CZ376397A3

CZ376397A3 - Derivát dolastatinu, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ376397A3
Application number: CZ973763A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Haupt; Franz Dr. Emling; Cynthia A. Dr. Romerdahl
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1998-06-17
Also published as: HUP9801910A3; ATE224910T1; IL122215A; DK0871656T3; AU725164B2; SK165397A3; DE69623472T2; NO975710D0; NO975710L; MY124487A; US5831002A; PT871656E; CA2219819A1; HU228071B1; UA46775C2; PL185763B1; EP0871656B1; ES2188759T3; CN1182154C; JPH11504652A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká peptidu a farmaceutického prostředku, který ho obsahuje a je vhodný pro léčení onkologických onemocnění

Dpsayadn í stav t.echn i ky

Je známé, že peptidy izolované z mořských zdrojů jako Do I astat in-i 0 (americký patentový spis číslo 4 816444) a Dolastatin-15 (evropský patentový spis číslo EP-A-398558) mají mocnou aktivitu jako inhibitory růstu buněk (Biochem Pharmacology 40, č. 8, str. 1859 až 1864, 1990; J. Nati. Cancer Inst.

85, str. 483 až 488, 1993 a tam uváděné odkazy na literaturu).

Na základě zajímavých výsledku při pokusech s nádorovými systémy in vivo, se provádějí v současné době další preklinická hodnocení těchto přírodních produktů k iniciaci klinických studií na nemocných rakovinou.

Přírodní produkty mají však ten nedostatek, že jsou špatně rozpustné ve vodných rozpouštědlech a investiční náklady pro jejich syntézu jsou vysoké.

Vynález se týká nových peptidu a jejich derivátů, které představují zlepšený terapeutický potenciál pro ošetřování neoplastových onemocnění ve srovnání s DolasLatinem- 15. Kromě toho lze nové peptidy podle vynálezu snadno syntetizovat dále podrobně popsaným způsobem.

• 4

- 2 Podstata vynálezu

	Podstatou	vynálezu je peptid obecného vzorce I
	R¹R²N -	CHX - CO - A - B - D - E - (F)t - K	( I)
kde	znamená
R¹	methyl,	ethyl nebo isopropyl,
R³	vod í k,	methyl nebo ethyl,

R¹ N-R³ spolu dohromady pyrroi1idinový kruh,

A zbytky valyl, isoleucyl, leucyl, 2-terč.-butylglycyl,

2-ethylglycyl, norleuayl nebo norvalyl,

B zbytky N-methylvalyl, N-methy11eucy1, N-methyl i soleucyl , N-methylnorva1yl, N-methylnor 1eucyl, N-methyl-2terč.-butylglycyl, N-methyl - 3-terč.-butylalanyl nebo N-methyl-2-ethylglycyl,

D zbytky prolyl, 3,4-dehydroproly1, 4-f1uoropro1y1, 4,4dif1uoroprolyl, azetidin-2-karbony1, homoprolyl, 3methylproly1, 4-methy1prolyl, 5-methylprolyl nebo thi azolidin-4-karbony1 ,

E 3,4-dehydropro1y1, 4-f1uoroprolyl, 3-methy1 pro1y1, 4methylprolyl, azetidin-2-karbony1 nebo 4, 4-di £ 1uoropropyl,

F zbytky valyl, 2-terč.-buty1g1yay1, isoleucyl, leucyl,

2-cyk1ohexy1g1ycy1, norleucyl, norvalyl, neopentylglycyl, alanyl, beta-alanyl nebo ami no isobutyroy1,

X alkyl s výhodou s 2 aě 5 atomy uhlíku, cyklopropyl

- 3 • ·

nebo cyklopentyl, t 0 nebo 1 a

K alkoxy s výhodou s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxy nebo substituovanou nebo nesubstituovanou aminoskupinu, nebo jeho soli s fyziologicky vhodnými kyselinami. Vynález se také týká způsobu přípravy těchto peptidů obecného vzorce I, farmaceutických prostředků, které tento peptid obecného vzor ce I obsahují spolu s farmaceuticky vhodnými nosiči a kterých se používá pro ošetřování rakoviny.

Symbol K znamená obzvláště Ci_4alkoxy, benzyloxy nebo ami no obecného vzorce R⁵-N-R^b, kde znamená

R⁵ vodík nebo hydroxy nebo Ci-4alkoxy nebo benzyloxy, popřípadě substituované až dvěma substituenty na sobě nezávisle volené ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1.4a1ky1 sulfonyl, Ci-4alkoxy, halogen, Ci„4alkyl, kyano, hydroxy, N<CH3)z, COOMe, COOEt, C001Pr, a COONHz nebo R⁵ znamená fenyloxy popřípadě substituované až dvěma substituenty na sobě nezávisle volené ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1 -4alky1su1fony1, Ct_4alkoxy, halogen, Ci^alkyl, kyano, hydroxy, N(CH₃)z, COOMe, COOEt, COOiPr, a COONHz

R⁶ vodík nebo Ci_i2alkyl popřípadě substituovaný alespoň jedním atomem fluoru, nebo znamená -C(CH₃)2CN, -C(CH₃)2CCH, -C(CH3)zC=CH₂, -C(CH₃)₂CHzOH, -C(CH3)zCHzCH₂0H nebo -(CHz)vC₃-7cyk1oa1ky1em, kde znamená v 0, 1 nebo 2 a který je popřípadě substituován methylem, nebo znamená norefedryl, norpseudoefedry1, chinolyl, pyrazyl, adamantyl, -CH2-benzimidazolyl, -CHz-adamanty1. a 1fa-methy1benzy1, alfa-dimethylbenzyl, -(CH2)vfeny1, kde znamená v 0, 1 nebo 2 a který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na

- 4 sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci-4alkylsulfonyl, Ci _4<alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který muže vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)z, COOMe, COOEt, COOiPr a COONHa, nebo znamená -(CH2)_mnafty 1 , kde znamená m 0, 1 nebo 2 a který je popřípadě substituován ledním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF₃, nitro, Ci-431kylsul fonyl , Ci-4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který múze vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)z, COOMe, COOEt, COOiPr a COONHa, nebo znamená -(CH2)vbenzhydry1, kde znamená v 0, 1 nebo 2 a který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci_4S1kylsulfonyl, Ci-4alkoxy, halogen,

Ci_4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH₃)2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená bifenyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci_4alkylsulfonyl, Ci_4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který múze vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, NCCH312, COOMe, COOEt, COOiPr a COONHa, nebo znamená pyrídyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci.4alky1suJfony1, Ci4alkoxy, halogen, Ci-4alkyl, který muže vytvářel cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3>2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená pikolyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci-4alkylsulfonyl, Ci-4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH₃)2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená -CH2-CHz-pyridy1, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými 2e souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1 - 4a1kylsulfonyl, Ci_4alkoxy, halogen, C1.4alk.yl, který muže vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH₃)2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2,

nebo znamená benzothiazolyl , který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými 2e souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1_4&Ikylsulfonyl, Ci-4alkoxy, halogen, Ci-4alkyl, který nuže vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, NÍCH312, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená benzo i soth i 320! y 1 , který je popřípa dě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci-4al kylsulfonyl ,

Ci.4a!koxy, halogen, Ci_4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3>2

COOMe,

COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená benzopyrazolyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro,

C i ..4a! ky Isul fonyl, Ci-4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který můše vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3>2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená benzooxyzolyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma sub situenty na sobě nezávisle volenými ze souboru nahrnujícího CF3, nitro, Ci_4alkylsulfonyl , Ci-4^1koxy, halogen, C1 _ 4 alkyl, který můše vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr a C00NH₂, nebo znamená -(CHs1m-f1uoreny1 , kde znamená m 0 nebo 1, který 30 popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru nahrnujícího CF3, nitro, C1-4a1ky1su1fony1, Ci_4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)a, COOMe,

COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená pyrimidyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru nahrnujícího CF3, nitro, C1 -4alky1 sulfonyl, Ci.4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)2.

COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2. nebo znamená - ( CHa)_m 1nda nyl, kde znamená m 0 nebo 1, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volený mi ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci.4 - a 1ky1 sulfony1,

- 6 Ci_4alkoxy, halogen, Ci_4alkyl, který muže vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)a, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená -(CH2CH2O}yCH3, kde znamená y 0, 1, 2,

3, 4, nebo 5 nebo znamená -(CH2CH2O)_yCH2CH3, kde znamená y 0,1, 2, 3, 4, nebo 5 nebo znamená -NH-CsHs, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci-4alkylsulfonyl, Ci_4alkoxy, halogen, Ci-4<alkyl, který muže vytvářeL cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)z, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená -NCH3-C6H5, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1 - 4a 1 ky 1 sul f ony I , Ci_4alkoxy, halogen, C1..4 alkyl, který muže vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)z, COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2, nebo znamená -NH-CHa-CfeHs, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, Ci_4alkylsulfonyl, Ci-4alkoxy, halogen, Ct..4alkyl, který může vytvářet cyklický systém, kyano, hydroxy, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr a COONHz, nebo znamená -NCH3 CHzCbHs, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze soubo ru zahrnujícího CF3 , nitro, halogen, Ci_4alkyl, který kyano, hydroxy, N(CH3)z,

C1,4a1ky1su1fony1, Ci-4alkoxy muže vytvářet cyklický systém COOMe, COOEt, COOiPr a COONH2 nebo znamená pětičlenný heteroaryl, který je popřípadě sub stituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3, nitro, C1.4a1ky1 sul fonyl, Ci.jalkoxy, thiomethyl, thioethyl, pikolyl, acetyl, C3-pcykloalky1, thiofenyl, CHz-COOEt, C3-4alkylen vytvářející bicyklický systém s heterocyk1em, fenyl, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího nitro, CF3, kyano, halogen a Ci_4alkyl, a dále zahrnujícího benzyl který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na so- 7 -

bé nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího nitro, CF3, halogen, Ci_4alkyl, Ci-4alkylsulfonyl, kyano, hydroxy, Cj-4dialkylamino, nebo znamená pětičlenný -CHR⁷-heteroary1, který je popřípadě substituován jedním nebo dvěma subsituenty na sobě nezávisle volenými ze souboru zahrnujícího CF3 , nitro,kyano, halogen. COOHe, COOEt, COOiPr a COONHz, Ci-4alkyl, Ci_4alkoxy, íenyl, benzyl, nafty! a Cí_4alkylsulfonyl, přičemž R⁷ znamená vodík, Ci-salkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem nebo benzyl.

Příkladně se jako pětičlenný -CHR⁷-heteroary1 uvádějí následující zbytky·'

* V « 4 ·

Příkladně se jako pětičlenný heteroaryl uvádějí následující zbytky^:

COOEt

o •· · •· »* •· ♦

9 9* •· ♦· « · · ·· • ··

Příkladně se jako seskupení R⁵-N-R⁶ uvádějí následující skupiny

O —N S=o ' \_____f ^//^'o N ^u

Výhodné jsou peptidy obecného vzorce I, kde znamená

R‘	methyl něho ethyl,
R²	vodík, methyl nebo ethyl,
A	zbytky valyl, isoleucyl nebo 2-terčbuty1g1ycy1,
B	zbytky N-methyl valyl, N-methyl iso1eucyl nebo N-methyl 2-terc.-butylglycyl,
D	zbytky prolyl, 3,4-dehydropro1yl, 4-f1uoropro1y1, 3methylprolyl nebo azetidin-2-karbony1,
E	zbytky 3,4-dehydropro1yl, 4-f1uoroproly1, 3-methylpro lyl nebo azetidin-2 - karbony1,
F	zbytky b-valyl, 2-terč.-buty1g1ycy1, D-isoleucyl, D1eucyl nebo ami no isobutyroy1,
X	-CH(CH₃)₂, -C(CH₃)₃, -CH(CH₃)CH₂CH₃ ;
L	0 nebo 1 a

s výhodou znamená β 4

-11-OC(CH₃)₃, -ΝΗ₂, -NH-Ci-12-alkyl, -NH-C₃.₈-cy-loalkyl,

-NH- [3,3,0]-bicyUlooktyl, nore^.edryl, norpseudoe^edryl,

-NH-tkinolyl, -NH-pyrazyl, -NH-CH₂-benzimidazolyl, -NH-adamantyl, -NH-CH₂-adamantyl, -NH-CH(CH₃)-^enyl, -NH-C(CH₃)₂-^.enyl, -NfCwalkoxyJCxu-alkyl, alkoxy) ~CH₂-^enyl, -N(Ci-₄-alkoxy) ^-enyl, -N(CH₃)OBzl, -NH-(CH₂)_v-^enyl (v-0,1,2, . 3), -NH-(CH₂)_mna-At^vi /m=n .11, -NH-ι..-benzhydryl (w=*o,l,- - 2),

-NH-bi-^enyl, -NH-pyrídyl, -NH-CH₂-pyridyl, -NH-CH₂-CH₂pyridyl, -NH-benzothiazolyl, -NH-benzolsothiazolyl, -NH-benzopyrazolyl, -NH-benzoxazolyl, -NH-(CH₂)_m-fluorenyl (m«*0 1), -NH-pyrimidyl, -NH-(CH₂)_ro-lndanyl (m-0 ₇ 1),

-NH- (CH₂CH₂O)_y-CH₃ (y-0,1,2,3,4 , 5), -NH-(CH₂CH₂O)_y-CH₂CH₃ (Y=O,1,2,3,4,5), -NH-pětičlenný heteroaryl, shora charakterizovaný, -NH-CHR⁷-pět i členný heteroaryl, shora charakterizovaný, při černá R⁷ znamená vodík, Ci.salkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem nebo K znamená zbytek

r~\

--N O \—J

H,C

Především znamená K zbytek

-NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -NH(CH₂)₂CH₃, -NH(CH₂)₃CH_3j -NH(CH₂)₄CH₃, -NH(CH₂)_sCH₃, -NH(CH₂)₆CH₃, -NH(CH₂)₇CH₃, -NHCH(CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH₂CH₃, -NHCH(CH₃)CH₂CH₂CH₃, -NHCH(CH₂CH₃)2, -NH(CH₂CH₂CH₃) 2, -NHC(CH₃)₃, -NHCH(CH₂CH₃)CH₂CH₂CH₃, -NHCH(CH₃)CH(CH₃)₂, -NHCH(CH₂CH₃)CH(CH₃)_2/ -NHCH(CH₃)C(CH₃)₃, -NH-cyVilopropyl, -NH-cvklobutyl, -NH-cylílopentyl, -NH-cyklohexyl, -NH-cykoheptyl, -NH-cyí(looktyl, -NH-bicykLo[3,3,0]oktyl, -N(CH₃)OCH₃, -N(CH₃ )OCH₂CH₃₍-N(CH₃)OCH₂CH₂CH₃, -N(CH₃)OCH(CH₃ )₂, -N(CH₂CH₃)OCH₃, -N(CH₂CH₃)OCH₂CH₃ -N(CH(CH₃)₂)OCH₃, -N(CH₃)OCH₂C₆H₅,^/-N(OCH₃)CH₂-C₆H₅, -N(CH₃)OC₆H₅, -nh-ch₂-c_€h₅, -NH(CH₂)₂C_€H₅,

-NH(CH₂)₃C₆H_5/ -NHCH(CH₃)C₆H₅, -NHC(CH₃)₃C₆H₅, -NHC(CH₃)₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)(CH₂CH₃)₂, -NHCH(CH₃)CH(OH)C₆H₅, -NHCH₂-cyclohexyl, -NH-CH₂CF₃, -NHCH(CH₂F) _2/-NHC(CH₃)₂CH₂CH₂OH, -NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₃, -NHC(CH₃)₂CH(CH₃)₂, -NHC(CH₃)₂CN, -NHC(CH₃)₂CCH, -NHC(CH₃)2C-CH2/ nore^edryl, norpseudoe/.edryl, -NH-chinolyl, -NH-pyrazyl, -NH-adamantyl(l), -NH-adamantyl(2), -NH-CH₂-adamantyl, -NH-CH₂-na^.trjyl, -NH-benzhydryl, -NH-bifenyl, -NH-pyridyl, -NH-pikolyl, -NH-CH₂-CH₂-pyrldyl, -NH-benzothiazolyl, -NH-benzoisothlazolyl, -NH-benzopyrazolyl, -NH-benzoxazolyl, -NH-fluorenyl, -NH-pyrlmidyl, -NH-thiazolyl(2), -NH-isoxazolyl(3), -NH-CH₂-furanyl(2), -NH-(3-methyl)isoxazolyl(5), -NH-(3-methyl)isothiazolyl(5), -NH-(2-trifluormethyl)-thiadiazolyl(5), -OC(CH₃)₃, -NH-CH₂-(4-methyl)thiazolyl(2), -NH-CH₂-thienyl(2), -NH-CH₂-(5-methyl)thienyl(2), -NH-(2-methyl)thiadiazolyl(5), -NH- (2-cyJ(lopropyl) thiadiazolyl (5), nebo znamená K zbytek vzorce

S \_7

Uvedené příklady vynález toliko objasňují, nijak j e j však neomezuj í

Peptidy obecného vzorce T se skládají z L-aminokse1 in, F může však znamenat rovněž D-aminokyse1 i nu.

Peptidy obecného vzorce T mohou být. ve formě solí s fysiologicky vhodnými kyselinami, jako jsou například kyselina chlorovodíková, citrónová, vinná, mléčná, fosforečná, methan- 13 sulfonová, octová, mravenčí, maleinová, jantarová, malonová, sírová, L-glutamová, roznová, muková, benzoová, glukuronová,

f umarová, jablečná,

L-asparagová, pyrohštavelová, askorbová a acetylglycin.

Peptidy obecného vzorce I se mohou připravovat o sobě známými způsoby z chemie peptidú. Tak se například mohou postupně skládat z aminokyselin nebo se mohou získat vázáním vhodných malých peptidových fragmentů. Při postupném skládání se vychází z C zakončení peptidověho řetězce, který se postup ně prodlužuje vždy o jednu aminokyselinu. Při kopulaci fragmentů je možné spolu vázat fragmenty různé délky, přičemž se takové fragmenty získají postupným vázáním aminokyselin nebo rovněž kopulací fragmentů. Při obou těchto způsobech je nutné vázat vzájemně jednotky vytvářením amidové vazby. K tomuto účelu jsou vhodné jak chemické Lak enzymat. i cké způsoby.

Chemické způsoby pro vytváření amidové vazby podrobně popsal Mueller <Methoden der organischen Chemie, svazek XV/2, str. 1 až 364, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974; Stewart, Young,

Solid Phase Peptide Synthesjs, str. 31 až 34, 71 až 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Snthesis, str. 85 až 128, Jobn Wiley and Sons, New York, 1976) a které jsou rovněž popsány v jiných základních publikacích o chemii peptidů. Obzvláště výhodným je azidový způsob, symetrický a směsný anhydridový způsob, in šitu generované a předformované aktivní estery, použití urethanu chráněného N-karboxyanhydridy aminokyselin a vytváření amidových vazeb za použití systému kopulační s1ožka/akt ivátory, přičemž se zvláště uvádějí dicyk1ohexy1karbodi imid (DCC) , diisopropylkarbod iimid (DTC), 1 -ethoxykarbony1 - 2 ethoxy-1,2-d i hydroch i no lin (EEDQ), 1 -ethy1 - 3-( 3-dimethy1aminopropy1)karbodi imidhydro chlorid (EDCI), anhydrid n-propanfosfonové kyseliny ( PPA) , N,N-bis(2-oxo-3oxazolidiny1)amidofosfory1chlorid (ROP Cl), bromo-tr i s-pyrro1 i d i nofosf oniumhexa f1uorf osf át (PyBrop) , d i f e-

ny1fosfory1 as id (DPPA) reagencie Castro (BOP, PyBop) , 0-benzotriazoly1 -N,N,N , N -tetramethy1 uroň iové soli (HBTU),

O-azabenzotriazolyl-N,N,N ,N -tetramethyluroniové so li (HATU), diethy1fosfory1kyanid (DEPCN), 2,5-difeny1 -2,3-di hydro-3-oxo-4hydroxythiofendioxid (SLeglichovo reakční činidlo, HOTDO) a

1,1 - karbony1di imidazoI ( CDl)

Kopulační činidla se mohou používat samotná nebo v kombinaci s aditivy, jako jsou například

N,N-dimethyl-4-aminopyridin (DMAP)

N-hydroxybenzoLri azol (HOBt), N-hydroxysukcinimid (HOSu) nebo 2-hydroxypyridin.

Zatímco je zpravidla možné upustit od chránících skupin při enzymatické syntéze peptidů, je přechodná ochrana reaktivreakční složky při chemické syntéze. Při chemické syntéze pept.idů se dává přednost, třem běžným způsobům použití chrán i c í ch skupin:

způsobu používajícího benzy1oxykarbony 1 (Z), t-butoxykarhnnyl (Boc) a 9-f1uorenylmethoxykarbony1 (Fmoc).

V každém případě se používá chránící skupiny na a 1fa-aminoskupi ně jed notky prodlužující řetězec. Podrobný přehlad skupin chránících aminoskupinii uvádí Mueller ( Methoden der organischen Chemie, svazek XV/1, str. 20 až

906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974).

Jednotky, použ í váné pro vytváření peptidového řetězce, se mohou nechávat reagova t nebo podobným způsobem, jaký popsal Murrifíeld (J Amer. Chem

Soc. 85, str.

2149,

1963) Obzvláště výhodnými jsou způsoby, př i kterých se peptidy vytvářejí postupně něho kopulací fragmentů za použití chráních skupin

Z, Bon nebo Fmnc.

složek při způsobu, který popsal Murrifield se váže na nerozpustný se zpravidla vytváří postupně na polymerním nosiči za použití ohřáních skupin Boc nebo Fmoc, rostoucí peptidový řetězec je kovalentně vázán C zakončením na nerozpustné pryskyřičné čás tice (obr. 1 a 2). Tento způsob umožňuje odstranit reagenční činidla a vedlejší produkty filtrací a tedy je překrysta1 ování polymerní nosič (označovaný zde také jako pryskyřice). Peptid

- 15 meziproduktů zbytečné.

Chráněné aminokyseliny se mohou vázat na jakýkoliv vhodný polymer, který musí být pouze nerozpustný v použitém rozpouštědle a musí mít stálou fyzikální formu, která usnadňuje filtraci . Polymer musí obsahovat funkční skupinu, na kterou se muže pevně vázat první chráněná aminokyselina kovalentní vazbou. Pro tento účel jsou vhodné nejrůznější polymery: příkladně se uvdějí celulóza, polyvinylalkohol, polymethakry1át, sulfonovaný polystyren, kopolymer chl ormet.hyl ováného styrenu a di v inylbenzenu (Murrifie1dova pryskyřice), 4-methylbenzhydrylaminová pryskyřice (pryskyřice MRHÁ), feny1acetamidomethy1ová pryskyřice (Pam-pryskyřice), p henzy1oxybenzyIalkoholová pryskyřice, benzhydry1ami nová pryskyřice (BHA-pryskyřice), 4-(hydroxymethy1)benzoy1oxymethy1ová pryskyřice, pryskyřice, kterou popsal Breipohl a kol. (Tetrahedron Letters 28, str. 565, 1987, obchodní produkt společnosti BACHEM) , 4-í 2, 4-dimethoxyfeny1aminomethy1)fenoxypryskyřice (obchodní produkt společnosti Novabiochem) nebo o-chlortri ty1ová pryskyřice (obchodní produkt společnosti Riohellas).

Pro peptidovou synthesu v roztoku se hodí všechna rozpouštědla, jež jsou inertní za reakčních podmínek, obzvláště voda, N,N-dimethy1formamid (DME), dimethy1su1foxid (DMSO), acetonítril, dichlormethan (DCM), 1.4-díoxan, tetrahydrofuran (THF), N-m ethyl -2-pyrrol i don (NMP) a směsi těchto rozpouštědel . Peptidovou synthesu na polymerním nosiči lze provádět, ve všech inertních organických rozpouštědlech, ve kterých jsou použité deriváty aminokyselin rozpustné. Výhodná rozpouštědla j ako N, N-d imethy1formamid , dichlormethan, N methyl 2-pyrrol idon, acetonitril a dimethy1 sulfoxid a jejich směsi však působí bobtnání pryskyřic. Když je synt.hesa ukončena, pept i d se od polymerního nosiče odštěpí. Podmínky, za kterých je odštěpení od různých prykyřic možné, jsou popsány v literatuře. Nejběžněji používané odštěpovací reakce jsou kat.alyzovány kyselinami

- 16 a palladiem, obzvláště je vhodné štěpení v tekutém bezvodém hydrogenf1uoridu, v bezvodé trif1uormethansulfonové kyselině, ve zředěné nebo v koncentrované triíluoroctové kyselině, palladiem katalyzované štěpení v tetrahydrofuran nebo ve směsi tetrahydrofuranu a dichlormethanu v přítomnosti slabé zásady jako je morfol in nebo štěpení ve směsích kysel iny octové a dichlormethantrif1uormethanolu V závislosti na zvolených chránících skupinách, mohou se tyto skupiny udržet nebo popřipádě odštěpit za štěpících podmínek. Cenné muže být také částečné odstraněni chránících skupin peptidu.

ma j í- 1 se provést určité der-i vat i začn í reakce . Peptidy dialkylované na N-zakoncení se mohou připravoval.

b)

c) kopu 1ac1 nebo na redijkčn í příslušných N.N-di a 1ky1ami nových kysel po 1ymern i m nos i či , alkylací pept. i du vázaného na prykyřici d i Dle thy 1 f omam i d/ 1 ý ným aldehydem nebo hydrogenací peptidů ketonu a palladia v roztoku systému octová kysel i na s NaCNBH3 a př í s 1 ilš ketonem, v roatoku v na uhli.

přítomnosti aldehydu nebo

Různé v přírodě se nevyskytující aminokyseliny podle vynálezu jsou obchodně dostupné něho se mohou syntetizovat z obchodně dostupných materiálů způsoby známými ze stavu techniky. Obchodně dostupnými výchozími materiály jsou kyselina azet i d i n-2- karboxy 1 ová, 3 - met,by 1 - L- prol i n , 5- methyl - L- prol i n a skupinou Boc nebo Fmoc chráněný 3,4-dehydropro1in (ACROS, NOVABTOCTJEM, BACHEM). Cis- a trans-4 f 1 uoroprol i η 1 ze př i pravit způsobem, který popsal Panasik a kol. (N. Panasik, E.S. Eberbardt, AS Edison, D.R. Povelí, R.T. Raines, Int. J. Pep1.1 de Protein Res 44, str. 262 až 269, 1994) z hydroxyprol inu.

Sloučeniny podle vynálezu mohou sloužit k inhibici nebo jinému léčení pevných nádorů (například nádorů plicních, prsních, tlustého střeva, prostaty, žlučníku, konečníku nebo en dometriálních nádorů) nebo hematologických onemocnění (například leukemie, lymphomas), podáváním sloučenin savcům.

- 17 Specielní předností nových sloučenin podle vynále2u je, še jsou odolnější vůči enzymatickému rozkladu ve srovnání s Do 1 astat inem-15.

Podávání může být. běžnými farmaceut i ckým i , s výhodou onkologickými prostředky, včetně orálních a parenterá1ních prostředků, subkutánně, i nt.ravenosně, intramuskulárně a íntraper i toneá1 ně

Sloučeniny mohou být. podávány samot,né nebo v podobě farmaceutických prostředků obsahujících sloučen i nu obecného vzorce T spolu s farmaceuticky vhodným nosičem pro danou cestu podávání . Takovými farmaceutickými prostředky mohou být kombinované výrobky, mohou tedy obsahovat. jiné terapeuticky účinné př í sady.

Dávka podávaná savcům obsahuje nádor inhibuj ící účinnou lát, ku, která závisí na běžných faktorech jako je b i o 1og i cká aktivita použité sloučeniny, způsob podání, věk.

zdravotn í stav a hmotnost, pacient,a, povaha a druh příznaků, f rekvence ošetřování, podávání jiných léků a požadovaný účinek.

T ypickou denní dávkou je přibližně 0,5 až mg na kg tělesné hmotnost i při orálním podávání a přibližně

0,05 až 20 pří parenterá1nim podáván í

Nové sloučeniny podle vynálezu lze podávat ve formě běž ných pevných nebo tekutých farmaceutických prostředků, tedy pov1ečených nebo nepov 1 ečených tablet,, kapslí, prášků, granulí.

čípků nebo roztoků.

Ty se vyráběj f obvyklým způsobem. IJčinné látky mohou být, při

Lom kombinovány s obvyklými farmaceutickýt, i .

pomocným i činidly,

1álkám i činidly j ako s poj i vy tablet,, plnidly, chránícík rozpadavosti tablet, regulátory zviáčňovadly, rozpouštědly, látkami zpožďujícími

Lekutos úč i nek, antioxidanty a nebo s nosnými plyny (H. Sucker a kol. Pharma·· · zeutische Technologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1978). Takto podávané formy léčiv obsahují normálně hmotnostně 1 aš 90 % účinné látky.

Následující příklady vynález objasňují, aniž ho omezuj i .

V příkladech jsou proteinové aminokyse1 iny uváděny zkratkám i v běžném 3-písměnovém kódu. Jinými zkratkami j sou

Me₂Val

N-methylvalin.

Př i k 1ady proveden í

A. Obecné postupy

I. Peptidy podle vynálezu obecného vzorce I jsou buď syntet i zovné k1 as i ckou roztokovou syntézou standardními shora popsa ným i způsoby za použití Z a Boc nebo standardní mi způsoby syntézy v pevném stavu pomocí chráničích skupin Boc a Fmoc.

a) pro techniku chránících skupin Fmoc.

1 .	profily t í DMF	1	X	1	m i n
2.	20 % piperidinu v DMF	1	X	4	m i n
3 .	20 % piperidinu v DMF	1	X	16	min
4.	promyt í DMF	5	X	1	m i n
5 .	přidání předem aktivované chránící
	aminokyseliny (aktivované 1 ekvivalentem
	TBTIJ a 5 ekvivalenty DTPEA v DMF)
	pept.idová kopul ce	1	v	61	min
6.	promyt, í DMF	3	X	1	m i n
7 .	není-li konverse úplná,
	opakováni kopulace (zpět, k 5.)
8 .	promyt, í DMF	3	X	1	m i n
9 .	zpět do 2.

Ke kopulaci aminokyselin po N-aminokyse1 i nach se používá

- 19 »·· reakčních řinjdel B0P-C1 a PyRrop. Reakční doby se příslušně zvětší zařazením dvojných vazeb. Při roztokové syntese je pro tento způsob kopulace nejvýhodnějsi použití buď Boc-chráněných (N-karboxy anhydridů) aminokyselin NCA, Z-chráněných (N-karboxyanhydridů) aminokyselin NCA, nebo piva1oy1ch1oridu jako kon denzačniho činidla.

II. Redukční alkylace N-zakončení

Peptidová pryskyřice podle na N-zakončení (kroky 2 až 4 v s 3-násobným molárním nadbytkem

Ala se zbaví chránících skupin Ala) a pak se nechá reagovat aldehydu nebo ketonu v systému dimehyJformamid/1 % octové kyseliny, s přísadou 3 ekvivalentů

NaCNBHa Po ukončení reakce (neqat.ivní Ka i ser - test) se pryskyřice promyje několikrát. vodou, i sopropanol em , dimehy1formami dem a dicblormethanem. Reduktivní alkylace v roztoku lze například dosáhnout, reakcí peptidů zbavených chránících skupin na N-zakončení , pept.idových fragmentů nebo aminokysel in s odpovídajícími aldehydy nebo ketony použitím NaCNBH3 nebo systému vodík palladium na uhlí.

111 . Zpracován í pept.idových pryskyřic získaných podle odstavce

Tb a II

Peptidová prvskvříce se vysuší za sníženého tlaku a pak se zpracuje 1,5 hodin směsí TFA/vi vard Florey Fmoc Workshop Manual, se odfiltruje a promyje se TFA promývací roztoky s ^koncentrují diethtyletheru. Po ochlazení v 1 filtruje, vyjme se do 30% octové ida (95^:5) (Wade, Tregear, HoMelhourne, 1985). Pryskyřice a dichlormethanem. Filtrát a a pept, id se vysráží přísadou ledové lázni se sraženina odkyseliny a lyofilizuje se.

IV. Použije-li se ochlorol.ríty1ové pryskyřice (obchodní produkt společnost, i Biohellas), míchá se 1 hodinu při teplotě místnost, i suspense pept. idové pryskyřice v sysstému octová ky« * · ♦

- 20 * « · · · · • » · · * · · * • · · · · · · ·· »··« ·· ·· «·· se 1 i na/trif1uorethno)/dichlormethan (1=1=3). Pryskyřice se odfiltruje za odsávání a důkladně se promyje štěpícím roztokem. Spojené filtráty se ^koncentrují ve vakuu a zpracují se etherem. Vysrážená pevná látka se odstraní filtrací nebo odstředěním, promyje se di ethyl etherem a vysuší se za sníženého t1aku.

V. Čištění a charakter izace peptidů

Čištění se provádí qelovou chromatografií (SEPHADEX G-10, 0-15/10 % HOAn. SFPHADEX T,H20/Me0H) a/neho středotlakou chromatografií ( st.acionární fáze= HD-ST1. C-8. 20-45 mikrometru,

100 ňnqsl.rnm; mobilní fáze = gradient s A = systém O 1 % TFA/ voda. B = systém 0, 1 % TFA/MeOH) . nebo preparát, i vn í chromátografií HPI.C (stacionární fáze’· Waters Delta-Pak C-18, 15 mikrometrů 100 Angstrom: mobilní f áze = gradient s A = systém 0,1 % TFA/voda, B = systém 0, 1% TFA/MeOH).

Čistota výsledných produktu se zjišťuje analytickou chromat.ograf i í HPI.C (stacionární fáze = 1OO 2,1 mm VYDAC C-18 300 Angstrom; mobilní fáze= aceton itri 1 -voda gradient, pufrováno s 0,1 % TFA, 40 C) . Charakter izace bombardováním rychlými atomy hmotovou spektroskopií a NMR spektroskopií

B.- Specifické postupy

Příklad 1 ( SEQ ΙΓ) NO = 1 )

MesVal -Val -MeVaí - Pro-h-azet i <1 i ny 1 - 2-karhoxamid

Nechává se reaqovat 0,53 g pryskyřice Fmoc-RINK (substituce 0,46 mmol/g), odpovídající velikost, i dávky 0,25 mmol jako v ATa pokaždé s 0,4 mmol

Fmoc·azetidin- 2-karboxylové kyseliny,

Fmoc Pro-OH.

Fmoc-MeVal OH,

- 21 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Val - OH.

Aminokyselina následující po N-methylaminokyse 1 i ně se spojí dvojnou vasbou kapulačním činidlem ByProp. Po ukončení iterativních syriLet, i ckých cyklech, se z peptidové pryskyřice odstraní chránící skupiny N-zakončení (kroky 2 až 4 v Ala) a nechá se dále reagovyt. s vodným roztokem formaIdehydu jako v AII a vysuší se za sníženého tlaku. Výsledná pryskyřice se odštěpí TFA jako v AIII. Surový produkt, se čisti preparát ivní středotlakou chromatografií, čímž se 2Íská 5 mg žádaného čistého peptidu (10 až 40 % A v 10 ; 40 až 90 % A ve 200 ). Sloučenina se dále charakter 1 zuje bombardováním rychlými atomy hmotovou spektroskopií a NMR spektroskopií. ([M*H]⁺.

Příklad 2 (SEQ ID NO:1)

MeaVa1-Val-MeVal-Pro-3,4-dehydropro1y1benzy1 am i d

a) Z-MeVa1 - Pro-OMe

Ve 250 ml suchého dichlormethanu se rozpustí 66,25 g (250 mmol) Z-Val-OH. Po přidání 36,41 ml (262,5 mmol) tri ethylam1 nu se reakční směs ochladí na teplotu -25 C a přidá se 32,27 ml (262,5 mmol) piva1oy1ch1oridu. Po 2,5-hod i novém míchání se do reakční směsi přidá 41,89 g (250 mmol) H-Pro-0Me x HC1 ve 250 ml dichlormethanu a při teplotě 0 C se neutralizuje 36,41 ml (262,5 mmol) tri ethylami nu. V míchání se pokračuje n

hodiny při teplotě -25 C a přes noc při teplotě místnost.i. Reakční sffiss se zředí dichlormethanem a důkladně se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhliči tanu sodného (3x), vodou (íx), 5k citrónovou kyselinou (3x) a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se vysuší síranem sodným a odpaří se k suchu. Zbytek (91,24 g) se míchá přes noc s petroletherem a zfiltruje se. Získá se 62,3 g produktu.

b) Η-MeVal-Pro-OMe

Ve 490 ml methanolu se rozpustí 48,9 g (130 mmol) Z-MeValPro-OMe, Po přidání 10,9 rol (130 mmol) koncentrované chlorovodíkové kyseliny a 2,43 g 10% palladia na uhlí se reakční směs hydrogenuie. Filtrací a odpařením k suchu se získá 36,43 g produktu

c) Z-Val-MeVal-Pro-OMe

Ve 110 ml dimethylformamidu se míchá dva dny při teplotě 40 C 18,1 g H-MeVa1 - Pro-OMe, 21,6 g (78 mmol) Z-Val-N-karboxyanhydridu a 22,8 ml (130 mmol) di isopropy1ethy1aminu po dobu dvou dnů. Po odpaření dimethyl formám idu se přidá dichlořmethan a organická fáze se promyie nasyceným vodným roztokem hydrogenuhliči tanu sodného ( 3x) , vodou (1x), 5% citrónovou kyselinou (3x) a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se vysuší síranem sodným a odpaří se k suchu. Získá se 29,3 g produktu v podobě viskosního oleje.

d) H Val-MeVal-Pro-OMe

Ve 230 ml metbanolu se rozpustí

29,3 g (61,6 mmol) Z-ValMeVa1 - Pro -OMe. Po přidání 1,15 g 10% palladia na uhlí se reak ční směs hydrogenuje. Filtrací a odpařením k suchu se z í ská

21,96 g produktu.

e) Z-Val Val-MeVal-Pro-OMe

V 610 ml dich1 ořmethanu se rozpustí 15,29 g (61 mmo 1 )

Z-Val-OH a 21,96 g (61 mmol) H-Va1 -MeVa1 - Pro-OMe a ochladí se na teplotu 0 C. Po přidání 8,16 ml (73,2 mmol) N-methyl morfolinu, 2,77 g (20,3 mmol) HOBt a 11,74 g (61 mmol) EDCI se reakční směs míchá přes noc při teplotě místnosti, zředí se dich1ormethanem a důkladně se promyje nasyceným vodným roztokem ·

- 23 hydrogenuhliči tanu sodného (3x) , vodou (Ix), 5% citrónovou kyselinou (3x) a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se vysuší síranem sodným a odpaří se k suchu. Získá se 31,96 g produktu.

f) 7.-Val - Val -MeVal -Pro-OH

Ve 250 ml methanolu se rozpust, í 31,96 g (57 mmol) Z-ValVal-MeVal-Pro-OMe a přidá se 102,6 ml (102,6 mmol) 1M roztoku hdroxidu líthného ve vodě. Po 24-hodinovém míchání při teplotě místnosti se přidá voda a methanol se odpaří za sníženého tlaku. Vodná fáze se extrahuje (3x) ethylacetátem, nastaví se na a hodnotu pH 2 při teplotě 4 Ca extrahuje se ( 3x) ethylacetá tem. Spojené organické extrakty se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Získá se 30,6 g produktu v podobě bílé pevné hmoty.

g) MezVa1 -Va1 -MeVa1 - Pro OH

Připraví se N . N - d i methyl ováná t.etrapept i dová kyselina ze Z-chráněné tetrapeptidové kyseliny hydrogenací chránící Z-skupiny a následným přidáním vodného forma1dehydového roztoku do hydrogenační směsi, čímž se získá žádaný produkt v téměř kvantitativním výtěžku.

h) Me2Va1 -Va1 -MeVa1 - Pro 3,4 -dehydropro1 inmethylester

V 75 ml suchého dichlormethanu se rozpustí 3,38 g MeaVal Val-MeVal-Pro-OH (7,27 mmol) a 0,925 g 3,4-dehydropro1 inmethy1esterhydrochloridu (7,27 mmol). Při teplotě 4 C se přidá 0,975 ml N-methylmorf ol inu (8,72 mmol), 0,332 HORt, (2,43 mmol) a 1,4 g EDCI (7,27 mmol). Po míchání přes noc při teplotě místnosti se přidá dichlormethan a organická fáze se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhliči tanu sodného (3x) a vodou (1x). Organická fáze se extrahuje 5% vodnou citrónovou kyselinou. Hodnota pH vodné kyselinové vrstvy se nastaví na 8

- 24 IN roztokem hydroxidu sodného a extraahuje se 4x dichlormethanem. Po vysušení síranem sodným a odpaření za sníženého tlaku se získá 2,82 g pentapeptidmethylesteru.

k) MezVal-Val-MeVal-Pro-3,4-dehydroprolinbenzylamid

Roztok 2,0 g dehydroprolinu, obsahující pentapepti dmethylester ve 20 ml methanolu, se zpracuje při teplotě místnosti

4,6 ml IN ruztoku hydroxidu lithného. Po ukončení reakce (kontrola chromatografií v tenké vrstvě) se přidá voda, methanol se odpaří a sloučenina se lyofilizací zb^ví vody. Získaný bílý prášek se rozpustí ve 36 ml d i chl ormethanu a přidá se 0,388 ml (3,55 mmol) benzylamidu. Po přidání 0,476 ml N-methyl morfo 1 i nu (4,26 mmol), 0,163 g HOBt (1,19 mmol) a 0,684 g EDCI (3,55 mmol) při teplotě 4 C se reakční směs míchá přes noc při teplotě místností. Přidá se d i chl ořmet,han a organická fáze se promyje 3x nasyceným roztokem hydrogenuhl i či tanu sodného a vodou (lx). Organická vrstva se extrahuje 2x 5% citrónovou kyselinou. Kyselá vodná vrstva se nastaví na hodnotu pH 9 5N roztokem hydroxidu sodného a extrahuje se dichlormethanem (4x). Po vysušení síranem sodným a odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku se získá 600 mg surového pentapeptidbenzylamidu. 300 mg tohoto surového peptidu se čistí kapalinovou středotlakou chromatografií (0 až 10 % A v 5 , 10 až 25 % A v 10 . 25 až 90 % A v 450 ), čímž se získá analyticky čistý produkt. Sloučenina se dále charakterizuje hmotovou spektrografií při bombardování rychlými atomy ([M^H]⁺ = 639,4)

Následující sloučeniny byly připraveny a mohou být připraveny podle příkladu 1 a 2'

3.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xac
4.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xad
5.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xae
6.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xaf
7.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xag
8.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xah
9,	Xaa	Val	Xab	Pro	Xai
10.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xak

11. Xaa Val Xab Pro Xal

12. Xaa Val Xab Pro Xam

13. Xaa Val Xab Pro Xan

14. Xaa Val Xab Pro Xao

15. Xaa Val Xab Pro Xap

16. Xaa Val Xab Pro Xaq

17. Xaa Val Xab Pro Xar

18. xaa Val Xab Pro Xas

19. Xaa Val Xab Pro Xat

20. Xaa Val Xab Pro Xau

21. Xaa Val Xab Pro Xav

22. Xaa Val Xab Pro Xaw

23. Xaa Val Xab Pro Xax

24. Xaa Val Xab Pro Xay

25. Xaa Val Xab Pro Xaz

26. Xaa Val Xab Pro Xba

27.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbb
28.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbe
29.	Xbd	Val	Xab	Pro	Xar
30.	Xbe	Val	Xab	Pro	Xar
31.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcx
32.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcy
33.	Xaa	Ile	Xab	Pro	Xar
34.	Xaa	Xbh	Xab	Pro	Xar
35.	Xaa	Val	Xbf	Pro	Xar
36.	Xaa	Val	Xbg	Pro	Xar
37.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbi
38.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbk
39.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbl
40.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbm
41.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbn
42.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbo
43.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbp
44.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbq
45.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbr
46.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbs
47.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbt
48.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbu
49.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbv
50.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbw
51.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbx
52.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xby
53.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xbz
54.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xca
55.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcb
56.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcc

57.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcd
58.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xce
59.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcf
60.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcg
61.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xch
62.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xci
63.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xck
64.	Xaa	Val	Xab	Xcn	xco

65. Xaa Val Xab Xcn Xak

66. Xaa Val Xab Xcn Xaq

67.	Xaa	Val	Xab	Xcn	Xar
68.	Xaa	Val	Xab	Xcn	Xay
69.	Xaa	Val	Xab	Xcp	Xak
70.	Xaa	Val	Xab	Xcp	Xaq
71.	Xcw	Val	Xab	Xcp	Xar
72.	Xcx	Val	Xab	Xcp	Xay
73.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcn	Xcr
74.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcn	Xcs
75.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcn	Xct
76.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcn	Xcu
77.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcn	Xcv
78.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcq	Xcr
79.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcq	Xcs
80.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcq	Xct
81.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcq	Xcu
82.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcq	Xcv
83.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	Xcr
84.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	Xcs
85.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	Xct
86.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	Xcu
87.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	Xcv
88.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcw	OCHj
89.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcl
90.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcm
91.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xcz
92.	Xaa	Val	Xab	Pro	Xda

Příklady MS charakleriaace syntetizovaných nových sloučenin jsou uvedeny v následující tabulce

Příklad č	Ana1ysa [ mc	MS při bombardování >1 . hmotnost ( naměřei	rychlými atomy aá) 1
61		627
64		546
88		552
89		655
Tabulka I -	Ident i f i kace	sekvence sloučenin	připravených podle
příkladu 1	a 2
Sl oučen i na	Č .	Sekvneční	TD-číslo
1-32, 35 -	63, 88 -92	1
33		2
34		3
64-72		4
74-87		5
Symboly Xaa	v součtu mají	následující význam^:

Xaa · N,N-Dimethylvalin thy 1va1 i n

Xab: N-Me

Xac:

Xad:

Xae:

• · ♦ · ♦ ·

Xaf:

Xag:

h₃c

Xah:

Xai:

Xak;

Xal:

°h₃c

Xam:

⁰ h₃c * · • 4

Xan:

Xao:

Xap:

Xaq:

• »

- 30 Xau:

Xav:

Xaw:

Xax:

0^3

Xay:

Xaz:

Xba :

Xbb:

β ·

Xbc:

Xbd:

N,N-dlmethylisoleucin

Xbe:	N,N-dimethy1-2-tert tbuty1-glycin ,
Xbf:	N-methylisoleucin .
Xbg:	N-methyl-2-tert.-butyl-glycin
xbh:	2-tert-butylglycin

Xbi:

o h₃c « ·♦· « a· • · * · ·· a a ··

M·♦

- 32 Xbk:

Xbl:

Xbm:

Xbn:

Xbo:

*4 ·♦··

- 33 Xbp:

Xbq:

Xbr:

Xbt:

O V

*

Xbu:	f > cr^m3 0
Xbv:	^^r^y^rV^CH· ^{0 H}3^C
Xbw:	Λν». o h₃c
Xbx:	ΓΤ o h₃c
Xby:	o h₃c
Xbz:	o h₃c
Xca:	0 H₃c 3

t • · · «· ····

Xcb:

Xcd:

Xce;

Xcg:

v?

I

Xcb:

O

Xck:

3,4-dehydroprolin -adamantyl(1)-amid

Xcl:

Xcm:

Xcn:	3,4 -dehydroprolin
Xco:	314-dehydroproline amid j
Xcp:	L-thiazolidine-4-karbonyl
Xcq:	4-fluoro-prolin .
Xcr:	CH. Λ 0
	CH ^Η3θγ(Ή₃

Xcs:

O h₃c^ch₃ ^χν-^ΛΥ^ν'-^ζ^(ή₃

Xct: O

Xcu:

Xcv:

XCW:

L-azetidin ι-2-k-arbonyl

Xcx:

Xcy:

Xcz:

Xda:

O

- 38 Sloučeniny podle vynálezu se mohou testovat na účinek proti rakovině běžnými způsoby včetně například dále popsaného způsobu^:

A. Metodologie in vitro

Cytotoxicita se měří standardn í metodologií pro přilnuté buněčné linie jako je microcu1 ture tetrazolium test (11TT)

Podrobnosti této zkoušky jsou popsány v literatuře (Alley, MC a kol. Cancer Research 48 ' str. 589 aš 601, 1988). K získání kultur pro mikrotitrační destičky se použije exponenciálně rostoucích kultur nádorových buněk, jako jsou buňky HT-29 colon - careinoma nebo LX-plicního nádoru. Buňky se nasadí v množství 5000 až 20 000 na důlek v 96-důlkových destičkách (ve 150 ul media) a kultivují se přes noc při teplotě 37 C. Přidají se sloučeniny v 10-násobném zředění 10'⁴ M až 10 ^lo M.

Buňky se pak inkubují 48 hodin. Ke zjištění počtu živých buněk v každém důlku se přidá barvivo MTT (50 ul roztoku 3 mg/ml 3(4,5 -di methylthiazol-2-yl)-2.5-di f eny1tetrazo1 i umbromidu v soo laňce). Tato směs se inkubuje 5 hodin při teplotě 37 Ca pak se do každého důlku přidá 50 ul 25% SDS. pH 2. Po celorioční inkubaci se pak odečítá absorbance každého důlku při 550 nm čítačem EI.TSA. Vypočtou se střední hodnoty +/- SD dat z replikovaných důlků, za pouužití vzorce % T/C (% ošetřených živých buněk/kontro1ních buněk)

OD ošetřených buněk

--“— x 100 = % T/C

OD kontrolních buněk

Koncentrace zkoušené sloučeniny, která dává hodnotu inhibice růstu T/C = 50 % je označována jako hodnota ICso.

Sloučenina podle příkladu TC50 ΓΜ]

1	1	X	10'⁶
2	1	X	10
61	1	X	10 ³
64	1	X	10 ³
88	1	X	10-³
89	1	X	10 ³

B. Metodologie in vivo

Sloučeniny podle vynálezu se zkoušely dále v preklíni ckých testech na aktivitu in vivo, která je indikativní použití Takové testy se provádějí na holých myších, kterým se

Lransplantuqí (xenoroubují) nádorové tkáně, s výhodou i dského původu, jak je to dobře známo v tomto oboru.

Zkoušené s1oučen i ny se vyhodnocují z hlediska proti nádorové úč i nnost i po podán í myším s xenoimplantátem.

v athymické holé myš i vých se transplantují do nové hostitelské myši pomocí nádoro fragmentů o velikosti přihližně 50 nm. Den transplantace je dnem 0 Šest az deset dní později se myši ošetří zkoušenými sloučeninami podávanými jako intravenosní injekce ve skupinách po až 10 myších při každé dávce. Sloučeniny se podávaly každý druhý den po dobu tři týdnů v dávkách 1 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti . Průměry nádorů a tělesná hmot,nost se měřily dvakrát týdne. Objemy nádorů se vypočetly z průměrů měřených posuvným měřítkem a pro každou ošetřovanou skupinu se vypočtou objemy nádorů podle vzorce (délka x šířka²)/?. = mm³ objemu nádoru

Pro každou skupinu se vypočtou střední objemy nádorů a zjistí se hodnoty T/C pro každou skupinu oproti neošetřenýfů kontrol ním nádorům.

Nové sloučeniny vykazují dobré vlastnosti inhibice nádorů.

Průmys1ová vyuz i te1nost

Pepí, i d pro výrobu farmaceutických prostředků k ošetřováni onkologických onemocnění savců.

Seznam sekvencí

Obecné informace

Př i h1ašovate1

A.

Adresát^: BASF Akt iengese11schaft

Car 1 Bosch-Strasse 38

E.

Město:

Stát ;

Ludw i gshaf en

Německá spolková republika

ZIP: D-67056

G.

Telefon: 0621/6048526

Telefax: 0621/6043123

Telex: 1762175170 i i) Název vynálezu: Peptid a farlBdceutický prostředek, který ho obsahuie iii) Počet sekvencí ^; 5 i v) Forma pro počítač

A. Typ média^: Disketa 3.5 palce. 2 DD

B. Počít.ač: ibm AT-kompatibi 1ní, 80286 procesor

C. Operační systém: MS-DOS version 5,0

D. Soft,vare: Wordperfect,

2. Informace o SEQ ID. NO: 1:

i) Charakter istiky sekvence

A. Délka^: 5 aminokyse1 in

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: peptid xi) Popis sekvence: SEQ TD. NO ' 1

Xaa Val Xaa Pro Xaa

2. Informace o SEQ ID. NO: 2:

i) Charakter istiky sekvence

A. Délka^; 5 aminokyselin

B. Typ: aminokyse1 i na

D. Topologie¹ lineární *

i i) Typ molekuly¹ peptid xi) Popis sekvence¹ SEQ ID. NO :2¹

Xaa Ile Xaa Pro Xaa

2. Informace o SEQ ID. NO¹ 3¹

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka¹ 5 aminokyselin

B. Typ¹ aminokyse1 i na

D. Topologie¹ lineární ii) Typ molekuly¹ peptid xi) Popis sekvence¹ SEQ ID. NO¹3¹

Xaa Xaa Xaa Pro Xaa

2. Informace o SEQ ID. NO¹ 4¹

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka¹ 5 aminokyselin

B. Typ¹ aminokyselina

D. Topologie¹ lineární i i) Typ molekuly¹ peptid xi) Popis sekvence¹ SEQ ID. NO¹4¹

Xaa Val Xaa Xaa Xaa

2. Informace o SEQ ID. NO¹ 5¹

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka¹ 6 aminokyselin

B. Typ¹ aminokyselina

D. Topologie¹ lineární i i) Typ molekuly¹ peptid xi) Popis sekvence¹ SEQ ID. NO ¹5¹

Xaa Val Xaa Pro Xaa Xaa

* ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptid obecného vzorce I

R¹R²N - CHX - CO - A - B - D - E - (F)t - K (I)

kde znamená R^J methyl, ethyl nebo isopropyl R³ vodík, methyl nebo ethyl,

R^-N-R² spolu dohromady pyrroi 1 idi nový kruh,

A zbytky valyl, isoleucyl, leucyl, 2-terč.-hutylglycyl,

2-ethylglycyl, norleucyl nebo norvalyl,

B zbytky N-methy1va1yl, N-methylleucyl, N-methy1 isoleucy] , N-methylnorva1yl . N-methy1 nor1eucyl , N-methyl-2terc.-buty1glycyl, N-methy1 - 3-terč.-butyI a 1any1 nebo N methy1 -2-ethylglycy1 ,

D zbytky prolyl, 3,4-dehydropro1y1, 4-fluoroproly1, 4,4dif1uoroprolyl, azeLidin-2-karbony1 , homoprolyl, 3methy1proly1, 4-methylprolyl , 5-methy1 pro 1y1 nebo thiazo1idin-4-karbony1 ,

E 3,4-dehydroproly1 . 4-f1uoroprolyl, 3-methy1proly1, 4methy1proly1 , azetidin-2 - karbony1 nebo 4, 4-dif1uoro propyl,

F zbytky valyl, 2 - terč. -buty1g1ycy1, isoleucyl, leucyl,

2-cyk1ohexy1g1ycy1, norleucyl, norvalyl, neopenty 1 g 1 ycyl , alanyl, bel.a-alanyl nebo am i no i sobulyroy 1 ,

X alkyl o výhodou s 2 až 5 atomy uhlíku, cyklopropyl nebo

2.

nebo cyklopentyl, nebo 1 a l· · •· •· •· ·♦ a

* • a ·· * · »· · · a a · • a ·· alkoxy s výhodou s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxy subst i tuovanou nebo nesubsti tuovanou jeho soli s fyziologicky vhodnými kysel

Peptid podle nároku 1 obecného vzorce symbo1y mají v nároku 1 uvedený význam, nebo nebo už i t í v medicíně 2vláště pro ošetřování am i noskupinu.

I, kde jednotlivé jeho so1 i pro poonkolog i ckých nemoc í,

Farmaceutický prostředek, v v z nároku roku 1 setí že obsahuje terapeuticky účinné obecného v2orce

T, kde j ednot1 uvedený

Způsob m , ze význam, a oše třován í se savcům f armaceut i cky nádorů savců množství peptidu vé symboly mají vhodný nosič.

vyznačuj í s nádorovým onemocněním podává pod 1 e v nánádory inhibující množství pepti du podle nároku 1 obecného vzorce T, kde jednotlivé symboly mají v nároku 1 uvedený význam.

Způsob přípravy pept,idu podle nároku 1 obecného vzorkde jednot 1 ivé symboly mají v nároku 1 uvedený význam, t í m , že se pept. id přípravu je O sobě známým i způsoby z peptidové chemie.