z-AGETChpYE-NH2(多肽69)。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：多肽或其盐在制备APC/Asef蛋白相互作用的抑制剂中的应用。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：多肽或其盐在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
作为一个优选方案，所述肿瘤是指结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、鼻咽癌、喉癌、食道癌、腺样囊性癌、白血病、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤。
为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的多肽或其盐，或权利要求1所述的多肽或其盐的混合物，和药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可以制成本领域公知的各种常规剂型，包括但不限于，适于口服的片剂(包括各种包衣片剂、缓释或控释片剂)、锭剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒剂、可分散粉末、水性或油性混悬剂、乳剂、酏剂或糖浆剂等等；适于局部使用的霜剂、软膏剂、凝胶、水性或油性溶液或混悬剂等等；适于吸入使用的粉末或液体气雾剂、适于经胃肠外给药的无菌水性或油性的静脉内、皮下或肌内注射剂、栓剂等等。
本发明的药学上可接受的载体包括但不限于常规的各种有机或无机药物载体，例如赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、水溶性聚合物、无机盐、溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、起泡剂和调味剂等等。
本领域技术人员知晓在本发明的药物组合物中，作为活性成分的抗肿瘤肽和药学上可接受的载体的合适用量，能够根据本领域的常规方法确定。本领域技术人员同样知晓如何制备含有本发明的抗肿瘤肽的药物组合物。
本发明的抗肿瘤肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。
本发明的优点在于：本发明提供了一种新型多肽，通过抑制癌细胞中APC/Asef蛋白相互作用起到抗肿瘤作用。它来源于Asef蛋白，我们选择性地缩短了该蛋白的肽链长度并进一步优化了序列，最终得到了本发明的抗肿瘤肽。多肽的N端与C端封端，能够与APC蛋白形成强烈的疏水作用，并且多肽中所含的带有羧基的氨基酸能够与APC蛋白中的碱性氨基酸形成强烈的静电作用，7肽的立体构型能够与APC蛋白口袋契合，因此能够强烈的抑制APC/Asef相互作用，从而起到抗肿瘤治疗效果。本发明抗肿瘤肽具有广谱性，对多种癌细胞具有抑制和杀伤作用，肽链长度短，抗肿瘤活性高，而且稳定不易失活。
附图说明
图1免疫共沉淀检测多肽1(A1B3)对APC/Asef的抑制作用。
图2多肽1(A1B3)Transwell实验。
图3多肽1(A1B3)划痕实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1多肽1的固相合成、切割、纯化及鉴定
1.1多肽1的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽1(Ac-AGEALYE-NH2)：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1Fmoc保护基团
取1g Rink Amide MBHA Resin(该树脂取代度为0.40mmol/g,树脂是带着Fmoc保护的)放入接肽瓶中，加入适量CH2Cl2使树脂膨胀，然后把CH2Cl2抽掉加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取Fmoc-Glu(Otbu)-OH 0.4254g，HOBt 0.135g加入上面接肽瓶中。加入6ml(AR)级的DMF，0.31ml collidine，0.15ml DIC，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35℃，反应结束后的洗涤，将反应液抽干，用DMF洗树脂3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
按照上述方法逐一缩合Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，AC-Ala-OH。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
1.2多肽1的切割
将1.5克树脂干燥后，刮刀将树脂尽量打散，放入25ml茄形瓶中，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的92.5％切割液(三氟醋酸：EDT：水：对甲酚(92.5：2.5：2.5：2.5)15ml室温振荡60分钟，待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得多肽1粗品0.2G。
1.3多肽1的纯化及鉴定
用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：80％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。根据高效液相色谱图采集24-26min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末5mg，ESI：791.8[M-H]-，HPLC：98.8％。
实施例2按照实施例1相同方法制备多肽2Ac-AGEAIYE-NH2 5mg，ESI：791.8[M-H]-，HPLC：98.3％。
实施例3按照实施例1相同方法制备多肽3Ac-AGESLYE-NH2 Ac-AGEAIYE-NH2 5mg，ESI：807.9[M-H]-，HPLC：98.1％。
实施例4按照实施例1相同方法制备多肽4Ac-AGETLYE-NH2 5mg，ESI：821.8[M-H]-，HPLC：98.5％。
实施例5按照实施例1相同方法制备多肽5Ac-GGEQLAI-NH2 5mg，ESI：726.9[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例6按照实施例1相同方法制备多肽6Ac-GGESLAI-NH2 5mg，ESI：685.7[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例7按照实施例1相同方法制备多肽7Ac-AGEALAD-NH2 5mg，ESI：685.7[M-H]-，HPLC：96.8％。
实施例8按照实施例1相同方法制备多肽8Ac-AGEALAW-NH2 8 5mg，ESI：756.8[M-H]-，HPLC：98.2％。
实施例9按照实施例1相同方法制备多肽9Ac-AGEAYAD-NH2 5mg，ESI：735.7[M-H]-，HPLC：95.1％。
实施例10按照实施例1相同方法制备多肽10Ac-GGEALAD-NH2 5mg，ESI：621.7[M-H]-，HPLC：96.9％。
实施例11按照实施例1相同方法制备多肽11Ac-GGEQIAI-NH2 5mg，ESI：726.8[M-H]-，HPLC：97.4％。
实施例12按照实施例1相同方法制备多肽12Ac-GGEALAW-NH2 5mg，ESI：742.8[M-H]-，HPLC：98.2％。
实施例13按照实施例1相同方法制备多肽13Ac-GGEALSD-NH2 5mg，ESI：687.6[M-H]-，HPLC：97.5％。
实施例14按照实施例1相同方法制备多肽14Ac-GGEALTD-NH2 5mg，ESI：701.7[M-H]-，HPLC：96.5％。
实施例15按照实施例1相同方法制备多肽15Ac-GGEALVD-NH2 5mg，ESI：699.7[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例16按照实施例1相同方法制备多肽16Ac-GGEALDD-NH2 5mg，ESI：715.7[M-H]-，HPLC：98.1％。
实施例17按照实施例1相同方法制备多肽17Ac-GGEALAA-NH2 5mg，ESI：627.6[M-H]-，HPLC：98.6％。
实施例18按照实施例1相同方法制备多肽18Ac-GGEALAI-NH2 5mg，ESI：669.7[M-H]-，HPLC：96.3％。
实施例19按照实施例1相同方法制备多肽19Ac-GGEQLAL-NH2 5mg，ESI：726.8[M-H]-，HPLC：97.8％。
实施例20按照实施例1相同方法制备多肽20Ac-GGEQLAY-NH2 5mg，ESI：776.8[M-H]-，HPLC：96.9％。
实施例21按照实施例1相同方法制备多肽21Ac-GGEQLAD-NH2 5mg，ESI：728.7[M-H]-，HPLC：97.4％。
实施例22按照实施例1相同方法制备多肽22Ac-GGEQLAW-NH2 5mg，ESI：799.8[M-H]-，HPLC：96.8％。
实施例23按照实施例1相同方法制备多肽23Ac-GEALA-NH2 5mg，ESI：499.5[M-H]-，HPLC：98.6％。
实施例24按照实施例1相同方法制备多肽24Ac-GGEALYS-NH2 5mg，ESI：735.7[M-H]-，HPLC：97.2％。
实施例25按照实施例1相同方法制备多肽25Ac-GGEALYE-NH2 5mg，ESI：777.8[M-H]-，HPLC：96.9％。
实施例26按照实施例1相同方法制备多肽26Ac-GGEALA-NH2 5mg，ESI：556.6[M-H]-，HPLC：95.8％。
实施例27按照实施例1相同方法制备多肽27Ac-GGEALY-NH2 5mg，ESI：648.7[M-H]-，HPLC：97.1％。
实施例28按照实施例1相同方法制备多肽28Ac-GGDALYE-NH2 5mg，ESI：763.8[M-H]-，HPLC：95.9％。
实施例29按照实施例1相同方法制备多肽29Ac-GGEQLAINELISD-NH2 5mg，ESI：1399.8[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例30按照实施例1相同方法制备多肽30Ac-GGEALYD-NH2 5mg，ESI：763.8[M-H]-，HPLC：96.8％。
实施例31按照实施例1相同方法制备多肽31Ac-AGEALYD-NH2 5mg，ESI：777.8[M-H]-，HPLC：97.3％。
实施例32按照实施例1相同方法制备多肽32Ac-SGEALYE-NH2 5mg，ESI：807.8[M-H]-，HPLC：97.3％。
实施例33按照实施例1相同方法制备多肽33Ac-SGDALYE-NH2 5mg，ESI：793.8[M-H]-，HPLC：96.5％。
实施例34按照实施例1相同方法制备多肽34Ac-AGDALYE-NH2 5mg，ESI：777.8[M-H]-，HPLC：97.4％。
实施例35按照实施例1相同方法制备多肽35Ac-AGEALFE-NH2 5mg，ESI：775.8[M-H]-，HPLC：95.8％。
实施例36按照实施例1相同方法制备多肽36Ac-AGEALYQ-NH2 5mg，ESI：790.8[M-H]-，HPLC：96.3％。
实施例37多肽37(AGEALYE-NH2)的的固相合成、切割、纯化及鉴定
1.1多肽37的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽37(AGEALYE-NH2)：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1Fmoc保护基团
取1g Rink Amide MBHA Resin(该树脂取代度为0.40mmol/g,树脂是带着Fmoc保护的)放入接肽瓶中，加入适量CH2Cl2使树脂膨胀，然后把CH2Cl2抽掉。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取Fmoc-Glu(Otbu)-OH 0.4254g，HOBt 0.135g加入上面接肽瓶中。加入6ml(AR)级的DMF，0.31ml collidine，0.15ml DIC，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35℃，反应结束后的洗涤，将反应液抽干，用DMF洗树脂3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
按照上述方法逐一缩合Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
1.2多肽37的切割
将1.5克树脂干燥后，刮刀将树脂尽量打散，放入25ml茄形瓶中，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的92.5％切割液(三氟醋酸：EDT：水：对甲酚(92.5：2.5：2.5：2.5)15ml室温振荡60分钟，待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得多肽37粗品0.2G。
1.3多肽37的纯化及鉴定
用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：90％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。根据高效液相色谱图采集19-23min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末5mg，ESI：749.8[M-H]-，HPLC：97.9％。
实施例38多肽38(Fmoc-AGEALYE-NH2)的的固相合成、切割、纯化及鉴定
1.1多肽38的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽38(Fmoc-AGEALYE-NH2)：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1Fmoc保护基团
取1g Rink Amide MBHA Resin(该树脂取代度为0.40mmol/g,树脂是带着Fmoc保护的)放入接肽瓶中，加入适量CH2Cl2使树脂膨胀，然后把CH2Cl2抽掉。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取Fmoc-Glu(Otbu)-OH 0.4254g，HOBt 0.135g加入上面接肽瓶中。加入6ml(AR)级的DMF，0.31ml collidine，0.15ml DIC，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35℃，反应结束后的洗涤，将反应液抽干，用DMF洗树脂3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
按照上述方法逐一缩合Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
1.2多肽38的切割
将1.5克树脂干燥后，刮刀将树脂尽量打散，放入25ml茄形瓶中，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的92.5％切割液(三氟醋酸：EDT：水：对甲酚(90：5：2.5：2.5)15ml室温振荡60分钟，待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得多肽38粗品0.2G。
1.3多肽38的纯化及鉴定
用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：50％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。根据高效液相色谱图采集20-25min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末5mg，ESI：972.1[M-H]-，HPLC：98.1％。
实施例39多肽39(Z-AGEALYE-NH2)的固相合成、切割、纯化及鉴定
1.1多肽39的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽39(Z-AGEALYE-NH2)：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1Fmoc保护基团
取1g Rink Amide MBHA Resin(该树脂取代度为0.40mmol/g,树脂是带着Fmoc保护的)放入接肽瓶中，加入适量CH2Cl2使树脂膨胀，然后把CH2Cl2抽掉。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取Fmoc-Glu(Otbu)-OH 0.4254g，HOBt 0.135g加入上面接肽瓶中。加入6ml(AR)级的DMF，0.31ml collidine，0.15ml DIC，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35℃，反应结束后的洗涤，将反应液抽干，用DMF洗树脂3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
按照上述方法逐一缩合Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Z-Ala-OH。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
1.2多肽39的切割
将1.5克树脂干燥后，刮刀将树脂尽量打散，放入25ml茄形瓶中，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的60％切割液(三氟醋酸：EDT：水：对甲酚(60：15：15：10)15ml室温振荡60分钟，待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得多肽39粗品0.2G。
1.3多肽39的纯化及鉴定
用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：60％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。根据高效液相色谱图采集25-28min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末5mg，ESI：883.9[M-H]-，HPLC：95.6％。
实施例40按照实施例1相同方法制备多肽40Ac-AGEALWE-NH2 5mg，ESI：814.9[M-H]-，HPLC：98.3％。
实施例41按照实施例39相同方法制备多肽41Z-AGEALY(3-Cl)E-NH2 5mg，ESI：918.4[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例42按照实施例39相同方法制备多肽42Z-AGEALY(3-I)E-NH2 5mg，ESI：1010.0[M-H]-，HPLC：95.8％。
实施例43按照实施例39相同方法制备多肽43Z-AGEALY(CH3)E-NH2 5mg，ESI：897.9[M-H]-，HPLC：95.4％。
实施例44按照实施例39相同方法制备多肽44Z-AGEDLYE-NH2 5mg，ESI：926.8[M-H]-，HPLC：98.2％。
实施例45按照实施例39相同方法制备多肽45Z-AGEAchgYE-NH2 5mg，ESI：909.9[M-H]-，HPLC：98.5％。
实施例46按照实施例39相同方法制备多肽46Z-AGEAchaYE-NH2 5mg，ESI：923.9[M-H]-，HPLC：97.9％。
实施例47按照实施例39相同方法制备多肽47Z-AGEAFYE-NH2 5mg，ESI：916.8[M-H]-，HPLC：97.2％。
实施例48按照实施例39相同方法制备多肽48Z-AGEALF(4-F)E-NH2 5mg，ESI：885.9[M-H]-，HPLC：98.1％。
实施例49按照实施例39相同方法制备多肽49Z-AGEALF(4-NO2)E-NH2 5mg，ESI：912.9[M-H]-，HPLC：98.3％。
实施例50按照实施例39相同方法制备多肽50Z-AGEALF(4-NH2)E-NH2 5mg，ESI：882.9[M-H]-，HPLC：98.3％。
实施例51多肽51 3-苯基丙酰-AGEALYE-NH2的固相合成、切割、纯化及鉴定
1.1多肽51的固相合成
本发明利用多肽合成仪采用固相合成法合成多肽51：以DMF为溶剂，各种α-氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液的浓度0.25M，HBTU溶液、HOBt溶液的浓度为0.33M，哌啶溶液的浓度为200ml/L，DIEA溶液的浓度为174.2ml/L。
1.1.1Fmoc保护基团
取1g Rink Amide MBHA Resin(该树脂取代度为0.40mmol/g,树脂是带着Fmoc保护的)放入接肽瓶中，加入适量CH2Cl2使树脂膨胀，然后把CH2Cl2抽掉。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
1.1.2多肽的缩合
称取Fmoc-Glu(Otbu)-OH 0.4254g，HOBt 0.135g加入上面接肽瓶中。加入6ml(AR)级的DMF，0.31ml collidine，0.15ml DIC，密封后放入振荡器中反应1小时，温度控制在35℃，反应结束后的洗涤，将反应液抽干，用DMF洗树脂3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性，假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。加入6ml 20％piperidine/DMF溶液振荡5min，抽干，再加入6ml20％piperidine/DMF溶液振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2CL2洗3次，抽干，取10-20颗树脂作Kaiser test检测显蓝色呈阳性，假若是呈阴性，则重复以上脱帽步骤。
按照上述方法逐一缩合Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(otbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，3-苯基丙酰-Ala-OH。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
1.2多肽51的切割
将1.5克树脂干燥后，刮刀将树脂尽量打散，放入25ml茄形瓶中，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的60％切割液(三氟醋酸：EDT：水：对甲酚(60：15：15：10)15ml室温振荡60分钟，待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。
待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得多肽39粗品0.2G。
1.3多肽51的纯化及鉴定
用反向高效液相色谱法对抗肿瘤肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相：A相(水相)：去离子水(含0.1％TFA(m/v))；B相(有机相)：70％乙腈水溶液(含0.1％TFA(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：A相以每分钟1％的变化从55％降到10％，B相以每分钟1％的变化从45％升到90％。根据高效液相色谱图采集22-24min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗肿瘤肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末5mg，ESI：881.9[M-H]-，HPLC：96.6％。
实施例52按照实施例39相同方法制备多肽50Z-AGEAChpYE-NH2 5mg，ESI：909.8[M-H]-，HPLC：95.6％。
实施例53按照实施例39相同方法制备多肽53Z-AGEAChrYE-NH2 5mg，ESI：881.8[M-H]-，HPLC：96.1％。
实施例54按照实施例39相同方法制备多肽54Z-AGEAChbYE-NH2 5mg，ESI：895.8[M-H]-，HPLC：96.3％。
实施例55按照实施例39相同方法制备多肽55Z-AGEALF(4-NHAC)E-NH2 5mg，ESI：923.9[M-H]-，HPLC：96.7％。
实施例56按照实施例39相同方法制备多肽56Z-AGEALF(4COOtBu)E-NH2 5mg，ESI：912.0[M-H]-，HPLC：95.6％。
实施例57按照实施例39相同方法制备多肽57Z-AGEA(b-tBu-Ala)YE-NH2 5mg，ESI：897.9[M-H]-，HPLC：95.1％。
实施例58按照实施例37相同方法制备多肽58GGAGEALYE-NH2 5mg，ESI：863.9[M-H]-，HPLC：97.2％。
实施例59按照实施例1相同方法制备多肽59Ac-LAGEAChpYE-NH2 5mg，ESI：931.1[M-H]-，HPLC：96.3％。
实施例60按照实施例51相同方法制备多肽60 3-(3-氟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH25mg，ESI：926.1[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例61按照实施例51相同方法制备多肽61 3-(4-羟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH25mg，ESI：924.3[M-H]-，HPLC：95.4％。
实施例62按照实施例51相同方法制备多肽62 3-(4-氟苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH25mg，ESI：927.1[M-H]-，HPLC：96.1％。
实施例63按照实施例51相同方法制备多肽63苯乙酰氯-AGEAChpYE-NH2 5mg，ESI：893.9[M-H]-，HPLC：96.5％。
实施例64按照实施例51相同方法制备多肽64苯甲酰氯-AGEAChpYE-NH2 5mg，ESI：879.9[M-H]-，HPLC：96.7％。
实施例65按照实施例51相同方法制备多肽65 3-(3-羟基苯基)丙酸-AGEAChpYE-NH2 5mg，ESI：924.1[M-H]-，HPLC：95.2％。
实施例66按照实施例39相同方法制备多肽66Z-AGESLYE-NH2 5mg，ESI：899.9[M-H]-，HPLC：98.3％。
实施例67按照实施例39相同方法制备多肽67Z-AGETLYE-NH2 5mg，ESI：913.9[M-H]-，HPLC：98.2％。
实施例68按照实施例39相同方法制备多肽68Z-AGESChpYE-NH2 5mg，ESI：925.9[M-H]-，HPLC：98.6％。
实施例69按照实施例39相同方法制备多肽69Z-AGETChpYE-NH2 5mg，ESI：939.9[M-H]-，HPLC：98.1％。
实施例70:多肽分子水平抑制APC/Asef相互作用实验。
1.1利用荧光偏振实验(FP)建立APC/Asef相互作用抑制剂体外筛选体系，评价多肽分子水平抑制APC/Asef相互作用的能力。
(1)表达纯化APC(303-739)和Asef(170-271)。构建原核表达载体pET28a-APC和pET28a-Asef并在菌株BL-21中大量表达APC和Asef，然后应用亲和离子交换，凝胶过滤等层析方法得到重组质粒表达的纯化蛋白APC和Asef；
(2)母液配置：对合成的多肽进行逐一编号，如多肽1，多肽2，…；多肽69。然后各称取1mg并用DMSO溶解至100mM初始浓度。配制荧光肽母液浓度为100μM。
(3)反应条件：用反应缓冲液(50mM Hepes 7.5,300mM NaCl,1mM EDTA，1mM DTT)稀释APC(303-739)和荧光肽(Tracer)至各自相应浓度。反应在室温，96孔板中进行。每个实验组做3个复孔。
(4)梯度稀释：在A行各孔加入8μL多肽，B-H各行加入4μLDMSO。从A行各取4μL多肽加入B行稀释后再取出4μL加入C行，以此类推直到G行，G行稀释之后取出4μL多肽丢掉。
(5)加入91μLAPC蛋白稀释液，室温条件孵育1.5h。加入5μL荧光肽稀释液，室温条件下继续孵育1.5h。
(6)信号值检测：用多功能酶标仪(Synergy H4Hybrid Reader)来检测荧光偏振值。激发光为485nm，发射光为525nm，G因子为1，灵敏度设置为65。
(7)G.数据处理：1)计算样本的平均荧光值，包含作为阳性对照的“蛋白+荧光肽”和作为阴性对照的“Tracer”；2)然后按照以下公式进行计算：Inhibition(％)＝100*(阳性对照-sample)/(阳性对照-阴性对照)。以小分子终浓度的log值为横坐标，抑制率(％)为纵坐标，用Graphpad Prism 5软件拟合出抑制曲线并求出IC50值，结果如下表1所示。
表1多肽抑制APC/Asef相互作用的IC50(单位：μM)
以及，下述多肽序列IC50(单位：μM)
多肽序列 IC50(μM)
Ac-SSSHHYSHPGGGGEQLAINELISDG-NH2 8.135
Ac-GGEQLAINELISD-NH2 34
1.2利用等温滴定量热法(ITC)实验测定多肽1对APC的亲和力。
(1)样品准备：准备好肽和蛋白，用反应缓冲液稀释至合适的浓度。Cell池需要蛋白样品体积约200μL，“Syringe”滴定针中的样品体积约40μL。实验用的APC(303-739)蛋白纯化后储存于50mM Hepes 7.5，300mM NaCl，1mM EDTA的缓冲液中，不加DTT，用buffer稀释至终浓度0.015mM,并加入DMSO，使DMSO终浓度为1％，4度，12000rpm离心5min。A20用DMSO稀释至20mM，并用缓冲液稀释至0.2mM(此时含有1％DMSO)，12000rpm离心5min后使用。
(2)在滴定前，清洗Cell池和Syringe部分，做水滴水反应，来检测仪器是否工作正常，包括检测仪器是否洗干净以及参比池是否正常。
(3)样品滴定反应。Cell池预先用buffer润洗一次，将蛋白轻轻加入Cell池中，同时Syringe使用程序进行自动上样多肽。
(4)设置反应温度，滴定数，滴定体积等参数，开始进行滴定。一个反应的时间约为40min。本文进行的ITC实验，反应温度为30℃，DP初始值为5.0μcal/s，滴定数为20滴，每滴2μL，每滴持续时间为4s，每滴间隔时间为120s。
(5)反应结束，清洗Cell池和Syringe，使用配套的Origin软件进行数据处理得到结合常数如表2所示。
表2ITC测定多肽与APC蛋白结合常数
1.3免疫共沉淀检测多肽1能抑制APC/Asef相互作用
(1)六孔板每个孔种4*10^5个293T细胞,每个实验组用2个六孔板的细胞量，铺板24h后转染。
(2)瞬时转染48小时弃去细胞培养基，用预冷的lxPBS洗涤2次转染后的细胞。
(3)收集洗涤后的细胞，用500μL预冷的细胞裂解液RIPA(50mM Tris-HCl pH 7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,1％NP-40)临用前加入1Xcocktail和lmM PMSF)于冰上，裂解细胞20分钟。
(4)12,000g，4度，离心15分钟，收集上清，用BCA法测定上清的蛋白浓度，并用预冷的PBS稀释蛋白浓度至1微克/微升。取上清25μL作为input。
(5)用lxPBS洗涤ANTI-FLAG M2 Affinity Gel三次，再用lxPBs稀释为50％slurry。向细胞裂解物中加入20μl ANTI-FLAG M2 Affinity Gel，放置在旋转混合仪上，4度孵育过夜。
(6)12000g离心1min，收集的琼脂糖珠沉淀用预冷的RIPA洗涤三次，并吸干洗涤液。然后加入25μL,2X蛋白上样缓冲液(2％SDS，10％glycerol，50mM Tris-HCl，pH 7.6，10mM DTT，0.2％溴酚蓝)
(7)样品煮沸10分钟，冰上5min，重复3次。
(8)12,000g，离心1分钟，收集上清用于免疫印迹分析如下图1所示。
实施例71多肽的抗肿瘤活性测定
1.1细胞迁移
(1)Transwell小室的制备
使用Corning公司的8μm孔径无胶24孔板transwell insert
预平衡：在24孔板中中加入600μL含有血清的培养液，在37℃的培养箱里平衡一个小时增强细胞的粘附作用。如果需要加药处理，则此培养液中加入相应浓度的药物。
(2)制备细胞悬液
消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用无血清培养基重悬。
(3)接种细胞
用细胞活力分析系统(Vi-CELL XR)对细胞进行计数，取细胞悬液体积200μL加入Transwell小室24孔板上室。如果需要加药处理，则此培养液中加入相应浓度的药物。SW480每孔加入5X10^4个，迁移24h。DLD-1每孔加入2X10^5个，迁移24h。
(4)细胞固定与染色，计数
100％甲醇固定10min，固定完之后用结晶紫染色染60min。用清水将染色液清洗干净之后放在37度培养箱烘干，去显微镜下拍照，20X镜下，每个实验组选5个视野，取平均值计数。结果如图2和图3所示，通过该方法检测多肽1对结肠癌细胞迁移的影响，发现多肽1可以有效的降低结肠癌细胞SW480的迁移。
1.2MTT实验
(1)使用处于生长对数期的人子宫颈癌细胞(Hela)，人肝癌细胞(HepG2)，人前列腺癌细胞(PC-3)，人肝癌细胞(HuH-7)和人涎腺腺样囊性癌细胞(SalivaryAdenoidCysticcarcinoma，SACC-83)，结肠癌细胞株(SW480，SW620)对细胞进行消化、重悬得到细胞悬液，将细胞稀释到50,000个/mL。在96孔板中每孔加入100μL，将铺好的96孔板放入培养箱中，在37℃、5％CO2条件下培养16小时。
(2)使用不含有FBS的培养基稀释多肽样品。向96孔板中加入不同浓度的多肽。其中，多肽设置1μM,2μM,4μM,8μM,16μM共5个浓度梯度，每个浓度设6个复孔。多肽5设置8μM,16μM,32μM,64μM,128μM共5个浓度梯度，每个浓度设6个复孔。同时设置不含有多肽样品的阴性对照组，也是6个复孔。在37℃、5％CO2条件下培养6小时。
(3)向每孔加入100μL含10％MTT的细胞培养基(其中MTT浓度为0.5mg/mL)。将96孔板放入培养箱中孵育4个小时。
(4)移除96孔板中含有MTT的培养液，加入100μL的DMSO，使甲醇溶解充分。使用酶标仪在OD 490nm处测量96孔板的吸光值，并计算抑制率：
抑制率＝(1-OD测试组/OD阴性对照组)*100％
根据抑制率计算IC50，结果如下表3所示。
表3.多肽对不同肿瘤细胞的IC50(单位：μM)
由上述结果可知，本发明的多肽均具有明显的抗肿瘤活性，其中多肽1抗肿瘤活性最好。
在本说明书中使用的缩写是指下列缩写(表4)。本文所描述的术语中的短线，例如，3-Cl等等，可以省略，并且这种省略的状况也代表相同含义。
表4.缩写
Z 苄氧羰基
Ac 乙酰氧羰基
Aib α-氨基异丁酸
Cha 环己基丙氨酸
Chp 环戊基丙氨酸
Chg 环己基甘氨酸
Chb 环丁基丙氨酸
Chr 环丙基丙氨酸
TBU 叔丁氧羰基
Fmoc 芴甲氧羰基
DMF N,N二甲基甲酰胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
DCM 二氯甲烷
HBTU O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA 二异丙基乙胺
tBu 叔丁基
Pya(4) 4-吡啶基丙氨酸
αMePhe α-甲基苯丙氨酸
αMeTyr α-甲基酪氨酸
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种多肽或其盐，其特征在于，包含式(1)所代表的序列或其盐：
式(1)：P1-Ala-Gly-X1-Ala-X2-X3-X4-P2
其中，P1是下式代表的基团:
-RA1，-CO-RA1，-CO-ORA1，-CO-CORA1，-SO-RA1，-SO2-RA1，-SO2-ORA1，-CO-NRA2RA3，-SO2-NRA2RA3或-C(＝NRA1)-NRA2RA3；
X1是Asn、Asp、Aib、Gln或Gly；
X2是Ala、Ile、Leu、Cha、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、αMePhe、αMeTyr或Pya(4)；
X3是Leu、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、αMePhe或αMeTyr；
X4是Aib、Asn、Asp、Gln、Gly、Phe(P3)、Lys、Tyr(P4)、Ser、Thr或Trp；
P2是下式代表的基团:
-RA1或-NRA1RA2；
其中，RA1、RA2和RA3表示氢原子、任选取代的烃基团或任选取代的杂环基团；
Phe(P3)表示苯丙氨酸或者苯丙氨酸中苯环被任选取代的烃基团取代；
Tyr(P4)表示酪氨酸或者酪氨酸中苯环被任选取代的烃基团取代；
Pya(4)表示4-吡啶基丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，P1是氢原子。
3.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，X1是Aib、Asp或Gly。
4.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，X2是Lys。
5.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，X3是Lys。
6.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，X4是Aib、Asp或Gly。
7.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，所述多肽或其盐由式(1)所代表的序列或其盐组成。
8.根据权利要求1所述的多肽或其盐，其特征在于，所述多肽或其盐的长度不多于50个氨基酸。
9.权利要求1所述的多肽或其盐在制备APC/Asef蛋白相互作用的抑制剂中的应用。
10.权利要求1所述的多肽或其盐在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、鼻咽癌、喉癌、食道癌、腺样囊性癌、白血病、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤。
12.一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的多肽或其盐，或权利要求1所述的多肽或其盐的混合物，和药学上可接受的载体。
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