SK18722001A3

SK18722001A3 - Inhibítory integrínu ALFAvBETA6

Info

Publication number: SK18722001A3
Application number: SK1872-2001A
Authority: SK
Inventors: Alfred Jonczyk; Beate Diefenbach; Ulrich Groth; Gunther Zischinsky
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-06-26
Filing date: 2000-06-13
Publication date: 2002-05-09
Also published as: PL352374A1; JP2003503422A; DE19929410A1; ZA200200673B; CA2377224A1; CZ20014484A3; HUP0201729A2; NO20016341L; CN1358195A; HUP0201729A3; AU6263000A; KR20020015704A; WO2001000660A1; AR024472A1; BR0011954A; EP1189930A1; AU771099B2; NO20016341D0; MXPA01013247A

Description

Vynález sa týka nových peptidov všeobecného vzorca I

Ac-Arg-X¹-Asp-X²-X³-X⁴-X⁵-X ⁶-NH₂ (I) kde znamená

Ac acetyovú skupinu

X¹	Ser, Gly, Thr, Asp,	Arg, Val, Tyr, His	alebo Ala,
x²	Leu, íle, Nie, Val	alebo Phe,
x³	Asp, Glu, Lys, Phe,	Aib, Nal, Gly, Ala	, Bgl alebo Phg,
x⁴	Gly, Ala, Ser, β-Ala alebo Abu,
x⁵	Leu, íle, Nie, Val	alebo Phe,
x⁶	Arg, Har, Lys,Leu,	Orn, Phe, Ala, Tyr,	Gly, Ser alebo

Asp, ako ligandov integrínu v ₆, ktoré sú biologicky aktívne, pričom uvedené aminokyseliny môžu byt derivatizované, amínokyselinové zvyšky sú vzájomne viazané peptidovým spôsobom prostredníctvom -amínoskupín a -karboxylových skupín, včítane D a L foriem a opticky aktívnych amínokyselinových zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí, pričom je vylúčený Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂.

Vynález je založený na objavení nových zlúčenín, ktoré majú hodnotné vlastnosti a môžu byť použité na výrobu liečiv.

Zistilo sa, že zlúčeniny podlá vynálezu a ich soli majú hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou znášanlivosťou.

Peptidy podlá vynálezu sa môžu používať ako účinné inhibítory v θ intgrínového receptora a tým na ošetrovanie rôznych chorôb a patologických nálezov.

Doterajší stav techniky

Iné inhibítory integrínu v g sú opísané v nemeckom patentovom spise číslo DE 19858857 a iné také typy taktiež opísal S. Kraft a kol. (J. Biol. Chem.274, str. 1979 až 1985, 1999). Zlúčeniny podlá vynálezu možno považovať za výberový vynález s prihliadnutím na vyššie uvedenú literatúru.

Integríny patria do rodiny heterodimérnej triedy . I transmembránových receptorov, ktoré majú významnú úlohu v množstve ad'néznych procesov bunka-matrica, prípadne bunka-bunka (Tuckwell a kol., 1996, Symp.Soc.Ex.Biol. 47). Zhruba sa môžu deliť do troch tried: /^-integríny, ktoré predstavujú receptory pre extracelulárnu matricu, 4₂-integríny, ktoré sú aktivovatelné na leukocytoch a sú spúšťané pri zápalových procesoch, ako aj integríny, ktoré ovplyvňujú bunečnú odozvu pri hojení rán a pri iných patologických procesoch (Marshall a Hart, Semin,Cancer Biol. str. 191, 1996).

Integríny ,Ziib43'Ζδ 1^vtfi /^V<W^V ^5' M'

Z v $6' sa všetky viažu na Arg-Gly-Asp (RGD) peptidovú sekvenciu v prírodných ligandoch, ako sú napríklad fibronektín alebo vitronektín. Rozpustné RGD- obsahujúce peptidy sú schopné inhibovať interakciu každého tohto integrínu so zodpovedajúcimi prírodnými ligandami. Integrín je pomerne vzácny integrín (Busk a kol., J. Biol.Chem 267 (9), str. 5790, 1992), ktorý sa pri procesoch opravy eptelových tkanív vo väčšom množstve vytvára a ' prednostne viaže prirodzené matricové molekuly fibronektín a tenascín (Want a kol., Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 15(5), str. 664, 1996). Fyziologické a patologické funkcie pčv nie sú do teraz dokonale známe, domnievame sa ale, že tento integrín má dôležitú úlohu pri fyziologických pochodoch a ochoreniach ( napríklad zápaly, hojenie rán, nádory), na ktorých sa podieľajú epitelové bunky. Tak sa pčv exprimuje na keratínocytoch v ranách (Haapasalmi a kol., J. Invest. Dermatol. 106(1), str. 42, 1996), z čoho možno usudzovať, že agonistami a antagonistami tohto integrínu sú ovplyvňované popri procesoch hojenia rán a zápalov aj iné patologické prejavy kože, ako napríklad lupienka. Okrem toho má «ύν^₆význam v epiteli dýchacích ciest (Weinacker a kol., Am J.Respir. Cel Mol. Biol. 12(5), str. 547, 1995), takže by sme mohli úspešne nasadzovať zodpovedajúce agonisty/antagonisty tohto integrínu pri ochoreniach dýchacích ciest, ako sú bronchitída, astma, píúcna fibróza a nádory dýchacích ciest. Taktiež je známe,, že<^vd₆ majú význam pre črevný epitel, takže by sa mohli používať zodpovedajúce integrínové agonisty/antagonisty pri. ošetrovaní zápalov, nádorov a pri poraneniach žalúdočného a črevného traktu.

Závislosť tvorenia angiogenézie na vzájomnom pôsobení vaskulárnych integrínov a extracelulárnych matriových proteinov opísal P.C. Brooks, R.A. Clark a D.A. Cheresh (Science 264, str. 569 až 571, 1994).

Úlohou vynálezu je preto ešte naviac k známym prírodným vysokomolekulárnym ligandom a protilátkam, s ktorými sa terapeuticky a diagnosticky ťažko pracuje, nájsť mocné, špecifické a selektívne nízkomolekulárne ligandy pre v θ , výhodne paptidy, ktoré by sa mohli používať pre uvedené terapeutické oblasti, no taktiež ako diagnostické alebo redukčné činidlá.

Podstata vynálezu

Zistilo sa, že vyššie charakterizované peptidové zlúčeniny podľa vynálezu a ich soli ako rozpustné molekuly pôsobia na bunky, ktoré majú · uvedený receptor alebo-ak-sa viažu na povrchy, predstavujú umelé ligandy pre v ₆ sprostredkovávané prichytávanie buniek. Predovšetkým pôsobia ako inhibitory v ₆ integrínu, pričom predovšetkým brzdia vzájomné pôsobenie receptoru s inými ligandami, napríklad väzbu fibronektínu. Toto pôsobenie možno dokázať napríklad spôsobom, ktorý opísal J.W. Smith a kol.(Biol. Chem. 265, str. 12267 až 12271, 1990).

Okrem toho sa zistilo, že nové zlúčeniny majú pri dobrej znášanlivosť velmi hodnotné farmakologické vlastnosti spolu s dobrou znášanlivosťou a môžu sa používať ako liečivá. Táto skutočnosť bude ešte presnejšie opísaná.

Peptidické zlúčeniny podľa vynálezu sa okrem toho môžu používať ako diagnostiká na detekciu a lokalizáciu patologických stavov v epitelovom systéme in vivo, ak sú vybavené signálnymi znakmi ( napríklad biotinylovým zvyškom) podľa stavu techniky.

Vynález zahŕňa taktiež kombinácie aspoň . s jednou inou účinnou zlúčeninou a/lebo konjugátmi s inými účinnými látkami, ako sú cytotoxicky účinné látky, ako aj konjugáty s rádiosignálnymi znakmi na rentgénovú terapiu alebo na PET diagnózu alebo tiež fúzne proteíny s proteínovými signálnymi znakmi, ako sú GFP alebo protilátky, alebo terapeutické proteíny, ako je IL-2.

Niektorými výhodnými spupinami zlúčenín všeobecného vzorva I sú nasledujúce zlúčeniny podvzorcov la až If, kde zvlášť neuvedené symboly majú význam uvedený pri všeobecnom vzorci I, pričom znamená vo všeobecnom vzorci

a/	X¹	Ser,	Gly	alebo	Thr,
b/	X¹	Ser,	Gly	alebo	Thr,
	X²	Leu,
c/	X¹	Ser,	Gly	alebo	Thr,
	x²	Leu,
	x³	Asp	alebo D-Asp,
d/	x¹	Ser,	Gly	alebo	Thr,
	x²	Leu,

X³ x⁴	Asp Gly,	alebo D-Asp,
Ala	alebo Ser,
X¹	Ser,	Gly	alebo Thr,
x²	Leu,
x³	Asp	alebo	D-Asp,
x⁴	Gly,	Ala	alebo Ser,
x⁵	Leu,
x¹	Ser,	Gly	alebo Thr,
x²	Leu,
x³	Asp	alebo D-Asp,
x⁴	Gly,	Ala	alebo Ser,
x⁵	Leu,
x⁶	Arg,

a ich soli.

Vynález sa zvlášť týka peptidových zlúčenín vybratých zo súboru zahŕňajúceho

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2,

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, . Ac-Arg-Ser-Asp-Leu-Asp-Ser-Leur-Arg-NH₂»--Ac-Arg-Asp-Asp-Leu-Asp~Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu“Asp-Ser-Leu-Ala-NH₂/ i Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-D-Arg-NH2,

J ' Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-D-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu“Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Ala-Ser-Leu-Arg-NH2, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Aib-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Nal-Ser~Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Arg-Nfo, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Ala-Ser-Leu-Arg-NH2, ‘ Ac-Arg-Thr-Asp-Nle-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Ile-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Har-NH₂,

Ac-Arg~Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Ala-NH_2/

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Gly-Leu-Arg-NHz,

Uvádzané skratky zvyškov aminokyselín znamenajú zvyšky nasledujúcich aminokyselín:

Abu	4-amínomaslová kyselina
Aha	6-amínohexánová kyselina, 6-amínokapronová kyselina
Aib	*6 -amínoizomaslová kyselina
Ala	alanín
Asn	asparagín
Asp Arg Bgl Cys Dab	asparagová kyselina arginín C-alfa-terc-butylglycín cysteín 2,4-diamŕnomaslová kyselina - ..... ....
Dap Gin	2,3-diamínopropionová kyselina glutamín
Glp Glu	pyroglutamová kyselina glutamová kyselina
Gly Har	glycín homoarginín
His	histidín
homo-Phe	homo-fenylalanín
íle	izoleucín
Leu	leucín

Lys Met	lyzín metionín
Nal	naft-2-ylalanín
Nie	norleucín
Orn	ornitín
Phe	fenylalanín
Phg	fenylglycín

4-Hal-Phe 4-halogénfenylalanín

Pro	prolín
Ser	serín
Thr	treonín
Trp Tyr Val	tryptofan tyrozín valín

Okrem toho sa ešte uvádzajú skratky, ktoré majú nasledujúci význam:

Ac	acetyl
BOC	terc-butoxykarbonyl
BSA	albumín hovädzieho séra

CBZ alebo Z benzyloxykarbonyl

DCC1 ·	dicyklohexylk-arbodi-imid ---
DMF	dimetylformamid
EDC1	N-etyl-N-N' -(dimetylamínopropyl)karbodiimid,
Et	etyl
FCA	fluoresceínkarboxylová kyselina
FITC	fluoresceinisotiokyanát
Fmoc	9-fluorenylmetoxykarbonyl
FTH	fluoresceintiomočovina
HOBt	1-hydroxybenzotriazol
HONSu	N-hydroxysukcinimid
Me	metyl

MBHA	4-metylbenzydrylamín
Mtr	4-metoxy-2,3,6-trimetylfenylsulfonyl
OBut	terc-butylester
Oct	oktanoyl
OMe	metylester
OEt	etylester
Pbf	2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofurán-5-sulfonyl
Pmc	2,2,5,7,8-pentametylchroman-6-sulfonyl
POA	fenoxyacetyl
Sal	salicyloyl
TBS++	tris pufrovaná solanka s dvojmocným katiónom
TBSA	TBS + BSA
TBTU	2-(lH-benzotriazol-l-yl) -1,1,3-tetrametyl-uróniumtetrafluórborát
TFA	trifluóroctová kyselina
Trt	trityl (trifenylmetyl).

Ak vyššie uvedené aminokyseliny môžu byt v niekolkých enantiomérnych formách, všetky tieto formy a tiež ich zmesi ( napríklad DL formy) vynález zahŕňa. Okrem toho môžu byt aminokyseliny chránené známymi chrániacimi skupinami.

Zlúčeniny podlá vynálezu zahŕňajú takzvané prodrogové deriváty, to znamená napríklad alkylovými alebo acylovými skupinami, cukrami alebo oligopeptidmi pozmenené zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktoré sa v organizme rýchlo štiepia na účinné zlúčeniny podlá vynálezu. Do tejto skupiny patria tiež biologicky odbúratelné polymérne deriváty zlúčenín podlá vynálezu opísané v literatúre ( napríklad J. Pharm. 115, str. 61 až 67, 1995).

Uvedené aminokyseliny alebo amínokyselinové zvyšky, napríklad skupiny NH alebo C-koncové amidové skupiny, môžu byť tiež derivatizované, pričom sú výhodnými N-metylové, Netylové, N-propylové, N-benzylové alebo Gt-metylové deriváty. Deriváty Asp a Glu sú hlavne metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, terc-butyl, neopentyl- alebo benzylestery bočných karboxylových skupín a naviac sú výhodnými derivátmi Arg, ktoré môžu byť substituované na skupine -NH-C(=NH)-NH₂skupinou acetylovou, benzoylovou, metoxykarbonylovou alebo etoxykarbonylovou.

Vynález zahŕňa okrem zlúčenín, ktoré majú acetylovú skupinu na N-zakončení tiež zlúčeniny, v ktorých je skupina Ac nahradená inou acylovou skupinou, napríklad skupinou propionylovou, butyrylovou alebo benzoylovou.

Vynález zahŕňa tiež deriváty zahŕňajúce známe markery, ktoré detekciu peptidov ulahčujú. Ako príklady takých derivátov sa uvádzajú rádioaktívne označené, biotinylované alebo fluorecsenčne označené paptidy.

Fluorecsenčne farbivovými skupinami sú výhodne výhodne skupina 7-acetoxykumarín-3-ylová, fluorescein-5-(a/lebo 6-) ylová, 2’ , i' -dichlórfluoresceín-5(a 6-)ylová, dihydrotetra-metylrosamin-4-ylová, tetrametylrodamín-5-(a -6-)ylová, 4,4dif luór-5,7-dimetyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacen-3-etylo.vá alebo 4,4-difluór-5,7-difenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacén-

3-etylová skupina.

Vhodné skupiny funkcionalozovaných fluorescenčných farbív, ktoré sa môžu používať ako reakčné činidlá pri príprave zlúčenín všeobecného vzorca I podľa vynálezu, sú opísané napríklad v publikácii Handbook of Fluorescent

Probes and Research Chemicals, 5. vydanie, 1992 až 1994, R.P. Haughland Molecular Probes Inc.

Všeobecne sú peptidy podľa vynálezu lineárne, môžu však byť tiež cyklické /sic/. Vynález zahŕňa nielen vyššie charakterizované peptidy, ale tiež zmesi a prostriedky, ktoré popri zlúčeninách podľa vynálezu obsahujú tiež iné farmakologicky aktívne zlúčeniny alebo pomocné prísady, ktoré môžu priaznivo ovplyvňovať: primárne farmakologické pôsobenie peptidov podľa vynálezu.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I a východiskové látky na ich prípravu sa pripravujú známymi spôsobmi, ktoré sú opísané v literatúre ( napríklad v štandardných publikáciách ako Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart), a to za reakčných podmienok, ktoré sú pre menované reakcie známe a vhodné. Pritom sa môžu tiež používať: známe, tu bližšie neuvádzané varianty.

Výhodne sa peptidy podľa vynálezu pripravujú spôsobom používajúcim pevnú fázu s následným oddelením a čistením, ako +· V·»

- -opísal· napríklad -Jonczyk a Me-ienhofer- (Peptides-,- Proc. - 8 Am.Pept. Symp.Eds. V. Hrubý a D.H. Rich, Pierce Comp. III, str. 73 až 77, 1983, alebo Angew. Chem. 104, str. 375, 1992), alebo Merrifield (J.Am.Chem.Soc.94, str. 3102, 1972).

Peptidy podľa vynálezu sa môžu pripravovať: na pevnej fáze ( ručne alebo s použitím automatizovaných syntetizérov) stratégiou Fmoc využívajúcou v kyslom prostredí labilné bočné chrániace skupiny a čistenie chromatografiou RP-HPLC. Piková homogenita sa môže merat chromatografiou RP-HPLC a identita zlúčenín využitím FAb-MS.

Peptidy sa taktiež môžu pripravovať známymi spôsobmi prípravy aminokyselín a peptidov, ktoré sú známe z literatúry ( napríklad Novabiochem -1999 Catalog Peptide Synhesis Handbook of Calbiochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden) a z početnej štandardnej literatúry a z uverejnených patentových spisov.

Môžu sa používať postupné kopulácie a kondenzácie fragmentov. Môžu sa používať rôzne N-koncové a C-koncové a bočné chrániace skupiny, ktoré sa výhodne volia tak, aby boli ortogonálne odstiepiteľné. Kopulačné stupne sa môžu realizovať s použitím rôznych kondenzačných činidiel, ako sú karbodiimidy, karbodiimidazoly, činidlá uroniového typu ako TBTU, použitím spôsobov zmesových anhydridov a halogenidov kyselín alebo aktívnych esterov. Aktivované estery sa výhodne tvoria in situ, napríklad adíciou HOBt alebo N-hydroxysukcinimidu.

Cyklizácia lineárnej prekurzorovej molekuly, majúcej bočné - -chrániace -skupiny, sa -podobne môže- realizovať- - zapoužitia kondenzačných reakcií, ktoré sú opísané v literatúre ( napríklad nemecký patentový spis číslo DE 43 10 643, alebo Houben-Weyl, l.c., zväzok 15/11, str. 1 až 806, 1974).

Pri príprave s použitím pevnej fázy sa môžu používať rôzne živice a kotviace funkcie. Živice môžu byt napríklad na báze polystyrénu alebo polyakrylamidu, ako kotviace funkcie prichádzajú do úvahy Wang o-chlórtrityl na prípravu paptidových kyselín, amínoxanthenoxykotvy napríklad na prípravu peptidových /sic/ amidov.

Biotynylované alebo fluorescenčné značené paptidy/ proteíny sa podobne môžu pripravoval známymi spôsobmi ( napríklad E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology, a Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. vydanie, 1996, R. P. Haugland Molecular Probes Inc., alebo svetový spis číslo WO 97/14716).

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa d’alej môžu pripravoval uvolnením zo svojich funkčných derivátov solvolýzou, zvlášť hydrolýzou alebo hydrogenolýzou. Pre .solvolýzu alebo pre hydeogenolýzu sú ako východiskové látky vhodné zlúčeniny, ktoré majú namiesto jednej alebo niekolkých voíných amínoskupín a/lebo hydroxylových skupín zodpovedajúce chránené aminoskupiny a/lebo hydroxylové skupiny, výhodne zlúčeniny, ktoré namiesto jedného H-atómu, ktorý je spojený s N-atómom, majú skupinu chrániacu aminoskupinu, alebo ktoré namiesto atómu vodíka v hydroxylovej skupine majú skupinu chrániacu hydroxylovú skupinu. To isté platí pre karboxylové kyseliny, ktoré môžu byť chránené tak, že sa nahradí ich -CO-OH hydroxylové skupina chrániacou skupinou napríklad esterovou skupinou-. - ----- - - -----

Výraz skupina chrániaca aminoskupinu je všeobecne známy a ide o skupiny, ktoré sú vhodné na ochranu (na blokovanie) aminoskupiny pre chemickými reakciami, ktoré sú však lahko odstránitelné, keď je požadovaná chemická reakcia na inom mieste molekuly realizovaná.Výraz skupina chrániaca hydroxylovú skupinu je podobne všeobecne známy a ide o skupiny, ktoré sú vhodné na ochranu ( na blokovanie) hydroxylovéj skupiny pred chemickými reakciami, ktoré sú však lahko odstránitelné, keď je žiadúca chemická reakcia na inom mieste molekuly realizovaná. Uvoľňovanie zlúčenín všeobecného vzorca I z ich funkčných derivátov sa darí - podľa použitej chrániacej skupiny - napríklad silnými kyselinami, ako je zvlášť kyselina trifluóroctová a chloristá, no taktiež inými silnými anorganickými kyselinami, ako je kyselina chlorovodíková alebo sírová, silnými organickými karboxylovými kyselinami, ako je trichlóroctová kyselina alebo sulfonovými kyselinami, ako je kyselina benzénsulfonová alebo p-toluénsulfonová. Hydrogénolyticky odstráni teľné chrániace skupiny ( napríklad skupiny CBZ alebo skupina benzylová) sa môžu odštiepovať napríklad spracovaním vodíkom v prítomnosti katalyzátora ( napríklad katalyzátora na báze ušľachtilého kovu, ako paládium, účelne na nosiči, ako na uhlí).

Typické chrániace skupiny pre N-koncové skupiny a pre bočné aminoskupiny sú skupina Z, BOC, Fmoc, pre koncové C-skupiny alebo pre Asp alebo Glu bočné reťazce sú O-prim-alkylové skupiny ( napríklad metoxyskupina alebo etoxyskupina), skupiny O-terc-alkylové ( napríklad OBut) alebo Obenzy lová skupina. Na chránenie guanidínopodielu skupiny Arg sú vhodné napríklad skupina Z, BOC, N0₂, Mtr, Pmc alebo Pbf. Alkoholové skupiny sa-môžu-chrániť-terc-alkylovými alebo tritylovými skupinami.

Skupina Boe, OBut a Mtr sa môže napríklad výhodne odštiepovať kyselinou trifluóroctovou v dichlórmetáne alebo približne 3 až 5 N kyselinou chlorovodíkovou v dioxáne pri teplote 15 až 30° C, kým skupina Fmoc približne 5 až 50 % roztokom dimetylamínu, dietylamínu alebo piperidínu v dimetylformamide pri teplote 15 až 30 ⁰ C.

Tritylová skupina sa používa na chránenie aminokyselín histidín, asparagín, glutamín a cysteín. Odštiepovanie chrániacej skupiny sa realizuje podľa požadovaného konečného produktu systémom trifluóroctová kyselina/10 % tiofenolu, pričom sa tritylová skupina od uvedených aminokyselín odštiepi. Pri použití alebo trifluóroctová tritylová skupina z systému trifluóroctová kyselina/anizol kyselina/ tioanizol sa odštiepi len histidínu, asparagínu a glutamínu, zostáva však na bočnom reťazci Cys.

Hydrogénolyticky odstrániteľné chrániace skupiny ( napríklad skupiny CBZ alebo skupina benzylová) sa môžu odštiepovať napríklad spracovaním vodíkom v prítomnosti katalyzátora ( napríklad katalyzátora na báze ušľachtilého kovu, ako paládium, účelne na nosiči, ako na uhlí). Ako rozpúšťadlo sa hodia vyššie uvedené rozpúšťadlá, zvlášť napríklad alkoholy, ako metanol alebo etanol alebo amidy ako dimetylformamid. Hydrogenolýza sa spravidla realizuje pri teplote približne 0 až 100° C, za tlaku približne 0,1 až 20 MPa, výhodne pri teplote 20 až 30° C, za tlaku približne 0,1 až 1 MPa. Hydrogenolýza CBZ sa darí napríklad dobre na 5 až 10 % paládiu na uhlí v metanole, alebo s použitím amóniumformátu ( namiesto vodíka) na paládiu na uhlí v systéme metanol/dimety-lformamid—p-r-i-teplote - 20 až - 3θθ C-.- Ako je uvedené vyššie, zahŕňajú peptidy podľa vynálezu tiež svoje fyziologicky prijateľné soli, ktoré sa môžu pripravovať známymi spôsobmi. Zásada všeobecného vzorca I sa môže kyselinou prevádzať na príslušnú adičnú soľ s kyselinou, napríklad reakciou ekvivalentného množstva zásady a kyseliny v inertnom rozpúšťadle, ako je napríklad etanol a následným odparením rozpúšťadla. Pre túto reakciu prichádzajú do úvahy zvlášť kyseliny, ktoré poskytujú fyziologicky prijateľné soli. Môžu sa používať anorganické kyseliny, ako sú kyselina sírová, dusičná, halogénovodíkové kyseliny, ako chlorovodíková alebo bromovodíková, fosforečné kyseliny, ako kyselina ortofosforečná, sulfaminová kyselina a organické kyseliny, zvlášť alifatické, alicyklické, aralifatické, aromatické alebo heterocyklické jednosýtne alebo niekolkosýtne karboxylové, sulfonové alebo sírové kyseliny, ako sú kyselina mravčia, octová, propionová, pivalová, dietyloctová, malonová, jantárová, pimelová, fumarová, maleínová, mliečna, vínna, jablčná, citrónová, glukónová, askorbová, nikotínová, izonikotínová, metánsulfonová, etánsulfonová, etándisulfonová, 2-hydroxyetánsulfonová, benzénsulfonová, p-toluénsulfo nová, naftalénmonosulfonová a naftaléndisulfonová a laurylsírová kyselina. Soli s fyziologicky nevhodnými kyselinami, napríklad pikráty, sa môžu používať na izoláciu a/lebo čistenie zlúčenín všeobecného vzorca I.

Na druhej strane sa kyseliny zlúčenín všeobecného vzorca I reakciou so zásadou môžu prevádzať na svoje fyziologicky vhodné soli kovové alebo amóniové. Ako soli prichádzajú do úvahy zvlášť soli sodné, draselné, horečnaté, vápenaté a amóniové, ďalej substituované amóniové soli, napríklad - - dimetylamóniové, dietylamóniové,- di-izopropylamóni-ové-, mono--etanolamóniové, dietanolamóniové alebo diizopropylamóniové, cyklohexylamóniové, dicyklohexylamóniové, dibenzyletyléndi amóniové, ďalej napríklad soli s arginínom alebo s lyzínom.

Peptidové zlúčeniny podlá vynálezu sa môžu používať ako je vyššie uvedené, ako farmaceutický účinné zlúčeniny v humánnej a vo veterinárnej medicíne zvlášť na profylaxiu a/lebo terapiu porúch, na ktorých sa podieľajú epitelové bunky. Zvlášť na ošetrovanie zápalov, na hojenie rán pokožky, na ošetrovanie orgánov respiračného traktu a na ošetrovanie žalúdka a čriev, napríklad na ošetrovanie apoplexie, angíny pectoris, nádorov, osteolytických chorôb ako osteoporózy, patologických angiogénnych chorôb, ako napríklad zápalov, pulmonárnej fibrózy, oftalmologických chorôb, diabetickej retinopatie, degeneratívnych škvŕn, myopie, očnej histoplazmózy, reumatoidnej artritídy, osteoartritídy, rubeotického glaukómu, vredovitej kolitídy, Krohnovej nemoci, aterosklerózy, lupienky, restenózy po angioplastii, akútneho zlyhania ľadvín, nefritídy, mikrobiálnej infekcie a rozptýlenej sklerózy.

Vynález sa týka paptidových zlúčenín vyššie uvedeného všeobecného vzorca I a ich fyziologicky prijateľných solí ako liečiv, diagnostických a reakčných činidiel.

Vynálezom sú zvlášť zodpovedajúce liečivá ako inhibitory na ošetrovanie chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou Λν$₆ integrínových re ceptorov, zvlášť patogénnych angiogénnych chorôb, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, “osteoporózy,— zápalov,— infekcií ako tiež naovplyvňovanie procesu hojenia rán.

Vynález sa taktiež týka vhodných farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú aspoň jedno liečivo všeobecného vzorca I a prípadne nosič a/lebo excipienty.

Vynález sa ďalej týka použitia peptidových zlúčenín a/lebo ich fyziologicky prijateľných solí podľa vynálezu a návodu na výrobu liečiv na liečenie porúch, ktoré sú nepriamo alebo priamo založené na expresii v ₆ integrínového re ceptoru, čo platí zvlášť pre patologické angiogénne poruchy,

trombózy, srdcový infarkt, koronárne	poruchy	srdca, arte-
riosklerózu,	nádory,	osteoporózu,	zápal,	infekcie a na
ovplyvňovanie	liečenia	rán.
Liečivá	podľa	vynálezu,	prípadne	farmaceutické

prostriedky,ktoré ich obsahujú, sa môžu používať v humánnej a vo veterinárnej medicíne. Ako nosiče prichádzajú do úvahy anorganické alebo organické látky, ktoré sú vhodné na enterálne ( napríklad orálne) alebo parenterálne alebo topické podávanie alebo na podávanie vo forme inhalačných sprejov a ktoré nereagujú so zlúčeninami všeobecného vzorca I, ako sú napríklad voda, rastlinné oleje, benzylalkoholy, alkenylglykoly, polyetylénglykoly, glyceríntriacetát, želatína, uhľohydráty, ako laktóza alebo škroby, stearát horečnatý, mastik a vazelína. Na orálne použitie sa hodia zvlášť tablety, pilulky, potiahnuté tablety, kapsuly, prášky, granule, sirupy, šťavy alebo kvapky, na rektálne použitie čipky, na parenterálne použitie roztoky, zvlášť olejové alebo vodné roztoky, ďalej suspenzie, emulzie alebo implantáty, na topické použitie masti, krémy alebo púdre. Zlúčeniny podľa vynálezu-sa - tiež -môžu-lyofil-i-zovať a- - získané-lyof ilizáty sa môžu napríklad používať na prípravu vstrekovateľných prostriedkov. Prostriedky sa môžu sterilizovať a/lebo môžu obsahovať pomocné látky, ako sú klzné činidlá, konzervačné, stabilizačné činidlá a/lebo zmáčadlá, emulgátory, soli na ovplyvňovanie osmotického tlaku, pufre, farbivá, chuťové prísady a/lebo ešte jednu ďalšiu alebo ešte niekoľko ďalších účinných látok, ako sú napríklad vitamíny.

Na podávanie vo forme inhalačných sprejov sa účinná látka rozpúšťa alebo suspenduje v hnacom plyne alebo v zmesi hnacích plynov ( ako sú napríklad oxid uhličitý alebo fluórchlorované uhľovodíky). V takom prípade sa pritom používa účinná látka v mikronizovanej forme, pričom sa môže pridávat aspoň jedno fyziologické kompatibilné rozpúštadlo, napríklad etanol. Inhalačné roztoky sa môžu podávat za použitia známych zariadení na tento účel.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podlá vynálezu sa spravidla používajú v dávkach podobných ako obchodne známe peptidy, zvlášt podobne ako zlúčeniny podlá amerického patentového spisu číslo 4 472305, výhodne v dávke približne 0,05 až 500 mg, zvlášt 0,5 až 100 mg na dávkovaciu jednotku. Denná dávka je výhodne približne 0,01 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti. Určitá dávka pre každého jednotlivého jedinca závisí od najrôznejších faktorov, napríklad od účinosti určitej použitej zlúčeniny, od veku, telesnej hmotnosti, všeobecného zdravotného stavu, pohlavia, strave, od okamihu a cesty podania, od rýchlosti vylučovania, od kombinácie liečiv a od závažnosti určitého ochorenia. Výhodné je parenterálne podávanie.

Vynález £a taktiež týka zlúčenín všeobecného vzorca I, ktoré sa môžu používať v analytickej biológii a v molekulárnej biológii. Nové zlúčeniny všeobecného vzorca I, kde znamená X skupinu fluorescenčného farbiva, viazanú prostredníctvom -CONH, -C00, -NH-C(=S)-NH, -NH-C(=0)-NH,

-SO₂NH alebo -NHCO väzbou, sa môžu používať ako diagnostické markery v technike FACS (Fluorescence Activated Celí Sorter) a vo fluorescenčnej mikroskopii.

Použitie značených zlúčenín vo fluorescenčnej mikroskopii je opísané v literatúre ( napríklad Y. -L.Wang a D.L. Taylor, Fluorescecne Microskopy of Living Cells in

Culture, časť A+B, Academic Press, Inc. 1989).

Nové zlúčeniny podlá vynálezu sa tiež môžu používať ako integrované Ugandy na výrobu stĺpcov pre afinitnú chromatografiu na výrobu čistých integrínov. Komplex Avidinom derivatizovaného nosiča, napríklad Sepharose, a nových zlúčenín všeobecného vzorca I sa tvorí známym spôsobom ( ako opisuje napríklad E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Ako polymérne nosičové materiály sú na tento účel vhodné polymérne pevné fázy, známe z chémie peptidov výhodne s hydrofílnymi vlastnosťami, napríklad zosietené polycukry, ako sú celulóza, Sepharose alebo Sephadex ^R, akrylamidy, polymér na poly etylénglykolovej báze alebo Tentakelpolyméry^R.

Vynález zahŕňa tiež obsahujú úseky, ktoré peptidické štrukturálne rekombinantné DNA-sekvencie, ktoré kódujú oblasti peptidov majúcich motívy podlá vynálezu.

Také DNA sa môžu prenášať časticami na bunky, ako opisuje Ch. Andree a kol. (Proc.Natl.Acad. Sci. 91, str. 12188 až 12192, 1994) alebo môžu zvyšovať transfer na bunky inými pomocnými činidlami, ako sú lipozómy (A.I. Aronsohn a J.A. Hughes, J.Drug Targeting 5, str. 163 až 169, 1997).

Transfer takej DNA by sa preto mohol použiť v kvasniciach prostredníctvom Bacculovírov alebo v bunkách cicavcov na redukciu peptidických látok.

Ak sa infikuje živočíšny alebo ludský organizmus takou rekombinantnou DNA, môžu sa viazať infikovanými bunkami nakoniec vytvorené peptidy podľa vynálezu bezprostredne na ŕtv (i ₆-integrínový receptor, napríklad na nádorové bunky a môžu ich blokovať.

Zodpovedajúca rekombinantná DNA, ktorá s môže pripraviť známymi a bežnými spôsobmi, môže byť ale tiež vo forme vírusovej DNA, ktorá obsahuje úseky, ktoré kódujú vírusový obalový proteín. Infekciou hostiteľského organizmu takými rekombinantnými, zvlášť nepatogénnymi vírusmi, sa môžu hostiteľské bunky, ktoré expresujú integrín νβθ výhodne napádať (cieľovanie).

Vhodnými vírusmi sú napríklad adenovírusy, ktoré sa často používajú ako vektory pre cudzie gény v bunkách cicavcov. Pre svoje rôzne vlastnosti sa hodia pre génovú terapiu, ako uvádza S.J. Watkins a kol. (Gene Therapy 4, str. 1004 až 1012, 1997) a tiež J.Engelhard a kol.(Hum. Gene Ther. 4, str. 759 až 769, 1993). Ako uvádza A. Fasbender a kol. (J. Clin. Invest. 102, str. 184 až 193, 1998), je spoločným problémom génovej terapie vírusovými a nevírusovými vektormi obmedzená účinnosť transferu génu. Vyššie opísanou prídavnou ligandovou sekvenciou pre integrín v obalovom proteíne adonovírusov sa môže dosiahnuť zlepšenie transferu, napríklad cystický fibrózový transmembránový regulátor vodivosti (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulátor, CFTR) cDNA.

Podobne ako opisuje T. Tanaka a kol. (Cancer Research

58, str. 3362 až 3369, 1998), sa môžu využiť namiesto DNA pre angiostatín tiež DNA pre sekvencie podľa vynálezu na transfekciu buniek prostredníctvom retrovírusových alebo adenovírusových vektorov.

Peptidy podľa vynálezu sa môžu používať tiež v komplexe lipozómov zo systému lipid/peptid/DNA vyrobenom na transfekciu bunečných kultúr z lipozómového komplexu skladajúceho sa zo systému lipid/DNA ( bez peptidu) na použitie v génovej terapii ľudí. Prípravu komplexu lipozómov zo systému lipid/DNA/peptid opísal napríklad S.L.Hart a kol. (Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Targeting Vector, Human Gene Therapy 9, str.575 až 585, 1998).

Môže sa pripravovať lipozómový komplex lipid/peptid/DNA, napríklad z naseldujúcich zásobných roztokov : 1 Aig/ul lipofektínu ( ekvimolárna zmes DOTMA (=N-£1-(2,3-dioleyloxy)pro pylj-Ν,Ν,Ν-trimetylamóniumchlorid) a DOPE (dioleylfosfátidy letanolamín ) , 10 /ug/ul plazmidu DNA a 100 zig/ml peptidu. Preto sa ako DNA, tak peptid rozpúšťajú ’ v bunečnom kultivačnom prostredí.

Komlpex liopzómov sa pripraví zmiešaním týchto troch zložiek v určitom hmotnostnom pomere ( lipid:DNA:peptid, napríklad 0,75 :1 :4). Komplex lipozómov a DNA je už opísaný pre génovú terapiu ľudí (Caplen N. J. a kol., Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Náture Medicíne 1, str. 39 až 46, 1995).

Vynález sa preto tiež týka použitia zdpovedajúcim spôsobom modifikovanej rekombinantnéj DNA z gén uvoľňujúcich systémov, zvlášť zo systému vírus-DNA, na ošetrovanie chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou /v θ integrinových receptorov, zvlášť patogénnych angiogénnych chorôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií, ako aj na ovplyvňovanie procesov hojenia rán.

Vynález vysvetľujú, no nijako neobmedzujú nasledujúce príklady praktického realizovania. Teploty sa uvádzajú vždy v stupňoch Celzia.

Chromatografická HPLC analýza ( retenčná doba R_t) sa realizuje s použitím nasledujúcich systémov:

Stĺpec 5 /um LichroSpher 60 RP-Select B ( 250-4) s 50 minútovým gradientom od 0 do 80 % 2-propanolu vo vode/0,3 % trifluóroctovej kyseliny za toku 1 ml/min a za detekcie pri 215 nm.

Hmotová spektrometria (MS): El ( elektrónová rázová ionizácia) M⁺, FAB ( bombardovanie rýchlymi atómami) (M + M) ⁺ .

Príklady realizácie vynálezu

Príklad 1

Príprava a čistenie peptidov podľa vynálezu

Peptidy podľa vynálezu sa v podstate pripravujú a čistia použitím Fmoc-stratégie za chránenia ku kyseline labilných bočných reťazcov na živiciach labilných ku kyseline s využitím obchodne dostupných kontinuálnych (continuous flow) syntetizérov peptidov podľa opisu Haubnera a kol. (J.Am.Chem. Soc. 118, str 17703, 1996).

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Äsp-Ser-Leu-Arg-NH₂

Dvakrát sa následne podrobí 2 g amínoxantenyloxypolystyrénovej živice (Novabiochem 0,37 mmol/g) kopulačnému stupňu s použitím 0,50 g TBTU, 0,53 ml etyldiizopropylamínu a Fmoc-amínokyseliny v dimetylformamide vždy v obchodnej syntéznej aparatúre a známym spôsobom ( aparatúra a príručka Milligen 9050 PepSynthetizer™, 1987) v každom prípadne počas 30 minút. Premytie sa robí v dimetylformamide počas 10 mnút, štiepenie v systéme piperidín/dimetylformamid ( objemovo 1 :

4) počas 5 minút a N-koncová acylácia ( uzatvorenie) sa realizuje s použitím systému acetánhydrid/pyridín/dimetylformamid ( objemovo 2:3 : 15) počas 15 minút. Používajú sa aminokyseliny Fmoc-Arg (Pmc), potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Ser(But), potom Fmoc-D-Asp (OBut), potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Asp (OBut), tiež Fmoc-Gly a nakoniec Fmoc-Arg (Pmc). Po odstránení chrániacej skupinu Fmoc z Fmoc-Arg (Pmc)-Gly-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pmc)amínoxantenyloxypolysyrénovej živice sa opä£ urobí acylácia. Po premytí DMF a izopropanolom a následnom vysušení vo vákuu pri teplote miestnosti sa získa 2,8 g

Ac-Arg-(Pmc)-Gly-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg (Pmc) -amínoxantenyloxypolysyrénovej živice. Spracovaním tejto peptidylovej živice 20 ml systému kyselina trifluóroctová/voda/TIS ( objemovo 94 : 3 : 3) počas 2 hodín pri teplote miestnosti, filtráciou, skoncentrovaním vo vákuu a trituráciou s dietyléterom sa získa 0,47 g Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂ ( kód EMD 272974).

Produkt sa čistí chromatografiou RP-HPLC na Lichro 25 sorbe RP 18 ( 250 - 25, 7 Aim, Merck KGaA) v 0,3 % trifluóroctovej kyseline za použitia gradientu 4 % až 24 % 2propanolu počas jednej hodiny pri prietoku 10 ml/min a eluát sa hodnotí UV prietokom fotometrom pri 215 a 254 nm. Získa sa

168 mg produktu:

Rt /sic/ 15,5 min, FAB 973

Podobne sa pripravia nasledujúce zlúčeniny:

! / K od' (EMD)	Sekvencia	MW (g/mol)	FAB	Rt [sic]

271277	Ac-RADLDSLR-NH₂	986,1	986,6	18,18
271315	Ac-RGDLdsLR-NH₂	972,1	972.6	15.7
272973	Ac-RaDLDSLR-NH₂	986,1	986,6	16,39
271294	Ac-RSDLDSLR-NH₂	1002,1	1002	18,28
271296	Ac-RVDLDSLR-NH₂	1014,2	1014	19,68
271295	Ac-RYDLDSLR-NH₂	1078,2	1078,6	19,58
271297	Ac-RGDLDSLR-NH₂	972,1	972	16,83
271298	Ac-RHDLDSLR-NH₂	1052_y2	1052	17^10
271299	Ac-RRDLDSLR-NH₂	1071,2	1071	16 *50
271300	Ac-RDDLDSLR-NH₂	1030,1	1030	16,95
	Ac-RGDLdGLR-NH₂			/
	Ac-RGDLdALR-NH₂
271293	Ac-RTDLDSLR-NH₂	1016,1	1017	17,67
271265	AC-RTDLDSLA-NH2	931^0	931,6	18,15
271266	Ac-RTDLDSAR-NH₂	974,0	974,6	14,43
271267	Ac-RTDLDALR-NH₂	1000,1	1000,6	18,64
271268	Ac-RTDLASLR-NH₂	972,1	972,6	18,42
271270	Ac-RTDADSLR-NH₂	974_f 0	974,6	14,95
271273	Ac-RTALDSLR-NH₂	972,1	972,6	18,95
271277	Ac-RADLDSLR-NH₂	986,1	986,6	18,18

2ώ

271283	Ac-ATDLDSLR-NH₂	931,0	931,5	18,75
271285	Ac-RTDLDSLr~NH₂	1016,1	1017.	17,38
271286	Ac-RTDLDS1R-NH₂	1016,1	1017	17,22
271287	Ac-RTDLDsLR-NH₂	1016,1	1017	16,98
271288	Ac-RTDLdSLR-NH₂	1016,1	1017	17,70
271289	Ac-RTD1LDSLR-NH₂	1016,1	1017	17,31
271290	Ac-RTdLDSLR-NH₂	1016,1	1017	17,72
271291	Ac-RtDLDSLR-NH₂	1016.1	1017	16,84
271292	Ac-rTĽLDSLR-NH₂	1016_fl	1017	18,07
271577	Ac-RTELDSLR-NH₂	1030_?2	1030.,6	17 ,27
271309	Ac-RTDLaSLR-NH₂	972 _?1	973	17,03
271317	Ac.-RTDL- (D-Phg) -SLR-NH₂ '	1034,2	1034,7	19,86
271318	Ac-RTDLfSLR-NH₂	1048.,2	1049	22 ,66
271319	AC-RTDL-(D-Nal)-SLR-NH₂	1098,3	1099	26,38
271320	Ac-RTDLGSLR-NH₂	958,1	958,6	16,74.
271321	Ac-RTDL-Aib-SLR-NH₂	986,1	986	19,63
271322	Ac-RTDLpSLR-NH₂	998,2	998,6	18 .,23
271575	Ac-RTDLPSLR-NH₂	998,2	998,5	17,30
271576	AC-RTDL-(D-Bgl)-SLR-NH₂	1014,2	1014,6	20,06'
271310	Ac-RTDLdSLA-NH₂	931,0	931,5	18,20
271311	Ac-RTDLdSAR-NH₂	974,0	974,6	14,59
271547	Ac-RTDLdSPR-NH₂	1000.,1	1000.4 — - f______	13,26
271573	Ac-RTDLdSFR-NH₂	1050,1	1050.5	16,82
271574	Ac-RTDLdSlR-NH₂	1016,1	1016,5
249381	Ac-RTDFdSLR-NH₂	1050,1	1050,5	17,04
249383	Ac-RTDldSLR-NH₂	1016 ,1	1016,5	16,22
249385	Ac-RTD-Nle-dSLR-NH₂	1016,1	1016,5	17,03
271314	Ac-RTDLdsLR-NH₂	1016,1	1016,8	15 ,4
271303	Ac-Om- RDLDSLR -NH₂	974,1	974	16 ,26
271308	Ac-Har-TDLDSLR-NH₂	1030,1	1030	17,66
27Í302	AC-HTDLDSLR-NH₂	997,1	997	l⁷-7.² 8
271301	Ac-KTDLDSLR-NH₂	988,1	988	16,46
271323	Ac-RTDLdLR-NH₂	929,1	929	15,95
271324	Ac-RTDLdGLR-NH₂	986,1	986	16,66
271325	Ac-RTDLd-pAla-LR-NH₂	1000,1	1000	15,92
271327	Ac-RTDLd-Abu-LR-NH₂	1014,1	1014	16,43
272975	í Ac-RTDLDSLG-NH₂	916.,9	917	16,19
271329	Ac-RTDLDSLF-NH₂	1007,1	1007	24,23

271332	Ac-RTDLDSLD-NH₂	975,0	975	16,40
271336	Ac-RTDLDSLL-NH₂	973,1	973	23,51
271339	Ac-RTDLDSLS-NH₂	947,0	947	16,54
271343	Ac-RTDLDSLK-NH₂	988,1	988	16,36
271346	Ac-RTDLDSLY-NH₂	1023.1	1023	18,98
271350	Ac-RTDLDSL-Orn-NH₂	974,1	974	15,84
271355	Ac-RTDLDSL-Har-NH₂	1030,1	1030	17,55
271316	Ac-RTDLDGLR-NH₂	986,1	986,7	17,55
	Ac-RTDLdALR-NH₂
272974	Ac-RGDLdSLR-NH₂	972,1	973	16,4

Nomenklatúra aminokyselín sa riadi smernicou Eur. J.

Biochem. 138, str. 9 až 37, 1984.

index = D-amínokyselina

Príklad 2

Test receptorového viazania systému v ₆/fibronektín

Vyrobené peptidy podľa vynálezu sa viažu v roztoku spolu s konkurenčne pôsobiacim fibronektínom na imobilizovaný v g receptor a zisťuje sa hodnota Q ako miera selektivity viazania skúšaného peptidu na v ₆. Hodnota Q sa vypočítava z kvocientu hodnoty IC₅q testovaného peptidu a štandardu. Ako štandard sa použil lineárny Ac-RTDLDSLR-NH₂ ( kód EMD 271293 ) ( lit./patent porovnaj Pytela a kol., Science 231, str.

1559, 1986).

Skúška viazania sa realizuje nasledujúcim spôsobom:

Imobilizácia rozpustného v ₆ receptoru na mikrotit račných doštičkách prebieha po zriedení proteínového roztoku v TBS+ + a následnej inkubácii cez noc pri teplote 4 ⁰ C (

100 /ul/jamka). Nešpecifické miesta viazania sa blokujú inkubáciou ( dve hodiny pri teplote 37 ⁰ C) s 3 % (hmotnosť/objem) BSA v TBS + + ( 200 /ul/jamka).'Nadbytok BSA sa odstráni trojitým premytím TBSA+ + . Peptidy sa sterilné ( 1 : 10) v TBSA+ + zriedia a inkubujú sa s imobilizovným integrínom ( 50 /ul peptidu + 50 /ul ligandu na jamku, dve hodiny pri teplote 37 ⁰ C) spolu s biotinylovaným fibronektínom 2 mg/ml. Neviazaný fibronektín a peptidy sa odstránia trojitým premytím TBSA+ + . Detekcia viazaného fibronektínu sa realizuje inkubáciou ( jednu hodinu pri teplote 37° C) s alkalickou fosfatázou kopulovanou s antibiotínovou protilátkou (Biorad) ( 1 : 20000 v TBSA+ + , 100/Ul/ jamka). Po trojitom premytí TBSA+ + sa realizuje kalorimetrické zistenie inkubácie ( 10 až 15 minút pri teplote 25° C v tme) s roztokom substrátu ( 5 mg nitrofenylfosfátu, 1 ml etanolamínu, 4 ml vody, 100 /Ul/jamka). Enzýmová reakcia sa ukončí pridaním 0,4 M roztoku hydroxidu sodného ( 100/ul/ jamka. Farebná intenzita sa stanovuje pri 405 nm v meracom zariadení ELISA a porovnáva sa s nulovou hodnotou. Ako nulová hodnota sa používajú jamky nepotiahnuté receptorom. Ako štandard sa používa Ac-RTDLDSLR-NH₂. Hodnoty I^cso P^retestované peptidy sa odčítajú z grafu a z nich spolu s IC₅₀ hodnotou štandardného peptidu sa zisťuje hodnota Q peptidu podľa vynálezu.

Hodnota Q = IC₅₀ testovaného peptidu/IC₅₀ štandardu.

Hodnota Q sa vypočíta ako stred opakovaných testov.

Výsledky opísaného testu sú v nasledujúcej tabuľke.

Tabuľka II

Výsledky «ύν/Jg/f ibronektínového receptorového testu viazania

1—-------- Kod (EMD)	Sekvencia	Q ’ hodn^ = IC₅₀test· peptid . / IC₅₀ EMD 271293

271293	Ac-RTDLDSLR-NH₂	1,00 (=75 nM)
272974	Ac-RGDLdSLR-NH₂	0^15
271297	Ac-RGDLDSLR-NH₂	0,22
271294	Ac-RSDLDSLR-NH₂	3_Z2
271300	Ac-RDDLDSLR-NH₂	14
271299	Ac-RRDLDSLR-NH₂	15
271296	Ac-RVDLDSLR-NH₂	16
271291	ÄC-RtDLDSLR-NH₂	20
271295	Ac-RYDLDSLR-NH2	30

271298	Ac-RHDLDSLR-NH₂	30
271277	Ac-RADLDSLR-NH₂	31
272973	Ac-RaDLDSLR-NH₂	98
271265	Ac-RTDLDSLA-NH₂	7
271266	Ac-RTDLDSAR-NH₂	60
271270	Ac-RTDADSLR-NH₂'	60
271285	Ac-RTDLDSLŕ-NH₂	1
271286	Ac-RTDLDS-(D-Leu)-R-NH₂	10
271288	Ac-RTDLdSLR-NH₂	0,08
271289	Ac-RTD-(D-Leu)-DSLR-NH₂	40
271290	Ac-RTdLDSLR-NH₂	15
271292	Ac-rTDLDSLR-NH₂	7
271308	Ac-Har-TDLDSLR-NH₂	20
271302	Ac-HTDLDSLR-NH₂	70
271301	Ac-KTDLDSLR-NH₂	110
271303	Ac-Orn-TDLDSLR-NH₂	190
271309	Ac-RTDLaSLR-NH₂	O.;16
271321	Ac-RTDL-Aib-SLR-NH₂	O₇4
271319	Ac-RTDL-(D-Nal)-SLR-NH₂	0,7
271320	Ac-TRDLGSLR-NH₂	1
271268	Ac-RTDLASLR-NH₂	1
271318	Ac-RTDLfSLR-NH₂	AaÍ
271317	Ac-RTDL-(D-Phg)-SLR-NH₂
271576	Ac-RTDL-(D-Bgl)-SLR-NH₂	71
271575	Ac-RTDLPSLR-NH₂	157
271322	Ac-RTDLpSLR-NH₂	182
249385	Ac-RTD-Nle-dSLR-NH₂	0,15
249383	Ac-RTDldSLR-NH₂	0,6
249381	Ac-RTDFdSLR-NH₂	Tú
271287	Ac-RTDLDsLR-NH₂	0,45
271267	Ac-RTDLDALR-NH₂	0,8
271316	Ac-RTDLDGLR-NH₂	0..95
271323	Ac-RTDLdLR-NH₂	273
271355	Ac-RTDLDSL-Har-NH₂	_

271343	Ac-RTDLDSLK-NH₂	2,2
271336	Ac-RTDLDSLL-NH₂	4,4
271350	Ac -RTDLDSL-Orn-NH₂	4,5
271329	Ac-RTDLDSLF-NH₂	5,5
271265	Ac-RTDLDSLA-NH₂	7
271346	Ac-RTDLDSLY-NH₂	8.5
272975	Ac-RTDLDSLG-NH₂	12
271339	Ac-RTDLDSLS-NH₂	13
271332	Ac-RTDLDSLD-NH₂	51
271314	Ac-RTDLdsLR-NH₂	0,.26
271310	Ac-RTDLdSLA-NH₂	0,47
271324	Ac-RTDLdGLR-NH₂	b¹
271574	Ac-RTDLdSlR-NH₂	Ó
271573	Ac-RTDLdSFR-NH₂	2_f4
271311	Ac-RTDLdSAR-NH₂	13
271325	Ac-RTDLd-PAla-LR-NH₂	18
271327	Ac-RTDLd-Abu-LR-NH₂	33

príklady vysvetľujú farmaceutické

Nasledujúce prostriedky:

Príklad A. Injekčné ampulky

Roztok 100 g účinnej látky všeobecného vzorca I a 5 g dinatriumhydrogénfosfátu v 3 1 dvakrát destilovanej vody sa nastaví 2n kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 6,5, sterilné sa sfiltruje a plní do injekčných ampuliek, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a sterilné sa ampulky uzavrú. Každá injekčná ampulka obsahuje 5 mg účinnej látky.

Príklad B. Čipky

Roztaví sa zmes 20 g účinnej látky všeobecného vzorca I so 100 g sójového lecitínu a 1400 g kakaového masla, vleje sa do formičiek a nechá sa vychladnúť. Každý čípok obsahuje 20 mg účinnej látky.

Príklad C. Roztok

Pripraví sa roztok 1 g účinnej zlúčeniny všeobecného vzorca I, 9,38 g dihydrátu natriumdihydrogénfosfátu, 28,48 g dinatriumhydrogénfosfátu s 12 molekulami vody a 0,1 g benzalkonium-chloridu v 940 ml dvakrát destilovanej vody. Hodnota pH roztoku sa upraví na 6,8, doplní sa na jeden liter a sterilizuje sa ožiarením. Tento roztok možno používať ako očné kvapky.

Príklad D. Masť

500 mg účinnej látky všeobecného vzorca I sa zmiesi s 99,5 g vazelíny za aseptických podmienok.

Príklad E. Tablety

Zo zmesi 1 kg účinnej látky všeobecného vzorca I,. 4 kg laktózy, 1,2 kg zemiakového škrobu, 0,2 kg mastika a 0,1 kg stearátu horečnatého sa obvyklým spôsobom vylisujú tablety, tak, že každá tableta obsahuje 10 mg účinnej látky.

Príklad F. Potiahnuté tablety

Podobne ako podľa príkladu E sa vylisujú tablety, ktoré sa potom obvyklým spôsobom potiahnu povlakom zo šachatózy, zemiakového škrobu, mastika, tragantu a farbiva.

Príklad G. Kapsuly

Známym spôsobom sa plní do kapsulí z tvrdej želatíny 2 kg účinnej látky všeobecného vzorca I tak, že každá kapsula obsahuje 20 mg účinnej látky.

Príklad H. Ampuly

Roztok 1 kg účinnej látky všeobecného vzorca I v 60 1 dvakrát destilovanej vody sa sterilné sfiltruje a plní sa do ampúl, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a sterilné sa ampuly uzavrú. Každá ampula obsahuje 10 mg účinnej látky.

Príklad I. Inhalačný sprej

Rozpustí sa 14 g účinnej látky všeobecného vzorca I v 10 1 izotonického roztoku chloridu sodného a plní sa do bežných obchodných nádob na striekanie s pumpovým mechanizmom. Roztok sa môže striekať do úst alebo do nosa. Každý vstrek ( približne 0,1 ml) zodpovedá dávke približne 0,14 mg.

Priemyselná využiteľnosť

Peptidické zlúčeniny, ktoré ako ligand integrínu v ₆sú vhodné na výrobu farmaceutických prostriedkov na ošetrovanie chorôb založených na expresii a na patologickej funkcii v ₆ integrínových receptorov.

Priemyselná využiteľnosť

Peptidické zlúčeniny, ktoré ako ligand integrínu v θ sú vhodné na výrobu farmaceutických prostriedkov na ošetrovanie chorôb, založených na expresii a na patologickej funkcii v ₆ integrínových receptorov.

7p A *22.-200/

Claims

1. Peptidové zlúčeniny všeobecného vzorca I

Ac-Arg-X¹-Asp-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-NH₂ (I) kde znamená

Ac acetylovú skupinu,

X¹ Ser, Gly, Thr, Asp, Arg, Val, Tyr, His alebo Ala,

X² Leu , íle , Nie , Val alebo Phe, x³ Asp, Glu, Lys, Phe, Aib, Nal, Gly, Ala, Bgl alebo Phg, x⁴ Gly, Ala, Ser, ó^Ala l alebo Abu, x⁵ Leu, íle, Nie, Val alebo Phe, x⁶ Arg, Asp, Har, Lys, Leu, Orn, Phe, Ala, Tyr, Gly, Ser alebo

ako ligandy integrínu v ₆, ktoré sú biologicky aktívne, pričom uvedené aminokyseliny môžu byť derivatizované, amínokyselinové zvyšky sú vzájomne viazané peptidovým sôsobom prostredníctvom úŕ-amínoskupín a ©č-karboxylových skupín včítane D a L foriem a opticky aktívnych amínokyselinových zvyškov a ich fyziologicky prijateľných solí, pričom je vylúčený Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂·

2. Peptidové zlúčeniny podľa nároku 1 všeobecného vzorca I, zo súboru zahŕňajúceho

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂,

Ac-Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH^, Ac-Arg-Ser-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Asp-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Ala-NH₂,

Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-D-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂/ Ac-D-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg“Thr-Asp-Leu-D-Ala-Ser“Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Aib-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Nal-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Ala-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Nle-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, 'Äc-Aŕg-Thr-Asp-Ile-D-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-D-Ser-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Har-NH₂, Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-NH2/ Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-D-Ser-Leu-Arg-ŇH₂, Ac-Arg-Thr~Asp-Leu-D-Asp-Ser-Leu-Ala-NH2, Ac-Arg-Thr-'Asp-Leu-D-Asp-Gly-Leu-Arg-NH₂, a ich fyziologicky prijateľné soli.

3. Peptidové zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku

1 a podľa nároku 2 a ich fyziologicky prijateľné soli ako liečivá.

4. Liečivá podľa nároku 3 ako inhibitory na ošetrovanie chorôb, ktoré sú založené na expresii a na patologickej funkcii v θ integrinových receptorov.

5. Liečivá podľa' nároku 4 na ošetrovanie trombóz, srdcového infarktu, koronárnych chorôb srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, fibróz, zápalov, infekcií, lupienky, ako aj na ovplyvnenie hojenia rán.

6. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci satým, že obsahuje aspoň jedno liečivo podľa nároku 4 a 5 a prípadne nosič a/lebo pomocnú látku a prípadne iné účinné látky.

7. Použitie peptidických zlúčenín podľa nároku 1 a 2 a/lebo ich fyziologicky prijateľných solí na výrobu liečiva na ošetrovanie chorôb, ktoré sú založené na expresii a patologickej funkcii Λ v integrinových receptorov.

8. Použitie peptidových zlúčenín podľa nároku 7 na výrobu liečiva na ošetrovanie trombóz, srdcového infarktu, koronárnych chorôb srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, fibróz, zápalov, infekcií, lupienky, ako aj na ovplyvnenie hojenia rán.