RO118953B1

RO118953B1 - Derivaţi peptidici şi metodă de tratament a tumorilor la mamifere

Info

Publication number: RO118953B1
Application number: RO97-02264A
Authority: RO
Inventors: Andreas Haupt; Franz Emling; Cynthia A. Romerdahl
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2004-01-30
Also published as: DE69623472T2; NZ310444A; HRP960257A2; AU6124296A; IL122215A0; CA2219818C; SK282466B6; US5831002A; ZA964710B; PL323726A1; NO975711L; AR003136A1; CZ293682B6; NO975711D0; EP0871656B1; ZA964711B; AU725170B2; ATE224910T1; CN1182154C; CA2219819A1

Abstract

Invenţia se referă la derivaţi peptidici, având formula corespunzătoare structurii generale I: R^(1)R^(2)N - CHX -CO -A -B -D - E -(F)t - K având activitate antitumorală, şi la o metodă de tratament atumorilor la mamifere, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din unul dintre derivaţii peptidici, pentru a inhiba dezvoltarea tumorii. ŕ

Description

Invenția se referă la derivați peptidici și metodă de tratament a tumorilor la mamifere, cu aplicabilitate în domeniul industriei de medicamente și în medicină, pentru tratamentul bolilor neoplazice.

Se cunoaște că peptidele izolate din materiale de origine marină cum ar fi Dolastatin10 (US 4.816.4444) și Dolastatin-15 (EP-A-398558) prezintă activitate de inhibare a creșterii celulelor (conform Biochem.Pharmacology 40, nr.8,1859-64,1990; J. Natt. Cancer Inst 85, 483,1993 și referințele citate în acesta). Pe baza rezultatelor obținute pe sisteme de tumori in vivo, sunt în curs evaluări preclinice ale acestor produși naturali, în vederea inițierii studiilor clinice pe pacienții cu cancer. Totuși, produșii naturali prezintă dezavantaje cum ar fi solubilitate slabă în solvenți apoși și costurile blocurilor necesare pentru sinteză.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a obține noi derivați peptidici de tip Dolastatin și de a furniza o metodă de tratament antitumoral.

Derivații peptidici, conform invenției, au formula corespunzătoare structurii generale I:

R¹R²N - -CHX -CO-A-B-D-E-(F), -K în care

R¹ este metil, etil sau izopropil;

R² este hidrogen, metil sau etil;

R’-N-R² pot forma împreună un ciclu pirolidinic;

A reprezintă un rest valiil, izoleucil, 2-tenf-butilglicil, 2-etilglicil, norleucil sau novalil;

B reprezintă un rest N-metil-valil, -leucil-izoleucil -norvalil,-2-terț-butilglicil,-3terț-butil-alanil sau-2-etilglicil;

D este un rest 3,4-dehidroprolil, 4-fluoroprolil, 4,4-difIuorprolil, azetidin-2-carbonil, 3-metilprolil, 4-metilpropil sau 5-metilprolil;

E este un rest prolil, homoprolil, hidroxiprolil sau tiazolidin-4-carbonil;

F este un rest valii, 2-terț-butilglicil, izoleucil, leucii, 2-ciclohexilglicil, norleucil, norvalil, neopentilglicil, alanil, (3-alanil sau aminoizobutiroil;

X este alchil (de preferință C₂-C₅), ciclopropil sau ciclopentil;

t este 0 sau 1; și

K este alcoxi (de preferință C, J, benziloxi sau un fragment amino substituit sau nesubstituit;

Metoda de tratament al tumorilor la mamifere, conform invenției, cuprinde în administrarea, sub formă orală și /sau parenterală, a unei cantități eficiente terapeutic din unul dintre derivații peptidici, definiți în revendicarea 1, într-o doză cuprinsă între 0,0005 și 0,050 g per kilogram corp, în cazul administrării orale și 0,00005...0,020 g per kilogram corp, în cazul administrării parenterale, în scopul de a inhiba dezvoltarea tumorii.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- furnizarea de compuși peptidici noi cu solubilitate îmbunătățită în solvenți apoși;

- rezistență mărită a noilor derivați peptidici la degradarea enzimatică comparativ cu Dolastatin -15;

- costuri reduse de sinteză.

în mod special, K poate fi C_v4 alcoxi, benziloxi, -NH₂, -NH-C,^ -alchil, -NH- H₃)₂CN, -NH-C(CH₃)₂CCH, -NH-C(CH₃)₂C=CH₂ -NH-CiCHakCFL.CHOH, -ΝΗ-0(ΟΗΛΟΗ>ΟΗ, -NH-cicloalchil, -NH-[3,3,0]-biciclooctil, norefedril, norpseudoefedril, -NH-chinolil, -NH-pirazil, -NH-CH₂-benzimidazolil, -NH-adamantil, -NH-CH₂-adamantil, -NH-CH(CîȚ)-fenil, -NH-C(CHj), -fenil, -N(C_m -alcoxi)-C_M -alchil, -N(C_M -alcoxij-CîȚ-fenil, -N(C,^ -alcoxi)-fenil, -N (CHJOBzI, -NH-țCHjX-fenil (v=0,1, 2 sau 3, -NH-țCH^^-naftil (m=0 sau 1), -NH-țCfl)^ -benzhidril (w=0, 1 sau 2), -NH-bifenil, -NH-piridil, -NH-CH₂-CH₂-piridil, -NH-CH₂-piridil-NH-benzotiazolil, -NHbenzoizotiazolil, -NH-benzopirazolil, -NH-benzoxazolil, -NH-(CH₂)_m -fluorenil (m=0 sau 1),

RO 118953 Β1

-NH-pirimidil, -NH-(CH₂)_m -indanil (m=0 sau 1), -NH-(CH₂CH₂O)_y-CH₃ (y=0,1,2, 3, 4 sau 5), -NH-(CH₂CH₂O)_y -CH₂CH₃ (y=0,1,2,3,4 sau 5), -(CH₂CH₂O)y -CH₃ (y=0,1, 2, 3, 4 sau 5), -(CH₂CH₂O)_y-CH₂CH₃ (y=0, 1,2, 3, 4 sau 5), -NCH₃-NH-C₆H₅, -NCH₃-NH-CH₂-C₆H₅; sau K este

/^_s	Λ~\			/---	65
' 5	--H 0 J		--N S k_/	-H S—0 \—J

RO 118953 Β1

Sunt preferați compușii având formula generală (I) în care: substituenții R¹, R², A, B, D, E, X, F și t au următoarele semnificații:

R¹ este metil sau etil;

R² este hidrogen, metil sau etil;

A reprezintă un rest valii, izoleucil, 2-terț-butilglicil;

B reprezintă un rest N-metil-valil, -izoleucil sau 2-terț-butilglicil;

D este un rest 3,4-dehidroprolil, 4-fluoroprolil, azetidin-2-carbonil, 3-metilprolil sau 5metil-prolil;

E este un rest prolil, homoprolil, hidroxiprolil sau tiazolidin-4-carbonil;

F este un rest D-valil, 2-terț-butilglicil, D-izoleucil sau aminoizobutiroil;

RO 118953 Β1

X este -CH(CH₃)₂, -C(CH₃)₃, sau -CH(CH₃)CH₂CH₃;

t este 0 sau 1.

Semnificațiile preferate pentru K sunt: 150

-OC(CH₃)₃, -NHCH₃, -NHCI-LjCHa, -NHțCH^CHj, -NHțCF^CH,, -NHțCH^Cl·^, NHțCH,^ CH₃), -NH(CH₂)₆CH₃, -NH(CH₂)₇CH₃, -NHCHțCH^, -NHCHțCHJCHjCHg, -NHCHțCHJCHg CH₂CH₃,-NHCH(CHCH2) J-NH(CH JDH pH ₂-NHC(CH ) ,NHCH(CH pH )CH pH QH _eNHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCHțCHgCH^CmCHj^.NHCHCCHgîCțCHj^, NH-ciclopentil, -NHciclohexil, -NH-cicloheptil, -NH-ciclooctil, NH-biciclo[3,3,0]octil, N(CH₃) OCH₃, N(CH₃) OCH₂ 155 CH₃, -N(CH₃)OCH₂CH₂CH₃, N(CH₃)OCH(CH₃)₂, -N(CH₂CH₃)OCH₃, -N(CH₂CH₃)OCH₂CH₃, -N(CH(CH₃)₂)OCH_3j -N(CH₃)OCH₂C₆H_5i -N(OCH₃)OCH₂C₆H_5i -(OCH₃)CH₂-C₆H₅, -N(CH₃) OC₆H₅, -NH-CH₂-C₆H₅, -NHțCHg^CgHg, -NHCCH^C^, -NHCHțCHOQ^, -NH(CH1QH, -NHC(CCH₃)₂CH₂CH₃,-NHC(CH₃)(CH2CH3)2, -NHCH(C^)CH(OH)C^I^, -NHCI-t-ciclohexil, -NH-CH₂CF₃, -NHCH(CH₂F)₂) -NHCțCHg^CHaCF^OH.-NHțCHgCI-^O^CI-^CI-^, -NHCțCHj^ 160 CH(CH₃)₂,-NHC(CH₃)₂CN, -NHC(CH₃)₂CCH, norefedril, norpseudoefedril, -NH-chinolil, -NHpirazil, - NH-adamantil (2), -NH-adamantil (1), -NH-CH₂-adamantil, -NH-CH₂-naftil, -NH-benzhidril, -NH- bifenil, -NH-piridil, -NH-CH₂-piridil, -NH-CH₂-CH₂-piridil, -NH-benzotiazolil, -NHbenzoizotiazolil, -NH-benzopirazolil, -NH-benzoxazolil, -NH-fluorenil, -NH-pirimidil, -NH-CH₂(4-metil)-tiazolil (2), - NH-CH₂-furanil (2), -NH-CH₂-tienil (2), -NH-CH₂- (5-metil)tienil (2), -NH- 165 tiazolil (2), -NH-izoxazolil (3), -NH-(3-metil)izoxazolil (5), -NH-(3- metil)izotiazolil (5), -NH-(2trifluormetil)-tiadiazolil (5), -NH-(2-ciclopropil)tiadiazolil (5), -NHC(CH₃)₂C = CH^ sau K poate fi:

H.C B,C

170

H,C

175

Aceste exemple ilustrează, dar nu limitează, obiectul prezentei invenții.

Peptidele având formula generală I sunt formate din L-aminoacizi dar F poate fi de asemenea un D-aminoacid.

Noii compuși se pot prezenta sub formă de săruri cu acizi acceptabili din punct de vedere fiziologic, cum ar fi: acid clorhidric, acid citric, acid tartric, acid lactic, acid fosforic, 180 acid metansulfonic, acid acetic, acid formic, acid maleic, acid fumărie, acid malic, acid succinic, acid malonic, acid sulfuric, acid L-glutamic, acid L-aspartic, acid piruvic, acid mucic, acid benzoic, acid glucuronic, acid oxalic, acid ascorbic și acetilglicina.

Compușii noi pot fi preparați prin metode cunoscute în chimia peptidelor. Astfel, peptidele pot fi asamblate secvențial din amino acizi sau prin legarea fragmentelor peptidice 185 mici. în asamblarea secvențială, începând cu C-terminal catena peptidică este extinsă treptat, cu câte un amino acid. în cuplarea fragmentului, este posibil să se lege împreună fragmentele de diferite lungimi și fragmentele, la rândul lor, pot fi obținute prin asamblare secvențială din amino acizi sau prin cuplarea fragmentelor.

Atât în asamblarea secvențială, cât și în cuplarea fragmentelor este necesar să se 190 lege unități, prin formarea unei legături amidice. Pentru acest scop, sunt adecvate metodele enzimatice și chimice.

Metodele chimice de formare a legăturii amidice sunt descrise, în detaliu, de către Mueller, Methoden der Organischen Chemie vol.XV/2, pp 1 la 364, Thieme Verlag, Stuttgart,1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pg.31 la 34,71 la 82, Pierce 195 Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide

RO 118953 Β1

Synthesis,pg.85 la 128, John Wiley & Sons, New York, 1976 și alte lucrări cunoscute din chimia peptidelor. Se preferă, în mod deosebit, metoda cu azidă, metoda anhidridei simetrice și mixte, esterii activi preformați sau generați in situ, utilizarea anhidridelor aminoacizilor Ncarboxi uretan protejate și formarea legăturii amidice, folosind reactanți de cuplare/activatori, în special, diciclohexilcarbodiimidă (DCC), diizopropilcarbodiimidă (DIC),1-etoxicarbonil-2etoxi-1,2-dihidrochinolină (EEDQ), clorhidrat de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimidă (EDCI), anhidrida n-propanfosfonică (PPA), clorură de N,N-b/s(2-oxo-3-oxazolidin)-amidofosforil (ΒΟΡ-CI), brom-tr/s-pirolidinfosfoniu hexafluorfosfat (PyBrop), difenilfosforil azidă (DPPA), reactivul Castra (BOP, PyBop), săruri de O-benzotriazolil-N.N.N'.N'-tetrametiluroniu (HBTU), săruri de O-azabenzotriazolil-N.N.N'.N'-tetrametiltiuroniu (HATU), cianură de dietilfosforil (DEPCN),dioxid de 2,5-difenil-2,3-dihidro-3-oxo-4-hidroxitiofen(reactivul Stenglich; HOTDO) și 1,1'-carbonildiimidazol (CDI). Reactivii de cuplare pot fi folosiți singuri sau în combinație cu aditivi, cum ar fi N,N-dimetil-4-aminopiridin (DMAP), N-hidroxi-benztriazol (HOBt), N-hidroxibenztriazină (HOOBt), azabenztriazol (HOAt), N-hidroxisuccinimidă (HOSu) sau 2-hidroxipiridină.

în sinteza enzimatică a peptidelor, este posibil să se renunțe la grupele de protecție, în sinteza chimică este necesară protejarea reversibilă a grupelor reactive, care nu sunt implicate în formarea legăturii amidice, pentru ambii reactanți. Pentru sinteza chimică a peptidelor se preferă trei tehnici de grupe de protecție convenționale: tehnicile benziloxicarbonil (Z), t-butoxicarbonil (Boc) și 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Identificată în fiecare caz este grupa de protejare a grupării α-amino a fiecărei unități de extindere a catenei. O prezentare detaliată a grupărilor de protejare ale aminoacidului este dată de Mueller, Methoden der Organischewn Chemie vol.XV/1, pp 20 la 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Unitățile folosite pentru asamblarea catenei peptidice pot fi reacționate în soluție, în suspensie sau printr-o metodă similară cu cea descrisă de Merrifield în J. Amer. Chem. Soc. 85(1963), 2149.

Metode preferate în mod deosebit sunt cele în care peptidele sunt asamblate secvențial sau prin cuplarea fragmentelor, folosind tehnici de protecție a grupelor Z, Boc sau Fmoc.

Unul din reactanții din tehnica Merrifield este legat la un suport polimeric insolubil (denumit în continuare rășină). Aceasta dă posibilitatea ca peptidă să fie asamblată secvențial pe suportul polimeric folosind tehnica grupării de protejare Boc sau Fmoc, catena peptidică în creștere fiind legată covalent la C -terminal de particulele insolubile de rășină (conform fig.1 și 2). Acest procedeu face posibilă îndepărtarea reactanților și a produșilor secundari prin filtrare și, în acest fel, nu mai este necesară recristalizarea intermediarilor.

Aminoacizii protejați pot fi legați la orice polimer adecvat, care trebuie să fie insolubil în solvenții folosiți și să aibă o formă stabilă fizic, ce să facă filtrarea ușoară. Polimerul trebuie să conțină o grupare funcțională, la care primul aminoacid protejat poate fi atașat ferm, printr-o legătură covalentă. Compuși adecvați în acest scop sunt o serie de polimeri, cum ar fi celuloza, alcoolul polivinilic, polimetacrilatul, polistirenul sulfonat, copolimerul stiren clormetilat/divinilbenzen (rășina Merrifield), rășina 4-metilbenzhidrilaminică (rășina MBHA), rășina fenilacetamidometil (rășina Pam), rășina alcool p-benziloxi-benzil, rășina benzhidriamină (rășina BHA), rășina 4-(hidroximetil)-benzoiloximetil, rășina Breipohl s.a. (Tetrahedron Letters 28 (1987) 565; furnizată de BACHEM), rășina 4-(2,4-dimetoxifenilaminometil)fenoxi (furnizată de Novabiochem) sau rășina o-clortritil (furnizată de Biohellas).

Pentru sinteza în soluție a peptidelor, sunt adecvați toți solvenții care sunt inerți în condițiile de reacție, în special, apa, Ν,Ν-dimetilformamida (DMF), dimetil sulfoxidul (DMSO), acetonitrilul, diclormetanul (DCM), 1,4-dioxanul, tetrahidrofuranul (THF), N-metil-2-pirolidona (NMP) și amestecuri ale acestor solvenți. Sinteza peptidelor pe suport polimeric poate fi efectuată în toți solvenții organici în care derivații amino-acizilor folosiți sunt solubili. Totuși solvenții preferați au în plus proprietăți de gonflare a rășinii, cum ar fi DMF, DCM, NMP, acetonitril și DMSO și amestecuri ale acestor solvenți.

RO 118953 Β1

După terminarea sintezei, peptidă este scindată de suportul polimeric. Condițiile de scindare de pe diferite suporturi de rășină sunt prezentate în literatură. Reacțiile de scindare cele mai folosite sunt cele catalizate cu acid și cu paladiu, în special, scindarea în acid fluor- 250 hidric lichid anhidru, în acid trifluormetansulfonic anhidru, în acid trifluoracetic diluat sau concentrat, scindarea catalizată cu paladiu în THF sau amestecuri THF-DCM în prezența unei baze slabe, cum ar fi morfolină sau scindarea în amestec de acid acetic -diclormetan-trifluoretanol. în funcție de grupele de protejare alese, acestea pot fi menținute sau pot fi scindate în condițiile de scindare. 255

Deprotejarea parțială a peptidei poate fi preferată atunci când trebuie efectuate anumite reacții de derivatizare. Se pot prepara peptide dialchilate la N-terminal:

a) prin cuplarea Ν,Ν-alchilaminoacizilor adecvați în soluție sau pe suport polimeric;

b) prin alchilarea reductivă a peptidei legate de rășină în DMF/acid acetic 1% cu

NaCNBHg și aldehida sau cetona adecvată; 260

c) prin hidrogenarea peptidelor în soluție, în prezența aldehidei sau cetonei și Pd/C.

Diferiți aminoacizi care nu se găsesc în natură și care sunt prezentați în descrierea de față pot fi obținuți din surse comerciale sau sintetizați din materiale accesibile comercial, folosind metodele cunoscute în domeniu. Sunt accesibile comercial următoarele materii prime: acidul azetidin-2-carboxilic, 3-metil-L-pirolina, 5-metil-L-prolina și 3,4-dehidroproline 265 protejate Boc- sau Fmoc- (ACROS, VOVABIOCHEM, BACHEM). Cis și frans-4-fluorprolina se poate prepara din hidroxiprolină prin metoda descrisă de Panasik ș.a. (N.Panasik, E.S. Eberhardt, A.S.Edison, D.R.Powell, R.T.Raines, IntJ.Peptide Protein Res. 44,1994,262- 269).

Compușii conform invenției pot fi folosiți pentru inhibarea sau pentru tratamentul de altă natură a tumorilor solide (de exemplu, tumori pulmonare, de sân, colon, prostată, vezică, 270 rect sau de endometru) sau bolile maligne hematologice (de exemplu, leucemii, limfoame), prin administrarea compusului la un mamifer.

Este un avantaj deosebit al compușilor conform invenției că sunt mai rezistenți la degradarea enzimatică comparativ cu Dolastin-15.

Administrarea poate fi făcută prin orice mijloace care sunt convenționale pentru 275 agenții farmaceutici, de preferință, cei oncologici, incluzând căile orale și parenterale, cum ar fi subcutanat, intravenos, intramuscular și intraperitoneal.

Compușii pot fi administrați singuri sau sub formă de compoziții farmaceutice, care conțin un compus cu formula I împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic adecvat căii de administrare dorite. Asemenea compoziții farmaceutice pot fi combinații de produși, adică 280 mai pot conține și alți ingredienți activi terapeutic.

Doza care trebuie administrată la mamifere va conține o cantitate eficientă pentru inhibarea tumorii din ingredientul activ, în funcție de o serie de factori convenținali, cum ar fi activitatea biologică a compusului dorit, mijloacele de administrare, vârsta, sănătatea și greutatea corporală a pacientului, natura și gravitatea simptomelor, frecvența tratamentului, 285 administrarea altor agenți terapeutici și efectul dorit. O doză zilnică tipică este de aproximativ 0,5...50 mg per kilogram corp, în cazul administrării orale și de aproximativ 0,05...20 în cazul administrării parenterale.

Noii compuși pot fi administrați sub forme farmaceutice de administrare, convenționale. solide sau lichide, de exemplu, tablete neacoperite sau tablete acoperite (cu film), 290 capsule, pulberi, granule, supozitoare sau soluții. Acestea sunt obținute, în mod convențional. Substanțele active pot fi prelucrate cu auxiliari farmaceutici convenționali, cum ar fi lianții pentru tablete, agenții de umplutură, conservanții, agenții de dezintegrare a tabletelor, regulatorii de curgere, plastifianții, agenții de umectare, dispersanții, emulgatorii, solvenții, compozițiile cu eliberare susținută, antioxidanții și /sau gazele propulsoare (conform H.Suckerș. 295 a. Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978). Formele de administrare, obținute în acest mod, conțin în mod normal între 1 și 90 %, în greutate, substanță activă.

RO 118953 Β1

Următoarele exemple au rolul de a ilustra invenția. Aminoacizii proteinogeni sunt abreviați folosind codul cunoscut cu trei litere. Alte abrevieri folosite: Me2Val=N,N- dimetilvalină, Z=benziloxicarbonil.

A. Mod de lucru general

I. Peptidele revendicate în revendicarea 1 sunt sintetizate fie prin sinteze clasice folosind metodologia Z- și Boc- descrisă anterior, fie prin metode standard ale sintezei în fază solidă, folosind tehnicile de protecție a grupelor Boc și Fmoc.

a) Ciclul de sinteză pentru tehnica grupei de protecție Fmoc

1. Spălare cu DMF 2. 20% piperidină în DMF 3. 20 % piperidină în DMF 4. Spălare cu DMF

1x1 min 1 x 4 min 1x16 min 5 x 1 min

5. Adăugarea aminoacidului preactivat protejat (activare cu 1 TBTU și 5 echivalenți de DIPEA în DMF;

cuplarea peptidei 1 x 61 min

6. Spălare cu DMF 3 x 1 min

7. Dacă conversia este incompletă, se repetă cuplarea (înapoi la 5)

8. Spălare cu DMF 3x1 min

9. înapoi la 2

ΒΟΡ-CI și PyBrop se folosesc ca reactivi pentru cuplarea amino acidului după N-metilamino acizi. Timpii de reacție au crescut corespunzător, incluzând cuplările duble, în sinteza de soluție, folosirea cea mai avantajoasă pentru acest tip de cuplare este fie a aminoacidului NCA (N-carboxianhidridă) protejat Boc, fie a aminoacidului NCA (N-carboxianhidrida) protejată Z sau fie a clorurii de pivaloil ca agent de condensare.

II. Alchilarea reductivă la N terminal

Rășina-peptidă preparată ca în Ala s-a deprotejat la N terminal (etapele 2- 4 în A, I

a) și apoi s-a pus în reacție cu un exces molar de 3 ori de aldehidă sau cetonă în DMF/1 % acid acetic cu adăugare de 3 echivalenți de NaCNBH₃. După terminarea reacției (testul Kaiser negativ) rășina s-a spălat de mai multe ori cu apă, izopropanol, DMF și diclormetan.

Alchilarea reductivă în soluție poate fi realizată, de exemplu, prin reacția peptidelor deprotejate la N-terminal, fragmente de peptide sau amino acizi cu aldehidele sau cetonele corespunzătoare folosind NaCNBH₃ sau hidrogen-Pd/C.

III. Prelucrarea rășină-peptidă obținută ca în Ib și II

Peptidă - rășină s-a uscat sub presiune redusă și apoi s-a supus unui tratament cu un amestec de TFA/apă (95:5) timp de 1,5 h (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc Workshop Manual, Melboume 1985). Rășina s-a filtrat apoi și s-a spălat cu TFA și DCM. Filtratul și soluțiile de spălare s-au concentrat și peptidă s-a precipitat prin adăugare de ester dietilic. După răcire, într-o baie cu gheață, precipitatul s-a filtrat, s-a preluat în acid acetic 30% și s-a liofilizat.

IV. Când se folosește o o-clortritil-rășină (furnizată de Biohellas), suspensia peptidărășină într-un amestec acid acetil/trifluoretanol/diclormetan (1:1:3) este agitată la temperatura camerei, timp de 1 h. Rășina este apoi filtrată sub vid și spălată cu soluție de scindare. Filtratele combinate sunt concentrate sub vid și sunt tratate cu eter. Solidul precipitat este îndepărtat prin filtrare sau centrifugare, spălat cu eter dietilic și uscat sub presiune redusă.

IV. Purificarea și caracterizarea peptidelor

Purificarea s-a efectuat prin cromatografie pe gel (SEPHADEX G-10, G-15/10%

HOAc, SEPHADEX LH20/MeOH) și /sau cromatografie de presiune medie (fază staționară:

HD-SIL C-8,2-45μ, 100 Â; fază mobilă; gradient cu A=0,1%, TFA/apă, B=0,1% TFA/MeOH), sau HPLC preparativă (fază staționară: Waters Delta-Pak C-18, 15μ,100 Â; fază mobilă:

gradient cu A=0,1 % TFA/apă, B=0,1% TFA/MeOH).

RO 118953 Β1

Puritatea produșilor rezultați s-a determinat prin HPLC analitică (fază staționară: 100 2,1 mm VYDAC C-18, 300 Â; fază mobilă: gradient acetonitril-apă tamponat cu 0,1 % TFA, 40°C).

Caracterizarea s-a făcut prin spectrometrie de masă cu bombardament de atomi rapizi și spectroscopie RMN.

B. Mod de lucru specific

Exemplul 1. (SECV ID NR:1) Me₂Val-Val-MeVal-3,4-dehidroprolil-Pro-amidă

0,53 g Fmoc-RINK-rășină (substituție 0,46 mol/g), corespunzător unei șarje de 0,25 mmoli, s-a pus în reacție ca în exemplul A la, cu 0,4 mmoli cu fiecare dintre

Fmoc-Pro-OH

Fmoc-3,4-dehidroprolină

Fmoc-MeVal-OH

Fmoc-Val-OH

Aminoacidul care urmează acidului N-metilamino s-a cuplat cu PyBrop, ca reactant de cuplare cu cuplare dublă. După terminarea ciclurilor de sinteză, peptida-rășină a fost supusă deprotejării la N-terminal (etapele 2-4 din Ala) și apoi s-a pus în reacție cu o soluție apoasă de formaldehidă ca în exemplul A II și apoi s-a uscat sub presiune redusă. Rășina rezultată s-a supus scindării TFA ca în exemplul A III. Produsul brut s-a purificat prin cromatografie de presiune medie obținându-se 32 mg peptidă pură dorită (10... 40 % în 10;

40...90 % în 140').

Compusul s-a caracterizat, în continuare, prin spectrometrie de masă cu bombardament de atomi rapizi ([M+H]+=548).

Exemplul 2. (SECV ID NR:1). Me₂Val-Val-MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolin-pirolidin-2carbonil]-Pro-benzilamidă

a) Acid Z-(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carboxilic

1,5 g acid (2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carboxilic (11,6 mmoli) s-au dizolvat în 4 ml apă și 2,33 ml NaOH 5N. La 4°C, s-au adăugat, timp de 1 h 2,12 ml benzilclorformiat (Z-CI; 12,8 mmoli) și 6,5 ml NaOH 2N. După ce amestecul de reacție a fost agitat peste noapte, la temperatura camerei, s-a ajustat pH-ul la 10. Stratul apos a fost extras cu diclormetan (4x), s-a ajustat pH-ul la 2 cu HCI 5N și a fost extras cu diclormetan (2x). Extractele organice combinate s-au uscat pe sulfat de sodiu și s-au evaporat sub vid obținându-se 1,75 g produs dorit, sub forma unui ulei.

b) Z-(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil-L-prolil-benzilamidă

1,75 g acid (2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carboxilic (6,62 mmoli) și 1,59 g clorhidrat de prolinbenzilamidă (6,62 mmoli) s-au dizolvat în 66 ml diclormetan și s-a răcit la 4°C. După adăugarea a 0,89 ml N-metilmorfolină (7,94 mmoli), 0,304 g HOBt (2,21 mmoli) și 1,28 EDCI (6,62 mmoli), amestecul de reacție s-a agitat peste noapte, s-a diluat cu 150 ml diclormetan, și s-a spălat cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu (3x), acid citric 5% (3x), apă (1x) și NaCI saturată (1x). Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu și s-a concentrat sub vid, obținându-se 2,63 g ulei cu viscozitate înaltă.

c) (2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil-L-prolil-benzilamidă

2,63 g Z-(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil-L-prolil-benzilamidă (5,8 mmoli) s-au dizolvat în 43 ml metanol. După adăugarea a 105 mg 10% Pd/cărbune, amestecul de reacție s-a hidrogenat peste noapte. După filtrare și evaporare la sec s-au obținut 1,88 g dipeptidă deprotejată.

d) Z-Me-Val-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă 1,54 g Z-MeVal-OH (5,8 mmoli) și 1,88 (2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil-L-prolil benzilamidă (5,8 mmoli) s-au dizolvat în 58 ml diclormetan și s-au răcit la 4°C. După adăugarea a 0,78 ml N-metilmorfolină

350

355

360

365

370

375

380

385

390

395

RO 118953 Β1 (6,96 mmoli), 0,266 g HOBt (1,93 mmoli) și 1,12 g EDCI (5,8 mmoli), amestecul de reacție a fost agitat la temperatura camerei, peste noapte, s-a diluat cu 120 diclormetan, și s-a spălat cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu, (3x), apă (1x), acid citric 5% (3x), apă (1x) și

NaCI saurat (1 x). Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu și s-a concentrat sub presiune redusă, obținându-se 3,01 g produs sub forma unei spume albe uscate.

e) MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă

3,01 g Z-MeVal-[S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă (5,33 mmoli) s-au dizolvat în 39 ml metanol. După adăugarea a 96 mg 10% paladiu/cărbune, amestecul de reacție s-a hidrogenat, timp de 3 h. După filtrare și evaporare la sec s-au obținut 2,18 g tripeptidă deprotejată sub forma unui ulei limpede.

f) Z-Val-Me-Val-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă

1,28 Z-Val-OH (5,11 mmoli) s-au dizolvat în 10 ml diclormetan. După adăugarea a 0,73 ml trietilamină (5,37 mmoli) și răcire la -10°C, s-au adăugat treptat 0,66 ml clorură de pivaloil. După agitarea amestecului la -10°C, timp de 1,5 h s-a adăugat o soluție formată din 2,18 g MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă (5,11 mmoli) și 0,73 ml trietilamină (5,37 mmoli) în 10 ml diclormetan. Amestecul de reacție a fost agitat la -10°C, timp de 1,5 h și la temperatura camerei, peste noapte, s-a diluat cu diclormetan și s-a spălat cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu (3x), apă (1 x), acid citric 5% (3x), apă (1 x), NaCI saturat (1x). Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu și s-a concentrat sub vid obținânduse 2,75 g produs sub forma unei spume uscate.

g) Val-MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă

2,75 g Z-Val-MeVal[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă (4,13 mmoli) s-au dizolvat în 30 ml metanol. După adăugarea a 0,34 ml HCI concentrat (4,13 mmoli) și 78 mg 10% paladiu/cărbune, amestecul de reacție s-a hidrogenat, timp de 3 h. După filtrare și uscare la sec, s-au obținut 2,23 g tripeptidă deprotejată sub forma unei spume albe uscate.Produsul brut s-a dizolvat în 50 ml apă și s-a ajustat pH-ul la 2-3 cu HC11N. Stratul apos s-a extras cu diclormetan (3x), s-a ajustat pH-ul la 10 cu NaOH 5N și s-a extras în continuare cu diclormetan (3x). Extractele organice combinate s-au uscat pe sulfat de sodiu și s-au concentrat sub presiune redusă obținându-se 1,71 g tetrapeptid benzilamidă deprotejată.

h) Me₂Val-Val-MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonil]-Pro-benzilamidă

0,47 g Me₂Val-OH (3,24 mmoli) și 1,71 g Val-MeVal-[(2S,3S)-3-metil-pirolidin-2-carbonilj-Probenzilamidă (3,24 mmoli) s-au dizolvat în 32 ml DMF uscat. După răcire la 4°C,sau adăugat 1,07 ml DEPCN (6,48 mmoli) și 1,88 ml trietilamină (12,96 mmoli). Amestecul de reacție a fost agitat la temperatura camerei, peste noapte, și s-a evaporat DMF-ul sub presiune redusă. Reziduul s-a dizolvat în 100 ml diclormetan și s-a spălat cu soluție saturată de bicarbonat de sodiu (3x), apă (1 x), acid citric 5% (3x), apă (1 x), și NaCI sat. (1x). Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu și s-a concentrat sub presiune redusă, obținându-se 0,88 g produs sub forma unui ulei incolor. Produsul brut s-a dizolvat în diizopropileter la fierbere și s-a precipitat prin răcire. Precipitatul s-a colectat și s-a uscat, obținându-se 0,56 g produs pur. Compusul a fost caracterizat prin spectrometrie de masă cu bombardament de atomi rapizi ([M+H]⁺ = 655,6).

S-au preparat, ca în exemplele 1 și 2, următorii compuși:

3. Xaa Val Xab Xac Xad

4. Xaa Val Xab Xac Xae

5. Xaa Val Xab Xac Xaf

6. Xaa Val Xab Xac Xag

7. Xaa Val Xab Xac Xah

8. Xaa Val Xab Xac Xai

RO 118953 Β1

9. Xaa Val Xab Xac Xak

10. Xaa Val Xab Xac Xal

11. Xaa Val Xab Xac Xam

12. Xaa Val Xab Xac Xan

13. Xaa Val Xab Xac Xao

14. Xaa Val Xab Xac Xap

15. Xaa Val Xab Xac Xaq

16. Xaa Val Xab Xac Xar

17. Xaa Val Xab Xac Xas

18. Xaa Val XabXacXat

19. Xaa Val Xab Xac Xat

20. Xaa Val Xab Xac Xav

21. Xaa Val Xab XacXaw

22. Xaa Val Xab Xac Xax

23. Xaa Val Xab Xac Xay

24. Xaa Val Xab Xac Xaz

25. Xaa Val Xab Xac Xba

26. Xaa Val Xab Xac Xbb

27. Xaa Val Xab Xac Xbc

28. Xaa Val Xab Xac Xbd

29. Xaa Val Xab Xac Xbe

30. Xaa Val Xab Xac Xbf

31. Xbg Val Xab Xac Xar

32. Xbg Val Xab Xac Xas

33. Xbh Val Xab Xac Xar

34. Xbh Val Xab Xac Xas

35. Xaa I le Xab Xac Xar

36. Xaa I le Xab Xac Xas

37. Xaa Xbk Xab Xac Xar

38. Xaa Xbk Xab Xac Xas

39. Xaa Val Xbi Xac Xar

40. Xaa Val Xbi Xac Xas

41. Xaa Val Xab Xac Xbi

42. Xaa Val Xab Xac Xbm

43. Xaa Val Xab Xac Xbn

44. Xaa Val Xab Xbo Xae

45. Xaa Val Xab Xbo Xbp

46. Xaa Val Xab Xbo Xar

47. Xaa Val Xab Xbo Xas

48. Xaa Val Xab Xbo Xbm

49. Xaa Val Xab Xbq Xae

50. Xaa Val Xab Xbq Xar

51. Xaa Val Xab XbqXas

52. Xaa Val Xab Xbq Xbm

53. Xaa Val ab Xbr Xbp

54. Xaa Val Xab Xbr Xae

55. Xaa Val Xab Xbr Xas

56. Xaa Val Xab Xbr Xar

57. Xaa Val Xab Xbs Xae

450

455

460

465

470

475

480

485

490

RO 118953 Β1

58. Xaa Val Xab Xbs Xas

59. Xaa Val Xab Xbs Xar

60. Xaa Val Xab Xac Xbu

61. Xaa Val Xab Xac Xbt

62. Xaa Val Xab Xbq Xbu

63. Xaa Val Xab Xbq Xbt

64. Xaa Val Xab Xac Pro Xbv

65. Xaa Val Xab Xac Pro Xbw

66. Xaa Val Xab Xac Pro Xbx

67. Xaa Val Xab Xac Pro Xby

68. Xaa Val Xab Xac Pro Xbz

64. Xaa Val Xab Xbq Pro Xbv

65. Xaa Val Xab Xbq Pro Xbw

66. Xaa Val Xab Xbq Pro Xbx

67. Xaa Val Xab Xbq Pro Xby

68. Xaa Val Xab Xbq Pro Xbz

69. Xaa Val Xab Xbo Xaz

70. Xaa Val Xab Xbq Xaz

71. Xaa Val Xab Xbq Xbn

72. Xaa Val Xab Xbo Xbn

Rezultatele caracterizării noilor compuși sintetizați sunt prezentate în tabelul de mai jos.

Exemplu	Analiza MS cu bombardament cu atomi rapizi
[Nr.]	[Masa moleculară (măsurată)
45.	627
53.	655

Tabelul 1

Identificarea compușilor preparați conform exemplelor 1 și 2

Compus nr.	Numărul secvenței ID
1-34,39-63,69-72	1
35,36	2
37,38	3
64-68	4

Simbolurile Xaa au următoarele semnificații: Xaa: N,N-Dimetilvalină

Xab: N-Metilvalină

Xac:

O

RO 118953 Β1

Xad:

540

Xae:

Xag:

545

550

555

Xah:

Xai:

Xak:

O HjC

560

565

570

575

Xam:

RO 118953 Β1

xau: O

f

Xaz:

Xba:

Xbb:

Xbc:

Xbd:

Xbe:

⁰ CHa

Xbf:

Xbg: Xbh: Xbi: Xbk:

N,N-dimetilizoleucină

N,N-dimetil-2-fe/ț-butil-glicină

N-metîlizoleucină 670

2-tert-butilglicină

Xbl:

Xbm:

Xbn:

685

XbO:

L-azetidin—2-carbonil

RO 118953 Β1

Xbp:

Xbq:

Xbr:

Xbs:

(4-fluor)-L-prolină (5-metil)-L-prolină (3-metil)-L-prolină xbt·.

Xbu:

Xbv:

Xbw:

H₃C^CH₃ o

Xbx:

Xbz:

CH, h₃c θ

Compușii conform invenției pot fi evaluați din punctul de vedere al activității anticancerigene, prin metode convenționale, incluzând de exemplu, metodele prezentate în continuare.

A. Metodologia in vitro

Citotoxicitatea s-a măsurat folosind metodologia standard, pentru liniile de celule aderente, cum ar fi testul microculturii cu tetrazoliu (MTT). Detaliile acestui test sunt publicate (Alley, MCș.a., Cancer Research48:589-601,1988). Culturile cu creștere exponențială ale celulelor tumorale, cum ar fi cele ale carcinomului colonului HT-29 sau ale tumorii pulmonare LX-1, s-au folosit pentru a face culturile plăcii microtitru. Celulele s-au însămânțat la

RO 118953 Β1

5000 - 20.000 celule per godeu într-o placă cu 96 godeuri (în 150 pl de mediu) și au fost lăsate să crească peste noapte, la 37°C. Se adaugă compușii de testat, la o diluție de 10 ori, variind de la 10^-4 M la 10'¹°M. Celulele s-au incubat apoi timp de 48 h. Pentru a determina numărul de celule viabile din fiecare godeu, s-a adăugat colorant MTT (50 pl soluție de 3 mg/ml bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol în soluție salină). Acest ames- 740 tec s-a incubat la 37°C, timp de 5 h și apoi s-au adăugat în fiecare godeu 50 pl 25% SDS, pH = 2. După incubare peste noapte, s-a citit absorbanța la 550 nm în fiecare godeu, folosind cititorul ELISA. S-au calculat valorile medii +/- abaterea standard (SD) ale datelor din godeurile replicate, folosind formula % T/C (% celule viabile tratate/control).

745 OD celule tratate

-------------------x 100 = % T/C

OD celule de control

Concentrația compusului de testat care dă o valoare T/C de 50% inhibare a creșterii 750 s-a desemnat ca valoare IC^.

Compus din exemplul	ICsolM]
1.	1 x10’⁹
2.	1 x10’⁹
45.	1 x10'⁷
53.	1 x W⁸

755

B. Metodologia in vivo

Compușii conform invenției s-au testat preclinic pentru determinarea activității in vivo, 760 care este un indiciu al utilității clinice. Aceste evaluări s-au efectuat pe șoarecele nud, în care s-au transplantat (xenogrefe) țesuturi tumorale, de preferință, de origine umană, după cum se cunoaște în domeniu. Compușii s-au evaluat din punctul de vedere al activității lot antitumorale după administrare la șoarecii care au xenogrefe.

în special, tumorile de sân uman (MX-1), care s-au crescut în șoareci nuzi atimici 765 s-au transplantat în șoareci noi, folosind fragmente care au avut o mărime de aproximativ 50 mg. Ziua transplantării s-a denumit ca ziua 0. După 6 până la 10 zile, prin injectare intravenoasă, șoarecii s-au tratat cu compuși, în grupe de 5...10 șoareci pentru fiecare doză. Compușii s-au administrat zilnic, timp de 3 săptămâni, la doze cuprinse între 1 și 100 mg/kg corp. Diametrele tumorilor și greutățile corporale s-au măsurat de două ori pe săptămână. 770 Volumul tumorilor s-a calculat, folosind diametrele măsurate cu șublerul Vernier și cu formula:

(Lungime x lățime²)/2 = mm³ volum al tumorii

Volumele medii ale tumorii s-au calculat pentru fiecare grup tratat, și valorile T/C s-au determinat pentru fiecare grup, raportat la tumorile animalului de control netratat. 775

Compușii noi prezintă proprietăți bune de inhibare a tumorii.

Listarea secvențelor (1) Informația generală

(i)	Solicitant
(A)	BASF Aktiengesellschaft	780
(B)	Strada: Carl-Bosch-Strasse 38
(C)	Orașul: Ludwigshafen

RO 118953 Β1 (D) Țara: Bundesrepublik Deutschland (E) ZIP: D-67056 (F) Telefon: 0621/6048526 (G) Telefax: 0621/6043123 (H) TELEX: 1762175170 (ii) Titlul invenției:Derivați peptidici și metodă de tratament mamifere (iii) Numărul secvențelor: 4 (iv) Forma de citire pe calculator (A) Tipul de mediu: Dischete, 3,5 inch, 2DD (B) Calculator: IBM AT-compatibil.procesor 80286 (C) Sistem de operare: MS-DOS versiune 5,0 (D) SOFT: Word Perfect (2) Informație pentru seq id no:1 (i) caracteristicile secvenței:

(A) lungime: 5 amino acizi (B) tip:aminoacid (C) topologie: lineară (ii) Tipul de moleculă: peptidă (xi) Descrierea secvenței: SEQ ID NO:1

Xaa Val Xaa Xaa Xaa (2) Informație pentru seq id no:2 (i) caracteristicile secvenței:

(A) lungime: 5 amino acizi (B) tip: aminoacid (C) topologie: lineară (ii) Tipul de moleculă: peptidă (xi) descrierea secvenței: seq id no:2

Xaa ile xaa xaa xaa (2) Informație pentru seq id no: 3:

(i) caracteristicile secvenței:

(A) lungime: 5 amino acizi (B) tip: aminoacid (D) topologie: lineară (ii) tipul de moleculă:peptidă (xi) descrierea secvenței: seq id no:3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (2) Informație pentru seq id no:4 (i) caracteristicile secvenței:

(A) lungime: 6 amino acizi (B) tip: amino acid (A) topologie: lineară (ii) tipul de moleculă: peptidă (xi) descrierea secvenței: seq id no:4

Xaa val xaa xaa pro xaa tumorilor la

Claims

Revendicări

1. Derivați peptidici, având formula corespunzătoare structurii generale (I): 835

R^N-CHX-CO-A-B-D-E-țFJt-K (I) caracterizați prin aceea că

R¹ este metil, etil sau izopropil;

R² este hidrogen, metil sau etil;

R¹-N-R² pot forma împreună un ciclu pirolidinic; 840

A reprezintă un radical valii, izoleucil, 2-te/ț-butilglicil, 2-etilglicil, norleucil sau norvalil;

B reprezintă un radical N-metil-valil, leucii, izoleucil, norvalil,2-te/ț-butilglicil, 3-terțbutil-alanil, norleucil, 2-etilglicil;

D reprezintă un radical 3,4-dehidroprolil, 4-fluoroprolil, 4,4-difluorprolil, azetidin-2carbonil,3-metilprolil, 4-metilpropil sau 5-metilprolil; 845

E este un radical prolil, homoprolil, hidroxiprolil, tiazolidin-4-carbonil;

F este un radical valii, 2-terț-butilglicil, izoleucil, leucii, 2-ciclohexilglicil, norleucil, norvalil, neopentilglicil, alanil, (3-alanil sau aminoizobutiroil;

X este alchil (de preferință C₂-C₅), ciclopropil sau ciclopentil;

teste O sau 1; și 850

K este alcoxi (de preferință C_1M), benziloxi sau un fragment amino substituit sau nesubstituit,· și sărurile acestora acceptabile farmaceutic.
2. Derivați peptidici, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că prezintă activitate antitumorală.
3. Metodă de tratament al tumorilor la mamifere, caracterizată prin aceea că 855 aceasta cuprinde administrarea, sub formă orală și /sau parenterală a unei cantități eficiente terapeutic din unul dintre derivații peptidici definiți în revendicarea 1, într-o doză cuprinsă între 0,0005 și 0,050 g per kilogram corp, în cazul administrării orale și 0,00005...0,020 g per kilogram corp, în cazul administrării parenterale, în scopul de a inhiba dezvoltarea tumorii.