CZ280870B6

CZ280870B6 - Nový polypeptid a z něho připravené anti-HIV léčivo

Info

Publication number: CZ280870B6
Application number: CS921394A
Authority: CZ
Inventors: Nobutaka Fujii; Noaki Yamamoto
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 1996-04-17
Also published as: DE69115878D1; WO1992004374A1; NO921829L; CS139492A3; KR0184604B1; BG96323A; ES2081491T3; DK0502198T3; GR3018879T3; FI922044L; EP0502198A1; CA2068327C; EP0502198A4; JP3178835B2; AU8448091A; FI922044A7; BR9105902A; BG60621B1; RU2073685C1; EP0502198B1

Abstract

Nový polypeptid obecného vzorce I nebo jeho sůl a anti-HIV činidlo, které jako účinnou složku obsahuje tento nový polypeptid nebo jeho sůl.ŕ

Description

Tento vynález se týká nového polypeptidu nebo jeho soli. Podrobněji se tento vynález týká nového polypeptidu, který má silnou afinitu k lipopolysacharidům, zvláště endotoxinu, má zlepšenou protibakteriální aktivitu a zlepšenou protivirovou aktivitu, jeho farmaceuticky přijatelných solí a farmaceutického prostředku, který jako účinnou složku obsahuje uvedený polypeptld nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl.

Dosavadní stav techniky

Do dnešní doby (jak ukazuje následující literatura) byly Nakamurou, Iwanagou, Niwou a spol. popsány polypeptidy (tachyplesin a polyphemusin), odvozené od krabů podkovovitých. Tyto polypeptidy vykazují afinitu na endotoxiny. Byly popsány také jejich farmakologické vlastnosti: J.Biol.Chem. 263 16709 až 16713 (1988), Chem.Pharm.Bull. 37, 2661 až 2664 (1989), japonský vyložený spis č. 53799/1990, japonský patentový vyložený spis č. 152987/1990, japonský vyložený patentový spis č. 167230/1990, J.Biochem. 106, 663 až 668 (1989), Taisha (Metabolism) 26., 301 až 311 (1989) a japonský patentový spis č. 500194/1990.

Pokud jde o polypeptidy s afinitou na endotoxiny, které byly izolovány z krabů podkovovitých (rodu Tachypleus, rodu Lumulus a rodu Carcinoscorpius). existuje podle nejlepších znalostí výzkumníků pět strukturních analogů. Každý z nich je polypeptld s cyklickou strukturou se 17 nebo 18 přírodními aminokyselinami. Tyto polypeptidy mají navzájem mimořádně analogické vlastnosti. Takový polypeptld je velice zajímavý jako jedna z klíčových sloučenin, která umožňuje krabům podkovovitým adaptovat se na změny jejich vnějšího prostředí a chránit svůj druh z pradávných dob až do dnešních časů jako žijící zkameněliny.

Na druhé straně - s ohledem na zachování existence člověka, který je vysoce diferencován - jsou žádoucí léky, od nichž se očekává, že mají profylaktický nebo terapeutický účinek na syndrom získané imunitní nedostatečnosti (AIDS), způsobený virem lidské imunitní nedostatečnosti.

Autoři tohoto vynálezu věnovali pozornost shora uvedeným polypeptidům, afinitním na endotoxin, o nichž se domnívají, že mají vztah k zachovávání druhů kraba podkovovitého. Autoři tohoto vynálezu studovali vztah mezi strukturními změnami těchto sloučenin a aktivitou na virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV). Výsledkem těchto studií bylo nalezení polypeptidů, které se podstatně liší od obvyklé struktury známých polypeptidů z krabů podkovovitých s afinitou na endotoxiny. K velkému překvapení autorů bylo zjištěno, že tyto nové polypeptidy mají vynikající účinek a že jejich hodnoty proti-HIV aktivity jsou desetkrát nebo vícekrát větší než proti-HIV aktivity známého polypeptidu s afinitou na endotoxin.

-1CZ 280870 B6

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na uvedených objevech a týká se nového polyptidu obecného vzorce I

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

A₁-Trp-Cys-A₂-A₃-Lys-A₄-A₂-A₃-Gly-A₄-A₄-A₂-A₃-A₃-Cys-Arg-A₅ (I), v němž A^ znamená atom vodíku nebo jeden či dva zbytky aminokyselin, jimiž jsou lysin a arginin,

A₂ nezávisle znamená zbytek tyrosinu, fenylalaninu nebo tryptofanu,

A₃ nezávisle znamená zbytek argininu nebo lisinu,

A₄ nezávisle znamená zbytek alaninu, valinu, leucinu, isoleucinu, šeřinu, cysteinu nebo methioninu,

A₅ znamená skupinu -OH (odvozenou od karboxylové skupiny), nebo skupinu -NH₂ (odvozenou od amidové skupiny),

Cys znamená zbytek cysteinu, Gly znamená zbytek glycinu, Lys znamená zbytek lysinu, Arg znamená zbytek argininu a Trp znamená zbytek tryptofanu, cysteinové zbytky v polohách 3 a 16 mohou být navázány disulfidovou vazbou (-S-S-), a jestliže v obou polohách 7 a 12 jsou cysteinové zbytky, mohou být navázány disulfidovou vazbou (-S-S-), nebo jeho soli.

Nový polypeptid podle tohoto vynálezu má zásadné důležitou vlastnost v tom, že i když ve známých polypeptidech, odvozených od krabů podkovovitých, zbytek aminokyseliny v poloze 6 obvykle znamená zbytek valinu (Val), zbytek v poloze 6 těchto nových polypeptidů podle vynálezu znamená zbytek lysinu (Lys). Zbytek bazické aminokyseliny má úplně jiné vlastnosti, než zbytek valinu.

Nový polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu je podrobněji popsán níže. Nový polypeptid podle vynálezu se může připravovat známým způsobem, například metodou syntézy v pevné fázi. Konkrétně polypeptid podle tohoto vynálezu s přímým řetězcem shora uvedeného obecného vzorce I se může získat napojením karboxylové skupiny N-chránéného argininu na nerozpustnou pryskyřici s aminovými skupinami přímo nebo prostřednictvím spaceru (vymezovače) s funkční skupinou, schopnou navázat se na karboxylovou skupinu a karboxylovou skupinou, postupně se navážou způsobem syntézy v pevné fázi příslušné chráněné aminokyseliny od polohy 16 do polohy 1 sekvence aminokyselin následujícího obecného vzorce I

Α_Ί -Trp-Cys-A₂-A₇-Lys-A_ú-A₉-A-.-Gly-A.-A.-A₉-A-_i-A-_í-Cys-Arg-A_c·

3456 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 (I), v němž Aj, A₂, A₃, A₄, Cys, Gly, Lys, Arg a Trp znamenají jak shora uvedeno pro obecný vzorec I,

-2CZ 280870 B6 a potom se eliminuje (odstraní) nerozpustná pryskyřice a chránící skupiny aminokyseliny. V tomto případě karboxylový konec aminokyseliny v poloze 17 může být bud’ volný (A₅ odpovídá skupině -OH), nebo může být převeden na amid kyseliny (A₅ odpovídá skupině -NH₂). V získaném polypeptidu pak dále dva cysteiny v polohách 3 a 16 mohou tvořit disulfidovou vazbu (-S-S-) merkaptoskupinami.

A dále, jestliže jak v poloze 7 tak v poloze 12 jsou cysteinové zbytky, mohou tyto cysteiny tvořit disulfidovou vazbu.

Pokud jde o tvorbu této disulfidové vazby, oba dva páry cysteinových skupin mohou být převedeny na disulfidovou vazbu, například oxidací vzduchem. Nebo se disulfidová vazba může vytvořit podle způsobu, který uvádí Atherton E. a spol.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985, 2065. To se provádí v několika stupních. Nejdříve se selektivně chrání merkaptoskupiny kteréhokoliv páru cysteinů v polohách 3 a 16, a 7 a 12 chránící skupinou t-BuS (terč.butylthioskupina) a merkaptoskupiny druhého páru cysteinů se chrání chránící skupinou Acm (acetamidomethylová skupina), odstraní se t-BuS částečným oxidováním merkaptoskupin a nakonec se odstraní chránící skupina Acm podle známého způsobu.

Příslušnými aminokyselinami, které se používají při způsobu syntézy v pevné fázi, mohou být obecné L-formy nebo D-formy.

Pokud jde o nerozpustné pryskyřice s aminovou skupinou, které se používají při syntéze nového polypeptidu podle vynálezu, lze používat jakékoliv pryskyřice, pokud se mohou vázat svými aminovými skupinami na karboxylovou skupinu N-chránéného argininu na C-konci, nebo v některém případu na karboxylovou skupinu spaceru (vymezovače), na néj navázaného a následné eliminovat (odstranit).

Mezi příklady takové nerozpustné pryskyřice patří aminomethylové pryskyřice (aminomethylované styren-divinyl-benzenové kopolymery), benzhydrylaminové pryskyřice, methylbenzhydrylaminové pryskyřice a aminomethylfenoxymethylové pryskyřice a jejich deriváty atd. Jestliže se používá benzhydrylaminová pryskyřice, methylbenzhydrylaminová pryskyřice, dimethylbenzhydrylaminová pryskyřice (DMBHA pryskyřice) nebo aminomethylfenoxymethylová pryskyřice, amid se přímo získá štěpením. Z hlediska výtěžku je výhodná aminomethylová pryskyřice.

Jako vymezovač (spacer) s funkční skupinou, schopnou navázat se na karboxylovou skupinu a s karboxylovou skupinou, lze například uvést vymezovač, schopný převést karboxylovou skupinu argininu na p-karboxymethylbenzylester, ale neexistují žádná zvláštní omezení, pokud jde o vymezovač.

Chráněná aminokyselina znamená aminokyselinu, jejíž funkční skupiny jsou chráněny chránící skupinou známým způsobem. Na trhu se prodávají různé chráněné aminokyseliny.

-3CZ 280870 B6

Při syntéze polypeptidu podle tohoto vynálezu je výhodné vybrat jakoukoliv z následujících chránících skupin. Chrániči skupina α-aminové skupiny aminokyseliny je Boc (terč.butyloxykarbonylová skupina) nebo Fmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonylová skupina). Chránící skupina guanidinové skupiny argininu (Arg) je Tos (tosylová skupina),(nitroskupina) NO₂, Mtr (4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonová skupina) nebo Pmc (2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6-sulfonylová skupina). Jako chránící skupinu merkaptoskupiny cysteinu (Cys) lze uvést Bzl (benzylovou skupinu), MBzl (4-methoxybenzylovou skupinu), 4-MeBzl (4-methylbenzylovou skupinu), Acm (acetamidomethylovou skupinu), Trt (tritylovou skupinu), Npys (3-nitro-2-pyridinsulfenylovou skupinu), t-Bu (terč, butylovou skupinu) nebo t-BuS (terc.butylthioskupinu). Výhodnými chránícími skupinami jsou skupiny MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm a Npys. Chrániči skupinou pro hydroxylovou skupinu tyrosinu je Bzl, C1₂BZ1 (2,6-dichlorbenzylová skupina) nebo t-Bu, ale tato skupina nesmí být chráněna. Chrániči skupinou e-aminové skupiny lysinu (Lys) je Z (benzyloxykarbonylová skupina), C1Z (2-chlorbenzyloxykarbonylová skupina), Boc nebo Npys. Je výhodné, aby jako chránící skupina byla vybrána příslušná chránící skupina ze známých chránících skupin podle podmínek syntézy peptidu.

Kondenzaci chráněných aminokyselin lze provádět obvyklým kondenzačním způsobem, jako je například DCC metoda (dicyklohexylkarbodiimidová metoda), DIPCDI metoda (diisopropylkarbodiimidová metoda) [Tartar A. a spol.: J. Org. Chem. 44, 5000 (1979)], metoda aktivního esteru, metoda směsného nebo symetrického anhydridu kyselin, karbonyldiimidazolová metoda, DCC-HOBt metoda (1-hydroxybenzotriazolová metoda) [Kónig W. a spol.: Chem. Ber. 2024 a 2034 (1970).] nebo difenylfosforylazidový způsob, mi jsou DCC metoda, DCC-HOBt metoda, DIPCDI-HOBt metoda symetrického anhydridu kyseliny. Tato kondenzační reakce kle provádí v organickém rozpouštědle, jako je například methan nebo dimethylformamid, nebo ve směsi takových rozpouštědel. Jako deblokační reakční činidlo (činidlo, kterým se odstraňuje chránící skupina) chránících skupin α-aminové skupiny se používá trifluoroctová kyselina - dichlormethan, kyselina chlorovodíková-dioxan, Příslušný výběr se provede postupu kondenzační reakce způsobem podle E. Kaisera a (ninhydrinová metoda).].

103, 788, Výhodnýa metoda se obvydichlorpiperidin-dimethylformamid, nebo podobná směs, chránící skupiny. Stupeň se sleduje 595 (1970) podle druhu v každém stupni syntézy spol. [Anal. Biochem. 34,

Podle předcházejících s chráněným peptidem, který způsobů se může získat má žádanou sekvenci aminokyselin.

pryskyřice

Jestliže se jako nerozpustná pryskyřice použije aminomethylpryskyřice, může se pryskyřice odstranit například reakcí pryskyřice s chráněným peptidem s amoniakem v příslušném rozpouštědle. Výsledný chráněný peptid se pak nechá zreagovat s fluorovodíkem. Získá se tak amid polypeptidu shora uvedeného obecného vzorce, ze kterého jsou odstraněny všechny chránící skupiny. Jestliže se jako nerozpustná pryskyřice použije benzhydrylaminová pryskyřice, methylbenzhydrylaminová pryskyřice, aminomethylfenoxymethylová pryskyřice nebo pryskyřice DMBHA (Funakoshi S. a spol.: J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1982, 382.), pak se pryskyřice a chránící skupiny mohou odstranit současné reakci pryskyřice s chráněným

-4CZ 280870 B6 peptidem s fluorovodíkem, TFMSA (trifluormethansulfonová kyselina) [publikováno Academie Press, red. E. Gross, Yajima H. a spol.: The Peptides 5, 65 (1983).], TMSOTf (trimethylsilyltriflát) [Fujii N. a spol.: J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987,

274.] nebo TMSBr (trimethylsilylbromid) [Fujii N. a spol.: Chem. Pharm. Bull. .35, 3880 (1987).], nebo podobnými činidly.

Potom jestliže je to žádoucí, výsledný polypeptid se zredukuje 2-merkaptoethanolem, DTT (dithiothreitolem) nebo podobným činidlem, čímž se merkaptoskupiny cysteinu získají v redukované formě. Oxidací se pak získá cyklický polypeptid podle tohoto vynálezu.

Oxidační reakce se provádí známým způsobem. Obvykle se používá takové oxidační činidlo, jako je například vzdušný kyslík nebo hexakyanoželezitan (například hexakyanoželezitan draselný). Takto získaný polypeptid se pak může izolovat a vyčistit způsoby známými z oblasti polypeptidů, například extrakcí, rekrystalizací, různými chromatografiemi (gelová filtrace, na ionexu, rozdělovači, absorpční, s obrácenými fázemi), elektroforézou, protiproudým roztřepáváním atd. Nejúčinnějšími je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na obrácených fázích.

Jako specifické příklady polypeptidů podle tohoto vynálezu obecného vzorce I lze uvést polypeptidy následujících vzorců 1 až 22. V následujících vzorcích 1 až 22 každý symbol označuje zbytek aminokyseliny podle mezinárodně přijatého třípísmenkového kódu: Arg = arginin, Trp = tryptofan, Cys = cystein, Tyr = tyrosin, Lys = lysin, Gly = glycin, Phe = fenylalanin, Ile = isoleucin, Ser = serin, Leu = leucin, Met = methionin, Val = valin a Ala = alanin.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 (1) Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2 (2) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-^ (3) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NI^ (4) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Met-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2 (5) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Leu-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NI^ (6) Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-N!^ (7) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NI^ (8) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-N^ (9) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Leu-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-Nf^ (10) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Val-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2 (11) Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NH2 (12) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NI^ (13) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-N^ (14) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ser-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-N!^ (15) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ala-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg-NI^ (16) Arg-Trp-Cys-Trp-Arg-Lys-Cys-Typ-Lys-Gly-Leu-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NHj (17) Arg-Arg-Trp-Cys-Trp-Arg-Lys-Cys-Typ-Lys-Gly-Leu-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-N^ (18) Arg-Trp-Cys-Phe-Lys-Lys-Cys-Phe-Lys-Gly-Ser-Cys-Phe-Lys-Lys-Cys-Arg-N^ (19) Α^-Α^-ΤΓρ^δ-ΡΙιβ-Ι^δ-Ι^δ^δ-Ρΐιβ-Ι^δ-ΰΙγ-δβΓ^δ^Γ-Ι^δ-Ι^Β^δ-Αχ^-ΝΙ^ (20) Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Ala-Tyr-Lys-Gly-Leu-Ala-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-Nf^ (21) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Ala-Tyr-Lys-Gly-Val-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NI^ (22) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Ser-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NI^

-5CZ 280870 B6

Takto získané polypeptidy podle vynálezu obecného vzorce I mají (podobně jako známé polypeptidy, odvozené od krabů podkovovitých) schopnost vázat se na endotoxiny, mají antibakteriální aktivitu, mají aktivitu hemolyzovat hemocyty, citlivé na endotoxin, mají protivirovou aktivitu a zvláště pak mají dobrou protivirovou aktivitu proti virům lidské imunitní nedostatečnosti (HIV). Tyto polypeptidy mají desetkrát nebo vícekrát vyšší anti-HIV aktivitu než známý polypeptid Tachyplesin I. Některé z těchto polypeptidů mají několik tisíckrát vyšší anti-HIV aktivitu než Tachyplesin I.

Pokud jde o strukturní vlastnosti známých polypeptidů, odvozených od krabů podkovovitých, bylo zjištěno, že díky existenci zbytku 4 Cys v polohách 3, 7, 12 a 16 zaujímají strukturu β-skládaného listu, takže v polohách 9 a 10 je ohnuta β-turnem, část peptidů od polohy 3 do polohy 8 a část peptidů od polohy 11 do polohy 16 jsou k sobě přikloněny a čtyři zbytky Cys v polohách 3 a 16 a v polohách 7 a 12 jsou svázány příslušnými disulfidovými vazbami (-S-S-). Jako strukturní vlastnosti pro projevení se antivirové aktivity polypeptidů, jejichž zbytek v poloze 6 byl změněn na Lys, jsou pro sloučeniny podle vynálezu zásadně nutné strukturní části sekvencí konstitutivních aminokyselin navzájem mimořádně podobných, jak je vidět u ³Cys⁴A2⁵A3⁶Lys, přikloněné k ¹³A2¹⁴A3¹⁵A₃ ¹⁶Cys, nepostradatelnými jsou ²Trp a ¹⁷Arg. Je charakteristické, že dalším navázáním bázické aminokyseliny v A-^ k těmto strukturním částem v poloze 1 se získá taková struktura, která má mimořádně vysokou anti-HIV aktivitu.

Polypeptid podle vynálezu obecného vzorce I má bázické vlastnosti díky vlastnostem konstitutivních aminokyselin. Vytváří tedy s kyselinami soli. Například polypeptid tvoří sůl s anorganickou kyselinou (kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou dusičnou, kyselinou sírovou nebo podobnými kyselinami), nebo s organickou karboxylovou kyselinou (kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou maleinovou, kyselinou jantarovou, kyselinou jablečnou, kyselinou citrónovou, kyselinou vinnou, kyselinou salicylovou nebo podobnými kyselinami), nebo s organickou sulfonovou kyselinou (například methansulfonovou kyselinou, p-toluensulfonovou kyselinou nebo podobnými). Polypeptid podle tohoto vynálezu obecného vzorce I se může používat jako takováto farmaceuticky přijatelná sůl.

Léčivo podle vynálezu se připravuje jako farmaceutický prostředek, který jako účinnou složku obsahuje polypeptid obecného vzorce I nebo jeho sůl a farmakologicky přijatelný nosič, který se vybere podle způsobu podávání a formy podávání léčiva. Léčivo podle vynálezu se podává orálně nebo parenterálné podle objektu, který je léčen nebo dezinfikován, a to ať jde o léčení in vivo virového onemocnění, nebo o dezinfikování in vitro virové infekční části. Léčivo se může připravovat jako prášek, granule, roztok pro injekce nebo orální podávání, tobolky, čípky, mast, krém nebo aerosol s příslušnými farmaceutickými nosiči podle způsobu podávání .

Jestliže se léčivo podle vynálezu podává přímo injekcí do živého těla, polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu se mohou

-6CZ 280870 B6 podávat kontinuálně nebo přerušovaně v množství 10 až 5000 mg na kg tělesné hmotnosti člověka za den a intravenózní kapačkou jako roztok ve fyziologickém solném roztoku.

Na připojeném výkresu je jako příklad uvedeno schéma stupňů syntézy nového polypeptidu podle vynálezu.

Tento vynález je dále podrobně popsán pomocí příkladů, ale není těmito příklady omezen.

Příklady provedeni vynálezu

V následujících příkladech jsou použity následující přístroje a následující reakční činidla: HPLC aparatura - Waters Co. (USA) model 600, kolona Asahipak ODP-90 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), Fmoc aminokyselina, vyrobená firmou Kokusan Kagaku Co., Ltd., aminopryskyřice a kondenzační činidlo, vyrobené firmou Peptide Kenkyusho Co., Ltd. a pro FAB-MS byl používán FAB-hmotový spektrometr VG Co. (USA), model ZAB-SE.

Příklad 1

Syntéza polypeptidu následujícího vzorce A

Arg-Trp-Cys-Tyr12 3 4

Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 (A)

Ve shora uvedeném vzorci A Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, Gly, Ile znamenáji zbytky shora uvedených aminokyselin, zbytky Cys v polohách 3 a 16 a v polohách 7 a 12 jsou spojeny příslušnou disulfidovou vazbou.

(1) Zavedení Fmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH [(3-(a-Fmoc-amino-4-methoxybenzyl)4-methoxy-fenyl)propionová kyselina]

270 mg (0,2 mmol) aminomethylové pryskyřice (0,74 miliekvivalentu na gram) a 268,5 mg (0,5 mmol, 2,5 ekvivalentu) Fmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH (molekulová hmota 537) se umístí do kolony pro syntézu v pevné fázi. Kondenzační reakce se provádí dvé hodiny způsobem DIPCDI-HOBt v dimethylformamidu podle metody Gup L. a spol. (Chem. Pharm. Bull. 36, 4989 (1988).). Po ukončení kondenzační reakce se provede reakce, jíž se chrání volné aminové skupiny působením anhydridu kyseliny octové (DMBHA pryskyřice).

(2) Zavedení argininu z polohy 17 do DMBHA pryskyřice

Po odstranění Fmoc skupin z DMBHA pryskyřice, připravené podle odstavce (1) působením 20% piperidinu v dimethylformamidu, se přidá 2,5 ekvivalentu Fmoc-Arg/Mtr/-OH, vztaženo na DMBHA pryskyřici. Kondenzační reakce se provádí v dimethylformamidu podle DIPCDI-HOBt metody. Postup kondenzační reakce se sleduje měřením ninhydrinovým testem podle Kaisera a spol. (And. Biochem. 34., 595 (1970).).

-7CZ 280870 B6 (3) Zavedení cysteinu z polohy 16

Po odstranění Fmoc skupin z DMBHA pryskyřice, která se připraví podle odstavce (2), do níž byl zaveden arginin působením 20% piperidinu v dimethylformamidu, se přidá 2,5 ekvivalentu Fmoc-Cys(MBzl)-OH, vztaženo na DMBHA pryskyřici. Kondenzační reakce se provádí v dimethylformamidu podle DIPCDI-HOBt metody; podobně jako je tomu v odstavci (2) se postup kondenzační reakce sleduje měřením ninhydrinovým testem.

(4) Zavedení aminokyselin od polohy 15 do polohy 1

Podobně jako shora uvedeno byly zbytky Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Ile, Gly, Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(terc.Bu), Cys(MBzl), Trp a Arg(Mtr) postupně zavedeny do DMBHA pryskyřice podle sekvence od C-koncové aminokyseliny. Získá se tak pryskyřice s peptidem A, chráněným chránící skupinou. Kondenzační reakce každé aminokyseliny při syntéze v pevné fázi se provádí podle podmínek, které jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka I

operace	činidlo	rozpouštědlo	doba x počet opakování
odtranéní Fmoc skupiny	20% piperidin s dimethylformamidem	DMF	5 minut x 3
promytí	—	DMF	1 minuta x	6
kondenzace	Fmoc-aminokyselina (2,5 ekv.) + DIPCDI + HOBt	DMF	2 hodiny x	1
promytí	—		1 minuta x	4

(5) Příprava peptidu vzorce A odstraněním chránících skupin, postup odstranění pryskyřice a částečné čištění

Pryskyřice s peptidem vzorce A, chráněným chránící skupinou, která se připraví podle postupů, uvedených v odstavcích (1) až (4), se nechá zreagovat s 20% piperidinem v dimethylformamidu. Odstraní se tak skupina Fmoc. Potom se provede dvouhodinová reakce při 25 °C v systému 1M TMSOf-thioanisol-TFA (10 ml trifluoroctové kyseliny v přítomnosti m-kresolu (100 ekvivalentů) a ethanthiolu (300 ekvivalentů) na 100 mg pryskyřice. Pryskyřice se odfiltruje od reakční směsi a promyje se dvakrát 1 ml trifluoroctové kyseliny. Ke směsi filtrátu a promývacích podílů se přidá 100 ml ledem ochlazeného suchého etheru. Vytvořená sraženina se odstřeluje. Zbytek se oddělí od supernatantu dekantací. Výsledný zbytek se promyje studeným etherem, rozpustí se v 10 ml 4N kyseliny octové, přidá se 830 mg (80 ekvivalentů) dithiothreitolu a směs se míchá přes noc za teploty místnosti.

-8CZ 280870 B6

Reakční roztok se odstředuje, supernatant se pak nanese na Sephadex G-l_o (3,7 x 50 cm) a zfiltruje se na gelu promýváním 4N kyselinou octovou. Frakce, které projdou Sephadexem bez zastavení, se spojí jako hlavní eluční část. Lyofilizaci se získá prášek částečně vyčištěného necyklizovaného polypeptidu vzorce A.

(6) Příprava polypeptidu vzorce A vzdušnou oxidací

Hodnota pH poloviny frakcí, které při gelové filtraci projdou Sephadexem bez zastavení, se koncentrovaným vodným amoniakem upraví na 7,5. Tento roztok se oxiduje provzdušňováním, aby proběhla cyklizační reakce. Po ukončení vzdušné oxidace se zcyklizovaný polypeptid vzorce A adsorbuje na 10 g pryskyřice Diaion HP-20, desorbuje se a eluuje se 60% acetonitrilem (v 1N kyselině octové). Eluát se zahustí za teploty místnosti a za sníženého tlaku, aby se odstranil acetonitril. Lyofilizaci se získá prášek. Tento prášek se rozpustí v malém množství vody. Roztok se nanese na Asahipak a vyčistí se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC-Model 600 vyrobený firmou Waters Co.). Gradientovou eluci acetonitrilem se získá peptid vzorce A jako jediné maximum ve výtěžku 27 % (vypočtená hodnota je založena na vztahu k pryskyřici s peptidem vzorce A, chráněným chránící skupinou).

(7) Analýza polypeptidu

Složeni aminokyselin polypeptidu, vyčištěného podle shora uvedeného postupu v odstavci (6), podle štěpení aminopeptidázou dobře odpovídá vypočtenému složení na základě sekvence aminokyselin vzorce A. Hodnota molekulové hmoty podle hmotové spektrometurie (FAB) byla 2310,048, vypočtená hodnota (M+H)⁺ byla 2309,786. Specifická rotace [α]^° získaného polypeptidu byla + 14,2 ⁰(c = 0,3, IN kyselina octová).

Příklad 2 a srovnávací příklady 1 a 2

Protivirová aktivita na virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV)

Protivirová aktivita proti HIV polypeptidu vzorce A, který byl syntetizován v příkladu 1, byla testována a vyhodnocována následujícím způsobem.

Buňky MT-4 infikované HIV (2,5.10⁴ buněk na jamku, multiplicita infekce (MOI): 0,001) byly naneseny bezprostředně po infekci spolu s testovanou látkou v různých koncentracích na mikrotitrovací desku s 96 jamkami. Po pěti dnech inkubace při teplotě 7 °C v C0₂ inkubátoru se počet buněk, které přežily, změřil MTT metodou (Pauwels a spol.: J. Virol. Methods 20., 309 až 321 (1988).). Protivirová aktivita je vyjádřena jako koncentrace, při které zasaženi buněk HIV infekcí je inhibováno z 50 % (EC 50 znamená 50 % efektivní koncentrace). Na druhé straně, aby se zjistila cytotoxicita testované sloučeniny na buňky MT-4, inkubují se virem neinfikované buňky, podobně jako bylo shora uvedeno, s testovanou sloučeninou v různých koncentracích. Cytotoxicita je

-9CZ 280870 B6 vyjádřena jako 50% cytotoxická koncentrace (CC 50) testované sloučeniny. A dále, hrubý poměr CC 50 k EC 50 (CC 50/EC 50) je vyjádřen jako efektivní poměr (SI).

•

V tabulce II jsou uvedeny hodnoty EC 50, CC 50 a SI polypeptidu vzorce A, tachyplesinu I, známého polypeptidu s afinitou na endotoxiny, a azidothymidinu, anti-HIV-činidla. Poslední dvě sloučeniny jsou uvedeny pro srovnání

Tabulka II

	testovaná látka	CC 50 (μς/ιηΐ)	EC 50 (μ9/ιη1)	SI
příklad 1	polypeptid (A)	39	0,35	110
srovnávací příklad 1	tachyplesin I	49	18,1	3
srovnávací	azidothymidin	0,80	0,00048	1700
příklad 2	(AZT)		-
Jak je	zřejmé ze shora	uvedené tabulky, polypeptid	vzorce

A podle vynálezu má poněkud silnější cytotoxicitu než tachyplesin I, jehož anti-HIV aktivita byla již dříve objevena, ale vykazuje protivirovou aktivitu v koncentraci 1/50. Při srovnání s azidothymidinem má polypeptid vzorce A EC 50 při vyšší koncentraci, ale má 60-krát vyšší CC 50, což ukazuje nízkou cytotoxicitu.

Příklad 3

Tabulka III ukazuje strukturní vzorce a fyzikální vlastnosti různých polypeptidů podle vynálezu, připravených stejným způsobem jako v příkladu 1, a jejich protivirové aktivity na HIV, které byly testovány a vyhodnocovány podobně jako v příkladu 2.

Ve sloučeninách tohoto příkladu ve shora uvedené tabulce jsou zbytky Cys v polohách 3, 7, 12, a 16 spojeny disulfidovou vazbou mezi polohami 3 a 16 a polohami 7 a 12, pokud není uvedeno jinak. Ve shora uvedené tabulce AZT znamená azidothymidin (obvyklý název: zidovudin).

-10CZ 280870 B6

Tabulka III

(3H) znamená redukovanou formu (3)

Podle tohoto vynálezu se získává nový polypeptid nebo jeho sůl s protivirovou aktivitou proti viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) a anti-HIV činidlo, které jako účinnou složku obsahuje tento nový polypeptid nebo jeho sůl.

Claims

1. Polypeptid obecného vzorce I

A₁-Trp-Cys-A2-A₃-Lys-A₄-A₂-A₃-Gly-A₄-A₄-A₂-A₃-A₃-Cys-Arg-A₅

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 (I), v němž Aj znamená atom vodíku nebo jeden či dva zbytky aminokyselin, jimiž jsou lysin a arginin,

A₂ nezávisle znamená zbytek tyrosinu, fenylalaninu nebo tryptofanu,

A₃ nezávisle znamená zbytek argininu nebo lysinu,

A₅ znamená skupinu -OH, odvozenou od karboxylové skupiny, nebo skupinu -NH₂, odvozenou od amidové skupiny,

Cys znamená zbytek cysteinu, Gly znamená zbytek glycinu, Lys znamená zbytek lysinu, Arg znamená zbytek arginu a Trp znamená zbytek tryptofanu a cysteinové zbytky v polohách 3 a 16 mohou být navázány disulfidovou vazbou -S-S- a jestliže v obou polohách 7a 12 jsou cysteinové zbytky, mohou být navázány disulfidovou vazbou -S-S-, nebo jeho sůl.

2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje polypeptid obecného vzorce I podle nároku 1.

1 výkres

-12CZ 280870 B6

Aminomethylová pryskyřice | (1) Fmoc-DMBHA . propionová kyselina

DMBHA pryskyřice

Kondenzace chráněných aminokyselin v pořadí podle sekvence peptidu _v (2) Fmoc-^^ArgíMtr)-DMBHA pryskyřice (3) Fmoo-^Cys (MBzl )-^^Arg(Mtr )DMBHA pryskyřice

I (4) Pryskyřice, kde se kondenzují aminokyseliny (chrá* něné) v polohách 15 až 1

DMBHA pryskyřice s polypeptidem vzorce I,chráněným chránícími skupinami (5) Odstranění chránících skupin a pryskyřice a redukce

Redukovaná forma polypeptidu vzorce A

Ar g- Tr p— C y s— Ty r- Ar g- Ly s- C y s- Ty r- Ar g- G1 y-11 e- y s- Ty r-Ar g- Ly sSH SH SH

-Cys-Arg-NH₂

SH (6) Oxidační cyklizace, vyčištění (HP acsorpce na pryskyřici, desorpce, HPLC chromatografie)

Polypeptid vzorce A

Obrázek 1