CN110804091B - 一种人肠道防御素5衍生线性多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人肠道防御素5衍生线性多肽，具有以下通式：SEQ ID NO:1AX1AX2ARX3GRAAX4RX5X6LX7GVAX8IX9GRLYRLAAR。本发明还公开了该多肽的制备方法和应用。本发明的多肽去除了三对定向搭配的二硫键，将剩余非疏水和非正电荷氨基酸替换为精氨酸，简化了多肽合成过程的同时，显著强化了多肽的抗菌活性。

Description

一种人肠道防御素5衍生线性多肽及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物制药和多肽合成技术领域，具体涉及一种人肠道防御素5衍生线性多肽及其制备方法和应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌（鲍曼）是一种院内感染和社区获得性条件致病菌，极易耐药。目前，临床防治耐药鲍曼感染的抗生素极为短缺，部分具有明显毒副作用的药物如多粘菌素仍在一线使用中。2017年2月27日，世界卫生组织已将耐药鲍曼列为迫切需要开发新型抗生素的头号致病菌。
抗菌肽是一类广泛存在于动植物体内的两亲性低分子量多肽。作为先天免疫屏障的重要组成分子，抗菌肽能够有效保护机体免受致病菌侵袭。理论上讲，病原菌不会对抗菌肽产生耐药，正因如此，人们寄厚望于抗菌肽能够被开发成为新一代抗生素（R. E.Hancock，Lancet，1999, 349(3): 418-422）。在全球细菌耐药形势愈加严峻的背景下，目前已有10余种针对不同细菌的抗菌肽药物上市或进入临床试验阶段（Breij A De. et al，Science Translational Medicine, 2018, 10(423): eaan4044），但尚无能够有效控制耐药鲍曼感染的抗菌肽面市。
人内源性抗菌肽防御素按照结构同源和二硫键配对方式，分为α和β两大类。人防御素5（HD5）主要由肠道潘氏细胞和生殖道粘膜上皮细胞表达分泌，其结构特征如下：①32个氨基酸残基，其中碱性氨基酸（精氨酸）6个，酸性氨基酸（谷氨酸）2个，带4个正电荷；②3对二硫键，以Cys1-Cys6/Cys2-Cys4/Cys3-Cys5方式定向搭配；③单体肽呈现β-折叠片层样结构，可浓度依赖性地聚合。由于高浓度盐离子能够屏蔽阳离子抗菌肽，HD5的抗耐药鲍曼活性在复杂环境中受到限制；增强抗菌作用、简化多肽结构能推进其药物开发（Wang, C.et al, Antimicrob Agents Chemother，2017，AAC.01504-17）。通过结构-效应关系研究，我们前期发现正电荷是决定HD5抗菌活性的关键因素（Wang, C. et al, J Med Chem,2015, 7:3083-3093）。
利用基因工程技术重组表达和化学合成是制备高纯度抗菌肽的两种方法。相比于工序复杂的重组表达方案，化学合成法简单直接，更利于药物的大规模工业制备。HD5由32个左旋氨基酸组成（SEQ ID NO:3 ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR)，含3对定向配对的二硫键。制备时为防止二硫键错配，半胱氨酸巯基必须依次烷基化封闭，合成产物也需要反复纯化。这种复杂的合成工序极大提升了多肽的制备成本，不利于后期开发应用。若能去除HD5的二硫键，多肽的合成将显著简化。事实上，HD5之所以形成3对复杂的二硫键，主要是由于肠腔中含有大量胰蛋白酶，而二硫键定向搭配能够保护多肽免受蛋白酶降解（Wanniarachchi YA. et al, Biochemistry, 2011, 50:8005-17）。鲍曼在肺部、皮肤等局部组织发生感染的机率很高。由于局部组织胰蛋白酶含量低，多肽无需利用二硫键来形成复杂的构象规避酶解。
综上所述，耐药鲍曼感染严重威胁人类健康，新型抗生素的研发迫在眉睫。人体内源性抗菌肽HD5具有抗耐药鲍曼活性，且不易被细菌耐受。HD5在体液环境中易受干扰，抗菌作用减弱；多肽复杂的二硫键配对增加了化学合成成本，不利于工业化制备生产。增加多肽的精氨酸含量、去除二硫键配对有望推进HD5的药用开发。
发明内容
本申请的目的在于提供一种便于人工合成、有利于工业化制备生产的抗多重耐药鲍曼不动杆菌的多肽，用以解决现有抗生素短缺、治疗效果有限的缺陷。
为实现上述目的，本申请提供一种人肠道防御素5衍生线性多肽，该多肽具有以下通式：
SEQ ID NO:1 AX1AX2ARX3GRAAX4RX5X6LX7GVAX8IX9GRLYRLA
AR，
其中，X1选自Thr、Lys或Arg中的一种；
X2选自Tyr、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X3选自Thr、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X4选自Thr、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X5选自Glu、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X6选自Ser、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X7选自Ser、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X8选自Glu、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种；
X9选自Ser、Lys或Arg中的一种，优选为Lys或Arg中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述人肠道防御素5衍生线性肽的序列为SEQID NO:2 ARARARRGRAARRRRLRGVARIRGRL YRLAAR。将HD5的非碱性氨基酸突变为精氨酸后，多肽的抗菌活性显著提高。精氨酸不仅跟多肽的静电吸附以及高斯曲率的形成相关，还利于分子跨膜定位和毒素中和能力。
在根据本发明的一个实施方案中，所述多肽在水溶液中呈无规则卷曲，在脂质环境中呈螺旋结构。
本发明还提供了上述多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）称取适量 2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入多肽合成仪反应器中，用二氯甲烷（DCM）浸泡，然后相继以二甲基甲酰胺 (DMF) 和DCM洗涤；
2）向步骤1）所述的多肽合成反应器中加入0.399 mmol N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH）和 DCM、N,N-二异丙基乙胺（DIEA），反应90 min；Fmoc-Arg(pbf)-OH的用量和树脂量以及取代度相关；由于本发明的肽链属于中长肽，取代度取0.3 mmol/g；树脂用量为1 g，Fmoc-Arg(pbf)-OH的摩尔量为0.3 mmol（1 g×0.3 mmol/g）；由于缩合效率为70%左右，实际合成时称取量为0.399 mmol（0.3×1.33），因此在本发明的制备方法中的物料比例为，物料比例为，树脂量：DCM：DIEA=1g：14-18mL：0.9-1.1mL，优选为树脂量：DCM：DIEA=1g：16mL：1mL；。其中，每1g树脂对应的加入0.399mmol的N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH）。
3）向所述多肽合成反应器中加入适量的分析甲醇和DCM,其中甲醇和DCM的体积比为1：2， 封闭反应20 min后，用DMF洗涤，
4）加入哌啶脱除剂，所述哌啶脱除剂由哌啶和DMF以1：4的体积比混合而成, 脱除9-芴甲氧羰基（Fmoc），然后以DMF洗涤树脂；
5）按照多肽序列中氨基酸的次序依次投料；优选地，投料量过量投入，优选为实际需要的摩尔量的3倍；3倍摩尔量是反应效果最经济、最有效的一种方法，超过3倍会导致成本增加，少于3倍量，合成耗时延长。
6）将1-羟基苯并三唑（HoBt）/ N, N，-二异丙基碳二亚胺（DIC）/DMF体系加入反应器中，加入DMF，在反应1 h后用DMF洗涤，优选为洗涤4次；
7）以哌啶脱除剂脱保护，直至最后Ala脱保护结束，相继以DMF和甲醇洗涤，抽干；
8）将树脂倒入50 mL离心管，加入切割液，室温切割1.5 h；其中，所述切割液由三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、1,2-乙二硫醇（EDT）和水以95：2：2：1的体积比混合而成；优选地，树脂质量与切割液体积的比例为1g/10mL；此条件下，树脂肽在切割液中具有很好的流动性，有效时间内氨基酸侧链保护基团能够完全切除；切割液过多，只会让后续处理中乙醚的量增多，造成不必要的成本浪费。
9）过滤取滤液，在滤液中加入冰乙醚洗涤数次，得到粗品。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤5)中按照以下顺序分别称取适量的氨基酸投料Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤9）中，所述滤液与乙醚的体积比为1：8, 摇匀后3000rpm离心2 min，倒出上清液，再加入乙醚摇匀离心，重复洗涤离心三次。
在根据本发明的一个实施方案中，所述制备方法还包括以下纯化步骤：
10）通过液相色谱法对步骤9）所致的粗品进行纯化。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤10）中所述液相色谱法中，色谱柱为daisogel色谱填料；流动相A为体积分数为0.1%的TFA水溶液；流动相B由TFA与乙腈混合而成，其中TFA的体积分数为0.1%。
本发明还提供了一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包含如权利要求1-3中任一项所述的多肽。
本发明进一步提供了上述多肽在制备抗菌组合物中的应用。
本申请具有如下优点：
本申请多肽富含正电荷精氨酸、不含二硫键，带正电荷的精氨酸在人α-防御素序列中高度保守。将HD5的非碱性氨基酸变为精氨酸后，多肽的抗菌活性显著提高。精氨酸不仅跟多肽的静电吸附以及高斯曲率的形成相关，还利于分子跨膜定位和毒素中和能力。
结构弹性好。相比于母本肽HD5，该衍生线性肽抗多重耐药鲍曼活性显著增强，合成难度和成本大幅降低；相比于传统抗生素，该线性肽救治多重耐药鲍曼肺部感染小鼠的能力明显提高，药用价值好。
附图说明
图1为本申请的AR32多肽设计思路图。
图2为本申请的AR32多肽液相色谱图。
图3为本申请的AR32多肽质谱鉴定图。
图4为HD5多肽和本申请的AR32多肽在水溶液和十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中的圆二色谱扫描曲线。
图5为本申请的AR32多肽生物安全性评估结果柱状图。
图6为本申请的AR32多肽放射创面感染动物实验的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1 本申请的AR32多肽设计思路
如图1所示，本申请的AR32多肽是根据HD5的结构-效应关系研究结果设计而成。HD5多肽由32个氨基酸组成，结构相对复杂，化学合成成本较高；将3对二硫键替换为丙氨酸后（HD5d1），HD5抗多重耐药鲍曼（陆军军医大学西南医院分离鉴定，见文献Wang C. et al,ANTIMICROB AGENTS CH, 2018, 62(2): e01504-17）活性显著下降（表1）。本申请AR32多肽是通过将线性HD5衍生肽HD5d1的2号位点苏氨酸、4号位点酪氨酸、7号位点苏氨酸、12号位点苏氨酸、14号位点谷氨酸、15号位点丝氨酸、17号位点丝氨酸、21号位点谷氨酸、23号位点丝氨酸替换为精氨酸而得。
实施例2 本申请的AR32多肽微量肉汤稀释法抗菌实验
（1）按100 mL培养基溶解1.5 g琼脂粉（上海生工，AJ637）制备MHB（OXIOD,CM0337）平板，培养基凝固后以封口膜密封，4℃储存备用。
（2）吸取10 μL多重耐药鲍曼不动杆菌菌液，三线法接种细菌至MHB平板上。倒置，37℃细菌培养箱，过夜培养。
（3）以无菌枪头挑取单克隆细菌，接种到10 mL灭菌MHB培养基中，37℃恒温摇床，200 rpm，过夜培养。
（4） 按1:100将细菌接种到10 mL灭菌MHB培养基中，37℃恒温摇床，200rpm，培养至细菌对数生长期。吸取1 mL菌液，4℃低温离心，8000rpm，5min。
（5） 弃上清，以1mL MHB培养基重悬细菌，再次4℃低温离心，8000 rpm，5min，反复清洗3次。
（6）MHB倍比稀释，将细菌浓度调整至2×105 CFU/mL，置于冰面备用。
（7）用0.01% 醋酸（含0.2% BSA）溶液溶解多肽和抗生素，调整药物浓度至25、50、100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600μg/mL。
（8）灭菌聚丙烯96孔板（Corning，3365）中分别加入100μL菌液（2×105 CFU/mL）和10μL不同浓度的抗菌药物，混匀，孔板加盖。37 ℃恒温孵箱中培养24h。
（9）酶标仪读取孔板600 nm吸光度，读数前孔板平行震荡5s。按照Hancock实验室改良的适于抗菌肽MIC的读取标准（Wu M，et al. J Biol Chem，1999，274:29-35），杀菌率超过70%对应的多肽浓度为MIC。阿米卡星（上海生工，A602234）、头孢克肟（上海生工，A601276）和环丙沙星（上海生工，A600310）的MIC判断标准为杀菌率超过99%。
表1 AR32多肽、现有抗菌肽及传统抗生素杀灭鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC，μg/mL）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
如表1所示，AR32多肽杀灭多重耐药鲍曼株的MIC低至2.5 μg/mL，抗菌效果较HD5d1（2560μg/mL）和HD5（320μg/mL）显著增强，且优于传统抗生素。由于结构简单，AR32多肽容易合成，制备成本低，是一种潜在的新型抗生素。
微量肉汤稀释法抗菌实验结果提示，本申请中AR32多肽杀伤多重耐药鲍曼不动杆菌的MIC为2.5μg/mL，是HD5的1/128（表1）。相比于传统抗生素阿米卡星、头孢克肟、环丙沙星（MIC分别为160、640、320μg/mL），AR32多肽有明显的抗菌优势。
在本申请中，多重耐药鲍曼不动杆菌包括头孢菌素类（如头孢他啶或头孢吡肟）、碳青霉烯类（如亚胺培南）、β-内酰胺酶抑制剂（如头孢哌酮/舒巴坦）、氟喹诺酮类（如环丙沙星）和氨基糖苷类（如阿米卡星）。若对以上抗菌药物均耐药，包括头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/三唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星则称之为泛耐药鲍曼不动杆菌（PDR-AB）。
实施例3 本申请的AR32多肽化学合成及纯化
（1）固相化学合成：称取0.5 g 2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入多肽合成仪反应器中，用4mL二氯甲烷（DCM）浸泡5min，4mL二甲基甲酰胺 (DMF) 洗涤2次，DCM洗涤一次；加入126.36mg N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH）和6 mL DCM、0.2 mL N,N-二异丙基乙胺（DIEA），反应90 min；补加0.5 mL分析甲醇和1mL DCM, 封闭反应20 min后，用DMF洗涤4次，加入哌啶（20%哌啶+80%DMF), 脱除9-芴甲氧羰基（Fmoc）。DMF洗涤树脂5次，取少量树脂加入检测管中，加入2滴茚三酮（5g/100mL分析乙醇），2滴吡啶, 100℃条件下加热2 min显色。
按照以下顺序分别称取氨基酸投料Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,投料量为3倍摩尔量。将1-羟基苯并三唑（HoBt）/ N, N，-二异丙基碳二亚胺（DIC）/DMF体系加入反应器中，加入5 mL DMF，反应1 h后用DMF洗涤4次，20% 哌啶/DMF溶液脱保护20 min，直至最后Ala脱保护结束，DMF洗涤4次，甲醇洗涤3次抽干。
将树脂倒入50 mL离心管，加入切割液（三氟乙酸（TFA）/三异丙基硅烷（TIS）/1,2-乙二硫醇（EDT）/水=95/2/2/1）, 树脂/切割液为1g/10 mL，室温切割1.5h。将液体过滤到50mL平底离心管，加入冰乙醚(滤液/乙醚=1/8), 摇匀后3000rpm离心2min，倒出上清液，再加入乙醚摇匀离心。按此方法洗涤离心三次，得到粗品。
（2）多肽纯化：
多肽粗品用北京创新通恒 LC3000液相色谱仪，江苏智润科技制备色谱柱（20 ×250mm, 8μm daisogel色谱填料）纯化，流动相A为0.1% TFA/水，B为0.1% TFA/乙腈，收集目标峰，获得纯品AR32多肽。
（3）多肽检测
SHIMADZU高效液相色谱分析纯品AR32多肽的纯度，分析柱为Inertsil ODS-SP(4.6×250 mm×5 μm)，进样体积为30μL，流动相A为0.1% TFA/水，B为0.1% TFA/乙腈，流速1mL/min，检测波长220 nm。如图2所示，本申请多肽在8.812 min处出峰，纯度达95.1%。SHIMADZU LC-MS 2010 液相色谱质谱联用仪分析出峰产物的分子量为3815.6（图3），与理论分子量一致。
实施例4本申请的AR32多肽二级结构分析
（1）用灭菌超纯水分别配制200 μg/mL多肽和40 mM十二烷基磺酸钠（SDS）溶液（模拟脂环境，见文献Wang C. et al, Sci Rep, 2016, 6:22875)。移液器吸取125 μL多肽溶液，分别与等体积超纯水和SDS溶液混合，获得250μL浓度为100μg/mL的多肽水溶液和SDS溶液，室温平衡1h。
（2）取200μL多肽或多肽-SDS溶液，转移到1mm光程的石英池内，超声去泡。
（3）设置应用物理（Applied Photophysics）圆二色谱扫描仪的测量温度为27℃，记录样本190-260 nm的椭圆度，间隔2 nm读数一次，总扫描时间约73 s。
（4）独立实验，重复3次，使用Pro-Data Chirascan软件对测量结果进行平均平滑处理。
如图4所示，HD5和本申请AR32多肽在水溶液和SDS脂质环境中的圆二色谱扫描曲线。HD5在水溶液和脂环境中均呈现β片层样结构。AR32多肽在水溶液中成无规则卷曲，SDS脂球中则为α螺旋样结构。由此可见，二硫键去除和位点突变改变了HD5的结构特征，本申请AR32多肽具有较好的结构弹性。
实施例5 本申请的AR32多肽生物安全性评估
（1）溶血性评估：自陆军军医大学实验动物中心购买8周龄雌性BALB/c小鼠，摘眼球取血，快速收集血液至灭菌EP管内；4℃低温12000 rpm，离心10min，收集红细胞。以4倍体积的冷却PBS重悬沉淀红细胞，4 ℃低温12000 rpm，离心10min，弃上清。再次低温600 rpm离心10 min，弃上清，去除血小板。4倍体积的冷却PBS再次重悬沉淀红细胞，制成20%红细胞工作液，置于冰上备用。
灭菌超纯水配制多肽浓度至50和100μg/mL，吸取100μL多肽或超纯水与100μL红细胞工作液至灭菌EP管内，移液器吹打混匀，37 ℃恒温培养箱15 min。吸取100μL上清至96孔板内，用酶标仪测定OD570吸光度值。
多肽与红细胞共孵育后的吸光度计为Apep，无药物处理阴性对照组吸光度计为Ablank,Triton X-100 100%溶血吸光度计为Atot。多肽溶血性按（Apep-Ablank）/（Atot-Ablank）×100计算。该方案已报道于文献Wang C. et al, J Med Chem, 2015, 58, 3083-3093。
（2）细胞毒性评估：37℃、5% CO2条件下用1640细胞培养基（Gibco公司）培养人角质细胞株HACAT。胰酶消化贴壁细胞，按4×104 CFU/mL密度将细胞接种于无菌96孔板中，每孔100μL。细胞再次贴壁后，弃上清，更换100 μL新鲜培养基，加入终浓度为50和100μg/mL的多肽溶液，混匀，继续培养24 h。弃上清，每孔加入100μL无血清培养基和10μL CCK-8试剂（Dojindo）。37℃、5% CO2条件下培养1h。酶标仪检测悬液OD450吸光度值。多肽孵育后细胞吸光度计为Apep，对照无处理组吸光度计为Atot。细胞存活率按Apep/Atot×100计算。
如图5所示，作为人体内源性分子，HD5在100 μg/mL浓度下溶血率低于1%，不影响人角质细胞的存活率；结构简化和位点突变后，衍生多肽AR32同样具有优异的生物安全性。
实施例6本申请的AR32多肽放射创面感染动物实验
（1）8周龄BALB/c雌性小鼠（18-22g）在X射线辐照仪（Rad Source，RS2000）中接受6Gy一次性辐照，SPF动物房中饲养。小鼠随机分成4组，每组10只。
（2）细菌以灭菌MHB培养基培养至对数生长期，4℃低温离心8000rpm，去上清，用PBS稀释细菌至1×108CFU/mL。
（3）辐照后第5天，用异氟烷气体麻醉小鼠，滴鼻给予50μL多重耐药鲍曼，建立小鼠鲍曼肺部感染模型。
（3）辐照后第6天，用同样的方法麻醉小鼠，滴鼻给予50μL浓度为100μg/mL的AR32和环丙沙星CIP，每天1次，连续给药3天。小鼠分笼饲养。连续观察2周，记录小鼠死亡率。
如图6所示，由于射线影响机体免疫力，辐照小鼠在无任何干预措施的条件下，两周存活率为80%；感染耐药鲍曼不动杆菌后，14天死亡率高达90%，传统抗生素环丙沙星无明显疗效。等浓度的本申请AR32多肽滴鼻，小鼠存活率增至50%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种人肠道防御素5衍生线性多肽及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Thr、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> Thr、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> Thr、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (12)..(12)
<223> Thr、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14)..(14)
<223> Glu、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (21)..(21)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (23)..(23)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (4)..(4)
<223> The 'Xaa' at location 4 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (7)..(7)
<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (12)..(12)
<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (14)..(14)
<223> The 'Xaa' at location 14 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> The 'Xaa' at location 17 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (21)..(21)
<223> The 'Xaa' at location 21 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (23)..(23)
<223> The 'Xaa' at location 23 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)..(5)
<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (13)..(13)
<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (25)..(25)
<223> The 'Xaa' at location 25 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (45)..(45)
<223> The 'Xaa' at location 45 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (53)..(53)
<223> The 'Xaa' at location 53 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (57)..(57)
<223> The 'Xaa' at location 57 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (65)..(65)
<223> The 'Xaa' at location 65 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (81)..(81)
<223> The 'Xaa' at location 81 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (89)..(89)
<223> The 'Xaa' at location 89 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Ala Xaa Ala Xaa Ala Arg Xaa Gly Arg Ala Ala Xaa Arg Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa Gly Val Ala Xaa Ile Xaa Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> human hd5(human hd5)
<400> 2
Ala Arg Ala Arg Ala Arg Arg Gly Arg Ala Ala Arg Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Arg Gly Val Ala Arg Ile Arg Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Ala Ala Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> human hd5(human hd5)
<400> 3
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25 30

Claims (9)

1.一种人肠道防御素5衍生线性多肽，其特征在于，所述人肠道防御素5衍生线性肽的序列为SEQ ID NO:2 ARARARRGRAARRRRLRGVARIRGRL YRLAAR。
2.如权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括：
1）称取适量 2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入多肽合成仪反应器中，用二氯甲烷（DCM）浸泡，然后相继以二甲基甲酰胺 (DMF) 和DCM洗涤；
2）向步骤1）所述的多肽合成反应器中加入适量 N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH）和 16 mL DCM、1 mLN,N-二异丙基乙胺（DIEA），反应90 min；其中，物料比例为，树脂量：DCM：DIEA=1 g：14-18mL：0.9-1.1mL，且每1g树脂对应的加入0.399 mmol的N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH）；
3）向所述多肽合成反应器中加入0.5 mL分析甲醇和1 mL DCM, 封闭反应20 min后，用DMF洗涤，
4）加入哌啶脱除剂脱除9-芴甲氧羰基（Fmoc），然后以DMF洗涤树脂，所述哌啶脱除剂由哌啶和DMF以1：4的体积比混合而成；
5）按照多肽序列中氨基酸的次序依次投料；
6）将1-羟基苯并三唑（HoBt）/ N, N，-二异丙基碳二亚胺（DIC）/DMF体系加入反应器中，加入DMF进行反应；
7）以哌啶脱除剂脱保护，直至最后Ala脱保护结束，然后相继以DMF和甲醇洗涤，抽干；
8）将树脂倒入50 mL离心管，加入切割液，室温切割1.5 h；其中，所述切割液由三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、1,2-乙二硫醇（EDT）和水以体积比95：2：2：1的比例混合而成；
9）过滤并取滤液，在滤液中加入冰乙醚洗涤，得到粗品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中树脂量：DCM：DIEA=1 g：16mL：1mL。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中按照以下顺序分别称取适量的氨基酸投料Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤9）中，所述滤液与冰乙醚的体积比为1：8, 摇匀后3000 rpm离心2 min，倒出上清液，再加入冰乙醚摇匀离心。
6.如权利要求2-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下纯化步骤：
10）通过液相色谱法对步骤9）所制的粗品进行纯化。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤10）中所述液相色谱法中，色谱柱为daisogel色谱填料；流动相A为体积分数为0.1% 的TFA水溶液；流动相B由TFA与乙腈混合而成，其中TFA的体积分数为0.1%。
8.一种抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物包含如权利要求1所述的多肽。
9.如权利要求1所述的多肽在制备抗鲍曼不动杆菌组合物中的应用。
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