CZ20014484A3 - Inhibitory integrinu alfa v beta 6 - Google Patents

Description

Inhibitory integrinu oc_vp6

Oblast techniky

Vynález se týká nových peptidů obecného vzorce I

Ac-Arg- X¹ - Asp-X² -X³-X⁴ -X⁵-X⁶ - NH3 (I) kde znamená

Ac acetylovou skupinu,

X*	Ser,	Gly,	Thr, Asp, Arg, Val,	Tyr,	His nebo Ala,
X2	Leu,	Ile,	Nle, Val nebo Phe,
X3	Asp,	Glu,	Lys, Phe, Aib, Nal,	Gly,	Ala, Bgl nebo	Phg,
X4	Gly,	Ala,	Ser, β-Ala nebo Abu,
X5	Leu,	Ile,	Nle, Val nebo Phe,
X6	Arg,	Har,	Lys, Leu, Orn, Phe,	Ala,	Tyr, Gly, Ser	nebo

jakožto ligandů integrinu oív/36, které jsou biologicky aktivní, přičemž uvedené aminokyseliny mohou být derivatizovány, aminokyselinové zbytky jsou navzájem vázány peptidovým způsobem prostřednictvím <x-aminoskupin a of-karboxyl ových skupin, včetně D a L forem a opticky aktivních aminokyselinových zbytků a jejich fyziologicky přijatelnch solí, přičemž je vyloučen Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH3.

• 99 · · · ·· · 9

9 9 9 · 9 · · · · · • •99 · · 9 9 · ·

9 9999 999 9 9 9 9 9

999 999 999

9 99 999 9« 9999

Vynález je založen na objevu nových sloučenin, které mají hodnotné vlastnosti a mohou být použity pro výrobu léčiv.

Zjistilo se, že sloučeniny podle vynálezu a jejich soli mají hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou snášen1 ivostí.

Peptidy podle vynálezu se mohou používat jako účinné inhibitory ofvPe integr i nového receptoru a tim k ošetřování různých nemocí a patologických nálezů.

Dosavadní stav techniky

Jiné inhibitory integr inu ctvP6 jsou popsány v německém patentovém spise číslo DE 19858857 a jiné takové typy také popsal S. Kraft a kol. (J. Biol. Chem. 274, str. 1979 až 1985, 1999). Sloučeniny podle vynálezu lze považovat za výběrový vynález se zřetelem na shora uvedenou literaturu.

Integriny patří do rodiny heterodimerní třídy I - transmembránových receptorů, které mají významnou úlohu v četných adhezních procesech buňka-matrice popřípadě buňka-buňka (Tuckwell a kol., 1996, Symp. Soc. Ex. Biol. 47). Zhruba se mohou dělit do tří tříd: Pi-integriny, které představují receptory pro extracelulární matrici, P2~integriny, které jsou aktivovatelné na leukocytech, a jsou spouštěny při zánětlivých procesech, jakož také civ· - integr iny, které ovlivňují buněčnou odezvu při hojení ran a při jiných patologických procesech (Marshall a Hart, Semin. Cancer Biol. 7, str. 191, 1996).

Integriny ocsPi, <*iifc>p3, tfsPi, oevPi, ofvp3, <*vP5, ofvPs a tf_V06 se všechny váží na Arg-Gly-Asp (RGD) peptídovou sekvenci v přírodních 1igandech, jako jsou například fibronektin nebo vitronektin. Rozpustné RGD-obsahující peptidy jsou schopny inhibovat interakaci každého tohoto integrinu s odpovídajícími • · · ·· · · · ·· «·· · · · · · · · • · · · ·· · ·· • · ···· · · · · · · · · přírodními ligandy. Integrin ořvPe je poměrně vzácný integrin (Busk a kol., J. Biol. Chem. 267(9), str. 5790, 1992), který se při procesech opravy epitelových tkání ve větším množství vytváří a přednostně váže přirozené matricové molekuly fibronektin a tenascin (Want a kol., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15(5), str. 664, 1996). Fyziologické a patologické funkce ořvBe nejsou dosud dokonale známy, je však domněnka, že tento integrin má důležitou úlohu při fyziologických pochodech a nemocech (například záněty, hojení ran, nádory), na kterých se podílí epitělové buňky. Tak se aivP& exprimuje na keratinocytech v ranách (Haapasalmi a kol., J. Invest. Dermatol. 106(1), str. 42, 1996), z čehož lze usuzovat, že agonisty a antagonisty tohoto integrinu jsou ovlivňovány vedle procesů hojení ran a zálalů i jiné patologické jevy kůže, jako například lupénka. Kromě toho má cívP6 význam v epitelu dýchacích cest (Weinacker a kol., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12(5), str. 547, 1995), takže by se mohly úspěšně nasazovat odpovídající agonisty/antagonisty tohoto integrinu při onemocnění dýchacích cest, jako jsou bronchitida, astma, plicní fibróza a nádory dýchacích cest. Je také známo, že otvPe mají význam pro střevní epitel, takže by bylo možno používat odpovídající integrinové agonisty/antagonisty při ošetřování zánětů, nádorů a poranění žaludečního a střevního traktu.

Závislost vytváření angiogeneze na vzájemném působení vaskulárních integrinů a extracelulárních matricových proteinů popsal P.C. Brooks, R.A. Clark a D.A. Cheresh (Science 264, str. 569 až 571, 1994).

Úkolem vynálezu je proto přídavně k již známým přírodním vysokomolekulárním ligandům a protilátkám, se kterými se terapeuticky a diagnosticky obtížně prcuje, nalézt mocné, specifické a selektivní ni zkomol ekulární ligandy pro ofvBů, s výhodou peptidy, které by se mohly používat pro uvedené terapeutické oblasti avšak také jako dignostická nebo reakční činidla • · · · · · 99 99 · · 9 · 9 · · » · · φ··· ··· ·· « • · 9999 9 9 9 9999 9 • · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 · · ··· ·

Podstata vynálezu

Zjistilo se, še shora charakterizované peptidové sloučeniny podle vynálezu a jejich soli jakožto rozpustné molekuly působí na buňky, které mají uvedený receptor nebo kdyš se váží na povrchy, představují umělé ligandy pro civíte zprostředkovávané ulpívání buněk. Především působí jako inhibitory otv06 integrinu, přičemž především brzdí vzájemné působení receptoru s jinými ligandy, například vazbu fibronektinu. Toto působení lze doložit například způsobem, který popsal J. W. Smith a kol. (J. Biol. Chem. 265, str. 12267 až 12271, 1990).

Kromě toho se zjistilo, še nové sloučeniny mají při dobré snášenlivosti velmi hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou snášenlivostí a mohou se používat jakožto léčiva. Tato skutečnost bude ještě přesněji popsána.

Peptidické sloučeniny podle vynálezu se kromě toho mohou používat jakožto diagnostika pro detekci a lokalizaci patologických stavů v epi tělovém systému in vivo, pokud jsou vybaveny signálními znaky (například biotinylovým zbytkem) podle stavu techniky.

Vynález zahrnuje také kombinace s alespoň jednou jinou účinnou sloučeninou a/nebo konjugáty s jinými účinnými látkami, jako jsou cytotoxicky účinné látky, jakož také konjugáty s radiosignálními znaky pro rentgenovou terapii nebo pro PET diagnózu nebo také fůzní proteiny s proteinovými signálními znaky, jako jsou GFP nebo protilátky, nebo terapeutické proteiny, jako je IL-2.

Některými výhodnými skupinami sloučenin obecného vzorce I jsou následující sloučeniny podvzorců la až If, kde zvlášť neuvedené symboly mají význam uvedený u obecného vzorce I, přičemž znamená v obecném vzorci · 4 4 4 4 ·· 4 4 • · · ·«·· 4 4 4 4 • · · · ··· 4 4 4 • 4444444 4 4 44 4 4 ·>· 444 44»

al	X*	Ser, Gly nebo Thr,
b)	X1	Ser, Gly nebo Thr,
	X2	Leu,
c)	X1	Ser, Gly nebo Thr,
	X2	Leu,
	X3	Asp nebo D-Asp,
d)	X1	Ser, Gly nebo Thr,
	X2	Lěu,
	X3	Asp nebo D-Asp,
	X4	Gly, Ala nebo Ser,
e)	X1	Ser, Gly nebo Thr,
	X2	Leu,
	X3	Asp nebo D-Asp,
	X4	Gly, Ala nebo Ser,
	Χ5	Leu,
f)	X1	Ser, Gly nebo Thr,
	X2	Leu,
	X3	Asp nebo D-Asp,
	X4	Gly, Ala nebo Ser,
	Χ5	Leu,
	X6	Arg,

a jejich sol i.

Vynález se zvláště týká peptidových sloučenin vybraných ze souboru zahrnujícího

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH_2/

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Ser-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Asp-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Ala-NH₂, • · fc · · ·

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-D-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-D-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Ala-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp~Leu-Aib-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Nal-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Ala-Ser-Leu-Arg-NH_2/ Ac-Arg-Thr~Asp-Nle-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Ile-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH_2/ Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Har-NH₂, Ac-Arg-Thr'Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Ala-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂,

Uváděné zkratky zbytku aminokyselin znamenají zbytky ná sledujících am i nokyse 1 i n ·'

Abu 4-aminomáselná kyselina

Aha 6-aminohexanová kyselina, 6-aminokapronová kyselina

A i b of - am i no i somáse 1 ná kyše 1 i na

Ala alanin

Asn asparagi n

Asp asparagová kyselina

Arg arginin

Bgl C-alfa-terc-butylglycin

Cys cystě i n

Dab 2,4-diaminomáselná kyselina

Dap 2, 3-d i am i noprop i onová kyšelina

Gin glutamin ·· · ·· · ·· ·· « · · ···· ···· • · · · · · · ·· « • ······· · · · · · · « · · « · · · · · • · · ·· ··· ·« ····

Glp	pyroglutamová kyselina
Glu	g1utamová kyše1 i na
Gly	g1yc i n
Har	homoarginin
His	histidin
homo-Phe	homo-fenylalanin
Ile	i soleuc i n
Leu	1euc i n
Lys	lysin
Met	methionin
Nal	naft-2-ylalanin
Nle	nor1euc i n
Orn	orn i t i n
Phe	fenylalanin
Phg	fenylglycin
4-Hal-Phe	4-halogenfenylalanin
Pro	pro1 i n
Ser	ser in
Thr	threonin
Trp	tryptofan
Tyr	tyrosin
Val	val in

Kromě toho se ještě uvádějí zkratky, které mají následu jící význam

Ac

BOC

BSA

CBZ nebo Z

DCC1

DMF

EDC1

Et

FCA

FITC acetyl terč-butoxykarbony1 albumin hovězího séra benzyloxykarbonyl dicyklohexylkarbodi imid dimethylformamid

N-ethyl -N, N -(dimethylaminopropyl)karbodi imid, ethyl fluoresceinkarboxylová kyselina f1uoresce i n i soth i okyanát

Fmoc

FTH

HOBt

HONSu

Me

MBHA

Mtr

OBut

Oct

OMe

OEt

Pbf

Pmc

POA

Sal

TBS+ +

TBSA

TBTU

TFA

Trt

9-f1uorenylmethoxykarbonyl f1uorescei n th i omočovi na

-hydroxybenzotr i azo1

N-hydroxysukci n i m i d methyl

4-methylbenzhydry1ami n

4-methoxy-2, 3,6-trimethylfenylsulfonyl terč-butylester oktanoy1 methylester ethylester

2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl 2,2,5,7, 8-pentamethylchroman-6-sulfonyl fenoxyacetyl salicyloyl tris pufrováná solanka s dvoumocným kat iontem TBS + BSA

2-(lH-benzotriazol-1-yl)-1,1,3-tetramethy1 uroňiumtetraf1uorborát tr i f1uoroctová kyšelina trityl (trifenylmethyl).

Pokud shora uvedené aminokyseliny mohou být v několika enantiomerních formách, všchny tyto formy a také jejich směsi (například DL formy) vynález zahrnuje. Kromě toho mohou být aminokyseliny chráněny o sobě známými chránícími skupinami.

Sloučeniny podle vynálezu zahrnují také tak zvané prodrogové deriváty, to znamená například alkylovými nebo acylovými skupinami, cukry nebo oligopeptidy obměněné sloučeniny obecného vzorce I, které se v organismu rychle štěpí na účinné sloučeniny podle vynálezu. Do této skupiny patří také biologicky odbouratelné polymerní deriváty sloučenin podle vynálezu popsané v literatuře (například J. Pharm. 115, str. 61 až 67, 1995).

·· ·· • ♦ A A • · A

AAA AAA

AA AAAA

Uvedené aminokyse1 iny nebo aminokyselinové zbytky, například skupiny NH nebo C-koncové amidové skupiny, mohou být také deriv&tizovány, přičemž jsou výhodnými N-methylové, N-ethylové, N-propylové, N-benzylové nebo Ccf-methylové deriváty. Deriváty Asp a Glu jsou zvláště methyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, terc-butyl, neopentyl- nebo benzylestery postranních karboxylových skupin a přídavně jsou výhodnými deriváty Arg, které mohou být substituovány na skupině -NH-C(=NH)-NHz- skupinou acetylovou, benzoylovou, methoxykarbonylovou nebo ethoxykarbonylovou.

Vynález zahrnuje kromě sloučenin, které mají acetylovou skupinu na N-zakončení také sloučeniny, ve kterých je skupina Ac nahrazena jinou acylovou skupinou, například skupinou propionylovou, butyrylovou nebo benzoylovou.

Vynález zahrnuje také deriváty zahrnující známé markéry, které detekci peptidů usnadňují. Jakožto příklady takových derivátů se uvádějí radioaktivně značené, biotinylované nebo fluorescenčně značené peptidy.

Fluorescenčními barvivovými skupinami jsou s výhodou skupina 7-acetoxykumarin-3-ylová, fluorescein-5 (a/nebo 6-)ylová, 2' ,7' -dichlorfluorescein-5( a 6-)ylová, dihydrotetramethylrosamin-4-ylová, tetramethylrhodamin-5-(a -6-)ylová, 4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-iňdacen-3-ethylová nebo 4, 4-di fluor-5,7-di fenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-ethylová skupina.

Vhodné skupiny funkciona1izovaných fluorescenčních barviv, které se mohou používat jako reakční činidla při přípravě sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu, jsou popsány například v publikaci Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5. vydání, 1992 až 1994, R.P. Haughland Molecular Probes lne.

9 »· · ·· ·· • · · ·»·· · · · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · • ······· · · 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 999 ·> ····

Obecně jsou peptidy podle vynálezu lineární, mohou však být také cyklické [sic]. Vynález zahrnuje nejen shora charakterizované peptidy, nýbrž také směsi a prostředky, které vedle sloučenin podle vynálezu obsahují také jiné farmakologicky aktivní sloučeniny nebo pomocné přísady, které mohou příznivě ovlivňovat primární farmakologické působení peptidu podle vyná1 ezu.

Sloučeniny obecného vzorce I a výchozí látky pro jejich přípravu se připravují o sobě známými způsoby, které jsou popsány v literatuře (například ve standardních publikacích jako Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart), a to za reakčních podmínek, které jsou pro jmenované reakce známy a vhodné. Přitom se může také používat o sobě známých, zde blíže nepopisovaných variant,

S výhodou se peptidy podle vynálezu připravují způsobem používajícím pevnou fázi s následným oddělením a čistěním, jak popsal například Jonczyk a Meienhofer (Peptides, Proč. 8^th Am. Pept. Symp.Eds. V. Hrubý a D.H. Rich, Pierce Comp. III, str. 73 až 77, 1983; nebo Angew. Chem. 104, str. 375, 1992) nebo Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, str. 3102, 1972).

Peptidy podle vynálezu se mohou připravovat na pevné fázi (ručně nebo použitím automatizovaných syntetizérů) strategií Fmoc využívající v kyselém prostředí labilních postranních chránících skupin a čištění chromatografií RP-HPLC. Píková homogenita se může měřit chromatografií RP-HPLC a identita sloučenin využitím FAb-MS.

Peptidy se také mohou připravovat o sobě známými způsoby přípravy aminokyselin a peptidů, které jsou známy z literatury (například Novabiochem -1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook of Ca1biochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden) a z četné standardní literatury a ze zveřejněných patentových • Φ φ • ΦΦ φφφφ · · · · φφφφ φφφ φφ φ φ φφφφφφφ φ φ · · φ · • Φ φ φφ φ φφφ ·· φ φφ φφφ φφ φφφφ spisů.

Mohou se používat postupné kopulace a kondenzace fragmentů. Mohou se používat různé N-koncové a C-koncové a postranní chránící skupiny, které se s výhodou volí tak, aby byly ortogonálně odštěpítelné. Kopulační stupně se mohou provádět 2a použiti růaných kondenzačních činidel, jako jsou karbodiimidy, karbodiimidazoly, činidla uroniového typu jako TBTU, použitím způsobů směsných anhydridů a halogenidů kyselin nebo aktivních esterů. Aktivované estery se výhodně vytvářejí in sítu, například adicí HOBt nebo N-hydroxysukcinimidu.

Cyklizace lineární prekurzorové molekuly, mající posatranní chránící skupiny, se podobně může provádět za použití kondenzačních reakcí, které jsou popsány v literatuře (například německý patentový spis číslo DE 43 10 643; nebo Houben-Weyl, l.c., svaazek 15/11, str. 1 až 806, 1974).

Při přípravě za použití pevné fáze se může používat různých pryskyřic a kotvicích funkcí. Pryskyřice mohou být například na bázi polystyrenu nebo polakrylamidu, jakožto kotvicí funkce přicházejí v úvahu Wang, o-chlortri tyl pro přípravu peptidových kyselin, arainoxanthenoxykotvy například pro přípravu pept i dových [sic] am i dů.

Biotynylované nebo fluorescenčně značené peptidy/proteiny se podobně mohou připravovat o sobě známými způsoby (například

E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, svazek 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology:a Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. vydání, 1996, R.P. Haugland Molecular Probes lne. ; nebo světový patentový spis číslo WO 97/14716).

Sloučeniny obecného vzorce I se dále mohou připravovat uvolněním ze svých funkčních derivátů solvolýzou, zvláště hyd12 ·

0 00 • 0 0 · 0··0 00 • 9000009 9

9 9 0 9 rolýzou nebo hydrogenolýzou. Pro solvolýzu nebo pro hydrogenolýzu jsou jako výchozí látky vhodné sloučeniny, které mají místo jedné nebo několika volných aminoskupin a/nebo hydroxylových skupin odpovídající chráněné aminoskupiny a/nebo hydroxylové skupiny, s výhodou sloučeniny, které místo jednoho H-atomu, který je spojen s N-atomem mají skupinu chránící aminoskupinu, nebo které místo atomu vodíku v hydroxylové skupině mají skupinu chránící hydroxylovou skupinu. Totéž platí pro karboxylové kyseliny, které mohou být chráněny tak, že se nahradí jejich -CO-OH hydroxylová skupina chránící skupinou například esterovou skupinou.

Výraz skupina chránící aminoskupinu je obecně znám a jde o skupiny, které jsou vhodné k ochraně (k blokování) aminoskupiny před chemickými reakcemi, které jsou však snadno odstranitelné, když je žádoucí chemická reakce na jiném místě molekuly provedena. Výraz skupina chránící hydroxylovou skupinu je podobně obecně znám a jde o skupiny, které jsou vhodné k ochraně (k blokování) hydroxylové skupiny před chemickými reakcemi, které jsou však snadno odstranitelné, když je žádoucí chemická reakce na jiném místě molekuly provedena. Uvolňování sloučenin obecného vzorce I z jejich funkčních derivátů se daří - podle použité chránící skupiny - například silnými kyselinami, jako je zvláště kyselina trifluoroctová a chloristá avšak také jinými silnými anorganickými kyselinami, jako je kyselina chlorovodíková nebo sírová, silnými organickými karboxylovými kyselinami, jako je trichloroctová kyselina nebo sulfonovými kyselinami, jako je kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová. Hydrogenólyticky odstranitelné chránící skupiny (například skupiny CBZ nebo skupina benzylová) se mohou odštěpovat například zpracováním vodíkem v přítomnosti katalyzátoru (například katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu, jako palladium, účelně na nosiči, jako na uhlí).

Typické chránící skupiny pro N-koncové skupiny a pro ·· 9 99 9 ·9 ·9 • · · · 9 · * 9 9*9 • 999 9 · · · · 9

9 9999 999 9999 9 • 99 999 999

9 99 999 99 9999 postranní aminoskupiny jsou skupina 2, BOC, Fmoc, pro koncové C-skupiny nebo pro Asp nebo Glu postranní řetězce jsou O-prim-alkylové skupiny (npříklad methoxyskupina nebo ethoxyskupina), skupiny 0-terc-alkylové (například OBut) nebo Obenzylová skupina. Pro chránění guanídinopodílu skulpiny Arg jsou vhodné například skupina Z, BOC, NOa, Mtr, Pmc nebo Pbf. Alkoholové skupiny se mohou chránit terč-a1kýlovými nebo tritylovými skupinami.

Skupina BOC, OBut a Mtr se může například s výhodou odštěpovat kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu nebo přibližně 3 až 5 N kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu při teplotě 15 až 30 C, zatímco skupina Fmoc přibližně 5 až 50% roztokem dimethylaminu, diethylaminu nebo piperidinu v dimethylβ formámidu při teplotě 15 až 30 C.

Tri tylová skupina se používá ke chránění aminokyselin histidin, asparagin, glutamin a cystein. Odštěpování chránící skupiny se provádí podle žádoucího konečného produktu systémem trifluoroctová kyselina/10 % thiofenolu, přičemž se tri tylová skupina od uvedených aminokyselin odštěpí. Při použití systému trifluoroctová kysel ina/anisol nebo trifluoroctová kyselina/ thioanisol se odštěpí pouze tritylová skupina z histidinu, asparaginu a glutaminu, zůstává však na postranním řetězci Cys.

Hydrogenolyticky odstranitelné chránící skupiny (například skupiny CB2 nebo skupina benzylová) se mohou odštěpovat například zpracováním vodíkem v přítomnosti katalyzátoru (například katalyzátoru na bázi ušlechtilého kovu, jako palladium, účelně na nosiči, jako na uhlí). Jakožto rozpouštědlo se hodí shora uvedená rozpouštědla, zvláště například alkoholy, jako methanol nebo ethanol nebo amidy jako dimethylformamid. Hydrogenolýza se zpravidla provádí při teplotě přibližně 0 až 100 C, za tlaku přibližně 0,1 až 20 MPa, s výhodou při teplotě 20 až 30 C, za tlaku přibližně 0,1 až 1 MPa. Hydrogenolý14 «Φ « ·· » * Φ · 1 » Φ Φ · Φ 4 t Φ ·ΦΦΦ « · 4 » Φ t «4

ΦΦ Φ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ > Φ Φ 4 za CB2 skupiny se daří například dobře na 5 až 10% palladiu na uhlí v methanolu, nebo za použití amoniumformátu (místo vodíku) na palladiu na uhlí v systému methanol/dimethylformamid při teplotě 20 až 30 C.

Jak shora uvedeno, zahrnují peptidy podle vynálezu také své fyziologicky přijatelné soli, které se mohou připravovat o sobě známými způsoby. Zásada obecného vzorce I se může kyselinou převádět na příslušnou adiční sůl s kyselinou, například reakcí ekvivalentního množství zásady a kyseliny v inertním rozpouštědle, jako je například ethanol a následným odpařením rozpouštědla. Pro tuto reakci přicházejí v úvahu zvláště kyseliny, které poskytují fyziologicky přijatelné soli. Může se používat anorganických kyselin, jako jsou kyselina sírová, dusičná, halogenovodíkové kyseliny, jako chlorovodíková nebo bromovodíková, fosforečné kyseliny, jako kyselina ortofosforečná, sulfaminová kyselina a ogranické kyseliny, zvláště alifatické, alicyklické, aralifatické, aromatické nebo heterocyklické jednosytné nebo několikasytné karboxylové, sulfonové nebo sírové kyseliny, jako jsou kyselina mravenčí, octová, propionová, pivalová, diethyloctová, malonová, jantarová, pimelová, fumarová, maleinová, mléčná, glúkonová, askorbová, nikotinová, vinná, jablečná, citrónová, isonikotinová, methansulfonová, ethansulfonová, ethandisulfonová, 2-hydroxyethansulfonová, benzensulfonová, p-toluensulfonová, naftalenmonosulfonová a naftalendisulfonová a laurylsírová kyselina. Solí s fysiologicky nevhodnými kyselinami, například pikrátů, se může používat k izolaci a/nebo k čištění sloučenin obecného vzorce I.

Na druhé straně se kyseliny sloučenin obecného vzorce I reakcí se zásadou mohou převádět na své fysiologicky vhodné soli kovové nebo amoniové. Jakožto soli přicházejí v úvahu zvláště soli sodné, draselné, hořečnaté, vápenaté a amoniové, dále substituované amoniové soli, například dimethylamoniové, diethylamoniové, diisopropylamoniové, monoethanolamoniové, di- 15 ♦» · • * * • · · · • · tfc·· • fcfc ·< · ·» » ·« ·« • · ·· · · * « • » * · · » » · · ·>··· I» ♦ » · · « ·

Λ» ··» «· ·«;· ethanolamoniové, nebo diisopropylaooniové, cyklohexylamoniové, dicyklohexylamoniové, dibenzylethylendiamoniové, dále například soli s argininem nebo s lysinem.

Peptidové sloučeniny podle vynálezu se mohou používat, jak shora uvedeno, jako farmaceuticky účinné sloučeniny v humánní a ve veterinární medicíně zvláště pro profylaxi a/nebo terapii poruch, na kterých se podílejí epítelové buňky. Obzvláště pro ošetřování zánětů, pro hojení ran pokožky, pro ošetřování orgánů respiračního traktu a pro ošetřování žaludku a střev, například pro ošetřování apoplexie, angíny pectoris, nádorů, osteolytických nemocí jako osteoporózy, patologických angiogenních nemocí, jako například zánětů, pulmonární fibrózy, oftalmologických nemocí, diabetické retinopatie, degenerativních skvrn, myopie, oční histoplasmózy, reumatoidní artritidy, osteoartritidy, rubeotického glaukoma, vředovité kolitidy, Krohnovy nemoci, atherosklerózy, lupénky, restenózy po angioplastii, akutního selhání ledvin, nefritidy, mikrobiální infekce a rozptýlené sklerózy.

Vynález se týká peptidových sloučenin shora uvedeného obecného vzorce I a jejich fyziologicky přijatelných solí jakožto léčiv, diagnostických a reakčních činidel.

Vynálezem jsou zvláště odpovídající léčiva jakožto inhibitory k ošetřování nemocí, které jsou bezprostředně nebo nebezprostředně způsobeny expresí ofvPe integr i nových receptorů, zvláště patogenních angiogenních nemocí, trombóz, srdečního infarktu, koronárních onemocnění srdce, arteriosklerózy, nádorů, osteoporózy, zánětů, infekcí jakož také k ovlivňování procesů hojení ran.

Vynález se také týká vhodných farmaceutických prostředků, které obsahují alespoň jedno léčivo obecného vzorce I a popřípadě nosič a/nebo excipienty.

• · · · ·· · · 9 9 • ······· « « · _{0 β} * • · 9 9 9 9 9 9 9 • · * ·· ··· 99 9999

Vynález se dále také týká.použití peptidových sloučenin a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí podle vynálezu a návodu pro výrobu léčiv pro léčení poruch, které jsou nepřímo nebo přímo založeny na expresi tívťte integrinového receptoru, což platí zvláště pro patologické angiogenní poruchy, trombózy, srdeční infarkt, koronární poruchy srdce, arteriosklerózu, nádory, osteoporózu, zánět, infekce a pro ovlivňování léčení ran.

Léčiva podle vynálezu popřípadě farmaceutické prostředky, které je obsahují se mohou používatvat v humánní a ve veterinární medicíně. Jakožto nosiče přicházejí v úvahu anorganické nebo organické látky, které jsou vhodné pro enterální (například orální) nebo pro parenterální nebo topické podávání nebo pro podávání ve formě inhalčních sprejů a které nereagují se sloučeninami obecného vzorce I, jako jsou například voda, rostlinné oleje, benzylalkoholy, alkylenglykoly, polyethylenglykoly, glycerintriacetát, želatina, uhlohydráty, jako laktóza nebo škroby, stearát hořečnatý, mastek a vaselina. Pro orální použití se hodí zvláště tablety, pilulky, povlečené tablety, kapsle, prášky, granule, sirupy, šťávy nebo kapky, pro rektální použití čípky, pro parenterální použití roztoky, zvláště olejové nebo vodné roztoky, dále suspenze, emulze nebo implantáty, pro topické použití masti, krémy nebo pudry. Sloučeniny podle vynálezu se také mohou lyofi lisovat a získaných lyofilizátů se může například používat pro přípravu vstřikovatelných prostředků. Prostředky se mohou sterilovat a/ nebo mohou obsahovat pomocné látky, jako jsou kluzná činidla, konzervační, stabilizační činidla a/nebo smáčedla, emulgátory, soli k ovlivnění osmotického tlaku, pufry, barviva, chuťové přísady a/nebo ještě jednu další nebo ještě několik dalších účinných látek, jako jsou například vitaminy.

Pro podávání ve formě inhalačních sprejů se účinná látka rozpouští nebo suspenduje ve hnacím plynu nebo ve směsi hna- 17 • · · ·

cích plynů (jako jsou například oxid uhličitý nebo fluorchlorované uhlovodíky). V takovém případě se přitom používá účinné látky v mikronizované formě, přičemž se může přidávat alespoň jedno fyziologické kompatibilní rozpouštědlo, například ethanol. Inhalační roztoky se mohou podávat za použití o sobě známých zařízení k tomuto účelu.

Sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu se zpravidla používá v dávkách podobných jako obchodně známé peptidy, zvláště obdobně jako sloučeniny podle amerického patentového spisu číslo 4 472305, s výhodou v dávce přibližně 0,05 až 500 mg, zvláště 0,5 až 100 mg na dávkovači jednotku. Denní dávka je s výhodou přibližně 0,01 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Určitá dávka pro každého jednotlivého jedince závisí na nejrůznějších faktorech, například na účinnosti určité použité sloučeniny, na stáří, tělesné hmotnosti, všeobecném zdravotním stavu, pohlaví, stravě, na okamžiku a cestě podání, na rychlosti vylučování, na kombinaci léčiv a na závažnosti určitého onemocnění. Výhodné je parenterální podávání.

Vynález se také týká sloučenin obecného vzorce I, které se mohou používat v analytické biologii a v molekulární biologii. Nové sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená X skupinu fluorescenčního barviva, vázanou prostřednictvím -CONH, -C00, -NH-C(=S)-NH, -NH-C(=0)-NH, -SO2NH nebo -NHCO vazbou, se mohou používat jako diagnostické markéry v technice FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) a ve fluorescenční mikroskopii.

Použití značených sloučenin ve fluorescenční mikroskopii je popsáno v literatuře (například Y.-L.Wang a D.L. Taylor, Fluorescence Microscopy of Living Cells in Cul ture, část A+B, Academie Press, lne. 1989).

Nových sloučenin podle vynálezu se také může používat jakožto integrinových ligandů k výrobě sloupců pro afinitní • ·

chromatografii k výrobě čištých integrinů. Komplex Avidinem derivát izovaného nosiče, například Sepharose, a nových sloučenin obecného vzorce I se vytváří o sobě známým způsobem (jako popisuje například E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, svazek 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Jakožto polymerní nosičové materiály jsou pro tento účel vhodné polymerní pevné fáze známé z chemie peptidů s výhodou s hydrofilními vlastnostmi, například sesítěné polycukry, jako jsou celulóza, Sepharose nebo Sephadex^R, akrylamidy, polymer na polyethylenglykolové bázi nebo Tentakelpolymery^R.

Vnález zahrnuje také rekombinantní DNA-sekvence, které obsahují úseky, které kódují oblasti peptidů majících peptidické strukturální motivy podle vynálezu.

Takové DNA se mohou přenášet částicemi na buňky, jak po(Proč. Nati. Acad. Sci. 91, str. mohou zvyšovat transfer na buňky činiteli, jako jsou liposomy (A.I. Aronsohn Drug Targeting 5, str. 163 až 169, 1997).

pisuje Ch. Andree a kol . 12188 až 12192, 1994) nebo j i ným i pomocným i a J.A. Hughes, J

Transferu takové DNA by se proto mohlo použít v kvasnicích prostřednictvím Bacculovirů nebo v buňkách savců pro produkci peptidických látek.

Pokud se infikuje živočišný nebo lidský organizmus takovou rekombinantní DNA, mohou se vázat infikovanými buňkami nakonec vytvořené peptidy podle vynálezu bezprostředně na ctv&6integrinový receptor, například na nádorové buňky a mohou je blokovat.

Odpovídající rekombinantní DNA, která se může připravit o sobě známými a běžnými způsoby, může být však také například ve formě virové DNA, která obsahuje úseky, které kódují virový • · • · ·· · ·· • · · · « · · · · ····· · · · • « ··· · obalový protein. Infekcí hostitelského organismu takovými rekombinantními, zvláště nepatogenními viry, se mohou hostitelské buňky, které expresují integrin s výhodou napadat (cí1ování).

Vhodnými viry jsou například adenoviry, kterých se často používá jakožto vektorů pro cizí geny v buňkách savců. Pro své četné vlastnosti se hodí pro genovou terapii, jak uvádí S.J. Watkins a kol. (Gene Therapy 4, str. 1004 až 1012, 1997) a také J. Engelhard a kol. (Hum. Gene Ther. 4, str. 759 až 769, 1993). Jak uvádí A. Fasbender a kol. (J. Clin. Invest. 102, str. 184 až 193, 1998), je společným problémem genové terapie virovými a nevirovými vektory omezená účinnost transferu genu. Shora popsanou přídavnou ligandovou sekvencí pro integrin civíte v obalovém proteinu adonovirů se může dosáhnout zlepšení transferu například cystický fibrózový transmembránový vodivostní regulátor (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulátor, CFTR) cDNA.

Podobně jako popisuje T. Tanaka a kol. (Cancer Research 58, str. 3362 až 3369, 1998) se mohou využít místo DNA pro angiostatin také DNA pro sekvence podle vynálezu pro transfekci buněk prostřednictvím retrovirových nebo adenovirových vektorů.

Peptidy podle vynálezu se mohou používat také v komplexu 1iposomů ze systému 1ipid/peptid/DNA vyrobeném pro transfekci buněčných kultur z 1iposomového komplexu sestávajícího ze systému lipid/DNA (bez peptidu) pro použití v genové terapii lidí. Přípravu komplexu 1iposomů ze systému 1ipid/DNA/peptid popsal například S.L. Hart a kol. (Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Targeting Vector, Human Gene Therapy 9, str. 575 až 585, 1998).

Může se připravovat liposomový komplex 1ipid/peptid/DNA • ·

například z následujících zásobních roztoků: 1 pg/μΐ lipofektinu (ekvimolární směs DOTMA (=N-tl-(2,3-dioleyloxy)propyll-N,N,N-trimethylamoniumchlorid) a DOPE (dioleylfosfátidylethanolamin) , 10 jug/μΐ plasmidu DNA a 100 jug/ml peptidu. Za tímto účelem se jak DNA tak peptid rozpouštějí v buněčném kultivačním prostředí.

Komplex lyposomů se připraví smíšením těchto tří složek v určitém hmotnostním poměru (1 ipid:DNA:peptid například 0,75 = 1:4). Komplex lyposomů a DNA je již popsán pro genovou terapii lidí (Caplen N.J. a kol., LipoSome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Nátuře Medicine 1, str. 39 až 46, 1995).

Vynález se proto také týká použití odpovídajícím způsobem modifikované rekombinantní DNA z gen uvolňujících systémů, zvláště ze systému vir-DNA, k ošetřování nemocí, které jsou bezprostředně nebo nebezprostředně způsobeny expresí ανβ& integrinových receptorů, zvláště patogenních angiogenních nemocí, trombóz, srdečního infarktu, koronárních onemocnění srdce, arteriosklerózy, nádorů, osteoporózy, zánětů, infekcí jakož také k ovlivňováni procesů hojení ran.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Teploty se uvádějí vždy ve stupních Celsia

Chromatografická HPLC analýza (retenční doba Rt) se provádí za použití následujících systémů:

Sloupec 5 um LichroSpher 60 RP-Select B (250-4) s 50 minutovým gradientem od 0 do 80 % 2-propanolu ve vodě/0,3 % trif1uoroctové kyseliny za toku 1 ml/min a za detekce při 215 nm.

Hmotová spektrometrie (MS): El (elektronová rázová ionizace) M⁺: FAB (bombardování rychlými atomy) (M+H)⁺

0 9999

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava a čištění peptidů podle vynálezu.

Peptidy podle vynálezu se v podstatě připravují a čistí použitím Fmoc-strategie za chránění ke kyselině labilních postranních řetězců na pryskyřicích labilních ke kyselině za využití obchodně dostupných kontinuálních ( continuous flow) syntetizerů peptidů podle popisu Haubnera a kol. (J. Am. Chem. Soc. 118, str. 17703, 1996).

Ac-Arg- Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2

Dvakrát se následně podrobí 2 g aminoxanthenyloxypolystyrenové pryskyřice (Novabiochem 0,37 mmol/g) kopulačnímu stupni za použití 0,50 g TBTU, 0,53 ml ethyldiisopropylaminu a Fmoc-aminokyseliny v dimethylformamidu vždy v obchodní syntezní aparatuře a o sobě známým způsobem (aparatura a příručka Milligen 9050 PepSynthetizer™, 1987) v každém případě po dobu minut. Promytí se provádí v dimethylformamidu po dobu 10 minut, štěpení v systému piperidin/dimethylformamid (objemově 1:4) po dobu 5 minut a N-koncová acylace (uzavření) se provádí za použiti systému acetanhydrid/pyridin/dimethylformamid (objemově 2=3=15) po dobu 15 minut. Používají se aminokyseliny Fmoc-Arg(Pmc), pak Fmoc-Leu, pak Fmoc-Ser(But), pak Fmoc-D-Asp(OBut), pak Fmoc-Leu, pak Fmoc-Asp(OBut), pak Fmoc-Gly a nakonec pak Fmoc-Arg(Pmc). Po odstranění chránící skupiny Fmoc ze Fmoc-Arg(Pmc)-Gly-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pmc)-aminoxanthenyloxypolystyrenové pryskyřice se opět provede acylace. Po promytí DMF a isopropanolem a následném vysušení ve vakuu při teplotě místnosti se získá 2,8 g Ac-Arg(Pmc)-Gly-Asp(OBut)-Leu-D-Asp( OBut)-Ser( But)-Leu-Arg(Pmc)-aminoxanthenyloxypolystyrenové pryskyřice. Zpracováním této pep22 tidylové pryskyřice 20 ml systému kyselina trifluoroctová/voda/TIS (objemově 94=3:3) po dobu dvou hodin při teplotě místnosti, filtraci, zkoncentrování ve vakuu a trituraci s diethyletherem se zsíká 0,47 g

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2 (kód EMD 272974). .

Produkt se čistí chromatografií RP-HPLC na Lichrosorbu RP 18 (250 - 25, 7 pm, Merck KGaA) ve 0,3% trifluoroctové kyselině za použití gradientu 4 % až 24 % 2-propanolu v průběhu jedné hodiny při průtoku 10 ml/min a eluát se hodnotí UV průtokem fotometrem při 215 a 254 nm. Získá se 168 mg produktu;

Rt [sici 15,5 min; FAB 973.

Podobně se připraví následující sloučeniny:

! / Kod' (EMD)	Sekvence	MW (g/mol)	FAB	Rt [sic]
271277	Ac-RADLDSLR-NH2	986,1	986,6	18,18
271315	Ac-RGDLdsLR-NH2	972,1	972.6	15.7
272973	Ac-RaDLDSLR-NH2	986,1	986,6	16,39
271294	Ac-RSDLDSLR-NH2	1002,1	1002	18,28
271296	Ac-RVDLDSLR-NH2	1014,2	1014	19,68
271295	Ac-RYDLDSLR-NH2	1078,2	1078,6	19,58
271297	Ac-RGDLDSLR-NH2	972,1	972	16,83
271298	Ac-RHDLDSLR-NH2	1052^2	1052	17}10
271299	Ac-RRDLDSLR-NH2	1071,2	1071	16^50
271300	Ac-RDDLDSLR-NH2	1030,1	1030	16,95
	Ac-RGDLdGLR-NH2			i
	Ac-RGDLdALR-NH2
271293	Ac-RTDLDSLR-NH2	1016,1	1017	17,67
271265	Ac-RTDLDSLA-NH2	931,0	931,6	18,15
271266	Ac-RTDLDSAR-NH2	974,0	974,6	14,43
271267	Ac-RTDLDALR-NH2	1000,1	1000,6	18,64
271268	Ac-RTDLASLR-NH2	972,1	972,6	18,42
271270	Ac-RTDADSLR-NH2	974f0	974,6	14,95
271273	Ac-RTALDSLR-NH2	972,1	972,6	18,95
271277	Ac-RADLDSLR-NH2	986,1	986,6	18,18

·· · ·· • ♦ · · · · • · · · · · * ······· 9 • · ♦ · · ·♦ · ·· · ·· · · • · · • · • · • · • · ·· · ·

271283	Ac-ATDLDSLR-NH2	931,0	931,5	18,75
271285	Ac-RTDLDSLr-NH2	1016,1	1017	17,38
271286	Ac-RTDLDSlR-NH2	1016,1	1017	17,22
271287	Ac-RTDLDsLR-NH2	1016,1	1017	16,98
271288	Ac-RTDLdSLR-NH2	1016,1	1017	17,70
271289	Ac-RTD1LDSLR-NH2	1016,1	1017	17,31
271290	Ac-RTdLDSLR-NH2	1016,1	1017	17,72
271291	Ac-RtDLDSLR-NH2	1016.1	1017	16,84
271292	Ac-rTDLDSLR-NH2	1016,1	1017	18,07
271577	Ac-RTELDSLR-NH2	1030,2	1030,6	17 ,27
271309 ·	Ac-RTDLaSLR-NH2	972,1	973	17,03
271317	AC-RTDL-(D-Phg)-SLR-NH2 '	1034,2	1034,7	19,86
271318	Ac-RTDLfSLR-NH2	1048 ,2	1049	22 ,66
271319	Ac-RTDL-(D-Nal)-SLR-NH2	1098,3	1099	26,38
271320	Ac-RTDLGSLR-NH2	958,1	958,6	16,74.
271321	Ac-RTDL-Aib-SLR-NH2	986,1	986	19,63
271322	Ac-RTDLpSLR-NH2	998,2	998,6	18,23
271575	Ac-RTDLPSLR-NH2	998,2	998,5	17,30
271576	Ac-RTDL-(D-Bgl)-SLR-NH2	1014,2	1014,6	20,06'
271310	Ac-RTDLdSLA-NH2	931?0	931,5	18,20
271311	Ac-RTDLdSAR-NH2	974,0	974,6	14,59
271547	Ac-RTDLdSPR-NH2	1000.,1	1000.4	13^26
271573	Ac-RTDLdSFR-NH2	1050,1	1050.5	16,82
271574	Ac-RTDLdSlR-NH2	1016,1	1016,5	15,99
249381	Ac-RTDFdSLR-NH2	1050,1	1050^5	17,04
249383	Ac-RTDldSLR-NH2	1016,1	1016,5	16,22
249385	Ac-RTD-NIe-dSLR-NH2	1016,1	1016.5	17,03
271314	Ac-RTDLdsLR-NH2	1016,1	1016,8	15,4
271303	Ac-Orn-RDLDSLR-NH2	974,1	974	16,26
271308	Ac-Har-TDLDSLR-NH2	1030,1	1030	17,66
27Í302	Ac-HTDLDSLR-NH2	997,1	997	17 ,28
271301	Ac-KTDLDSLR-NH2	988 ,1	988	16,46
271323	Ac-RTDLdLR-NH2	929,1	929	15,95
271324	Ac-RTDLdGLR-NH2	986,1	986	16,66
271325	Ac-RTDLd-PAla-LR-NH2	1000,1	1000	15/92
271327	Ac-RTDLd-Abu-LR-NH2	1014,1	1014	16,43
272975	Ac-RTDLDSLG-NH2	916.,9	917	16,19
271329	Ac-RTDLDSLF-NH2	1007,1	1007	24,23

, ·· · ·· · • » 9 · · « • 9 · · 9 9 « * 9 9999 >99 9 **· 999 ·· · 9· ···

271332	Ac-RTDLDSLD-NH2	975,0	975	16,40
271336	Ac-RTDLDSLL-NH2	973,1	973	23,51
271339	AC-RTDLDSLS-NH2	947,0	947	16,54
271343	Ac-RTDLDSLK-NH2	988,1	988	16,36
271346	AC-RTDLDSLY-NH2	1023.1	1023	18.98
271350	Ac-RTDLDSL-Orn-NH2	974,1	974	15,84
271355	Ac-RTDLDSL-Har-NH2	1030,1	1030	17,55
271316	Ac-RTDLDGLR~NH2	986,1	986,7	17,55
	Ac-RTDLdALR-NH2
272974	Ac-RGDLdSLR-NH2	972,1	973	16,4

Nomenklatura aminokyselin se řídí směrnicí Eur. J. Biochem. 138, str. 9 aš 37, 1984.

index = D-aminokyselina

Přiklad 2

Test receptorového vázání systému cevfle/f ibronekt in

Vyrobené peptidy podle vynálezu se váží v roztoku spolu s konkurenčně působícím f ibronekt i nem na zmobilizovaný αν $6 receptor a zjišťuje se hodnota Q jakožto míra selektivity vázání zkoušeného peptidů na ανβο. Hodnota Q se vypočítává 2e kvocientu hodnoty IC50 testovaného peptidů a standardu. Jakožto standardu se použilo lineárního Ac-RTDLDSLR-NH2 (kód EMD 271293) (lit./patent srovnej Pytela a kol., Science 231, str. 1559, 1986).

Zkouška vázáni se provádí následujícím způsobem:

Imobilizace rozpustného ανβδ receptoru na mikrotitračních destičkách probíhá po zředění proteinového roztoku v TBS++ a e

následné inkubaci přes noc při teplotě 4 C (100 μΐ/důlek).

Nespecifická místa vázání se blokuji inkubací (dvě hodiny při

-.·· teplotě 37 C) s 3 % (hmotnost/objem) BSA v TBS++ (200 μΐ/důlek). Nadbytek BSA se odstraní trojím promytím TBSA++. Peptidy se sterilně (1:10) v TBSA + -»- zředí a inkubují se s imobilizovným integrinem (50 μΐ peptidu + 50 μ 1 ligandu na důlek; dvě o

hodiny při teplotě 37 C) spolu s biotiny1ováným fibronektinem 2 mg/ml. Nevázaný fibronektin a peptidy se odstraní trojím promytím TBSA++. Detekce vázaného fibronektinu se provádí ino kubací (jednu hodinu při teplotě 37 C) s alkalickou fosfatázou kopulovanou s antibiotinovou protilátkou (Biorad) (1'20000 v TBSA++; 100 μΙ/důlek). Po trojím promytí TBSA++ se provádí kolorimetrické zjištění inkubací (10 až 15 minut při teplotě o

C ve tmě) s roztokem substrátu (5 mg ni trofenyl fosfátu, 1 ml ethanolaminu, 4 ml vody; 100 μΙ/důlek). Enzymová rekce se ukončí přidáním 0,4 M roztoku hydroxidu sodného (100 μ1/důlek. Barevná intenzita se stanovuje při 405 nm v měřicím zařízení ELISA a porovnává se s nulovou hodnotou. Jakožto nulové hodnoty se používá důlků nepovíečených receptorem. Jako standardu se používá AC-RTDLDSLR-NH2. Hodnoty IC50 pro testované peptidy se odečítají z grafu a z nich spolu s IC50 hodnotou standardního peptidu se zjišťuje hodnota Q peptidu podle vynálezu. Hodnota Q = IC50 testovaného peptidu/ICso standardu.

Hodnota Q se vypočte jako střed opakovaných testů.

Výsledky popsaného testu jsou v následující tabulce.

Tabulka II

Výsledky otvpe/ f ibronekt i nového receptorového testu vázání

Kod (EMD)	Sekaence	Q 11 hodnj, = IC50 test· peptid . / IC50 EMD 271293
271293	Ac-RTDLDSLR-NH2	1,00 (=75 nM)
272974	Ac-RGDLdSLR-NH2	0ή15
271297	AC-RGDLDSLR-NH2	0,22
271294	Ac-RSDLDSLR-NH2	Λ2-

·· 9 99 • · · · · · • 999 9 9 ♦ 9999999 9 •99 · ·

271300	Ac-RDDLDSLR-NH2	14
271299	Ac-RRDLDSLR-NH2	15
271296	Ac-RVDLDSLR-NH2	16
271291	Ac-RtDLDSLR-NH2	20
271295	Ac-RYDLDSLR-NH2	30

271298	Ac-RHDLDSLR-NH2	30
271277	Ac-RADLDSLR-NH2	31
272973	Ac-RaDLDSLR-NH2	98
271265	Ac-RTDLDSLA-NH2	7
271266	Ac-RTDLDSAR-NH2	60
271270	Ac-RTDADSLR-NH2	60
271285	Ac-RTDLDSLr-NH2	1
271286	Ac-RTDLDS-(D-Leu)-R-NH2	10
271288	Ac-RTDLdSLR-NH2	0,08
271289	Ac-RTD-(D-Leu)-DSLR-NH2	40
271290	Ac-RTdLDSLR-NH2	15
271292	Ac-rTDLDSLR-NH2	7
271308	Ac-Har-TDLDSLR-NH2	20
271302	Ac-HTDLDSLR-NH2	70
271301	Ac-KTDLDSLR-NH2	110
271303	Ac-Orn-TDLDSLR-NH2	190
271309	Ac-RTDLaSLR-NH2	0,16
271321	Ac-RTDL-Aib-SLR-NH2	_
271319	AC-RTDL-(D-Nal)-SLR-NH2	2A
271320	AC-TRDLGSLR-NH2	1
271268	Ac-RTDLASLR-NH2	1
271318	Ac-RTDLfSLR-NH2	_
271317	Ac-RTDL-(D-Phg)-SLR-NH2	3,6
271576	Ac-RTDL-(D-Bgl)-SLR-NH2	71
271575	Ac-RTDLPSLR-NH2	157
271322	Ac-RTDLpSLR-NH2	182
249385	Ac-RTD-Nle-dSLR-NH2	0^15
249383	Ac-RTDldSLR-NH2	0,6
249381	Ac-RTDFdSLR-NH2	7.1 —i_
271287	Ac-RTDLDsLR-NH2	0,45
271267	Ac-RTDLDALR-NH2	0?8
271316	Ac-RTDLDGLR-NH2	0z95

271323	Ac-RTDLdLR-NH2	273
271355	Ac-RTDLDSL-Har-NH2	1,8

271343	Ac-RTDLDSLK-NH2	2,2
271336	Ac-RTDLDSLL-NH2	4,4
271350	Ac-RTDLDSL-Orn-NH2	4,5
271329	AC-RTDLDSLF-NH2	5,5
271265	Ac-RTDLDSLA-NH2	7
271346	Ac-RTDLDSLY-NH2	_
272975	Ac-RTDLDSLG-NH2	12
271339	Ac-RTDLDSLS-NH2	13
271332	Ac-RTDLDSLD-NH2	51
271314	Ac-RTDLdsLR-NH2	0,26
271310	Ac-RTDLdSLA-NH2	0,47
271324	Ac-RTDLdGLR-NH2	Ligl:
271574	Ac-RTDLdSlR-NH2	1,4
271573	Ac-RTDLdSFR-NH2	_
271311	Ac-RTDLdSAR-NH2	13
271325	Ac-RTDLd-PAla-LR-NH2	18
271327	Ac-RTDLd-Abu-LR-NH2	33

Následující příklady objasňují farmaceutické prostředky:

Příklad A. Injekční ampulky

Roztok 100 g účinné látky obecného vzorce I a 5 g dinatři umhydrogenf osf átu ve 3 1 dvakrát destilované vody se nastaví 2n kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 6,5, sterilně se zfiltruje a plní se do injekčních ampulek, lyofílizuje se za sterilních podmínek a sterilně se ampulky uzavřou. Každá injekční ampulka obsahuje 5 mg účinné látky.

· · 0 0 • · · 0 · 0 • · ···· ·0 0 • 0 0 0 0 ·· 0 00

Příklad B. Čípky

Roztaví se směs 20 g účinné látky obecného vzorce I se 100 g sojového lecitinu a 1400 g kakového másla, vlije se do formiček a nechá se vychladnout. Každý cípek obsahuje 20 mg účinné látky.

Příklad C. Roztok

Připraví se roztok 1 g účinné sloučeniny obecného vzorce I, 9,38 g dihydrátu natriumdibydrogenfosfátu, 28,48 g dinatriumhydrogenfosfátu se 12 molekulami vody a 0,1 g benzalkoni um -chlor idu v 940 ml dvakrát destilované vody. Hodnota pH roztoku se upraví na 6,8, doplní se na jeden litr a steriluje se ozářením. Tohoto roztoku je možno používat jakožto očních kapek.

Příklad D. Mast

500 mg účinné látky obecného vzorce I se smísí s 99,5 g vazelíny za aseptických podmínek.

Příklad E. Tablety

Ze směsi 1 kg účinné látky obecného vzorce I, 4 kg laktó2y, 1,2 kg bramborového škrobu, 0,2 kg mastku a 0, 1 kg stearátu hořečnatého se obvyklým způsobem vylisují tablety, tak, že každá tableta obsahuje 10 mg účinné látky.

Příklad F. Povlečené tablety

Obdobně jako podle příkladu E se vylisují tablety, které se pak obvyklým způsobem povléknou povlakem ze sacharózy, bramborového škrobu, mastku, tragantu a barviva.

-.·· • 9 • 9 • •99

99

Příklad G. Kapsle

O sobě známým způsobem se plní do kapslí z tvrdé želatiny 2 kg účinné látky obecného vzorce I tak, že každá kapsle obsahuje 20 mg účinné látky.

Příklad H. Ampule

Roztok 1 kg účinné látky obecného vzorce I v 60 1 dvakrát destilované vody se sterilně zfiltruje a plní se do ampuli, lyofilizuje se za sterilních podmínek a sterilně se ampule uzavřou. Každá ampule obsahuje 10 mg účinné látky.

Příklad I. Inhalační sprej

Rozpustí se 14 g účinné látky obecného vzorce I v 10 1 isotonického roztoku chloridu sodného a plní se do běžných obchodních nádob pro stříkání s pumpovým mechanizmem. Roztok se může stříkat do úst nebo do nosu. Každý střik (přibližně 0,1 ml) odpovídá dávce přibližně 0,14 mg.

Průmyslová využitelnost

Peptidické sloučeniny, které jakožto ligand integrinu of_v£6 jsou vhodné pro výrobu farmaceutických prostředků k ošetřování nemocí založených na expresi a na patologické funkci civíte integrinových receptorů.

Průmyslová využitelnost

Peptidické sloučeniny, které jakožto ligand integrinu «vP6 jsou vhodné pro výrobu farmaceutických prostředků k ošetřování nemocí založených na expresi a na patologické funkci otvPe integrinových receptorů.

PATENTOVÉ ·· * ·· •44 · 9 9

9 9 9 9 9 • 9 9999 99 »

Claims (8)

1. NÁROKY

   1. Pepti dové sloučeniny obecného vzorce I

   Ac-Arg-X¹τAsp-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-NHa (I) kde znamená

   Ac acetylovou skupinu,

   X¹ Ser, Gly, Thr, Asp, Arg, Val, Tyr, His nebo Ala, X² Leu, Ile, Nle, Val nebo Phe, X³ Asp, Glu, Lys, Phe, Aib, Nal, Gly, Ala, Bgl nebo Phg, X⁴ Gly, Ala, Ser, β-Ala nebo Abu, X⁵ Leu, Ile, Nle, Val nebo Phe, X⁶ Arg, Har, Lys, Leu, Orn, Phe, Ala, Tyr, Gly, Ser nebo Asp

   jakožto ligandů integrinu cř_Vp6, které jsou biologicky aktivní, přičemž uvedené aminokyseliny mohou být derivát izovány, aminokyselinové zbytky jsou navzájem vázány peptidovým způsobem prostřednictvím cf-aminoskupin a <x-karboxylových skupin, včetně D a L forem a opticky aktivních aminokyselinových zbytků a jejich fyziologicky přijatelnch soli, přičemž je vyloučen Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2
2. 2. Peptidové sloučeniny podle nároku 1 obecného vzorce I, ze souboru zahrnujícího • · « ·«

   Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Ser-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Asp-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Ala-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-D-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-D-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Ala-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Aib-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Nal-Ser-Leu~Arg-NH₂/ Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Ala-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Nle-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Ile-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Har-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Ala-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂, a jejich fyziologicky přijatelné soli.
3. 3. Peptidové sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 a podle nároku 2 a jejich fyziologicky přijatelné soli jakožto léčiva.
4. 4. Léčiva podle nároku 3 jakožto inhibitory pro ošetřování nemocí, které jsou založeny na expresi a na patologické funkci ανβ& integrinových receptorů.
5. 5.

   Léčiva podle nároku 4 k ošetřování trombóz, srdečního •

   44 4

   4· » • · 4 • 4 4 4

   4 4 4444

   4 4 1

   44 4 • 4 44

   4 4 4 4 ·· 4

   4 4 · • 4 · •4 4*44 infarktu, koronárních nemocí srdce, arteriosklerózy, nádorů, osteoporózy, fibróz, zápalů, infekcí, lupénky jakož také k ovlivnění hojení ran.
6. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se tím, še obsahuje alespoň jedno léčivo podle nároku 4 a 5 a popřípadě nosič a/nebo pomocnou látku a popřípadě jiné účinné látky.
7. 7. Použití peptidických sloučenin podle nároku 1 a 2 a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí pro výrobu léčiva k ošetřování nemocí, které jsou založeny na expresi a patologické funkci dv/36 integrinových receptorů.
8. 8. Použití peptidových sloučenin podle nároku 7 pro výrobu léčiva k ošetřování trombóz, srdečního infarktu, koronárních nemocí srdce, arteriosklerózy, nádorů, osteoporózy, fibróz, zápalů, infekcí, lupénky jakož také k ovlivnění hojení ran.