CN116693622A - 基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用 - Google Patents

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CN116693622A CN202310413039.5A CN202310413039A CN116693622A CN 116693622 A CN116693622 A CN 116693622A CN 202310413039 A CN202310413039 A CN 202310413039A CN 116693622 A CN116693622 A CN 116693622A
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Abstract

本发明公开了基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用，属于医药技术领域。其为通式1所示的化合物及其药学上可接受的盐或酯，GFKX1LLKX2X3AKX4LVKX5VLF通式1，其中，X1表示半胱氨酸或酪氨酸；X2表示半胱氨酸或甘氨酸；X3表示半胱氨酸或丙氨酸；X4表示半胱氨酸或丙氨酸；X5表示半胱氨酸或苏氨酸；片段中成对的半胱氨酸通过卤素巯基点击化学反应进行环合。本发明还公开了上述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法及应用。本发明结构更加稳定，生物活性更好，酶稳定性和抗肿瘤活性更高。

Description

基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用，属于医药技术领域。
背景技术
癌症一直以来都是困扰人类健康问题的重大疾病，对家庭及社会造成巨大的经济负担。目前为止，全球因癌症死亡的病例超过千万人。在女性患者中，乳腺癌已超过肺癌成为最常见的癌症，预估新增病例230万(11.7％)，其次是肺癌(11.4％)、结直肠癌(10.0％)、前列腺癌(7.3％)和胃癌(5.6％)。癌症死亡率居高不下，主要原因为缺乏有效的治疗手段。手术治疗往往伴随复发率高、易转移等问题，而且往往需要配合化疗药物治疗。常见的化疗药物有丝裂霉素、阿霉素和5-氟尿嘧啶。由于化疗药物选择性较差，会对邻近正常细胞造成损伤。因此，开发新型的抗药药物仍是目前药物化学领域的研究热点。
从北美尾蛙Ascaohustruei的去甲肾上腺素刺激的皮肤分泌物中分离得到的Ascaphin-8(GFKDLLKGAAKALVKTVLF-NH2)是一种含有19个氨基酸残基的C-末端的α-螺旋肽。之前的研究表明Ascaphin-8可以抑制白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，并且可以裂解人的红细胞。此外，Ascaphin-8还具有潜在的抗肿瘤活性，对人HepG2肝癌衍生细胞的生长具有抑制作用。因此，Ascaphin-8可以作为潜在的抗肿瘤化合物。然而，线性肽具有容易被体内蛋白酶水解、穿膜性能较差和构象不稳定的劣势，需要对其进行进一步化学结构优化。
申请号为202110003547.7的中国发明专利公开了一种基于全碳氢订书化策略的A4K14-Citropin1.1优化方法。然而，其合成中采用了价格昂贵的非天然氨基酸Fmoc-S5-OH为合成原料，并且采用了过渡金属催化剂进行环合，造成了重金属的引入，无法大规模生产。
鉴于此，有必要提供一种新结构的抗肿瘤活性化合物，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，是提供基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物。
本发明解决上述问题的技术方案如下：基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，为通式1所示的化合物及其药学上可接受的盐或酯，
GFKX1LLKX2X3AKX4LVKX5VLF
通式1，其中，X1表示半胱氨酸或酪氨酸；X2表示半胱氨酸或甘氨酸；X3表示半胱氨酸或丙氨酸；X4表示半胱氨酸或丙氨酸；X5表示半胱氨酸或苏氨酸；片段中成对的半胱氨酸通过卤素巯基点击化学反应进行环合。
本发明为了得到上述基Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，进行了如下工作：
第一步，对芳香硫醚订书肽进行设计，确定原始直链肽的关键残基为K3、K7、K11和K14，将除关键残基外的氨基酸残基定位订书位点。
第二步，对可能的氨基酸侧链偶联反应进行筛选，排除了需要金属离子催化的如Click反应等、反应条件剧烈不适合固相化学的如Heck偶联反应等，最终挑选了条件温和、仅需碱催化的卤素-巯基点击化学反应为订书反应。
第三步，对所设计的用于订书化修饰的前体直链肽进行固相合成，并采用HPLC对其进行纯化，获得纯品订书肽前体。随后纯品订书肽前体在液相中与溴代芳香化合物进行卤素-巯基点击化学反应，从而获得芳香硫醚订书肽抗肿瘤活性化合物。
综上，本发明采用芳香硫醚订书化修饰策略，通过卤素-巯基点击化学反应，采用廉价的溴代芳香化合物，将天然半胱氨酸进行偶联，从而得到了芳香硫醚结构的系列订书肽。本发明不仅在合成方法上避免了传统订书肽策略中使用的昂贵非天然氨基酸原料以及含有重金属离子的催化剂的缺陷，并且依然保持了传统订书肽提高多肽结构刚性和巩固α螺旋构型的优点，使得这些芳香硫醚订书肽具有更强的细胞渗透性、更好的酶稳定性以及更高的抗肿瘤活性。
通式1所示基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的N末端的氨基和C末端的羧基以及氨基酸侧链基团可以不进行修饰，也可以在基本不影响本发明基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物活性的前提下进行修饰。本发明Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物N末端的氨基进行乙酰化修饰，即是-Ac，C末端的羧基进行酰胺化修饰，即是-NH2。
本发明所使用的Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物及氨基酸和化学基团的表示方法均为所属领域公认的表示方法，其中氨基酸的缩写可参照表1中的定义。在本文中，若不特别指出，氨基酸一般指L-型的氨基酸。
表1氨基酸缩写表
氨基酸 三字母缩写 一字母缩写 氨基酸 三字母缩写 一字母缩写
丙氨酸 Ala A 亮氨酸 Leu L
苯丙氨酸 Phe F 赖氨酸 Lys K
丝氨酸 Ser S 半胱氨酸 Cys C
甘氨酸 Gly G 异亮氨酸 Ile I
缬氨酸 Val V
表2小分子化合物的名称、结构式和分子量
“药物上可接受的盐”指一些小分子酸性或碱性化合物与多肽形成的盐，一般能够增加多肽的溶解性，所形成的盐基本上不改变多肽的活性。
本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的有益效果是：
本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，结构更加稳定(螺旋度为18％-49％)，生物活性更好(IC50由9.33μM提升至2.99μM)，酶稳定性(3h时A8-4-Dp提升了3倍)和抗肿瘤活性更高，显著抑制肿瘤细胞的迁移，促进肿瘤细胞的凋亡(大于50％)，更加适用于癌症病人安全用药。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述通式1化合物选自如下结构中的任意一种：
采用上述进一步的有益效果是：上述为优选结构，得到的基于基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的性能更佳。其中，式2-式16的命名，详见表3。
本发明的目的之二，是提供上述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法。
本发明解决上述问题的技术方案如下：上述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法，包括如下步骤：
氨基酸α-氨基用9-芴基甲氧羰基保护，并对氨基酸进行侧链保护：Lys的侧链保护基为叔丁氧羰，Asp的侧链保护基为叔丁酯，Thr的侧链保护基为叔丁基，以含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液为脱保护试剂，清洗两次树脂以脱去Fmoc保护基，每次10分钟；
以3eq1-羟基苯并三唑和3eqN,N'-二异丙基碳二亚胺为活化试剂，将其和氨基酸溶于6mlN,N-二甲基甲酰胺中，于65℃下反应至所有的氨基酸连接到树脂上，之后使用TFA、TIPs和水按体积比为95:2.5:2.5组成的混合液为切割试剂，在室温反应2小时，将合成的多肽从树脂上切割下来，同时切去侧链保护基，随后用无水异丙醚醚沉淀得到粗肽，粗肽使用制备HPLC纯化，冻干得到纯度≥97.0％的白色冻干粉末，然后用高效液相色谱和高分辨率质谱进行确证，即得到所述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物。
本发明中，叔丁氧羰，缩写为Boc。叔丁酯，缩写为OtBu。叔丁基，缩写为tBu。1-羟基苯并三唑，即HOBt。N,N'-二异丙基碳二亚胺，即DIC。N,N-二甲基甲酰胺，即DMF。高效液相色谱，HPLC。高分辨率质谱，HR-MS。
树脂来自天津南开合成科技有限公司，所有溶剂和试剂从GLBiotech、J&KScientific、国药化学试剂有限公司或EnergyChemical购买。
用高效液相色谱和高分辨率质谱进行确证，其纯度可以达到95％以上(图1-图15)，且质谱数据表明其分子量和理论分子量是相符的(图16-图30)。
本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法的有益效果是：
1、本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法，以价格低廉的天然氨基酸为合成原料，并且采用了二溴苄或二溴联苯联苯进行环合，不会造成重金属的引入。
2、本发明的制备方法简单，操作容易，成本低廉，适合规模化推广应用。
本发明的目的之三，是提供一种药物组合物。
本发明解决上述问题的技术方案如下：一种药物组合物，包含上述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物。
本发明环肽类化合物的抗肿瘤作用可以通过常规的生物学实验来验证，如细胞毒性和细胞凋亡实验等，在本发明的具体实施方式中，优选细胞毒性实验，通过该试验，发现本发明通式1所涉及的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物都具有体外抗肿瘤作用。
本发明的药物组合物的有益效果是：
上述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物可以用于制备药物组合物。该药物组合物可以含有本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物中的任意一种或两种以上的组合物，优选仅含一种。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
采用上述进一步的有益效果是：基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物可以和药学上可接受的载体一起，制成药物组合物。
更进一步，所述药学上可接受的载体为惰性载体。
更进一步，所述惰性载体为水、甘油、乙醇中的任意一种或两种以上的组合。
采用上述更进一步的有益效果是：药物组合物可以与上述惰性载体进行组合，得到消毒的注射用水溶液。
进一步，所述药物组合物的剂型为滴剂、栓剂、注射剂、片剂、膜剂、丸剂、气雾剂、喷剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、糖浆剂和乳液剂中任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，便于病人在不同情况下服用，更加灵活方便。优选该组合物为单位给药剂量形式。其中，胶囊包括持续释放或延迟释放形式。
进一步，所述药物组合物的给药途径包括透皮给药、离子透入给药、阴道给药及、鼻内给药、口服给药、直肠给药、舌下给药、肺部给药和胃肠道外给药中任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：本发明的药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，优选胃肠道外给药，如肌肉、皮下或静脉内注射。
本发明的目的之四，是提供上述药物组合物的应用。
本发明解决上述问题的技术方案如下：上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
上述抗肿瘤药物，所涉及的肿瘤疾病包括胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、胶质瘤和乳腺癌。优选乳腺癌、结直肠癌和胶质瘤。
本发明的药物组合物的应用的有益效果是：上述药物组合物可以用于制备抗肿瘤药物，既开辟了新的抗肿瘤药物，又开辟了基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的新用途，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明表3中Ascaphin-8的高效液相色谱图；
图2为本发明表3中A8-1的高效液相色谱图；
图3为本发明表3中A8-1-o的高效液相色谱图；
图4为本发明表3中A8-1-m的高效液相色谱图；
图5为本发明表3中A8-1-p的高效液相色谱图；
图6为本发明表3中A8-2的高效液相色谱图；
图7为本发明表3中A8-2-o的高效液相色谱图；
图8为本发明表3中A8-2-m的高效液相色谱图；
图9为本发明表3中A8-2-p的高效液相色谱图；
图10为本发明表3中A8-3的高效液相色谱图；
图11为本发明表3中A8-3-o高效液相色谱图
图12为本发明表3中A8-3-m的高效液相色谱图；
图13为本发明表3中A8-3-p的高效液相色谱图；
图14为本发明表3中A8-4的高效液相色谱图；
图15为本发明表3中A8-4-Dp的高效液相色谱图；
图16为本发明表3中Ascaphin-8的质谱图；
图17为本发明表3中A8-1的质谱图；
图18为本发明表3中A8-1-o的质谱图；
图19为本发明表3中A8-1-m的质谱图；
图20为本发明表3中A8-1-p的质谱图；
图21为本发明表3中A8-2的质谱图；
图22为本发明表3中A8-2-o的质谱图；
图23为本发明表3中A8-2-m的质谱图；
图24为本发明表3中A8-2-p的质谱图；
图25为本发明表3中A8-3的质谱图；
图26为本发明表3中A8-3-o质谱图；
图27为本发明表3中A8-3-m的质谱图；
图28为本发明表3中A8-3-p的质谱图；
图29为本发明表3中A8-4的质谱图；
图30为本发明表3中A8-4-Dp的质谱图；
图31为本发明表3中Ascaphin-8及其芳香硫醚订书肽衍生物的圆二色谱(CD)图谱；
图32为本发明表中Ascaphin-8和A8-1、A8-4衍生物溶血率的测定；
图33为本发明表中A8-3和A8-2衍生物溶血率的测定；
图34为未经处理的MCF-7细胞迁移能力检测；
图35为本发明表3中Ascaphin-8影响MCF-7细胞迁移能力检测；
图36为本发明表3中A8-2-o影响MCF-7细胞迁移能力检测；
图37为本发明表3中A8-4-Dp影响MCF-7细胞迁移能力检测；
图38为本发明表3中Ascaphin-8、A8-2-o以及A8-4-Dp对MCF-7细胞垂直迁移能力影响的检测；
图39为本发明表3中Ascaphin-8、A8-2-o以及A8-4-Dp对MCF-7细胞垂直迁移能力影响的检测的定量分析；
图40为本发明表3中Ascaphin-8、A8-2-o以及A8-4-Dp处理MCF-7细胞后凋亡细胞的检测；
图41为未经处理的MCF-7细胞死活细胞染色鉴定；
图42为本发明表3中A4K14-citropin1.1影响MCF-7活力的死活细胞染色鉴定；
图43为本发明表3中AC-CCSP-2-o影响MCF-7活力的死活细胞染色鉴定；
图44为本发明表3中AC-CCSP-3-o影响MCF-7活力的死活细胞染色鉴定；
图45为本发明表3中Ascaphin-8、A8-2-o以及A8-4-Dp的蛋白酶水解稳定性结果。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本发明优选的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的名称、序列、质谱数据和结构式，如表3、图1-图30所示。
表3
实施例2：
固相合成Ascaphin-8，具体步骤如下：
氨基酸α-氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护，并对氨基酸进行侧链保护：Lys的侧链保护基为叔丁氧羰(Boc)，Asp的侧链保护基为叔丁酯
(OtBu)，Thr的侧链保护基为叔丁基(tBu)，活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，用20％哌啶/DMF作为脱保护试剂清洗两次树脂以脱去Fmoc保护基，每次10分钟，将活化试剂和氨基酸溶与DMF中于65摄氏度下反应下反应40min，以将氨基酸连接到树脂上，在所有的氨基酸连接到树脂上之后，使用TFA、TIPs和Water按体积比为95:2.5:2.5的混合液为切割试剂，在室温反应2小时，将合成的多肽从树脂上切割下来，同时切去侧链保护基，随后用无水异丙醚醚沉淀得到粗肽，粗肽使用制备HPLC纯化，冻干得到纯度≥97.0％的白色冻干粉末。
实施例3：
固相合成A8-1-o，具体步骤如下：
氨基酸α-氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护，并对氨基酸进行侧链保护：Lys的侧链保护基为叔丁氧羰(Boc)，Asp的侧链保护基为叔丁酯(OtBu)，Thr的侧链保护基为叔丁基(tBu)，其中用Fmoc-Cys(Trt)-OH替换X位的氨基酸，以N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化试剂，在65℃的条件下，将上述活化试剂以及氨基酸溶于N,N二甲基甲酰胺(DMF)中并反应40min以将氨基酸连接到树脂上，以20％哌啶/DMF为脱Fmoc试剂清洗两次树脂以脱去Fmoc保护基，每次10min，在脱保护前后分别用DMF和二氯甲烷(DCM)洗涤三次。将所有氨基酸连接到多肽连接完毕后，使用TFA、TIPs和Water按体积比为95:2.5:2.5的混合液室温反应2小时，从而将其从树脂上切割下来，同时脱除侧链保护基，后用无水异丙醚沉淀得到粗肽，粗肽使用制备HPLC纯化，冻干得到纯度≥97.0％的白色冻干粉末。将得到的纯化的肽溶于饱和的NaHCO3,将1.2eq的1,2-双(溴甲基)苯溶于乙腈中，然后等体积混合，于室温下反应1h，随后取上清液通过制备HPLC进行产物的纯化，冻干得纯度≥97.0％的白色冻干粉末。
实验例4：α-螺旋度检测
方法：使用JASCOJ-1500圆二色谱仪进行远紫外(UV)圆二色性(CD)测量。于室温条件下，在1mm的路径长度石英SUPRASIL(HELLMA)比色皿中进行190-280远紫外区域的波长扫描。扫描速率为100nm/min，带宽为2nm。将肽溶于三氟乙醇/水(v:v＝1:1)，以获得最终浓度为50mM的肽溶液用于CD光谱的测量。百分比的螺旋度通过如下公式进行计算:α＝{[θ]222/[θ]max}×100％。[θ]222是222nm处的摩尔椭圆率，[θ]max＝(-44,000+250T)(1–k/n)，k＝4，n代表氨基酸的数量，T＝20℃。
结果：CD数据表明，Ascaphin-8的螺旋度为41％，与线性类似物相比，通过卤素-巯基点击化学反应可以提高肽的螺旋度(表4，图31)。
表4优选芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的圆二色谱测定
名称 [θ]222 [θ]max 螺旋度(％)
Ascaphin-8 -12654315.8 -30789.474 41
A8-1-o -15230000.0 -30789.474 49
A8-1-m -6014831.6 -30789.474 20
A8-1-p -7448947.4 -30789.474 24
A8-2-o -21746105.3 -30789.474 71
A8-2-m -6950905.3 -30789.474 23
A8-2-p -9474768.4 -30789.474 31
A8-3-o -13080210.5 -30789.474 42
A8-3-m -8804410.5 -30789.474 29
A8-3-p -5430936.8 -30789.474 18
A8-4-Dp -5430936.8 -30789.474 18
实施例5：生物相容性检测
将多肽配制为10mM水溶液(含有10％DMSO)并进行梯度稀释，在96孔板中每孔加入200μL的红细胞溶液，各孔加入等体积不同浓度的药物使得最终红细胞溶液药物浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、0μM，并设置完全溶血阳性对照组：加2μL 10％的Triton；空白对照组：每孔加入2μL PBS。37℃孵育1h，1000rpm离心10min，吸取100μL上清至新96孔板，用酶标仪测定OD450值。
实验结果：在25μM浓度以下，所有的肽未引起显著的红细胞破裂溶血，只有药物浓度达到100μM时，才表现出大于50％的红细胞破裂溶血现象(图32-图33)。这表明Ascaphin-8及其衍生物有良好的生物相容性及安全性。
实施例6：体外抗肿瘤细胞实验
1)肿瘤细胞增殖抑制实验
采用CCK-8试验方法。将MCF-7/HCT116/U87细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，每孔100μL完全培养基。37℃，5％CO2条件下培养24h，Ascaphin-8、A8-1、A8-2、A8-3和A8-4及其衍生物按0μM、0.78μM、1.56μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM和25μM浓度梯度给药。培养48h后，更换为无血清培养基并每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃孵育1小时，使用酶标仪检测450nm处的吸光度值。
2)癌细胞划痕实验
将MCF-7细胞，接种在6孔板，每孔接种30万个细胞，在加有高糖培养基(10％FBS、1％PS、DMEM)中培养过夜。待细胞贴壁生长以后，用无菌微量移液枪头在孔板中画直线，相邻两条线之间间隔0.5cm。用PBS轻柔清洗细胞三次，将划下的细胞清除。然后加入含或不含3μM浓度的Ascaphin-8、A8-2-o和A8-4-Dp的2％低血清培养基，继续培养。分别于0，12，36h在显微镜下观察细胞划线位置生长情况，并拍照。最后计算药物处理后的划痕面积。
3)癌细胞迁移实验
MCF-7细胞经过2小时饥饿处理后，以5万/孔的密度铺板到Transwell上层培养的小室中，在2％低血清培养基(2％FBS、10％PS、DMEM)加入浓度为0或3μM的Ascaphin-8、A8-2-o和A8-4-Dp溶液作为上层装置的培养基，下层装置中则加入高糖培养基(10％FBS、1％PS、DMEM)，于37℃，5％CO2培养箱培养。48小时后，吸弃培养基，用600μLPBS轻柔清洗后加入4％多聚甲醛固定30分钟。再次用PBS清洗后，用结晶紫溶液染色30分钟。最后用干净的棉签将小室内部擦拭干净，于显微镜下拍照观察。
4)癌细胞凋亡实验
MCF-7细胞接种于6孔板中，每孔20万个细胞，加高糖培养基培养。24小时后，吸弃原培养基，用PBS清洗一次，加含有Ascaphin-8、A8-2-o和A8-4-Dp的溶液(10μM)的高糖培养基继续培养48小时。用预冷PBS离心洗涤，收集1×106个细胞。取500μL 1×Binding Buffer重悬细胞。每管加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin V-FITC(Ex＝488nm；Em＝530nm)和通过PI检测通道(Ex＝535nm；Em＝615nm)检测PI。
5)癌细胞活性检测
MCF-7细胞以5×103细胞/孔的密度接种在PerkinElmer Cell Carrier Ultra 96孔微孔板中，在37℃培养箱培养。24h后，加入Ascaphin-8、A8-2-o和A8-4-Dp，终浓度为10μM。24h后使用Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒进行染色，在每毫升的PBS中加入2μLCalcein-AM储存液和3μL PI储存液，混匀制成工作液。此时Calcein-AM的浓度为2μmol/L，而PI的浓度为4.5μmol/L。在96孔板中，每孔加入100μL，在37℃培养孵育15min。然后在高内涵筛选分析系统进行图像的拍摄。
实验结果：肿瘤细胞增殖抑制实验结果显示：多肽片段均显示出不同程度的体外肿瘤细胞抑制作用，多条经过订书化改造的肽较对照Ascaphin-8均有提高，抑制作用最佳的为A8-2-o和A8-4-Dp，其对MCF-7细胞的半数有效抑制浓度(IC50)分别为3.79μM和2.99μM，结果如表5所示。因此后续的抗肿瘤活性验证均以检测A8-2-o和A8-4-Dp对MCF-7细胞的抑制作用进行。在癌细胞划痕实验中(图34-图37)，A8-2-o和A8-4-Dp明显抑制了MCF-7细胞向中心生长的趋势(图36-图37)，而作为对照的原形肽(Ascaphin-8)虽然也能抑制癌细胞生长(图35)，但没有订书肽的作用更加显著。图38为细胞迁移实验的结果，从图中可以看出，空白组中有大量MCF-7细胞迁移到血清浓度更高的下层培养基一侧，与对照组相比，A8-2-o和A8-4-Dp显著抑制了细胞的迁移生长；对迁移的细胞数量进行统计分析(图39)，使用药物处理的细胞迁移量显著低于空白组(P<0.05)。细胞凋亡实验显示(图40)：用A8-2-o和A8-4-Dp处理的细胞中凋亡细胞所占比例明显高于空白组和原型肽组，A8-4-Dp组凋亡细胞比例甚至大于50％，表明经过环化策略修饰的肽能够大量诱导MCF-7凋亡。死活细胞染色实验中可以看到(图41-图44)：用A8-2-o和A8-4-Dp处理MCF-7细胞(图43-图44)，只有极少量活细胞，而对照组和Ascaphin-8组则可以看到大片的绿色荧光(图41-图42)，即大量细胞存活，表明10μM浓度下A8-2-o和A8-4-Dp可以有效杀死癌细胞。
以上实验结果表明：Ascaphin-8及其衍生物对癌细胞有不同程度的增殖抑制作用，与原形肽相比，A8-2-o和A8-4-Dp表现出更好的抑制肿瘤细胞活性的作用。
表5优选芳香硫醚订书肽类活性分子对不同癌细胞的半数有效抑制浓度(IC50)
实施例7：胰蛋白酶稳定性实验
分别称取1-2mg多肽(Ascaphin-8、A8-2-o和A8-4-Dp)溶于一定量的DMSO中，配置成浓度为1nM的储存液，称取一定量的胰蛋白酶溶于含有1mM氯化钙的磷酸盐缓冲溶液(50mM，pH＝7.4)至胰蛋白酶的浓度为0.5ng/μL，在2ml离心管中分别加入1950μL含胰蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液和50μL的肽储存液进行酶降解反应，分别取0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h时间点的50μL反应液加入20μL盐酸(1M)淬灭胰蛋白酶的活性，使用HPLC分析不同时间点肽的残余量。
实验结果：经过12小时的处理，A8-4-Dp显示出较阳性对照Ascaphin-8更强的抗胰蛋白酶能力，如图45所示。
综上，本发明的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，结构更加稳定，细胞渗透性更强，细胞膜通透性和生活活性更好，酶稳定性和抗肿瘤活性更高，更加适用于癌症病人安全用药。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，其特征在于，为通式1所示的化合物及其药学上可接受的盐或酯，
GFKX1LLKX2X3AKX4LVKX5VLF
通式1，其中，X1表示半胱氨酸或酪氨酸；X2表示半胱氨酸或甘氨酸；X3表示半胱氨酸或丙氨酸；X4表示半胱氨酸或丙氨酸；X5表示半胱氨酸或苏氨酸；片段中成对的半胱氨酸通过卤素巯基点击化学反应进行环合。
2.根据权利要求1所述的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物，其特征在于，所述通式1化合物选自如下结构中的任意一种：
3.权利要求1-2任一项所述的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
氨基酸α-氨基用9-芴基甲氧羰基保护，并对氨基酸进行侧链保护：Lys的侧链保护基为叔丁氧羰，Asp的侧链保护基为叔丁酯，Thr的侧链保护基为叔丁基，以含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液为脱保护试剂，清洗两次树脂以脱去Fmoc保护基，每次10分钟；
以3eq1-羟基苯并三唑和3eqN,N'-二异丙基碳二亚胺为活化试剂，将其和氨基酸溶于6mlN,N-二甲基甲酰胺中，于65℃下反应至所有的氨基酸连接到树脂上，之后使用TFA、TIPs和水按体积比为95:2.5:2.5组成的混合液为切割试剂，在室温反应2小时，将合成的多肽从树脂上切割下来，同时切去侧链保护基，随后用无水异丙醚醚沉淀得到粗肽，粗肽使用制备HPLC纯化，冻干得到纯度≥97.0％的白色冻干粉末，然后用高效液相色谱和高分辨率质谱进行确证，即得到所述基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为惰性载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述惰性载体为水、甘油、乙醇中的任意一种或两种以上的组合。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为滴剂、栓剂、注射剂、片剂、膜剂、丸剂、气雾剂、喷剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、糖浆剂和乳液剂中任意一种。
9.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药途径包括透皮给药、离子透入给药、阴道给药及、鼻内给药、口服给药、直肠给药、舌下给药、肺部给药和胃肠道外给药中任意一种。
10.权利要求4-9任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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