CN110305197B

CN110305197B - 一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN110305197B
Application number: CN201910690540.XA
Authority: CN
Inventors: 马克里; 何欣; 马晓光; 黄晓华; 王聪聪; 李颖
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: CN110305197A

Abstract

本发明公开了一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。本发明多肽由25个氨基酸组成，其氨基酸序列SEQ ID No.1所示。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为2698.08Da。本发明多肽具有抑制肿瘤肺部转移的活性，且治疗肿瘤安全有效。因此，本发明的多肽在临床抗肿瘤治疗上具有重要的应用价值。

Description

一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术

癌症是严重威胁人类生命健康的疾病之一，肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因。根据临床资料和流行病学调查分析，恶性肿瘤在临床确诊时，有60％以上的患者瘤细胞已发生全身扩散。从某种程度上说，控制住肿瘤转移即能控制肿瘤所致的死亡。目前，尽管国内外对肿瘤转移机理的研究和抗肿瘤转移药物研究投入了巨大的人力、物力，但还没有一个真正的抗肿瘤转移药物在临床应用。其原因是肿瘤转移是个十分复杂的多步骤连续过程，肿瘤转移的分子和细胞机制尚未真正阐述清楚。因此，弄清楚恶性肿瘤细胞扩散转移的分子机制，寻找抑制肿瘤细胞扩散转移的药物靶点，设计新型高效的、低毒的抗肿瘤转移药物，以提高恶性肿瘤病人临床治愈率及提高生存率，是今后恶性肿瘤治疗的重要策略之一。

多肽类药物具有分子量小、低毒性、高活性、无免疫原性、易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药、易于多途径吸收。因此，寻找抑制肿瘤转移的多肽，是一个开发设计抗肿瘤转移药物的新途径。目前，抑制肿瘤转移的多肽报道很少。有报道，MANS肽(肉豆蔻基富含丙氨酸n末端序列)能有效阻止肿瘤细胞的运动。也有人发现大豆肽lunasin可以明显降低其结肠癌的转移。无论如何，这些多肽临床试验尚达不到预期的目的。

发明内容

在长期从事多肽结构及功能的经验基础上，经反复体外和体内实验，本发明设计出一种具有强烈抑制不同组织来源的肿瘤细胞在体内肺部转移的多肽。该多肽易于合成，安全分子量小、低毒性、高活性、无免疫原性。

本发明的目的是基于抗肿瘤多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种具有高效、低毒的抑制肿瘤转移活性多肽。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明多肽由25个氨基酸组成，分子量为2698.08Da。

本发明还提供所述的多肽在制备抑制肿瘤细胞体内肺部转移药物中的应用。所述制剂可以为本发明所述的多肽，也可以为含有本发明多肽和其他药学上可允许的辅料的制剂。

本发明还提供所述的抑制肿瘤肺部转移的多肽的制备方法，该多肽用固相化学合成法制备得到，包括以下步骤：

(1)将Fmoc保护氨基酸在2-CL树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；

(2)步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；

(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品。

进一步地，在上述技术方案中，所述步骤(1)中的将Fmoc保护氨基酸在2-CL-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取1g 2-CL树脂放入反应器中，加入10mL DCM，4mmolFmoc保护氨基酸和1mmol DIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入1mL甲醇和1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入2-4mL哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

进一步地，在上述技术方案中，所述步骤(2)中的裂解液为87.5％的TFA水溶液。

进一步地，在上述技术方案中，所述步骤(2)中的滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。

进一步地，在上述技术方案中，所述步骤(3)中多肽粗品纯化的方法包括高效液相色谱法。

对于上述获得的本发明的多肽纯品，用质谱仪检测该序列分子量的正确性。

采用尾静脉注射肿瘤细胞技术，分别建立同系小鼠肺转移模型和异源移植裸鼠肺转移模型，检测本发明多肽对肿瘤细胞肺转移形成的作用。结果显示，本发明多肽在体内可强烈抑制肺癌转移的形成。

发明有益效果

本发明公开一种由25个氨基酸组成的多肽，其特点是分子量小，是目前发现的具有抗肿瘤转移播散作用的最短的多肽。分子量小，易于固相化学合成，结构稳定。与体内细胞表面表达的天然蛋白质结构类似，因此无免疫原性，安全有效，可开发为治疗肿瘤的辅助药物。本发明的多肽是一个水溶性、高效、低无毒的多肽类肿瘤转移抑制剂，可以有效地抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞在体内的肺转移灶的形成。且安全，无毒副作用。

附图说明

图1为本发明多肽的HPLC检测图谱。

图2为本发明多肽的质谱检测图谱。

图3本发明多肽对小鼠肺癌LLC在同系移植小鼠实验模型肺转移的抑制作用。

图4本发明多肽对人乳腺癌MBA-MD-231肿瘤细胞异种移植裸鼠模型肺转移的抑制作用。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

本发明中所出现的缩略语的说明：

2-CL树脂：二氯树脂、Fmoc：9-芴甲氧羰基、DMF：二甲基甲酰胺、DCM：二氯甲烷、HOBT：1-羟基苯并三唑、DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺、DIEA：N,N-二异丙基乙胺吡啶、PIP：哌啶、TFA：三氟乙酸。

实施例1制备本发明多肽

以下制备多肽的2-CL树脂，Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、裂解试剂均购买于国内生化试剂公司。

1.1本发明多肽树脂的合成

本发明多肽树脂为：

Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asp(otbu)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Phe-Ile-Ala-Val-Leu-Gln(trt)-Thr(tbu)-Ala-Ala-Ala-Ala-Leu-Arg(Pbf)-Met-Gly-Ala-Tyr(tbu)-2-CL树脂。

使用2-CL树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本发明多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第25个氨基酸相对应的保护氨基酸如下表所示：

表1.保护氨基酸

1.2接入第25～1个氨基酸。

1.2.1接入第25个氨基酸。

制备从C端到N端逐个进行。称取1g二氯树脂放入反应器中，加入10mL DCM，4mmolFmoc-Tyr(tbu)(L型酪氨酸)和1mmol的DIEA；用氮气鼓泡反应3h。然后加入1mL甲醇，1mLDIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净。加入2-4mL哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。

1.2.2接入第24～1个氨基酸

采用上述同样方法，依次接入表1中对应的第20～1个保护氨基酸，接完所有保护氨基酸后，即得到的Fmoc-多肽树脂，加入2-4mL哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，过滤洗涤后，即得本发明多肽树脂。

1.3本发明多肽粗品的制备

向取得的多肽树脂中加入87.5％的TFA水溶液作为裂解试剂，温度控制30度，反应三个小时；然后抽滤得到液体，用冰乙醚沉降出来，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒人20mL无水乙醚，出现白色絮状沉淀，在4000rpm转速，5℃条件下离心5分钟，倒去溶剂乙醚，向沉淀中加入无水乙醚20mL，振荡，同样条件下离心5分钟，再重复一次，除去大部分的杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，得本发明多肽粗品的固体粗品。

1.4本发明多肽粗品的纯化

将冻干的粗品多肽，溶于0.1％TFA/乙腈溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离。HPLC在Waters-600E多通道系统上进行，选用Gemini-NX 10μm，C18，100A，4.6×250mm半制备柱，Waters-2487紫外检测器(L＝215和254nm)，用0.1％TFA/乙腈溶液进行梯度洗脱。收集主要峰产物，减压旋蒸除去HPLC的样品峰中的乙腈。在冷冻干燥机上冷冻干燥，获得目标产物多肽，纯化的多肽质谱图见图1，多肽纯度为96.69％。

1.5本发明多肽纯品的质谱鉴定

最终产物经过ESI-MS方法鉴定。本发明多肽的理论分子量为2698.08Da(100％M+H)，质谱条件：样品溶解于甲醇，通过Cole-Panner 74900注射泵打入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件：喷雾器压力为7.0或11.0Psi，干燥器(N)流速为4.0L或8.0L/分钟，温度为300℃。喷雾针电压为4.0kV。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为2698.08Da，其分子量与计算值相符。纯化的多肽质谱图见图2。

上述制备得到的本发明多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

KKKKDKSSFIAVLQTAAAALRMGAY，即

H-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp-Lys-Ser-Ser-Phe-Ile-Ala-Val-Leu-Gln-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Leu-Arg-Met-Gly-Ala-Tyr-OH。

实施例.2本发明多肽对小鼠肺癌LLC肿瘤细胞体内肺转移的作用

将20-25克同系NCR(购自大连医科大学动物中心)小鼠分为对照组和处理组，每组7只。对照组经尾静脉注射小鼠肺癌LLC肿瘤细胞(ATCC号，CRL1642^TM)0.1mL，约1.5×10⁶个细胞(0.9％生理盐水稀释)；处理组经尾静脉注射小鼠肺癌LLC肿瘤细胞0.1mL，约1.5×*10⁶个细胞(加入本发明多肽至终浓度50μg/mL，氨基酸序列为：KKKKDKSSFIAVLQTAAAALRMGAY)。建立小鼠肺癌LLC肿瘤细胞肺转移小鼠模型。于注射5周后断头处死小鼠，分离肺脏，观察肺部肿瘤转移灶的形成(箭头所指为肿瘤结节)。在肺表面有肉眼可见的肿瘤结节为成瘤阳性，未有肉眼可见的肿瘤结节为成瘤阴性。结果如图3。其中对照组编号1-6为成瘤阳性，编号7为成瘤阴性，即对照组肺部肿瘤阳性转移率86％(6/7)；处理组编号1-6为成瘤阴性，编号7为成瘤阳性，即处理组肺部肿瘤阳性转移率14％(1/7)，经本发明多肽处理后，肺部肿瘤转移抑制率为86％。

实施例.3本发明多肽对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠模型肺转移瘤形成的影响

将20-25克BALB/cA-nu/nu小鼠(购于北京中科泽晟科技有限公司)分对照组和处理组，每组8只，对照组经尾静脉注射0.1ml MDA-MB-231(ATCC号，HTB-26^TM)细胞悬液(1×10⁶个细胞、0.9％生理盐水稀释)；处理组同时加入本发明多肽至终浓度50μg/ml。接种35天后断头处死小鼠，分离肺脏，肉眼观察肺肿瘤结节的形成(箭头所指为肿瘤结节)。肺表面有肉眼可见的肿瘤结节为成瘤阳性，未有肉眼可见的肿瘤结节为成瘤阴性。结果如图4所示。其中对照组编号1-7为成瘤阳性，编号8为成瘤阴性，成瘤率87.5％(7/8)。处理组编号1-7为成瘤阴性，编号8为成瘤阳性，成瘤率12.5％(1/8).经本发明多肽处理后，肺部肿瘤转移抑制率为87.5％。

实施例2和实施例3两种动物转移实验模型实验结果说明，本发明多肽具有明显的抑制肿瘤细胞体内肺部转移作用，很有希望开发为抗肿瘤转移药物。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学

<120> 一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Lys Lys Lys Asp Lys Ser Ser Phe Ile Ala Val Leu Gln Thr Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Leu Arg Met Gly Ala Tyr

20 25

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述多肽在制备抑制肿瘤细胞体内肺部转移药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞肺部转移的多肽的制备方法，其特征在于，所述抑制肿瘤细胞体内肺部转移的多肽的制备方法为固相化学合成，包括以下步骤：

(2)将步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；

(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品；

所述步骤(1)中将Fmoc保护氨基酸在2-CL-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取1g 2-CL树脂放入反应器中，加入10mL DCM，加入4mmol当量的Fmoc保护氨基酸和1mmolDIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入1mL甲醇和1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入2-4mL哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的裂解液为87.5％的TFA水溶液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中多肽粗品纯化的方法包括高效液相色谱法。