ES2952858T3

ES2952858T3 - Nuevos polipéptidos y uso médico de los mismos

Info

Publication number: ES2952858T3
Application number: ES17726194T
Authority: ES
Inventors: Matthias Mörgelin; Suado Abdillahi
Original assignee: Colzyx AB
Current assignee: Colzyx AB
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2023-11-06
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: US11136374B2; WO2017125585A2; EP4253406A3; HRP20231044T1; US10793618B2; CN109069693A; CN113717271A; EP3405222C0; EP3405222A2; US20210403535A1; EP3405222B1; CN109069693B; PL3405222T3; US20240043500A1; WO2017125585A3; GB201601136D0; RS64556B1; WO2017125585A9; US11814422B2; US20190023767A1

Abstract

La presente invención proporciona polipéptidos que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos derivada de colágeno tipo VI o un fragmento, variante, fusión o derivado del mismo, o una fusión de dicho fragmento, variante o derivado del mismo, en donde el polipéptido, fragmento, variante, fusión o derivado es capaz de matar o atenuar el crecimiento de microorganismos. Aspectos relacionados de la invención proporcionan las correspondientes moléculas de ácido nucleico aisladas, vectores y células huésped para producir los mismos. Además se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de la invención, así como métodos de uso de las mismas en el tratamiento y/o prevención de infecciones microbianas y en el cuidado de heridas. También se proporcionan un método para matar microorganismos in vitro y un dispositivo médico asociado con la composición farmacéutica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos polipéptidos y uso médico de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos derivados de una proteína componente de la matriz extracelular de origen natural, colágeno tipo VI, con propiedades antimicrobianas. La invención también se refiere al uso de estos polipéptidos en el tratamiento de infecciones microbianas o en el cuidado de heridas. También se proporcionan kits, dispositivos y composiciones que incorporan estos polipéptidos.

Introducción

Durante la última década, el aumento de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos convencionales se ha convertido en una importante amenaza para la atención sanitaria mundial (1, 2). Por lo tanto, es de gran interés desarrollar nuevos agentes antimicrobianos para luchar contra las enfermedades infecciosas emergentes. Los mecanismos de defensa rápida del huésped son esenciales para superar las acciones nocivas de las bacterias patógenas. Los péptidos antimicrobianos (AMP) son potentes moléculas del sistema de defensa inmunitario innato que proporcionan una respuesta rápida y no específica contra los patógenos invasores, y que representan la primera línea de defensa contra los patógenos invasores en la mayoría de los organismos pluricelulares. Los AMP presentan una actividad de amplio espectro frente a bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, hongos y virus y parásitos (3-8). A pesar de sus diversos orígenes, los AMP comparten varias propiedades fisicoquímicas, que son cruciales para su naturaleza antimicrobiana directa. Estos péptidos son moléculas relativamente pequeñas (10-50 aminoácidos) y suelen tener una carga neta positiva que varía entre 2 y 9 (4, 9-10). 0tra característica recurrente es que a menudo poseen >30% de residuos hidrófobos, lo que les permite adoptar una estructura anfipática al entrar en contacto con un entorno de tipo lipídico, por ejemplo la membrana bacteriana (4). En la actualidad, se han aislado más de dos mil AMP de una amplia gama de especies, incluidas plantas, insectos y mamíferos (véase Base de datos de péptidos antimicrobianos, http:// aps.unmc.edu/AP/main.php).

Es comúnmente aceptado que los AMP son activos de membrana y dañan la célula diana alterando la integridad de la membrana (11) o causando alteraciones intracelulares (12). Sin embargo, se han propuesto diferentes modos de acción para varios AMP, pero los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo objeto de investigación (13 16).

Aparte de su actividad antimicrobiana directa, algunos péptidos (p. ej., LL-37) también tienen funciones inmunomoduladoras como ser quimiotácticos, neutralizar la endotoxina (p. ej., LPS), mejorar la cicatrización de heridas, la angiogénesis y la regulación de la producción de citoquinas proinflamatorias (17-18). Su actividad antimicrobiana de amplio espectro, junto con un mecanismo de baja resistencia bacteriana, hace de estos AMP agentes terapéuticos atractivos contra las infecciones (8, 19), pero sigue existiendo la necesidad de terapias antimicrobianas y AMP adicionales.

Las proteínas de la matriz extracelular (MEC) como los colágenos, la fibronectina, la laminina y la vitronectina son dianas atractivas para las bacterias patógenas con el fin de adherirse, invadir y colonizar el tejido conjuntivo del huésped (20). A pesar de ello, cada vez hay más pruebas de que las proteínas de la MEC pueden tener un papel protector durante la fase inicial de la infección (21-24). El colágeno de tipo VI es un componente ubicuo de la matriz extracelular, presente en todos los tejidos conjuntivos y a menudo asociado a las membranas basales. El colágeno de tipo VI forma una red microfibrilar compleja y extensa en la mayoría de los tejidos conjuntivos. La forma predominante del colágeno tipo VI está compuesta por tres cadenas polipeptídicas distintas, a1(Vl), a2(VI) y a3(VI), que forman monómeros de triple hélice. En el interior de la célula, los monómeros se ensamblan en dímeros y tetrámeros que son secretados al espacio extracelular. Allí, los tetrámeros se agregan de extremo a extremo para formar microfibrillas que pasan a formar parte de ensamblajes de matrices supramoleculares extendidas. Más recientemente, se descubrieron tres cadenas adicionales (a4, a5 y a6), que pueden sustituir a la cadena a3 en algunos tejidos (9, 10). En términos de estructura, cada cadena a se caracteriza por una región triple helicoidal corta y extendida, flanqueada por dos grandes regiones globulares N- y C-terminales, que comparten homología con los dominios tipo A del Factor von Willebrand (VWA) (25-27). La VWA también es responsable de la interacción proteínaproteína en la MEC (25-28). Las cadenas a1(VI) y a2(VI) del colágeno tipo VI contienen un dominio VWA N-terminal (N1) y dos dominios VWA C-terminales (C1 y C₂), mientras que la cadena a3(VI) es mucho más grande y comprende unos diez dominios VWA N-terminales (N10-N1) y dos dominios VWA C-terminales. Además, la cadena a3(VI) tiene tres dominios C-terminales (C3-C5) que comparten homología con proteínas de glándulas salivales, repeticiones de fibronectina tipo III y la familia Kunitz de inhibidores de serina proteasa (29). Con su configuración única, el colágeno de tipo VI proporciona resistencia, integridad y estructura a una amplia gama de tejidos. También interviene en otros procesos biológicos importantes como la apoptosis, la autofagia, la angiogénesis, la fibrosis y la reparación de tejidos (30).

Se ha demostrado previamente que los péptidos derivados del Factor von Willebrand que contienen secuencias de unión a heparina consensuadas (motivos Cardin y Weintraub) (31) presentan actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (32-33). Específicamente, Andersson et al. 2004 (European Journal of Biochemistry, 2004, 271(1):1219-1226) se relaciona con los motivos estructurales asociados con la unión a la heparina (cationicidad, anfipaticidad y regiones consenso) y sus efectos sobre las propiedades antimicrobianas de los péptidos (32).

Abdillahi et al. 2012 (Journal of Innate Immunity, 2015, 4(4):371-376) analiza que el colágeno tipo VI se une al Streptococcus pneumonía y a los estreptococos de los grupos A, C y D (35), lo que provoca la muerte bacteriana (36). Abdillahi et al. 2015 (Journal of Innate Immunity, 2015, 7(5):506-507) analiza que también se han demostrado efectos adhesivos y bactericidas similares de las microfibrillas de colágeno tipo VI frente a Moraxella catarrhalís y otros patógenos pulmonares humanos Gram negativos y Gram positivos (37). Sin embargo, no se han aportado explicaciones estructurales o mecanicistas para tales observaciones anecdóticas.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevos agentes antimicrobianos, y especialmente agentes capaces de eliminar o inhibir el crecimiento de bacterias como MRSA que han desarrollado resistencia contra los antibióticos convencionales.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Un primer aspecto de la invención proporciona un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5 de la cadena a3 del colágeno tipo VI; y

(b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con una secuencia según una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5;

en el que el polipéptido no tiene más de 200 aminoácidos de longitud; y

en el que el polipéptido es capaz de eliminar o atenuar el crecimiento de microorganismos.

Los expertos en la materia apreciarán que el colágeno de tipo VI puede proceder de una fuente humana o no humana. Por ejemplo, el colágeno de tipo VI puede derivarse (directa o indirectamente) de un mamífero no humano, como un simio (p. ej., chimpancé, bonobo, gorila, gibón y orangután), mono (p. ej., macaco, babuino y colobo), roedor (p. ej., ratón, rata) o ungulados (p. ej., cerdo, caballo y vaca).

Así, por "colágeno de tipo VI" (también "colágeno VI") incluimos el colágeno humano de tipo VI natural y sus homólogos, como el colágeno bovino de tipo VI. En una realización preferente, el polipéptido se deriva del colágeno humano de tipo VI.

La secuencia de aminoácidos del colágeno tipo VI corresponde a un fragmento de colágeno tipo VI con actividad antimicrobiana.

Por "capaz de eliminar o atenuar el crecimiento de microorganismos" incluimos los polipéptidos con actividad antimicrobiana. La actividad antimicrobiana puede ser total o parcial, y puede depender de la dosis. Esto puede demostrarse, por ejemplo, mediante ensayos de difusión radial.

Los microorganismos contra los que los polipéptidos de la invención son eficaces pueden seleccionarse del grupo que consiste en bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y virus.

En una realización, el polipéptido de la invención es capaz de unirse a la membrana del microorganismo. En otra realización, el polipéptido puede tener afinidad por superficies cargadas negativamente, por ejemplo una membrana bacteriana. Esta afinidad puede comprobarse, por ejemplo, mediante la afinidad a la heparina, en la que una mayor afinidad a la heparina indica una mayor afinidad a las superficies cargadas negativamente.

Ventajosamente, la afinidad o capacidad de unión del polipéptido es comparable o mayor que la de LL-37. Así, en una realización, el polipéptido es capaz de exhibir un efecto antimicrobiano mayor o igual al de LL-37(es decir, LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES; SEQ ID NO: 36).

En una realización, el polipéptido es capaz de causar alteraciones estructurales al microorganismo, incluyendo, por ejemplo, perturbaciones de membrana, sangrado o exudación de constituyentes citoplasmáticos.

Por lo tanto, el polipéptido puede ser capaz de causar la rotura de la membrana de los microorganismos. Esto puede, por ejemplo, cuantificarse mediante estudios de microscopía, como la microscopía electrónica o la microscopía de fluorescencia, estudiando la captación de moléculas fluorescentes por los microorganismos.

En otra realización, el polipéptido puede ser capaz de promover el cierre de heridas y/o la cicatrización de heridas. Por "favorecer el cierre de la herida" y/o "la cicatrización de la herida" se entiende ayudar al proceso de cicatrización de la herida, por ejemplo acelerando la cicatrización. Por ejemplo, el producto para el cuidado de heridas puede ser capaz de potenciar la regeneración epitelial y/o la cicatrización de los epitelios de la herida y/o del estroma de la herida. En una realización, el producto para el cuidado de heridas puede ser capaz de potenciar la proliferación de células epiteliales y/o estromales a través de un mecanismo no lítico. La capacidad de cierre de la herida puede cuantificarse, por ejemplo, mediante experimentos de rascado celular.

Por lo tanto, el polipéptido puede tener un papel en el cuidado de heridas al promover el cierre/curación de heridas y/o al prevenir la infección de una herida.

Las heridas a tratar por los polipéptidos de la invención pueden ser extracorpóreas (es decir, heridas superficiales de la piel y el tejido subyacente) y/o intracorpóreas (como heridas internas debidas a trasplante de órganos o extirpación de tejido/partes de órganos, por ejemplo, tras cirugía de colon).

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden ejercer un efecto antimicrobiano contra bacterias Gram-positivas y/o Gram-negativas. Por ejemplo, los microorganismos pueden ser bacterias seleccionadas del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, estreptococos del grupo A (p. ej.Streptococcus pyogenes), estreptococos del grupo B (p. e j. Streptococcus agalactiae), estreptococos del grupo C (p. ej. Streptococcus dysgalactiae), estreptococos del grupo D (p. ej.,Enterococcus faecalis), estreptococos del grupo F (p. ej., Streptococcus anginosus), estreptococos del grupo G (p. ej., Streptococcus dysgalactiae equisimilis), estreptococos alfa-hemolíticos (p. ej. , Streptococcus viridens) y estreptococos del grupo B (p. ej., Streptococcus agalactiae). Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae), Streptococcus bovis, Streptococcus mitis, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptococcus mutans, Moraxella catarrhalis , Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi), Haemophilus influenzae b (Hib), Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus cloacae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA), Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA), Escherichia coli multirresistente (MREC), Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) y Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP).

En una realización, los microorganismos son bacterias resistentes a uno o más agentes antibióticos convencionales. Por "agente antibiótico convencional" incluimos agentes conocidos que son capaces de eliminar o atenuar el crecimiento de microorganismos, por ejemplo penicilinas y cefalosporinas naturales y sintéticas, sulfonamidas, eritromicina, kanomicina, tetraciclina, cloranfenicol, rifampicina e incluyendo gentamicina, ampicilina, benzipenicilina, penicilina benetamina, penicilina benzatina, feneticilina, fenoximetilpenicilina, penicilina procaína, cloxacilina, flucloxacilina, meticilina sódica, amoxicilina, clorhidrato de bacampicilina, ciclacilina, mezlocilina, pivampicilina, clorhidrato de talampicilina, carfecilina sódica, piperacilina, ticarcilina, mecillinam, pirmecillinan, cefaclor, cefadroxil, cefotaxima, cefoxitina, cefsulodina sódica, ceftazidima, ceftizoxima, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefradina, latamoxef disódico, aztreonam, clorhidrato de clortetraciclina, clomociclina sódica, clorhidrato de demeclocidina, doxiciclina, limeciclina, minociclina, oxitetraciclina, amikacina, sulfato de framicetina, sulfato de neomicina, netilmicina, tobramicina, colistina, fusidato sódico, sulfato de polimixina B, espectinomicina, vancomicina, sulfaloxato cálcico, sulfametopirazina, sulfadiazina, sulfadimidina, sulfaguanidina, sulfaurea, capreomicina, metronidazol, tinidazol, cinoxacina, ciprofloxacina, nitrofurantona, hexamina, estreptomicina, carbenicilina, colistimetato, polimixina B, furazolidona, ácido nalidíxico, trimetoprim-sulfametox-azol, clindamicina, lincomicina, cicloserina, isoniazida, etambutol, etionamida, pirazinamida y similares; agentes antifúngicos, por ejemplo miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, anfotericina, flucitosina, griseofulvina, natamicina, nistatina y similares; y agentes antivirales como aciclovir, AZT, ddl, clorhidrato de amantadina, inosina pranobex, vidarabina y similares. Así, en una realización, el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) (Staphylococcus aureusresistente a meticilina), Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA), Escherichia coli multirresistente (MREC), Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) y Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP).

Ventajosamente, el polipéptido según el primer aspecto de la invención exhibe toxicidad selectiva a agentes microbianos. Por "selectivo" entendemos que el polipéptido es preferentemente tóxico para uno o más microorganismos (como bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y/o virus) en comparación con las células huésped de mamífero, p. ej. humanas. Por ejemplo, la toxicidad del polipéptido para un microorganismo diana es al menos dos veces mayor que la toxicidad de ese polipéptido para las células de mamífero, más preferiblemente al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos ocho veces, al menos diez veces, al menos quince veces o al menos veinte veces.

Convenientemente, el polipéptido es sustancialmente no tóxico para las células de mamíferos, por ejemplo humanas.

Por ejemplo, el polipéptido puede no mostrar citotoxicidad para los eritrocitos o monocitos a concentraciones que pueden utilizarse para eliminar microorganismos como bacterias. En una realización, el polipéptido no muestra citotoxicidad a una concentración de hasta 30μM, o alternativamente a una concentración de hasta 50μM.

De este modo, cuando los compuestos se utilizan para tratar infecciones microbianas, por ejemplo, los regímenes de dosificación pueden seleccionarse de modo que las células microbianas se destruyan con un daño mínimo para el tejido sano del huésped. Así, el polipéptido puede presentar una "ventana terapéutica".

En una realización, el polipéptido es capaz de ejercer un efecto antiendotóxico.

Por "efecto antiendotóxico" se entienden los polipéptidos que contrarrestan los efectos inducidos por las endotoxinas. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido es capaz de suprimir, al menos en parte, la inducción de nitrito por LPS.

En una realización, el polipéptido se deriva de o muestra homología de secuencia de aminoácidos con un dominio VWA, por ejemplo un dominio VWA globular. Así, el polipéptido puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que corresponda a al menos cinco (por ejemplo, al menos 10, 15, 20 o más) aminoácidos contiguos de un dominio vWa , o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 70% (por ejemplo, al menos un 80%, 90% o 95%) de identidad con dicha secuencia.

En otra realización, el polipéptido puede comprender o consistir en un dominio VWA intacto.

Por "dominio VWA" incluimos los dominios de tipo A del factor von Willebrand, y los dominios que muestran homología con los dominios de tipo A del factor von Willebrand, así como las regiones que contienen dominios VWA. El polipéptido según la invención se deriva de la cadena a3 del colágeno tipo VI. Así, el polipéptido según la invención puede derivarse de las regiones a3N o a3C. Por ejemplo, el polipéptido según la invención puede derivarse del dominio N2, N3 o C1 de la cadena a3 del colágeno tipo VI.

Por lo demás, se divulga en el presente documento un polipéptido derivado de la cadena a4 del colágeno tipo VI. Por lo demás, se divulga en el presente documento un polipéptido derivado de la cadena a5 del colágeno tipo VI. Por lo demás, se divulga en el presente documento un polipéptido derivado de la cadena a6 del colágeno tipo VI. Por lo demás, se divulga en el presente documento un polipéptido derivado de la cadena a2 del colágeno tipo VI, por ejemplo de la región a2N.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden tener residuos catiónicos en su superficie, o motivos de secuencia catiónica en la misma.

Así, en una realización, el polipéptido tiene una carga neta positiva. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una carga comprendida entre 2 y 9.

En otra realización, el polipéptido tiene al menos un 30% de residuos hidrófobos.

En otra realización, el polipéptido puede tener una estructura anfipática.

Los polipéptidos del primer aspecto de la invención comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5 (como se muestra en la Tabla 1), una fusión de los mismos, una variante de los mismos que comprenda al menos un 80% de identidad con cualquiera de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5, o una fusión de dicha variante de la misma, que conserve una actividad antimicrobiana de cualquiera de las SEQ ID NOs:1,2, 3 y 5.

También se divulgan en el presente documento polipéptidos que comprenden o consisten en fragmentos, derivados, o fusiones de fragmentos o derivados, de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 a 5 (como se muestra en la Tabla 1), que conserva una actividad antimicrobiana de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 a 5.

Por lo demás, se divulgan en el presente documento polipéptidos que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOs: 4 o 6 a 23 (como se muestra en la Tabla 1) o un fragmento, variante, fusión o derivado del mismo, o una fusión de dicho fragmento, variante o derivado del mismo, que conserve una actividad antimicrobiana de cualquiera de los SEQ ID NOs: 4 o 6 a 23.

Tabla 1. Polipéptidos ejemplares de la invención

El polipéptido de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de los SEQ ID NOs: 1,2, 3 y 5:

"GVR28": GVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKV [SEQ ID NO: 1]

"FYL25": FYLKTYRSQAPVLDAIRRLRLRGGS [SEQ ID NO: 2]

"FFL25": FFLKDFSTKRQIIDAINKVVYKGGR [SEQ ID NO: 3]

"SFV33": SFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASP [SEQ ID NO: 5],

o una fusión de los mismos, una variante de los mismos que tenga un 80% de identidad con cualquiera de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5, o una fusión de dicha variante de los mismos, que conserve una actividad antimicrobiana de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1,2, 3 y 5.

Por lo demás, se divulga en el presente documento un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4:

Los expertos en la materia apreciarán que el término "aminoácido", tal como se utiliza en el presente documento, incluye los veinte aminoácidos estándar codificados genéticamente y sus correspondientes estereoisómeros en forma "D" (en comparación con la forma natural "L"), los omegaaminoácidos, otros aminoácidos naturales, los aminoácidos no convencionales (p. ej., los aminoácidos a,a-disustituidos, los aminoácidos N-alquilados, etc.) y los aminoácidos derivatizados químicamente (véase más adelante).

Cuando se enumera específicamente un aminoácido, como "alanina" o "Ala" o "A", el término se refiere tanto a la L-alanina como a la D-alanina, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención, siempre que el polipéptido conserve la propiedad funcional deseada. Para los péptidos mostrados, cada residuo de aminoácido codificado, en su caso, está representado por una designación de una sola letra, correspondiente al nombre trivial del aminoácido convencional.

En una realización, los polipéptidos de la invención comprenden o consisten en L-aminoácidos.

Cuando el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos según una secuencia de referencia (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NOs: 1,2, 3 o 5), el polipéptido de la invención puede comprender aminoácidos adicionales en su extremo N- y/o C- más allá de los de la secuencia de referencia, por ejemplo, el polipéptido puede comprender aminoácidos adicionales en su extremo N-terminal. Del mismo modo, cuando el polipéptido comprende una variante una secuencia de aminoácidos según una secuencia de referencia (por ejemplo, una variante con al menos un 80% de identidad con una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5 según la invención), puede comprender aminoácidos adicionales en su extremo N- y/o C-.

De otro modo, se divulga en el presente documento un polipéptido que comprende o consiste en un fragmento de la secuencia de aminoácidos según una secuencia de referencia (por ejemplo, un fragmento de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 a 23). Así, el polipéptido puede comprender o consistir en al menos 5 aminoácidos contiguos de la secuencia de referencia, por ejemplo al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 aminoácidos contiguos, por ejemplo de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 a 23.

Los expertos en la materia apreciarán además que el polipéptido de la invención puede comprender o consistir en una variante que comprenda al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos según una secuencia de referencia de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5. Dicha variante puede ser de origen no natural.

Por "variantes" del polipéptido incluimos inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativas o no conservativas. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido dentro de la misma clase general (p. ej., un aminoácido ácido, un aminoácido básico, un aminoácido no polar, un aminoácido polar o un aminoácido aromático) por otro aminoácido dentro de la misma clase. Así pues, el significado de sustitución conservadora de aminoácidos y de sustitución no conservadora de aminoácidos es bien conocido en la técnica. En particular, se incluyen variantes del polipéptido según la invención que presentan una actividad antimicrobiana.

Las variantes según la invención tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos según cualquiera de los SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5, por ejemplo al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% de identidad.

El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede determinarse utilizando programas informáticos adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin, y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula en relación con los polipéptidos cuyas secuencias se han alineado de forma óptima.

El alineamiento puede realizarse alternativamente utilizando el programa Clustal W (como se describe en Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680).

Los parámetros utilizados pueden ser los siguientes:

Parámetros de alineación rápida por pares: Tamaño de K-tupla(palabra); 1, tamaño de ventana; 5, penalización por hueco; 3, número de diagonales superiores; 5. Procedimiento de puntuación: x por ciento. Parámetros de alineación múltiple: penalización por apertura de hueco; 10, penalización por extensión de hueco; 0,05.

Matriz de puntuación: BLOSUM.

Alternativamente, el programa BESTFIT puede ser utilizado para determinar alineamientos de secuencia local. Por ejemplo, en una realización, los aminoácidos de las secuencias de referencia anteriores SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5 pueden mutarse para reducir la degradación proteolítica del polipéptido, por ejemplo mediante modificaciones de I, F a W (véase Stromstedt et al, Antimicrobial Agents Chemother 2009, 53, 593).

Las variantes pueden realizarse utilizando los procedimientos de ingeniería de proteínas y mutagénesis dirigida al sitio bien conocidos en la técnica utilizando los polinucleótidos recombinantes (véase por ejemplo, véase Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3a edición, Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

En otra realización, el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es una especie homóloga de cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 1, 2, 3 o 5. Por "homólogo de especie" se entiende que el polipéptido corresponde a la misma secuencia de aminoácidos dentro de una proteína equivalente de una especie no humana, es decir, que el polipéptido presenta la máxima identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID NOS: 1,2, 3 o 5 (por ejemplo, según una comparación de secuencias GAP o BLAST). Normalmente, el polipéptido homólogo de la especie tendrá la misma longitud que la secuencia de referencia humana (es decir, SEQ ID NOS: 1, 2, 3 o 5).

En otra realización, el polipéptido comprende o consiste en una proteína de fusión.

Por "fusión" de un polipéptido incluimos una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de referencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5, o una variante de los mismos según la reivindicación, fusionado a cualquier otro polipéptido. Por ejemplo, dicho polipéptido puede fusionarse a un polipéptido como la glutatión-S-transferasa (GST) o la proteína A para facilitar la purificación de dicho polipéptido. Ejemplos de tales fusiones son bien conocidos por los expertos en la materia. Del mismo modo, dicho polipéptido puede fusionarse a una etiqueta de oligohistidina, como His6, o a un epítopo reconocido por un anticuerpo, como el conocido epítopo de etiqueta Myc. Además, pueden utilizarse fusiones que incluyan una etiqueta final oligopéptida hidrófoba. Las fusiones a cualquier variante o derivado de dicho polipéptido también se incluyen en el ámbito de la invención. Se apreciará que se prefieren las fusiones (o variantes o derivados de las mismas) que conservan propiedades deseables, como una actividad antimicrobiana.

La fusión puede comprender una porción adicional que confiera una característica deseable a dicho polipéptido de la invención; por ejemplo, la porción puede ser útil para detectar o aislar el polipéptido, o para promover la captación celular del polipéptido. La porción puede ser, por ejemplo, una fracción de biotina, una fracción de estreptavidina, una fracción radiactiva, una fracción fluorescente, por ejemplo un fluoróforo pequeño o un fluoróforo de proteína verde fluorescente (GFP), como bien saben los expertos en la materia. La fracción puede ser una etiqueta inmunogénica, por ejemplo una etiqueta Myc, como es sabido por los expertos en la materia, o puede ser una molécula lipofílica o un dominio polipeptídico capaz de promover la captación celular del polipéptido, como es sabido por los expertos en la materia.

Los expertos en la materia apreciarán que el polipéptido de la invención puede comprender uno o más aminoácidos modificados o derivatizados, por ejemplo por PEGilación, amidación, esterificación, acilación, acetilación y/o alquilación.

Como se aprecia en la técnica, las proteínas pegiladas pueden presentar un aclaramiento renal y una proteólisis reducidos, una toxicidad reducida, una inmunogenicidad reducida y una solubilidad aumentada [Veronese, F.M. y J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 453-6., Chapman, A.P., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 531-45]. La pegilación se ha empleado para varios fármacos basados en proteínas, incluidas las primeras moléculas pegiladas, la asparaginasa y la adenosina deaminasa [Veronese, F.M. y J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002.

54(4): p. 453-6., Veronese, F.M. y G. Pasut, Drug Discov Today, 2005. 10(21): p. 1451-8].

Para obtener una proteína pegilada con éxito, con una semivida aumentada al máximo y una actividad biológica retenida, varios parámetros que pueden afectar al resultado son importantes y deben tenerse en cuenta. Las moléculas de PEG pueden ser diferentes, y las variantes de PEG que se han utilizado para la pegilación de proteínas incluyen el PEG y el monometoxi-PEG. Además, pueden ser lineales o ramificados [Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70]. El tamaño de las moléculas de PEG utilizadas puede variar y se han unido a proteínas moléculas de PEG de tamaños comprendidos entre 1 y 40 kDa [Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 487-504, Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999.

27(3): p. 425-32, Chapman, A.P., et al., Nat Biotechnol, 1999. 17(8): p. 780-3]. Además, el número de unidades de PEG unidas a la proteína puede variar, y se han descrito ejemplos de entre una y seis unidades de PEG unidas a proteínas [Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999.

27(3): p. 425-32]. Además, se ha utilizado la presencia o ausencia de un enlazador entre el PEG, así como diversos grupos reactivos para la conjugación. Así, el PEG puede unirse a grupos amino N-terminales, o a residuos de aminoácidos con grupos amino o hidroxilo reactivos (Lys, His, Ser, Thr y Tyr) directamente o utilizando ácido Y-amino butírico como enlazador. Además, el PEG puede acoplarse a grupos carboxilo (Asp, Glu, C-terminal) o sulfhidrilo (Cys). Por último, los residuos de ginebra pueden pegilarse específicamente utilizando la enzima transglutaminasa y se han descrito derivados alquilamínicos de PEG [Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p.487-504].

Se ha demostrado que el aumento del grado de pegilación produce un aumento de la semivida in vivo. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que el proceso de pegilación deberá optimizarse para una proteína concreta de forma individual.

El PEG puede acoplarse en enlaces disulfuro naturales como se describe en el documento WO 2005/007197. Los enlaces disulfuro pueden estabilizarse mediante la adición de un puente químico que no comprometa la estructura terciaria de la proteína. Esto permite utilizar la selectividad tiol conjugadora de los dos azufres que componen un enlace disulfuro para crear un puente para la unión específica de PEG. De este modo, se evita la necesidad de diseñar residuos en un péptido para unirlos a moléculas diana.

También puede conjugarse covalentemente una variedad de copolímeros en bloque alternativos como se describe en el documento WO 2003/059973. Los conjugados poliméricos terapéuticos pueden presentar mejores propiedades térmicas, de cristalización, adhesión, hinchamiento, recubrimiento, conformación dependiente del pH y biodistribución. Además, pueden conseguir una circulación prolongada, la liberación del bioactivo en el entorno proteolítico y ácido del lisosoma secundario tras la captación celular del conjugado por pinocitosis y propiedades fisicoquímicas más favorables debido a las características de las moléculas grandes (p. ej., mayor solubilidad del fármaco en fluidos biológicos). Los copolímeros en bloque, que comprenden bloques hidrófilos e hidrófobos, forman micelas poliméricas en solución. Tras la disociación de la micela, las moléculas individuales del copolímero en bloque se excretan de forma segura.

También pueden obtenerse derivados químicos de uno o más aminoácidos por reacción con un grupo funcional lateral. Dichas moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carboxibenzoxi, grupos tbutiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres e hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acílicos u O-alquílicos. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen derivados naturales de aminoácidos de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede sustituir a la prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituir a la lisina; la 3-metilhistidina puede sustituir a la histidina; la homoserina puede sustituir a la serina y la ornitina a la lisina. Los derivados también incluyen péptidos que contienen una o más adiciones o supresiones, siempre que se mantenga la actividad requerida. 0tras modificaciones incluidas son la amidación, la acilación amino terminal (p. ej., acetilación o amidación con ácido tioglicólico), la carboxilamidación terminal (p. ej., con amoníaco o metilamina), y las modificaciones terminales similares.

Los expertos en la materia apreciarán además que los compuestos peptidomiméticos también pueden ser útiles. Así, por "polipéptido" incluimos los compuestos peptidomiméticos que tienen una actividad antimicrobiana. El término "peptidomimético" se refiere a un compuesto que imita la conformación y las características deseables de un péptido concreto como agente terapéutico.

Por ejemplo, los polipéptidos de la invención incluyen no sólo moléculas en las que los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos (-C0-NH-) sino también moléculas en las que el enlace peptídico está invertido. Dichos peptidomiméticos retroinversos pueden fabricarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo como los descritos en Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque consiste en fabricar pseudopéptidos que contengan cambios que afecten a la columna vertebral, y no a la orientación de las cadenas laterales. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis. Alternativamente, el polipéptido de la invención puede ser un compuesto peptidomimético en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están unidos por un enlace -y(CH₂NH)- en lugar del enlace amida convencional.

En otra alternativa, se puede prescindir por completo del enlace peptídico siempre que se utilice una fracción de enlace apropiada que conserve el espacio entre los átomos de carbono de los residuos de aminoácidos; puede ser ventajoso que la fracción de enlace tenga sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planaridad que un enlace peptídico.

Se apreciará que el polipéptido puede bloquearse convenientemente en su región N- o C-terminal para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica.

También se han utilizado diversos aminoácidos no codificados o modificados, como los D-aminoácidos y los N-metilaminoácidos, para modificar péptidos de mamíferos. Además, una conformación presuntamente bioactiva puede estabilizarse mediante una modificación covalente, como la ciclización o la incorporación de puentes lactámicos o de otro tipo, por ejemplo véase Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75:2636 y Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Com. 111:166.

Un tema común entre muchas de las estrategias sintéticas ha sido la introducción de alguna fracción cíclica en un marco basado en péptidos. La fracción cíclica restringe el espacio conformacional de la estructura peptídica, lo que a menudo se traduce en una mayor especificidad del péptido para un receptor biológico concreto. Una ventaja añadida de esta estrategia es que la introducción de una fracción cíclica en un péptido puede hacer que éste sea menos sensible a las peptidasas celulares.

Así, los polipéptidos ejemplares de la invención comprenden aminoácidos de cisteína terminales. Dicho polipéptido puede existir en forma cíclica heterodética por formación de enlaces disulfuro de los grupos mercaptido en los aminoácidos cisteína terminales o en forma homodética por formación de enlaces péptido amida entre los aminoácidos terminales. Como se ha indicado anteriormente, la ciclación de péptidos pequeños mediante enlaces disulfuro o amida entre las cisteínas de la región N- y C-terminal puede eludir los problemas de especificidad y vida media observados a veces con los péptidos lineales, al disminuir la proteólisis y aumentar también la rigidez de la estructura, lo que puede dar lugar a compuestos de mayor especificidad. Los polipéptidos ciclados por enlaces disulfuro tienen amino y carboxi-terminales libres que aún pueden ser susceptibles de degradación proteolítica, mientras que los péptidos ciclados por formación de un enlace amida entre la amina N-terminal y el carboxilo C-terminal y, por tanto, ya no contienen amino o carboxi-terminales libres. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención pueden unirse mediante un enlace C-N o un enlace disulfuro.

La presente invención no está limitada en modo alguno por el procedimiento de ciclización de péptidos, sino que abarca péptidos cuya estructura cíclica puede lograrse mediante cualquier procedimiento de síntesis adecuado. Así, los enlaces heterodéticos pueden incluir, pero no se limitan a la formación a través de puentes disulfuro, alquileno o sulfuro. Los procedimientos de síntesis de péptidos homodésicos cíclicos y péptidos heterodésicos cíclicos, incluyendo puentes disulfuro, sulfuro y alquileno, se divulgan en el documento US 5.643.872. 0tros ejemplos de procedimientos de ciclización incluyen ciclización mediante química de clic, epóxidos, reacciones aldehído-amina, así como y los procedimientos divulgados en el documento US 6.008.058.

Otro enfoque para la síntesis de compuestos peptidomiméticos cíclicos estabilizados es la metátesis de cierre de anillo (RCM). Este procedimiento consiste en sintetizar un precursor peptídico y ponerlo en contacto con un catalizador RCM para obtener un péptido de conformación restringida. Los precursores peptídicos adecuados pueden contener dos o más enlaces C-C insaturados. El procedimiento puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. En esta realización, el precursor, que está anclado a un soporte sólido, se pone en contacto con un catalizador RCM y el producto se separa del soporte sólido para producir un péptido conformacionalmente restringido.

Otro enfoque, divulgado por D. H. Rich en Protease Inhibitors, Barrett y Selveson, eds., Elsevier (1986), ha consistido en diseñar imitadores peptídicos mediante la aplicación del concepto de análogo de estado de transición en el diseño de inhibidores enzimáticos. Por ejemplo, se sabe que el alcohol secundario de la estalina imita el estado de transición tetraédrico del enlace amida tixilo del sustrato de la pepsina.

En resumen, las modificaciones terminales son útiles, como es bien sabido, para reducir la susceptibilidad a la digestión por proteinasas y, por lo tanto, para prolongar la vida media de los péptidos en soluciones, particularmente en fluidos biológicos donde las proteasas pueden estar presentes. La ciclización de polipéptidos también es una modificación útil debido a las estructuras estables formadas por la ciclización y en vista de las actividades biológicas observadas para los péptidos cíclicos.

Así, en una realización, el polipéptido del primer aspecto de la invención es lineal. Sin embargo, en una realización alternativa, el polipéptido es cíclico.

El polipéptido de la invención tiene una longitud comprendida entre 20 y 200 aminoácidos, aunque los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden tener diversas longitudes. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud de entre 20 y 150, 20 y 100, 20 y 50, 20 y 40 o 25 y 35 aminoácidos.

En una realización, el polipéptido es o comprende un polipéptido recombinante. Los procedimientos adecuados para la producción de dichos polipéptidos recombinantes son bien conocidos en la técnica, como la expresión en células huésped procariotas o eucariotas (p. ej., véase Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). Los polipéptidos de la invención también pueden producirse utilizando un sistema de traducción in vitro disponible comercialmente, como el lisado de reticulocitos de conejo o el lisado de germen de trigo (disponible en Promega). Preferiblemente, el sistema de traducción es lisado de reticulocitos de conejo. Convenientemente, el sistema de traducción puede acoplarse a un sistema de transcripción, como el sistema de transcripción-traducción TNT (Promega). Este sistema tiene la ventaja de producir el transcrito de ARNm adecuado a partir de un polinucleótido de ADN codificante en la misma reacción que la traducción.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse alternativamente de forma artificial, por ejemplo utilizando técnicas de síntesis en fase líquida o sólida bien conocidas (como la síntesis de péptidos en fase sólida t-Boco Fmoc). Por ejemplo, los polipéptidos pueden sintetizarse como se describe en Solid-Phase Peptide Synthesis (1997) Fields, Abelson & Simon (Eds), Academic Press (ISBN: 0-12-182190-0). Así, los siguientes aspectos relacionados se incluyen dentro del ámbito de la presente invención.

Un segundo aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido según el primer aspecto de la invención. En una realización, la molécula de ácido nucleico puede aislarse.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un vector (tal como un vector de expresión) que comprende una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención. En una realización, el vector puede ser adecuado para la replicación en células eucariotas, por ejemplo en células de mamífero.

Un cuarto aspecto de la invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención o un vector según el tercer aspecto de la invención. En una realización, la célula huésped es recombinante. En una realización, la célula huésped es una célula eucariota, por ejemplo una célula de mamífero.

Además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también contempla un cultivo de dichas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutritivo.

Un quinto aspecto de la invención proporciona un procedimiento de fabricación de un polipéptido según el primer aspecto de la invención que comprende el cultivo de una población de células huésped según el cuarto aspecto de la invención en condiciones en las que se expresa dicho polipéptido, y el aislamiento del polipéptido a partir de las mismas. Los procedimientos para cultivar células huésped y aislar proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica.

Un sexto aspecto de la invención proporciona un procedimiento de fabricación de un polipéptido según el primer aspecto de la invención que comprende la síntesis en fase líquida o en fase sólida del polipéptido.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden formularse para su uso en medicina clínica y/o veterinaria.

Así, un séptimo aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según el primer aspecto de la invención junto con un excipiente, diluyente, vehículo, tampón o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Tal como se utiliza en el presente documento, por "composición farmacéutica" se entiende una formulación terapéuticamente eficaz para su uso en el tratamiento o la prevención de trastornos y afecciones asociados con microorganismos e infecciones microbianas.

También pueden incluirse compuestos adicionales en las composiciones farmacéuticas, como otros péptidos, agentes inmunomoduladores de bajo peso molecular, agonistas y antagonistas de receptores y agentes antimicrobianos. Otros ejemplos incluyen agentes quelantes como EDTA, citrato, EGTA o glutatión.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera conocida en la técnica que sea suficientemente estable al almacenamiento y adecuada para su administración a seres humanos y animales. Las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse, p. ej., mediante liofilización, secado por pulverización, enfriamiento por pulverización o mediante el uso de la formación de partículas a partir de la formación de partículas supercríticas. Por "farmacéuticamente aceptable" entendemos un material no tóxico que no disminuye la eficacia de la actividad biológica de los principios activos, es decir, el/los polipéptido(s) antimicrobiano(s). Tales tampones, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000).

Por "tampón" se entiende una solución acuosa que contiene una mezcla ácido-base con el fin de estabilizar el pH. Ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazoleláctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.

Por "diluyente" se entiende una solución acuosa o no acuosa destinada a diluir el péptido en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo).

Por "adyuvante" se entiende cualquier compuesto añadido a la formulación para aumentar el efecto biológico del péptido. El adyuvante puede ser uno o más de plata coloidal, o sales de zinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, pero no limitado a fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición de acilo. El adyuvante también puede ser polímeros catiónicos como PHMB, éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos como poli(vinil imidazol) y polipéptidos catiónicos como polihistidina, polilisina, poliarginina y péptidos que contengan estos aminoácidos. El excipiente puede ser uno o más de los hidratos de carbono, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de hidratos de carbono son la lactosa, la sacarosa, el manitol y las ciclodextrinas, que se añaden a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son el almidón, los éteres de celulosa, la celulosa, la carboximetilcelulosa, la hidroxipropilmetilcelulosa, la hidroxietilcelulosa, la etilhidroxietilcelulosa, la etilcelulosa, la metilcelulosa, la propilcelulosa, los alginatos, los carageenanos, el ácido hialurónico y sus derivados, el ácido poliacrílico, el polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivinílico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrólisis, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o copolímeros de los mismos con diferente composición, y polivinilpirrolidona, todos ellos de diferente peso molecular, que se añaden a la composición, p. ej. para controlar la viscosidad, para lograr la bioadhesión o para proteger el principio activo (se aplica también a A-C) de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son los ácidos grasos, los fosfolípidos, los mono-, di- y triglicéridos, las ceramidas, los esfingolípidos y los glicolípidos, todos ellos de diferente longitud de cadena acil y saturación, la lecitina de huevo, la lecitina de soja, el huevo hidrogenado y la lecitina de soja, que se añaden a la composición por razones similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son el talco, el óxido de magnesio, el óxido de zinc y el óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios como la reducción de la acumulación de líquido o propiedades pigmentarias ventajosas.

La composición farmacéutica también puede contener uno o más mono- o di-sacáridos, como xilitol, sorbitol, manitol, lactitiol, isomalt, maltitol o xilósidos, y/o monoacilgliceroles, como monolaurina. Las características del vehículo dependen de la vía de administración. Una vía de administración es la tópica. Por ejemplo, para las administraciones tópicas, un vehículo preferido es una crema emulsionada que comprenda el péptido activo, pero pueden utilizarse otros vehículos comunes como ciertas pomadas a base de petrolato/mineral y vegetales, así como geles poliméricos, fases cristalinas líquidas y microemulsiones.

Se apreciará que las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos de la invención, por ejemplo uno, dos, tres o cuatro péptidos diferentes. Utilizando una combinación de diferentes péptidos se puede aumentar el efecto antimicrobiano.

Como se discutió anteriormente, el polipéptido puede proporcionarse como una sal, por ejemplo un aducto ácido con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido perclórico, ácido tiociánico, ácido bórico, etc. o con ácido orgánico, como ácido fórmico, ácido acético, ácido haloacético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido sulfanílico, etc. Para mejorar la actividad biológica de la composición antimicrobiana, pueden añadirse sales inorgánicas como sodio monovalente, potasio o zinc divalente, magnesio, cobre calcio, todos ellos con su correspondiente anión.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de liposoma, en el que el polipéptido se combina, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos como lípidos, que existen en formas agregadas como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. Los lípidos adecuados también incluyen los lípidos anteriores modificados por poli(etilenglicol) en el grupo de cabeza polar para prolongar el tiempo de circulación del torrente sanguíneo. La preparación de tales formulaciones liposomales se puede encontrar por ejemplo en el documento US 4.235.871.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden presentarse en forma de microesferas biodegradables. Los poliésteres alifáticos, como el poli(ácido láctico) (PLA), el poli(ácido glicólico) (PGA), los copolímeros de PLA y PGA (PLGA) o el poli(caprolactona) (PCL), y los polianhídridos se han utilizado ampliamente como polímeros biodegradables en la producción de microesferas. Pueden encontrarse preparaciones de tales microesferas en el documento US 5.851.451 y en el documento EP 213303.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden formularse con sistemas micelares formados por tensioactivos y copolímeros en bloque, preferentemente los que contienen moléculas de poli(óxido de etileno) para prolongar el tiempo de circulación en el torrente sanguíneo.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden presentarse en forma de geles poliméricos, en los que polímeros tales como almidón, éteres de celulosa, celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, etilcelulosa, metilcelulosa, propilcelulosa, alginatos, quitosano, carageenanos, ácido hialurónico y sus derivados, ácido poliacrílico, polivinilimidazol, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, polivinilalcohol/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis, y polivinilpirrolidona se utilizan para espesar la solución que contiene el péptido. Los polímeros también pueden contener gelatina o colágeno.

Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden disolverse en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo), goma tragacanto y/o diversos tampones.

La composición farmacéutica también puede incluir iones y un pH definido para potenciar la acción de los polipéptidos antimicrobianos.

Las composiciones anteriores de la invención pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales como la esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, cargas, etc., por ejemplo, como se divulga en otras partes del presente documento.

Los expertos en la materia apreciarán que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse local o sistémicamente. Las vías de administración incluyen la tópica (p. ej., oftálmica), ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), oral, vaginal y rectal. También es posible la administración a partir de implantes.

Las formas de preparación adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, microemulsiones, definidas como sistemas ópticamente isótropos termodinámicamente estables compuestos por agua, aceite y tensioactivo, fases cristalinas líquidas, definidas como sistemas caracterizados por un orden de largo alcance pero un desorden de corto alcance (los ejemplos incluyen fases laminares, hexagonales y cúbicas, continuas en agua o en aceite), o sus homólogos dispersos, geles, ungüentos, dispersiones, suspensiones, cremas, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en forma de ampolla, así como preparados con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se utilizan habitualmente excipientes, diluyentes, adyuvantes o soportes como los descritos anteriormente. La composición farmacéutica también puede suministrarse en vendas, tiritas o en suturas o similares.

En una realización particular, la composición farmacéutica es adecuada para administración oral, parenteral o tópica. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede ser adecuada para la administración tópica (p. ej., administración oftálmica, en forma de aerosol, loción, pasta o gotas, etc.).

Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmacéuticamente eficaz. Por "dosis farmacéuticamente eficaz" se entiende una dosis suficiente para producir los efectos deseados en relación con la afección para la que se administra. La dosis exacta depende de la actividad del compuesto, la forma de administración, la naturaleza y gravedad del trastorno, la edad y el peso corporal del paciente. La administración de la dosis puede llevarse a cabo tanto por administración única en forma de una unidad de dosis individual o varias unidades de dosis más pequeñas, como por administraciones múltiples de dosis subdivididas a intervalos específicos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos, como agentes antibióticos, antiinflamatorios, inmunosupresores, vasoactivos y/o antisépticos adicionales (como agentes antibacterianos, antifúngicos, antivirales y antiparasitarios). Ejemplos de agentes antibióticos adicionales adecuados incluyen penicilinas, cefalosporinas, carbacefemas, cefamicinas, carbapenems, monobactámicos, aminoglucósidos, glucopéptidos, quinolonas, tetraciclinas, macrólidos y fluoroquinolonas. Entre los agentes antisépticos se encuentran el yodo, la plata, el cobre, la clorhexidina, la polihexanida y otras biguanidas, el quitosano, el ácido acético y el peróxido de hidrógeno. Asimismo, las composiciones farmacéuticas también pueden contener antiinflamatorios, como esteroides y derivados macrolactámicos.

Dichos agentes terapéuticos adicionales pueden incorporarse como parte de la misma composición farmacéutica o administrarse por separado.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de la invención, o las composiciones farmacéuticas de los mismos, pueden aplicarse a dispositivos médicos y otros productos cuya implantación o aplicación en el cuerpo humano o animal está asociada con el riesgo de infección por un agente microbiano.

Así, un octavo aspecto de la invención proporciona un dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas, o material para su uso en el mismo, que está recubierto, impregnado, mezclado o asociado de otro modo con una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención o un polipéptido según el primer aspecto de la invención.

Dicho dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas o material para su uso en el mismo puede entrar en contacto con el cuerpo humano o un componente del mismo (p. ej., sangre).

En una realización, el dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas, o material para uso en el mismo es para uso en cirugía de baipás, circulación extracorpórea, cuidado de heridas y/o diálisis.

La composición puede recubrirse, pintarse, pulverizarse o aplicarse de otro modo a una sutura, prótesis, implante, apósito para heridas, catéter, lente, injerto de piel, sustituto de piel, pegamento de fibrina o vendaje, etc. , o mezclarse con ellos . Al hacerlo, la composición puede conferir propiedades antimicrobianas o de cicatrización de heridas mejoradas al dispositivo o material.

Por "implante" se entiende:

(a) Un catéter (por ejemplo, para uso intravascular o del tracto urinario).

(b) Un stent (por ejemplo, un stent coronario).

(c) Una derivación (por ejemplo, una derivación cerebroespinal).

(d) Un tubo de intubación o traqueotomía.

(e) Un dispositivo oftálmico (por ejemplo, lentes de contacto, hebillas esclerales y lentes intraoculares).

(f) Una prótesis articular (es decir, artroplastia e implantación de otros dispositivos ortopédicos).

(g) Una válvula cardíaca artificial.

(h) Un implante mamario.

(i) Un dispositivo implantable de administración de fármacos (por ejemplo, bombas activas e implantes sólidos pasivos).

En una realización, el dispositivo o material se recubre con la composición farmacéutica de la invención (o el componente polipeptídico de la misma). Por "recubierto" entendemos que la composición farmacéutica se aplica a la superficie del dispositivo o material. Así, el dispositivo o material puede pintarse o rociarse con una solución que comprenda una composición farmacéutica de la invención (o polipéptido de la misma). Alternativamente, el dispositivo o material puede sumergirse en un depósito de una solución que comprenda un polipéptido de la invención.

En una realización alternativa, el dispositivo o material se impregna con una composición farmacéutica de la invención (o polipéptido de la misma). Por "impregnado" se entiende que la composición farmacéutica se incorpora o se mezcla de otro modo con el dispositivo o material de forma que se distribuye por todo él.

Por ejemplo, el dispositivo o material puede incubarse durante la noche a 4°C en una solución que comprenda un polipéptido de la invención. Alternativamente, una composición farmacéutica de la invención (o polipéptido de la misma) puede inmovilizarse en la superficie del dispositivo o material por evaporación o por incubación a temperatura ambiente.

En otra realización alternativa, un polipéptido de la invención está unido covalentemente al dispositivo o material, p. ej., en la superficie externa del dispositivo o material. Así, se forma un enlace covalente entre un grupo funcional apropiado del polipéptido y un grupo funcional del dispositivo o material. Por ejemplo, los procedimientos para la unión covalente de polipéptidos a soportes poliméricos incluyen la unión covalente mediante un intermediario de diazonio, mediante la formación de enlaces peptídicos, mediante la alquilación de grupos fenólicos, aminos y sulfhidrilos en la proteína de unión, mediante el uso de un intermediario polifuncional, p. ej. , glutardialdehído, y otros procedimientos diversos, p. ej., mediante el uso de vidrio sililado o cuarzo, donde la reacción de di- y trialcoxisilanos permite la derivatización de la superficie de vidrio con muchos grupos funcionales diferentes. Para más detalles, véase Inmovilización de enzimas por Griffin, M., Hammonds, E.J. y Leach, C.K. (1993) En Technological Applications of Biocatalysts (BIOTOL SERIES), pp. 75-118, Butterworth-Heinemann. Véase también el artículo de revisión titulado biomaterials in Tissue Engineering' por Hubbell, J.A. (1995) Science 13:565-576.

En una realización, el dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas o material comprende o consiste en un polímero. Los polímeros adecuados pueden seleccionarse del grupo que consiste en poliésteres (p. ej., ácido poliláctico, ácido poliglicólico o copolímeros de ácido poliláctico y ácido glicólico de composición diversa), poliortoésteres, poliacetales, poliureas, policarbonatos, poliuretanos, poliamidas) y materiales polisacáridos (p. ej. , alginatos reticulados, ácido hialurónico, carageenanos, gelatinas, almidón, derivados de la celulosa).

Alternativamente, o además, el dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas, o material puede comprender o consistir en metales (p. ej. , titanio, acero inoxidable, oro, titanio), óxidos metálicos (óxido de silicio, óxido de titanio) y/o cerámica (apatita, hidroxiapatita).

Dichos materiales pueden estar en forma de sólidos/monolitos macroscópicos, como geles reticulados química o fisicoquímicamente, como materiales porosos o como partículas.

Los dispositivos médicos, implantes, productos para el cuidado de heridas y materiales de la invención pueden fabricarse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Se apreciará que los dispositivos médicos, implantes, productos para el cuidado de heridas y materiales de la invención pueden utilizarse para cualquiera de los usos médicos divulgados en el presente documento.

Un noveno aspecto de la invención proporciona un kit que comprende una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención o un dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas, o material para su uso en el mismo, según el octavo aspecto de la invención.

Un décimo aspecto de la invención proporciona un polipéptido según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención para su uso en medicina.

Un undécimo aspecto de la invención proporciona un polipéptido según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento curativo y/o profiláctico de infecciones microbianas. El término "profiláctico" se utiliza para englobar el uso de un polipéptido o formulación descrito en el presente documento que previene o reduce la probabilidad de una afección o estado de enfermedad en un paciente o sujeto. Por "infecciones microbianas" se entienden las infecciones causadas por microorganismos como las descritas anteriormente.

Por ejemplo, en una realización la infección microbiana a tratar es una infección bacteriana.

La infección microbiana a tratar puede ser una infección aguda o sistémica.

En una realización, la infección microbiana es resistente a uno o más agentes antibióticos convencionales (como se discutió anteriormente).

En una realización, la infección microbiana a tratar es causada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus pyogenes.

En otra realización, la infección microbiana está causada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) (Staphylococcus aureusresistente a la meticilina) y Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA).

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos y las formulaciones de la invención pueden coadministrarse en combinación con uno o más agentes conocidos o convencionales para el tratamiento de la enfermedad o afección concreta. Por "coadministrar" se entiende que los presentes polipéptidos se administran a un paciente de tal manera que los polipéptidos, así como el compuesto coadministrado, pueden encontrarse en el cuerpo del paciente (p. ej., en el torrente sanguíneo) al mismo tiempo, independientemente de cuándo se administren realmente los compuestos, incluso simultáneamente.

Por lo tanto, en una realización, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico o la composición farmacéutica es para uso en combinación con uno o más agentes antimicrobianos adicionales, como los antibióticos convencionales descritos anteriormente. Alternativamente, o además, los agentes antimicrobianos adicionales pueden ser un polipéptido o proteína antimicrobiana, como LL-37 y la proteína de colágeno tipo VI, o por ejemplo seleccionados del grupo que consiste en defensinas, gramicidina S, magainina, cecropina, histatina, hifancina, cinamicina, burforina 1, parasina 1 y protaminas, y fragmentos, variantes y fusión de los mismos que conservan, al menos en parte, la actividad antimicrobiana de la proteína madre.

Un duodécimo aspecto de la invención proporciona un polipéptido según el primer aspecto de la invención o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención para su uso en el cuidado de heridas.

Por "cuidado de heridas" se entiende el tratamiento de heridas, la promoción del cierre de heridas, la prevención y/o el tratamiento de infecciones de heridas y/o úlceras, en las que la herida puede ser extracorpórea o intracorpórea. El uso en el cuidado de heridas incluye, por tanto, polipéptidos capaces de ayudar (por ejemplo, acelerar) el proceso de cicatrización de heridas y/o prevenir la infección de la herida. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse en un producto para el cuidado de heridas, como una crema, un gel, una pomada, un apósito o un emplasto, que sea capaz de potenciar la regeneración epitelial y/o la cicatrización de los epitelios de la herida y/o del estroma de la herida. En una realización, el polipéptido es capaz de potenciar la proliferación de células epiteliales y/o estromales a través de un mecanismo no lítico.

Se apreciará que los polipéptidos que tienen propiedades de cicatrización de heridas pueden tener un papel primario o auxiliar en la función de los productos para el cuidado de heridas de la invención.

En una realización del duodécimo aspecto de la invención, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico o la composición farmacéutica se administra en combinación con un agente antimicrobiano adicional, como se ha descrito anteriormente.

Por lo demás, se divulga en el presente documento el uso de un péptido o fragmento según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones microbianas, como se ha descrito anteriormente.

De otro modo divulgado aquí, es el uso de un péptido o fragmento según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de heridas, como descrito anteriormente.

De otro modo divulgado aquí es un procedimiento de tratar a un individuo con una infección microbiana, el procedimiento que comprende el paso de administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un péptido o fragmento según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención.

De otro modo divulgado aquí es un procedimiento de tratar una herida en un individuo, el procedimiento que comprende el paso de administrar a un individuo en necesidad de ello una cantidad eficaz de un polipéptido o fragmento según el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico según el segundo aspecto de la invención, o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención.

El término "cantidad eficaz" se utiliza aquí para describir concentraciones o cantidades de polipéptidos o composiciones farmacéuticas según la presente invención que pueden utilizarse para producir un cambio favorable en una enfermedad o afección tratada, ya sea una remisión, un resultado fisiológico favorable, una inversión o atenuación de un estado de enfermedad o afección tratada, la prevención o la reducción de la probabilidad de que se produzca una afección o estado de enfermedad, dependiendo de la enfermedad o afección tratada. Cuando los polipéptidos o las composiciones farmacéuticas de la invención se utilizan en combinación, cada uno de los polipéptidos o composiciones farmacéuticas puede utilizarse en una cantidad eficaz, en la que una cantidad eficaz puede incluir una cantidad sinérgica.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos y las formulaciones farmacéuticas de la presente invención tienen utilidad tanto en el campo médico como en el veterinario. Por lo tanto, los procedimientos del tratamiento divulgados de otra manera arriba se pueden utilizar en el tratamiento de animales humanos y no humanos (tales como caballos, perros y gatos). Sin embargo, es preferible que el paciente sea humano.

Para uso veterinario, un compuesto de la invención se administra como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que serán más apropiados para un animal en particular.

Un decimotercer aspecto de la invención proporciona un procedimiento para eliminar microorganismos in vitro que comprende poner en contacto los microorganismos con un polipéptido según el primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica según el séptimo aspecto de la invención. Por ejemplo, la composición farmacéutica o el polipéptido también pueden utilizarse en forma de solución o lavado esterilizante para evitar el crecimiento de microorganismos en una superficie o sustrato, como en un entorno clínico (p. ej., un quirófano) o en un entorno doméstico (p. ej., una superficie de trabajo en la cocina, el lavado de ropa como la ropa de cama).

En una realización, el compuesto antimicrobiano puede estar en solución a una concentración de 1 a 100 μg/ml. En una realización, la solución comprende además un agente tensioactivo o surfactante. Los tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos aniónicos (p. ej., un sulfonato alifático), tensioactivos anfóteros y/o zwitteriónicos (p. ej., derivados de compuestos alifáticos de amonio cuaternario, fosfonio y sulfonio) y tensioactivos no iónicos (p. ej., alcoholes alifáticos, ácidos, amidas o alquilfenoles con óxidos de alquileno)

Convenientemente, el agente tensioactivo está presente en una concentración de 0,5 a 5 por ciento en peso.

Las soluciones esterilizantes son especialmente adecuadas para su uso en entornos hospitalarios. Por ejemplo, las soluciones esterilizantes pueden utilizarse para esterilizar instrumentos quirúrgicos y superficies de quirófanos, así como las manos y los guantes del personal de quirófano. Además, las soluciones esterilizantes pueden utilizarse durante la cirugía, por ejemplo para esterilizar los huesos expuestos. En todos los casos, la solución se aplica sobre la superficie que se desea esterilizar.

La composición farmacéutica o el polipéptido también pueden utilizarse para desinfectar sangre y productos sanguíneos y en el diagnóstico de contaminación o infección bacteriana.

Tanto en los usos in vitro como in vivo , la composición farmacéutica o el polipéptido se exponen preferentemente a los microorganismos diana (o superficie/área a tratar) durante al menos cinco minutos. Por ejemplo, el tiempo de exposición puede ser de al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, 3, horas, 5 horas, 12 horas y 24 horas.

El listado o discusión de un documento aparentemente publicado con anterioridad en esta especificación no debe tomarse necesariamente como un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica o es de conocimiento general.

A continuación se describirán, con referencia a las siguientes figuras, ejemplos preferidos no limitativos que encarnan ciertos aspectos de la invención y ejemplos comparativos adicionales:

FIGURA 1. Efecto antibacteriano del colágeno tipo VI contra diferentes cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. (A) S. pyogenes, S. aureus, E. coli o P aeruginosa (2 *10® ufc/ml) se incubaron con colágeno de tipo VI (2 |^j M) durante 2 h a 37°C con un 5% deco2. Las bacterias incubadas con tampón Tris-HCl/glucosa; pH 7,4 o con LL-37 sirvieron como controles negativos o positivos, respectivamente. (B) Para la visualización de las actividades antimicrobianas, se trataron bacterias (2 *109 ufc/ml) con colágeno de tipo VI (2 j M) durante 2 h a 37 °C y posteriormente se sometieron a microscopía electrónica de barrido. En presencia de colágeno de tipo VI (panel derecho) se observaron daños extensos en la membrana, hemorragias y expulsión de componentes citoplasmáticos, en comparación con las bacterias no tratadas (panel izquierdo). La barra de escala representa 2 jm (S. pyogenes, S. aureus) y 1 jm (P aeruginosa, E. coli), respectivamente. (C) Estudios cinéticos de la rotura de la membrana bacteriana inducida por el colágeno tipo VI. S. pyogenes y P aeruginosa (pseudocolor verde) se trataron con colágeno tipo VI (2 j M) durante 0, 30, 60 y 120 min a 37 °C y se visualizaron con microscopía electrónica de barrido. Las puntas de flecha muestran el sangrado de la membrana. Los exudados citoplasmáticos se indican en pseudocolor púrpura. Barra de escala = 1 jm. (D) Para el análisis por microscopía de fluorescencia, las bacterias se trataron con colágeno de tipo VI como se ha descrito anteriormente y la permeabilización se evaluó utilizando la sonda impermeable FITc (paneles inferiores). Las mismas posiciones se visualizaron con microscopía óptica (paneles superiores). Se utilizaron 3 ^jM de LL-37 como control positivo de daño de membrana y bacterias sólo con tampón como control negativo. El color verde indica lisis bacteriana. Las imágenes se tomaron con un aumento de 1000x.

FIGURA 2. (A) Diagrama esquemático de las estructuras de dominio del colágeno tipo VI. El colágeno de tipo VI consta de tres cadenas a: a1(VI), a2(VI) y a3(VI). Los dominios globulares N- y C-terminal del colágeno tipo VI están numerados como se ha descrito previamente (51). Los corchetes indican la región en la que se expresaron los fragmentos recombinantes. (B) La actividad de unión a heparina de los dominios globulares recombinantes del colágeno tipo VI se determinó mediante slot blot utilizando heparina biotinilada. Los fragmentos expresados recombinantemente de las cadenas a1(VI), a2(VI) o a3(VI) (10 jg ) mostraron unión a la heparina. LL-37 (5 jg ) se utilizó como control positivo (panel derecho). La heparina no marcada (6 mg/ml) inhibió la unión de la heparina biotinilada a los fragmentos recombinantes y a LL-37 (panel izquierdo). (C) La unión de los fragmentos recombinantes a S. pyogenes se visualizó mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión utilizando marcaje con oro coloidal. Los fragmentos recombinantes a una concentración final de 2 j M mostraron unión a la membrana bacteriana (panel superior). Tras la preincubación con heparina no marcada, los fragmentos recombinantes no se unieron a la membrana bacteriana (panel inferior). La barra de escala representa 100 nm. (D) Las cantidades de fragmentos recombinantes unidos a la superficie bacteriana en ausencia (-) o presencia (+) de heparina se calcularon como etiqueta de oro por jm 2 de superficie bacteriana.

FIGURA 3. Eliminación dosis-dependiente de S. pyogenes por dominios globulares recombinantes de colágeno tipo VI. (A) Se incubaron bacterias (2 *10® ufc/ml) con fragmentos recombinantes a las concentraciones indicadas durante 2 h a 37 °C con un 5% de CO₂. (B) Los dominios globulares recombinantes del colágeno tipo VI inducen la rotura de la membrana. Se trataron bacterias (2 *109 ufc/ml) con fragmentos recombinantes y se visualizó la permeabilización mediante microscopía electrónica de barrido. En presencia de estas proteínas se observa una amplia rotura de la membrana y fugas de contenido intracelular, que se indican con puntas de flecha. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes y se presentan los valores medios. La barra de escala representa 5 jm.

FIGURA 4. Alineación estructural de los dominios VWA en la cadena a3 del colágeno humano tipo VI generada por superposición estructural de los modelos de dominio VWA. Debajo de la secuencia, las hélices a y los filamentos p se indican con recuadros rectangulares y flechas negras, respectivamente. Los aminoácidos expuestos se indican en negrita y los tramos catiónicos se resaltan en gris. Los recuadros rectangulares de la secuencia indican la ubicación de los péptidos catiónicos, así como del péptido de control (DVN32). Identificadores de secuencia: a3_N10[SEQ ID NO:37], a3_N9[SEQ ID NO:38], a3_N8[SEQ ID NO:39], a3_N7[SEQ ID NO:40], a3_N6[SEQ ID NO:41], a3_N5[SEQ ID NO:42], a3_N4[SEQ ID NO:43], a3_N3[SEQ ID NO:44], a3_N₂[SEQ ID NO:45], a3_C1[SEQ ID NO:46],

FIGURA 5. (A) Representación de la superficie de los dominios VWA de la cadena a3(VI) muestran las propiedades electrostáticas (negro=carga positiva; gris=carga negativa). (B) Los diagramas de cinta muestran la ubicación de los péptidos catiónicos y del péptido de control negativo (DVN32). (C) Las propiedades biofísicas de los péptidos (GVR28 [SEQ ID NO: 1], FYL25 [SEQ ID NO: 2], FFL25 [SEQ ID NO: 3], VTT30 [SEQ ID NO: 4], SFV33 [SEQ ID NO: 5] y DVN32 [SEQ ID NO: 6]). Los péptidos³se identifican por sus tres primeros residuos NH₂-terminales utilizando el código de una sola letra, seguido del número total de residuos que constituyen el péptido. Las secuencias¹5 de péptidos se indican en código de una sola letra. °μl: punto isoeléctrico teórico calculado mediante la herramienta Protparam disponible en http://us.expasy.org/tools/protparam.html.

FIGURA 6. Actividad antibacteriana de péptidos derivados de la cadena a3(VI). (A). Para determinar las actividades antibacterianas, los aislados bacterianos indicados (4 *10⁶ufc) se inocularon en gel de agarosa y se cargaron con péptidos (a 100 |^j M). LL-37 y el tampón Tris-HCl; pH 7,4 se utilizaron como control positivo y negativo, respectivamente. Las zonas libres corresponden al efecto inhibidor de cada péptido tras incubación a 37 °C durante 18-24 h. Se muestra una vista representativa de un gel RDA para E. coli (B) y S. aureus (C) con los péptidos indicados.

FIGURA 7. Los péptidos derivados del colágeno tipo VI se unen a las superficies bacterianas. (A) La unión de péptidos derivados del colágeno tipo VI a P aeruginosa, S. aureus o LPS se visualizó mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión utilizando marcaje con oro coloidal. P. aeruginosa o S. aureus (2 *10⁹ufc/ml) se incubaron con LL-37, DVN32 o SFV33 conjugados con 10 nm de oro coloidal (véase la Tabla 2) durante 2 h a 37°C con un 5% de CO₂. Barra de escala = 100 nm. Los péptidos se muestran como puntos negros (B) Para la unión al LPS, LL- 37, DVN32 y SFV33 conjugados con 10 nm de oro coloidal se incubaron con LPS (10 jg/ml) durante 1 h a 37°C con 5% de CO₂. Barra de escala = 50 nm. Los péptidos se muestran como puntos negros. (C) Espectros CD de LL-37, DVN32 y SFV33 en presencia o ausencia de LPS (0,2 mg/ml). La concentración del péptido fue de 30 j M.

FIGURA 8. Actividades antibacterianas de péptidos derivados del colágeno tipo VI en presencia de sal y plasma. En ensayos de recuento viable, se observó actividad antibacteriana de los péptidos derivados del colágeno de tipo Vl frente a P aeruginosa, S. aureus, E. coli y S. pyogenes, incubándose 2 *10⁷ufc/ml de bacterias con péptidos derivados del colágeno de tipo VI (0.3, 0,6, 3, 6, 30 y 60 ^jM) en presencia de tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM glucosa; pH 7,4) con o sin un 20% de plasma humano durante 2 h a 37°C con un 5% de CO₂. Las bacterias incubadas únicamente con tampón salino con o sin 20% de plasma humano sirvieron de control negativo. Las muestras con LL-37 sirvieron como controles positivos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes y se presentan los valores medios.

FIGURA 9. Permeabilización de la membrana citoplasmática por péptidos derivados del colágeno tipo VI. (A) P. aeruginosa o S. aureus (2 *10⁷ufc/ml) fueron sometidos a péptidos derivados de colágeno tipo Vl en tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM glucosa; pH 7,4) en presencia o ausencia de un 20% de plasma humano. Se añadió el colorante yoduro de propidio (PI) a las muestras y se incubaron durante 30 minutos en hielo y en la oscuridad. La mezcla se sometió a análisis FACS utilizando una citometría de flujo. Como control se utilizaron tampones idénticos sin péptidos. Como control positivo, se utilizaron bacterias tratadas con etanol al 70%. Cada experimento se realizó por triplicado y los valores representan medias ± desviaciones estándar. (B) Para la visualización de las actividades antimicrobianas, se trataron bacterias (2 *10⁹ufc/ml) con LL-37, DVn32 y SFV33 (30 j M) en presencia de tampón salino con o sin plasma al 20% durante 2 h a 37 °C y posteriormente se sometieron a microscopía electrónica de barrido. En el caso de LL-37 en condiciones salinas y SFV33 en condiciones salinas y plasmáticas, se observaron daños extensos en la membrana, formación de burbujas y expulsión de componentes citoplasmáticos. Las bacterias tratadas con tampón salino, plasma o DVN32 no mostraron efectos. La barra de escala representa 5 jm.

FIGURA 10. Niveles de fuga de membrana en función de la concentración de péptido. (A) Los niveles de eflujo de carboxifluoresceína tras 45 min de incubación para liposomas compuestos de extracto de lípidos polares de E. coli. Cada marcador representa la fuga media a 37°C en tampón Tris 10 mM (pH 7,4) con desviación estándar de experimentos triplicados realizados con concentraciones individuales de péptidos, es decir, sin adiciones acumulativas. El ajuste de la curva se realiza mediante ajuste sigmoidal de la curva dosis-respuesta y el nivel EC₅₀se resalta con una línea doble. Como control positivo se utilizó LL-37. (B) Se calcularon los valoresEC50 (μ M) para los péptidos derivados del colágeno tipo VI y LL-37.

FIGURA 11. Ensayo de citotoxicidad de péptidos derivados del colágeno tipo VI. (A) La actividad hemolítica de los péptidos derivados del colágeno tipo VI y LL-37 se monitorizó incubando 30 o 60 ^jM de los péptidos con sangre humana y midiendo a continuación la absorbancia a 540 nm. Los resultados se expresan en % de hemólisis inducida por Tritón X-100. (B) Se añadieron diluciones seriadas de péptidos de colágeno-VI y LL-37 a células THP1 y se midió la permeabilización celular determinando la liberación de LDH. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

FIGURA 12. Actividad antiendotoxina de los péptidos. Los péptidos derivados del colágeno tipo VI o LL-37 se pretrataron con LPS (10 ng/ml) durante 20 min a RT Posteriormente, la mezcla se añadió a células de macrófagos RAW 264.7 y se incubó durante 24 h a 37°C. Los niveles de nitrito en el sobrenadante se determinaron mediante el reactivo de Griess. Los datos se expresan como porcentaje de acumulación de nitrito en células activadas con LPS (100%) y muestran las medias ±SEM de tres experimentos independientes realizados por triplicado.

FIGURA 13. Los péptidos derivados del colágeno tipo VI favorecen la cicatrización de las heridas. Las células HaCaT se cultivaron en placas de 24 pocillos y crecieron hasta confluir. Se privó a las células de suero durante 24 h y, a continuación, se rascaron manualmente con una punta de pipeta estéril para introducir la herida y se lavaron dos veces para eliminar las células desprendidas. Las células se trataron con colágeno tipo VI (10|jg/ml), péptidos derivados del colágeno tipo Vl (10|jg/ml) o LL-37 (10|jg/ml) durante un máximo de 24 h a 37°C y 5% deco2 en ausencia de suero. Se fotografiaron las células en el momento de la herida 0 h y se examinó la migración celular 24 h después de la adición del péptido. El control consistió en células tratadas con medio sin suplemento. Las imágenes se tomaron con un aumento de 100x. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes.

FIGURA 14. Antibacterial activities of collagen type VI-derived peptides against multidrug-resistant microorganisms. En ensayos de recuento de viables, se observó actividad antibacteriana de los péptidos derivados del colágeno de tipo VI frente a Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA) y Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) (figura 14A), así como para péptidos derivados del colágeno de tipo VI contra Escherichia coli multirresistente (MREC) y Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) (figura 14B), y para péptidos derivados del colágeno de tipo VI contra Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP) (figura 14C). Se incubaron 2 *107 ufc/ml de bacterias con péptidos derivados del colágeno tipo VI (30 jiM) en presencia de tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM glucosa; pH 7,4). Las bacterias incubadas únicamente con tampón salino sirvieron de control. Las muestras con LL-37 sirvieron como controles positivos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes y se presentan los valores medios.

FIGURA 15. Eliminación de Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA) y Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) mediante colágeno de tipo VI. Las bacterias (2 *10® ufc/ml) se incubaron con 1 jiM de colágeno VI en tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM glucosa; pH 7,4) durante 2 h a 37 °C con un 5% de CO₂. Las bacterias tratadas con colágeno VI (MRpA cVl, MRSA cVl) muestran una extensa rotura de membrana y exudación de contenido citoplasmático, tal como se visualiza mediante microscopía electrónica de barrido. Del mismo modo, se observó una amplia permeabilización de la membrana en presencia de péptidos derivados del colágeno Vl (no mostrado). Por el contrario, las bacterias no tratadas (MRPA, MRSA) muestran una arquitectura no distorsionada. La barra de escala representa 2 jm.

FIGURA 16. Actividades antibacterianas de amplio espectro del colágeno tipo VI frente a diversos microorganismos Gram-negativos y Gram-positivos. En los ensayos de recuento viable, se incubaron 2 *107 ufc/ml de bacterias con colágeno de tipo VI (1 jM ) en presencia de tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM glucosa; pH 7,4). Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes y se presentan los valores medios.

FIGURA 17. Los péptidos derivados del colágeno VI mejoran la supervivencia en un modelo de infección invasiva por P aeruginosa. Se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 2 *108 ufc/ml de bacterias P aeruginosa y se trataron con 100 j l de SFV33, GVr28 o 100 j l de PBS (n = 6/grupo).

Ejemplos

Ejemplo A

Introducción

El propósito de este estudio fue investigar si los dominios globulares del colágeno tipo VI tienen un papel en la defensa del huésped durante la infección, y si los péptidos derivados de estos dominios tienen propiedades similares.

Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

La cepa AP1 (40/58) deStreptococcus pyogenes del serotipo M1 procedía del Centro Colaborador de la 0rganización Mundial de la Salud para la Referencia e Investigación de Estreptococos, Praga, República Checa. La cepa 111 de Staphylococcus aureus y la cepa B1351 de Escherichia coli se recogieron en el Departamento de Microbiología Clínica del Hospital Universitario de Lund (Suecia). La cepa de Pseudomonas aeruginosa utilizada en este estudio fue PAO1 (ATCc , Teddington Oly, Reino Unido), aislada originalmente de una herida. Todas las bacterias se cultivaron rutinariamente en caldo Todd-Hewitt (THB2, Difco, Detroit, DI, EE.UU.) y se incubaron a 37°C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO₂.

Expresión recombinante y purificación de los dominios VWA N- y C-terminal de las cadenas a del colágeno tipo VI Las microfibrillas de colágeno de tipo VI se extrajeron de la córnea bovina mediante digestión con colagenasa según lo descrito por Abdillahi et al. (36). Las construcciones de ADNc que codifican los dominios no colagenosos del colágeno tipo VI se generaron mediante RT-PCR en ARN total de cerebro de ratón y se clonaron con sitios de restricción 5-terminal Nhel o Xhol y 3-terminal BamHl o Xhol utilizando los siguientes cebadores, véase la Tabla 2 (38).

Tabla 2. Cebadores y enzimas de restricción utilizados para el análisis RT-PCR de las regiones globulares del colágeno tipo VI.

Cada uno de los productos de PCR amplificados se insertó en un vector pCEP-Pu modificado que contenía un péptido señal BM-40 N-terminal y una etiqueta streμll en tándem C-terminal aguas abajo de los sitios de restricción (39). Las células HEK₂93-EBNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) se transfectaron con los plásmidos recombinantes utilizando el reactivo FuGENE 6 (Roche, Mannheim, Alemania) según el protocolo del fabricante. Las células se seleccionaron con puromicina (1 μg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y las proteínas recombinantes se purificaron directamente a partir de medio de águila modificado de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con suero fetal de ternera (Biochrom GmbH, Berlín, Alemania). Tras filtración y centrifugación (1 h, 10.000 * g), los sobrenadantes del cultivo celular se aplicaron a una columna de estreptactina (1,5 ml, IBA GmbH, Gottingen, Alemania) y se eluyeron con 2,5 mM de destiobitina (Sigma-Aldrich), 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0.

Ensayo de recuento viable

Las bacterias se cultivaron hasta la fase logarítmica media (OD₆₂₀“ 0,4) en medio THB a 37°C con 5% de CO₂. La solución bacteriana se lavó posteriormente y se ajustó a 2 *109 ufc/ml en 10 mM Tris, pH 7,4, que contenía 5 mM de glucosa. A continuación, se incubaron S. pyogenes, S. aureus, E. coli o P aeruginosa con 2 μM de colágeno tipo VI purificado a 37°C durante 2 h. En algunos experimentos, S. pyogenes se incubó con fragmentos de colágeno tipo VI recombinante a distintas concentraciones (0,125, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 ^jM) durante 2 h a 37°C. Las bacterias incubadas con tampón Tris-HCl pH 7,4 o 3 j M LL-37 (Innovagen, Lund, Suecia) se utilizaron como controles negativo y positivo respectivamente. Para cuantificar la actividad bactericida, se sembraron diluciones seriadas de las mezclas de incubación en placas de agar sangre, se incubaron a 37 °C durante toda la noche y se determinó el número de unidades formadoras de colonias (ufc). La supervivencia al cien por cien se definió como la supervivencia total de las bacterias en el mismo tampón y en las mismas condiciones en ausencia de colágeno de tipo VI o de proteínas recombinantes.

Microscopía electrónica de barrido

S. pyogenes, S. aureus, E. coli o P aeruginosa (2 *109 ufc/ml) se incubaron con colágeno tipo VI purificado a una concentración de 2 ^jM durante 0, 30, 60 y 120 min a 37°C con 5% deco2. En algunos experimentos se incubó S. pyogenes con 2 ^jM de fragmentos de colágeno tipo VI recombinante durante 2 h a 37°C. Se utilizaron 3 ^jM de LL-37 como control positivo y bacterias en Tris-HCl, pH 7,4 como control negativo. Las muestras se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en cacodilato sódico 0,1 M, pH 7,4 (tampón cacodilato), se lavaron con tampón cacodilato y se deshidrataron con una serie ascendente de etanol como se ha descrito previamente (40). A continuación, las probetas se sometieron a un secado en punto crítico con dióxido de carbono y se utilizó etanol absoluto como disolvente intermedio. Las muestras de tejido se montaron en soportes de aluminio, se bombardearon con 20 nm de paladio/oro y se examinaron en un microscopio electrónico de barrido Philips/FEI XL 30 FEG operado a una tensión de aceleración de 5 kV.

Microscopía de fluorescencia

Las bacterias se cultivaron hasta la mitad de la fase logarítmica en medio THB, se lavaron y se resuspendieron en Tris-HCl 10 mM que contenía 5 mM de glucosa para obtener una suspensión de 2 *107 ufc/ml. se incubaron 100 j l de la suspensión bacteriana con 2 ^jM de colágeno tipo VI purificado o 3 ^jM de LL-37 a 37°C durante 30 min, seguidos de la adición de 200 j l de FITC (6 jg/ml, Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 30 min a 37°C. Las bacterias se lavaron y se inmovilizaron en portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) incubándolos durante 45 min a 37°C. Los portaobjetos se lavaron con Tris-HCl/glucosa y se fijaron con paraformaldehído al 4% (PFA) incubándolos a 4°C durante 15 minutos, seguidos de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos de vidrio se montaron en cubreobjetos utilizando el medio de montaje con reactivo antidesvanecimiento Prolong Gold (Invitrogen). Las bacterias se visualizaron en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E80i equipado con una cámara Nikon DS-Fi 1, un Plan Apochromat (objetivo 100x) y un condensador de aceite de alta apertura numérica.

Ensayo deunión a heparina

LL-37 (5jg) o fragmentos recombinantes de colágeno tipo VI (10jg) se aplicaron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C; GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Las membranas se bloquearon con un 2% de BSA en PBS (p/v) durante 2 h a temperatura ambiente, seguidas de lavados con PBST (PBS con Tween-20) y se incubaron con 60 jg de heparina-biotina (Sigma-Aldrich) durante toda la noche a 4°C. En algunos experimentos se añadió heparina no marcada (6 mg/ml) para competir con la heparina marcada. En algunos experimentos, se añadió heparina no marcada (6 mg/ml) para la competición de unión. Tras el lavado, las membranas se incubaron con estreptavidina HRP (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron y las bandas se visualizaron mediante el sistema de revelado de sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico (Thermo Fischer Scientific, Roskilde, Dinamarca).

Microscopía electrónica de transmisión

La unión de fragmentos de colágeno tipo VI recombinante a la superficie bacteriana se visualizó mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión como se describió anteriormente (35). Brevemente, se incubaron bacterias con fragmentos recombinantes de colágeno de tipo VI en presencia o ausencia de heparina (10 jg/ml) durante 1 h a 37°C. Para su visualización en el microscopio electrónico, los distintos fragmentos recombinantes se conjugaron con oro coloidal de 5 nm (41). Las muestras se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Philips/FEICM 100 TWIN que funcionaba a una tensión de aceleración de 60 kV. Las imágenes se grabaron con una cámara Olympus Veleta de montaje lateral y el software de adquisiciones ITEM.

Secuencia y análisis estructural

Se puede acceder a la secuencia de aminoácidos de las cadenas a del colágeno humano de tipo VI a través de la base de datos UniProtκΒ; a1(VI) (UniProt # P12109), a2(VI) (UniProt # P12110) y a3(VI) (UniProt # P12111). Se utilizó el visor suizo PDB DeepView versión 4.1 para alinear secuencias y analizar estructuras tridimensionales. Sólo se disponía de una estructura cristalina de a3N5 de ratón con el código PDB 4IGI (42). No se disponía de estructuras cristalinas para los dominios VWA humanos del colágeno tipo VI, por lo que se utilizaron modelos predichos de ModBase (http://modbase.compbio.ucsf.edu) para generar las figuras. No hubo modelos predichos para los dominios N1 y C₂de a3(VI).

Síntesis de péptidos

GVR28 (GVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKV) [SEQ ID NO: 1],

FYL25 (FYLKTYRSQAPVLDAIRRLRLRGGS) [SEQ ID NO: 2],

FFL25 (FFLKDFSTKRQIIDAINKVVYKGGR) [SEQ ID NO: 3],

VTT30 (VTTEIRFADSKRKSVLLDKIKNLQVALTSK) [SEQ ID NO: 4],

SFV33 (SFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASP) [SEQ ID NO: 5], y

DVN32 (DVNVFAIGVEDADEGALKEIASEPLNMHMFNL) [SEQ ID NO: 6]

fueron sintetizados por Biopeptides (San Diego, CA). La pureza (>95%) y la masa molecular de estos péptidos se confirmaron mediante análisis MALDI-TOF MS. Todos los péptidos utilizados eran solubles en agua, excepto DVN32, que se disolvió en ≤ 0,01% DMSO.

Ensayo dedifusión radial

El ensayo de difusión radial (RDA)²se realizó esencialmente como se describió anteriormente (43) con algunas modificaciones menores. Las bacterias se cultivaron hasta alcanzar la fase logarítmica media (DO₆₂₀“ 0,4) en 10 ml de caldo de soja tripticasa (TSB)₂de fuerza completa (3% p/v) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). A continuación, las bacterias se lavaron una vez con Tris-HCl 10 mM (que contenía 5 mM de glucosa; pH 7,4). Posteriormente, se añadieron 4 *106ufc/ml de bacterias a 5 ml del gel de agarosa subyacente, compuesto por 0,03% (p/v) de TSB, 1% (p/v) de agarosa de baja electroendosmosis y 0,02% (v/v) de Tween 20 (ambos de Sigma-Aldrich). La subcapa se vertió en una placa de Petri de 0 90 mm. Tras la solidificación de la agarosa, se perforaron pocillos de 0 4 mm y se añadieron a cada pocillo 6 μl de tampón Tris-HCl 10 mM solo o con péptido (100 μM). Las placas se incubaron a 37 °C durante 3 h para permitir la difusión de los péptidos. A continuación, se cubrió el gel subyacente con 5 ml del gel de recubrimiento (6% de TSB y 1% de agarosa de baja electroendosmosis en H₂O destilada). La actividad antimicrobiana se observó como una zona clara alrededor de cada pocillo tras incubar 18-24 h a 37 °C.

Análisis estadístico

Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. Los valores se expresaron como medias ± errores estándar y la significación se determinó como un valor P ≤0,05.

Resultados y conclusiones

El colágeno tipo VI mata patógenos humanos Gram-positivos y Gram-negativos por permeabilización de la membrana

Se estableció un enfoque integrado para combinar ensayos microbiológicos y bioquímicos con microscopía electrónica de barrido de alta resolución con el fin de investigar las propiedades antimicrobianas del colágeno de tipo VI. Se realizaron ensayos de recuento viable incubando las bacterias Gram-positivas S. pyogenes y S. aureus así como las bacterias Gram-negativas E. coli y P. aeruginosa con colágeno tipo VI purificado durante 2 h a 37°C. Los resultados mostraron que el colágeno de tipo VI mostraba una actividad antibacteriana contra S. aureus, E. col i y P . aeruginosa similar a la observada con S. pyogenes, el organismo modelo elegido (Fig. 1A). El péptido antimicrobiano de referencia humana LL-37 se utilizó como control positivo y mostró una eliminación de casi el 100% de todas las cepas bacterianas. Para examinar si el colágeno de tipo VI interrumpe la membrana bacteriana, se utilizó microscopía electrónica de barrido de alta resolución para visualizar la arquitectura bacteriana durante la muerte de una forma más tridimensional. Las bacterias se incubaron con tampón solo o con colágeno de tipo VI (Fig.1S). Los resultados mostraron una extensa rotura de la estructura de la membrana bacteriana y extravasaciones de componentes citoplasmáticos en presencia de colágeno tipo VI, lo que indica daños en las membranas bacterianas (Fig.1 S, panel derecho, Fig.1C). Estos resultados fueron similares a los observados tras el tratamiento con LL-37 (datos no mostrados). En cambio, en las muestras de control, la arquitectura de la pared celular bacteriana no se vio afectada (Fig.fS, panel izquierdo). Estas observaciones fueron corroboradas por el uso del colorante impermeable FITC. El análisis de microscopía de fluorescencia mostró que la captación de FITC sólo era visible en las muestras tratadas con colágeno tipo VI o LL-37 (Fig.lD), demostrando así la permeabilización de la membrana bacteriana. Se hicieron observaciones similares para una variedad de otros patógenos humanos Gram-positivos y Gram-negativos (Fig. 16). En conjunto, estos datos demuestran que el colágeno de tipo VI presenta una actividad antimicrobiana de amplio espectro frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

Las regiones globulares recombinantes del colágeno tipo VI que contienen el dominio VWA se unen a la superficie bacteriana de forma dependiente de la heparina

La afinidad por las superficies cargadas negativamente de las membranas bacterianas es un requisito previo para cualquier molécula antimicrobiana dada para inducir la muerte bacteriana, independientemente de su modo de acción. Así, la mayoría de los péptidos y proteínas antibacterianos se caracterizan por su afinidad por la heparina (32, 44). Para determinar si el colágeno tipo VI presentaba propiedades similares, se probó la heparina marcada con biotina en un ensayo de slot blot para determinar su unión a fragmentos recombinantes inmovilizados de colágeno tipo VI (como se indica en la Fig.2A). La heparina se unió a las diferentes regiones N- y C-terminal con intensidad variable (Fig.2B, panel izquierdo). Curiosamente, la afinidad de la heparina por el a3C fue comparable a la del LL-37, el control positivo. La unión a todos los fragmentos fue bloqueada por heparina no marcada (Fig.2B, panel derecho). Para visualizar estas interacciones, se conjugaron directamente fragmentos de colágeno de tipo VI con oro coloidal y se incubaron con bacterias S. pyogenes. La tinción negativa y la microscopía electrónica de transmisión revelaron que todos los fragmentos se unían a las superficies bacterianas en ausencia de heparina (Fig.2C, panel superior). No se observó ninguna unión en presencia de heparina, y en su lugar los conjugados de oro se distribuyeron aleatoriamente en el fondo (Fig. 2C, panel inferior). Se obtuvieron resultados similares para S. aureus, E. coli y P aeruginosa en ausencia o presencia de heparina (Fig.2D). Lo mismo ocurrió con la proteína completa (datos no mostrados).

Las regiones globulares recombinantes que contienen el dominio VWA de las tres cadenas a del colágeno tipo VI inducen la muerte bacteriana por rotura de la membrana

Para correlacionar la actividad antibacteriana del colágeno tipo VI con las regiones globulares N- y C-terminales individuales, se investigó el efecto bactericida de las proteínas recombinantes sobre los estreptococos. Se incubaron bacterias de la cepa AP1 de S. pyogenes con concentraciones crecientes de proteína y se analizaron mediante ensayos de recuento viable. Las bacterias mostraron una destrucción dependiente de la dosis en presencia de los diferentes fragmentos (Fig. 3A). Curiosamente, las regiones N- y C-terminal del a3(VI) fueron más potentes que los dominios respectivos del a1(VI) y a2(VI). Para analizar estos hallazgos a nivel ultraestructural, se examinaron muestras de bacterias incubadas con dominios VWA mediante microscopía electrónica de barrido de alta resolución. Como se muestra en la Fig.3B, las bacterias mostraron alteraciones estructurales significativas, como perturbaciones de la membrana, formación de burbujas y exudación de componentes citoplasmáticos. En particular, los estreptococos tratados con a3N y a3C mostraron una alteración de la membrana significativamente mayor. En cambio, las bacterias de control tratadas en condiciones similares sólo con tampón no se vieron afectadas (Fig.3B, arriba). Estos resultados implican que las regiones globulares del colágeno tipo VI que contienen dominios VWA individuales presentan un modo de eliminación bacteriana similar al de la holoproteína.

Los dominios VWA de la cadena a3 del colágeno tipo VI contienen motivos de aminoácidos anfipáticos con posible actividad antibacteriana

Las propiedades catiónicas, hidrofóbicas y anfipáticas son esenciales para el núcleo mismo de la actividad de los péptidos antimicrobianos, ya que la combinación de estas propiedades gobierna el grado en que se induce la muerte bacteriana (9, 45). Por lo tanto, se realizó un análisis de secuencia in silico de los dominios vWa de la cadena a3(VI) para identificar tales motivos de aminoácidos con actividad antimicrobiana putativa. Se eligió el a3(VI) porque resultó ser el más eficaz en la eliminación de bacterias, tal como se ha descrito anteriormente. En primer lugar, definimos la posible estructura secundaria alineando las secuencias de los dominios VWA N- y C-terminal (N10-N₂y C1, ver Fig.2A) mediante el programa Swiss-Pdb Viewer. Este análisis reveló que se predice que estos dominios asumen ahélices (Fig. 4, recuadros rectangulares), así como p-hebras (Fig. 4, flechas negras). Además, los modelos 3D generados con ModBase propusieron que estos dominios consisten en una hoja p hidrofóbica central de seis hebras flanqueada a ambos lados por tres hélices a anfipáticas (datos no mostrados). Estos hallazgos concuerdan en general con los datos estructurales obtenidos mediante cristalografía de rayos X del dominio a3N5 de ratón (42). Los dominios VWA N1 y C₂(véase la Fig. 2A) no se incluyeron en este estudio porque no había modelos moleculares disponibles en ninguna base de datos. A continuación, se determinaron los aminoácidos que probablemente estarían expuestos en la superficie (Fig. 4, letras en negrita) para predecir posibles sitios de interacción entre estos dominios y la membrana bacteriana. Combinando estos resultados con las zonas cargadas positivamente (Fig. 4, resaltadas en gris) en la secuencia, fue posible predecir regiones antimicrobianas putativas, como se indica en los recuadros azules.

Péptidos derivados de los dominios VWA de la cadena a3 del colágeno tipo VI ejercen actividad bactericida

Se identificaron secuencias peptídicas de regiones antimicrobianas putativas con una alta carga neta total e hidrofobicidad, ya que estas propiedades son prerrequisitos importantes para los AMP (46, 47). En total, se eligieron cinco péptidos de los dominios N3, N₂y C1 (Fig. 5, B y C). También se generaron modelos de representación de la superficie para obtener una visión general de la carga neta de estos dominios y, efectivamente, los dominios C1 y N3 mostraban un gran número de regiones catiónicas en su superficie (Fig.5A). En el caso del N₂se observaron pautas similares, aunque en menor medida. El dominio N10 mostraba más residuos aniónicos en su superficie (Fig.5A) y se utilizó un péptido sintetizado a partir de ese dominio como control negativo (DVN32). Con el fin de verificar la actividad antibacteriana de los péptidos derivados de VWA seleccionados, todos los péptidos se sometieron a ensayos de difusión radial (RDA) para comprobar su actividad bactericida frente a E. coli, S. aureus y P aeruginosa. Todos los péptidos mostraron una actividad bactericida significativa contra todas las cepas ensayadas en distinta medida (Fig. 6, A-C). Curiosamente, en la mayoría de los casos, el potencial de destrucción bacteriana observado fue considerablemente superior al de nuestro control positivo, el péptido "clásico" de defensa del huésped LL-37. Estos hallazgos demuestran que los dominios VWA de la cadena a3(VI) contienen varios motivos antimicrobianos.

Ejemplo B

Introducción

El propósito de este ejemplo era investigar más a fondo el modo de acción y los efectos inmunomoduladores de los péptidos de defensa del huésped derivados del colágeno tipo VI.

Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas

La cepa AP1 (40/58) deStreptococcus pyogenes del serotipo M1 procedía del Centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud para la Referencia e Investigación de Estreptococos, Praga, República Checa. La cepa 111 de Staphylococcus aureus y la cepa B1351 de Escherichia coli se recogieron en el Departamento de Microbiología Clínica del Hospital Universitario de Lund (Suecia). La cepa de Pseudomonas aeruginosa utilizada en este estudio fue PAO1 (ATCC, Teddington Oly, Reino Unido), aislada originalmente de una herida.

Medios de cultivo

Todas las bacterias se cultivaron rutinariamente en caldo Todd-Hewitt (THB, Difco, Detroit, DI, USA) incubando a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO₂.

Extracción de colágeno tipo VI y síntesis de péptidos

Las microfibrillas de colágeno tipo VI se extrajeron de la córnea bovina mediante digestión con colagenasa, tal como describen Spissinger et al. (34), con modificaciones de Bober et al. (35). En resumen, las córneas bovinas se cortaron en trozos y se homogeneizaron en tampón Tris/salino que contenía 5 mM de cloruro cálcico e inhibidores de proteasas. El homogeneizado se digirió con colagenasa tipo 1 (Worthington biochemical corporation, Lakewood, NJ). El material no disuelto se pelleteó por centrifugación a 48.000 * g durante 20 min. El sobrenadante se aplicó en alícuotas de 500 μl sobre una columna Superose 6 de 25 ml (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) equilibrada y eluida con tampón de homogeneización a 0,2 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 0,5 ml, y las que contenían colágeno VI se agruparon y almacenaron a 4°C. Biopeptides (San Diego, EE.UU.) sintetizó péptidos derivados del colágeno tipo VI (véase la Tabla 3). LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES) (SEQ ID NO: 36) (Innovagen AB, Lund, Suecia). La pureza (>95%) y la masa molecular de estos péptidos se confirmaron mediante análisis MALDI-TOF MS. Todos los péptidos utilizados eran solubles en agua, excepto el DVN32, que se disolvió en ≤ 0,01% DMSO (Sigma-Aldrich, St Louis).

Microscopía electrónica de transmisión

La unión de los péptidos a la superficie de las bacterias y al LPS se visualizó mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión como se ha descrito previamente (35). Brevemente, las bacterias (2 *109 ufc/ml) se incubaron con 2 μM de péptido conjugado con 10 nm de oro coloidal durante 2 h a 37°C con un 5% deoo2. Para la unión al LPS (de Escherichia coli 0111 :B4, Sigma-Aldrich), se incubaron 2 μM de péptido conjugado con 10 nm de oro coloidal con LPS (10 μg/ml) durante 1 h a RT. Las muestras se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Philips/FEICM 100 TWIN que funcionaba a una tensión de aceleración de 60 kV. Las imágenes se grabaron con una cámara Olympus Veleta de montaje lateral y el software de adquisiciones ITEM.

Tabla 3. Secuencia de aminoácidos y propiedades fisicoquímicas de los péptidos utilizados en este estudio.

Dicroísmo circular

Las mediciones de dicrosmo circular (CD) se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-810 equipado con un Peltier Jasco CDF-426S ajustado a 25°C. Las mediciones se realizaron al menos por duplicado en una cubeta de cuarzo de 10 mm bajo agitación con una concentración de péptido de 30 mM. Las mediciones se realizaron al menos por duplicado en una cubeta de cuarzo de 10 mm bajo agitación con una concentración de péptido de 30 mM. En algunas muestras se añadió LPS (0,2 mg/ml) para estudiar el efecto sobre la estructura secundaria de los péptidos. Se controló en el intervalo de 200-260 nm (la velocidad de barrido fue de 20 nm/min). Se sustrajeron las medias de cinco exploraciones.

Ensayo bactericida

Las bacterias se cultivaron hasta fase logarítmica media (OD₆₂₀“ 0,4) en medio THB a 37°C, con 5% de CO₂. La solución bacteriana se lavó posteriormente y se ajustó a 2 *107 ufc/ml en tampón salino (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl complementado con 5 mM de glucosa; pH 7,4) (ambos de Sigma-Aldrich). Se incubaron varias concentraciones de péptidos (0,3, 0,6, 3, 6, 30 y 60 ^jM) con bacterias en tampón salino con o sin un 20% de plasma humano. Las bacterias incubadas únicamente en tampón salino con o sin plasma se utilizaron como controles negativos. Las muestras con LL-37 sirvieron como controles positivos. Las muestras se incubaron durante 2 h a 37 °C con un 5% de CO₂. Para cuantificar la actividad bactericida, se sembraron diluciones seriadas de las mezclas de incubación en placas de agar THB, se incubaron a 37 °C con un 5% de CO₂durante toda la noche y se determinó el número de ufc. Los experimentos se realizaron por triplicado. La supervivencia al cien por cien se definió como la supervivencia total de las bacterias en el mismo tampón y en las mismas condiciones en ausencia de péptidos. Ensayo de captación de yoduro de propidio

La permeabilización de la membrana bacteriana se evaluó utilizando el colorante yoduro de propidio (PI) (Sigma-Aldrich) como se ha descrito previamente (39). Brevemente, las bacterias se cultivaron hasta la mitad de la fase logarítmica (OD₆₂₀“ 0,4), se lavaron y se ajustaron a 2 *109 ufc/ml. Las bacterias (diluidas 1:100) se mezclaron con péptidos (30 j M de concentración final) en presencia de tampón salino con o sin plasma y se incubaron durante 2h a 37°C, con un 5% de CO₂. Se añadió PI (0,5 mg/ml) a cada muestra y se incubó durante 30 minutos en hielo y en la oscuridad. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo (citómetro de flujo BD Accuri, Becton Dickinson, Franklin Lakes). Las bacterias incubadas únicamente en tampón salino con o sin plasma humano se utilizaron como controles negativos. Como control positivo, las bacterias se trataron con etanol al 70% durante 20 minutos a temperatura ambiente. El porcentaje de permeabilización de la membrana se calculó como el porcentaje de intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas con péptidos con respecto a la intensidad de fluorescencia de las muestras no tratadas.

Microscopía electrónica de barrido

Las bacterias (2 *109 ufc/ml) se incubaron con 30 j M de péptido durante 2 h a 37°C en condiciones fisiológicas como tampón salino con o sin plasma. Las muestras se fijaron con tampón cacodilato (2,5% de glutaraldehído (Merck, Alemania) en 0,1 M de cacodilato sódico (Sigma-Aldrich), pH 7,4, se lavaron con tampón cacodilato y se deshidrataron con una serie ascendente de etanol como se ha descrito previamente (40). Las muestras de tejido se montaron en soportes de aluminio, se bombardearon con 20 nm de paladio/oro y se examinaron en un microscopio electrónico de barrido Philips/FEI XL 30 FEG operado a una tensión de aceleración de 5 kV.

Ensayo de permeabilización de la membrana

Se formaron películas lipídicas secas de extracto de lípidos polares de E. coli en paredes de matraces de fondo redondo disolviendo lípidos en cloroformo, seguido de evaporación bajo flujo de N₂y posteriormente colocado en vacío durante la noche. Las películas lipídicas se volvieron a suspender mediante agitación durante 30 minutos (E. coli), a 55°C en una solución acuosa de 100 mM de 5(6)- carboxifluoresceína en 10 mM de Tris (ajustada a pH 7,4 a 37°C). A continuación, las suspensiones se agitaron en vórtex y se extrudieron repetidamente a través de una membrana de policarbonato de 100 nm montada en un miniextrusor LipoFast (Avanti Polar Lipids) para reducir las estructuras multilamelares y la polidispersidad. La carboxifluoresceína no atrapada se eliminó mediante filtración en gel en columnas Sephadex PD-10 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). La permeabilidad de la membrana se midió monitorizando el eflujo de carboxifluoresceína de los liposomas al entorno externo de baja concentración, lo que dio lugar a la pérdida del autoenfoque y a un aumento de la señal de fluorescencia con longitudes de onda de excitación y emisión de 492 y 517 nm, respectivamente. La fluorescencia se midió con un lector Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en una placa negra de 96 pocillos Nunc Delta Surface (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, DK). Los pocillos se prepararon con una dilución doble en serie de los péptidos en tampón tris, así como con controles sin péptidos (fondo) y 0,16% Triton X-100 (fuga máxima). Las placas se precalentaron a la temperatura de incubación (37 °C) y se administró solución de liposomas, a una concentración final de lípidos de 10 μM en 200 μl, con el dispensador integrado Varioskan. Los efectos de cada concentración de péptido en los sistemas de liposomas se controlaron durante 45 min, momento en el que la fuga inicial había disminuido en gran medida. Los resultados mostrados representan la media de experimentos por triplicado con desviaciones estándar y se expresan como porcentaje de la fuga total generada con Triton X-100 y sustracción del valor de referencia. Los valores_EC50se calculan a partir de un ajuste de curva sigmoidal dosis-respuesta con pendiente variable al porcentaje de fuga en función de la concentración del péptido (Iog10), utilizando Graphpad Prism.

Ensayo de hemólisis

Se extrajo sangre de individuos sanos en tubos Vacutainer (Becton Dickinson) que contenían EDTA y se centrifugaron a 800 * g durante 10 min. Se eliminaron el plasma y la capa leucocitaria. Los eritrocitos se lavaron tres veces y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Medicago, EE.UU.). Las células se incubaron con péptidos (concentración final de 30 y 60 μM) durante 1 h a 37 °C en rotación de extremo a extremo. Las células incubadas con un 2% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) sirvieron como control positivo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 800 * g durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y la absorbancia de la liberación de hemoglobina se midió a 540 nm y se expresa como % de hemólisis inducida por Tritón X-100.

Ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH)

Los experimentos de citotoxicidad se realizaron como se ha descrito anteriormente (41). Brevemente, las células monocíticas humanas THP-1 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA) se cultivaron en placas de 96 pocillos utilizando medio de Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) (PAA Laboratories) suplementado con un 10% de suero fetal de ternera. Se eliminó el medio y las células se lavaron posteriormente con DMEM. Se añadieron péptidos (1, 5, 10, 20, 50 μM) diluidos en DMEM por triplicado. El kit TOX-7 basado en LDH (Sigma-Aldrich) se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de LDH liberada por las células muertas se midió a 450 nm. Como control positivo se utilizó Triton X-100 al 2%.

Estimulación de macrófagos por LPS in vitro

Se sembraron células similares a macrófagos murinos (RAW 264.7; ATCC) en placas de 96 pocillos a razón de 3,5*105 células/pocillo en DMEM (sin rojo fenol, PAA Laboratories) suplementado con 10% de suero fetal de ternera y antibiótico-antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tras una incubación de una noche a 37°C, las células se lavaron una vez con DMEM. El LPS (10 ng/ml) se preincubó con los péptidos durante 20 min a temperatura ambiente y se añadió a las células. Posteriormente, las células se incubaron durante 24 h a 37°C. Se añadió reactivo de Griess (Sigma, St. Louis, MO) al sobrenadante del cultivo en proporción 1:1 seguido de 15 min de incubación en la oscuridad. A continuación, se midió la absorbancia a 550 nm con un espectrofotómetro. Las células con y sin estimulación de LPS se tomaron como controles positivo y negativo para la inducción de LPS. Para la determinación de la producción de NO con los tratamientos con péptidos y LPS, el ensayo se realizó por triplicado y se consideraron los valores medios de cada conjunto. Las células se cultivaron a 37°C y con un 5% de CO₂en aire totalmente humidificado.

Ensayo de cicatrización de heridas in vitro

Las células HaCaT (ATCC) se cultivaron en una placa de 24 pocillos a 3*105 células/pocillo con medio basal de queratinocitos, (KBM Gold, Lonza Group AG, Suiza) según las instrucciones del fabricante, hasta confluencia. Antes del experimento, las células se cultivaron en medio libre de suero durante 24 h. La monocapa celular se sometió a un raspado mecánico con una punta de pipeta estéril. Las células desprendidas se eliminaron lavándolas dos veces con PBS. Se añadieron a las células péptidos derivados del colágeno tipo Vl (10 μg/ml), LL-37 (10 μg/ml) y colágeno tipo VI (10 μg/ml) y se incubaron durante 24 h a 37°C. Las células con y sin adición de FCS al 10% en el medio basal se utilizaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Todos los experimentos se realizaron en una atmósfera humidificada con un 5% de CO₂a 37°C. Se tomaron imágenes de la monocapa celular herida utilizando un microscopio (Olympus, cámara digital SC₃0, Tokio, Japón) a las 0 y 24 h de la herida por rascado.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron con Graphpad Prism 6. Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. Los valores se expresaron como medias ± errores estándar y la significación se determinó como un valor p ≤0,05.

Resultados y conclusiones

Adherencia de péptidos derivados del colágeno tipo VI a la superficie bacteriana

Para examinar si los péptidos derivados del colágeno de tipo VI (véase la Tabla 3) interactúan con las superficies bacterianas, se incubaron péptidos marcados con oro con P aeruginosa y S. aureus y se sometieron a microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Las micrografías electrónicas revelaron que SFV33 y LL-37 eran capaces de adherirse a la superficie bacteriana de S. aureus y P aeruginosa (Fig. 7A), lo que también ocurría con los otros péptidos (datos no mostrados). Curiosamente, incluso el péptido de control DVN32, que está cargado negativamente, se unió a las superficies bacterianas de S. aureus y P aeruginosa.

Unión de péptidos derivados del colágeno tipo VI al LPS

En la siguiente serie de experimentos, para determinar si el lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas podría servir como diana potencial para péptidos derivados de colágeno tipo VI, se incubó LPS de E. coli con péptidos conjugados con oro durante 1 h y se sometió a microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Tanto LL-37 como SFV33 se unieron al LPS (Fig. 7B), mientras que DVN32 se unió un poco. Para investigar la interacción entre el LPS y estos péptidos se analizaron sus estructuras secundarias mediante análisis de dicrosmo circular (CD). LL-37 adoptó claramente una estructura helicoidal en presencia de LPS (Fig. 7C), mientras que DVN32 no cambió su estructura y permaneció lineal. Los espectros CD muestran que el cambio de conformación de SFV3 se asemeja a una estructura de espiral aleatoria en comparación con los otros péptidos (GVR28, FFL25, FYL25 y VTT30), que mostraban una mezcla de hélice alfa y lámina beta (datos no mostrados).

Los péptidos derivados del colágeno tipo VI muestran actividad antibacteriana en condiciones fisiológicas

Las actividades antibacterianas de muchos AMPs son inhibidas en un ambiente fisiológico tal como una alta concentración de sal o la presencia de proteínas plasmáticas (48, 49). Se realizaron ensayos de recuento viable utilizando péptidos derivados del colágeno tipo VI. Para ello, un panel de bacterias Gram-positivas S. pyogenes y S. aureus así como las bacterias Gram-negativas E. coli y P aeruginosa fueron sometidas a péptidos derivados del colágeno tipo VI en presencia de sal fisiológica con o sin 20% de plasma humano. Para comparar, se utilizó el AMP clásico LL-37 a las mismas concentraciones. La figura 8 muestra que SFV33 mata muy eficazmente a P aeruginosa y E. coli en plasma, mientras que su actividad antimicrobiana frente a S. pyogenes se redujo ligeramente. En particular, el efecto antimicrobiano del SFV33 dependió de la dosis en ambas condiciones. Ninguno de los péptidos ejerció actividad antibacteriana contra S. aureus en presencia de plasma (Fig. 8). En condiciones salinas, SFV33 mostró efectos casi similares a los de LL-37, mientras que GVR28 mostró efectos algo reducidos. En cambio, el péptido de control negativo (DVN32), como era de esperar, no ejerció actividad antibacteriana, ni siquiera a concentraciones más elevadas.

Actividad permeabilizadora de la membrana de péptidos derivados del colágeno tipo VI

Para investigar los efectos de los péptidos derivados del colágeno tipo VI sobre las membranas bacterianas, se midió la captación de yoduro de propidio. Como se muestra en la Fig. 9A, el SFV33 indujo un grado significativo de permeabilización de la membrana de P aeruginosa y S. aureus en condiciones salinas. También se detectaron efectos similares para SFV33 en plasma sobre P aeruginosa, pero no para LL-37. Los otros péptidos no fueron capaces de inducir la permeabilización de la membrana en condiciones fisiológicas, como se observó en S. aureus. Sin embargo, mostraron daños en la membrana en presencia de sal en P aeruginosa (Fig. 9A).

El efecto del SFV33 sobre las membranas bacterianas se examinó además con microscopía electrónica de barrido de alta resolución. A nivel ultraestructural, SFV33 causó la disrupción de las bacterias, provocando la desintegración y expulsión de los componentes citoplasmáticos en presencia de sal (P aeruginosa y S. aureus) y plasma (P aeruginosa) (Fig. 9B). Las bacterias tratadas con DVN32 no mostraron daños en la membrana y fueron similares a los controles. Estos resultados respaldan aún más la idea de que el péptido SFV33 derivado del colágeno tipo Vl altera las membranas celulares de P aeruginosa y S. aureus a una fuerza iónica fisiológica similar a la observada para LL-37.

Para investigar el efecto de los péptidos derivados del colágeno tipo VI sobre las membranas se utilizó un modelo liposomal para estudiar la permeabilización de las membranas. Los péptidos se sometieron a pruebas de fuga de membrana en un sistema de membrana modelo liposomal (extracto lipídico polar de E. coli). Los resultados mostraron que todos los péptidos tienen la capacidad de causar la permeabilización de la membrana a pH fisiológico, excepto DVN32 (Fig. 10A). Los péptidos indujeron una liberación de carboxifluoresceína dependiente de la concentración. FYL25 y SFV33 indujeron la mayor fuga de membrana en comparación con VTT30 (Fig. 10B). En conjunto, estos resultados respaldan firmemente las implicaciones del ensayo de fuga, la captación de yoduro de propidio y los experimentos de microscopía electrónica de barrido en el sentido de que la actividad antimicrobiana de los péptidos de colágeno de tipo VI, como el SFV33, probablemente se deba a daños en la membrana celular bacteriana.

Efecto de los péptidos en las células eucariotas

Un efecto secundario importante de algunos AMP es que no sólo actúan sobre las membranas bacterianas sino que también pueden destruir y eliminar células eucariotas. Se evaluó el efecto citotóxico de diferentes concentraciones de péptidos sobre los eritrocitos y los monocitos. Se utilizó Triton X-100 al 2% como agente citotóxico, un control positivo. Los resultados muestran que los péptidos no mostraron ninguna toxicidad hacia los eritrocitos y monocitos en concentraciones de hasta 30 ^{j M ,}en contraste con LL-37 (Fig. 11A y B). Sin embargo, el SFV33 mostró toxicidad a 50 ^{j M}para los monocitos (Fig. 11B). No obstante, estos resultados demuestran que los péptidos derivados del colágeno de tipo VI no afectaron a la viabilidad de las células humanas en ninguna de las concentraciones utilizadas para eliminar las bacterias.

Propiedades inmunomoduladoras de los péptidos derivados del colágeno tipo VI

El LPS es una endotoxina bien estudiada liberada por la membrana externa de las bacterias Gram negativas y desempeña un papel importante en la patogénesis de ciertas enfermedades bacterianas. Una liberación masiva de LPS puede causar un shock endotóxico y provocar la muerte (50). Se investigaron los efectos inmunomoduladores de los péptidos derivados del colágeno tipo VI. Se estimularon células similares a macrófagos murinos simultáneamente con LPS de E. coli y péptidos derivados del colágeno tipo VI y se midió la cantidad de nitrito en el sobrenadante con el reactivo de Greiss. Como se muestra en la Fig. 12, la adición de GVR28 suprimió significativamente la inducción de nitrito por LPS, que es similar a las observadas tras el tratamiento con LL-37. Por el contrario, los otros péptidos fueron incapaces de bloquear la producción de nitrito inducida por LPS.

Para examinar el efecto biológico de los péptidos sintéticos derivados del colágeno tipo VI en la cicatrización de heridas, se cultivaron células HaCaT en pocillos de una placa de 24 pocillos; se rasparon las células y se incubaron con colágeno tipo VI intacto, péptidos derivados del colágeno tipo Vi o LL-37 (10 jg/ml). La migración celular se registró mediante microfotografía a las 0 h y 24 h. Como se ilustra en la Fig. 13, los péptidos derivados de colágeno tipo VI mostraron una notable capacidad de cierre de heridas a las 24 h en comparación con las células de control sin suplemento. El péptido SFV33 no favoreció la cicatrización de las heridas.

Ejemplo C

Introducción

El propósito de este estudio fue evaluar los efectos antimicrobianos de los péptidos derivados del colágeno tipo VI en bacterias que son resistentes a muchos agentes antibióticos convencionales (52, 53). Además, este estudio evaluó el efecto del colágeno tipo VI en las membranas de bacterias resistentes.

Materiales y procedimientos

Microorganismos y condiciones de cultivo

Las siguientes cepas bacterianas multirresistentes fueron amablemente proporcionadas por Lisa Páhlman, (Dept. of Infection Medicine, Lund University): Pseudomonas aeruginosa (MRPA), Staphylococcus aureus (MRSA) Escherichia coli (MREC), Staphylococcus epidermidis (MRSE) y Klebsiella pneumoniae (MRKP) Todos los microorganismos multirresistentes analizados eran aislados clínicos de pacientes con bacteriemia o neumonía. Todas las cepas se cultivaron durante la noche en caldo Todd-Hewitt (THB, Gibco, Grand Island, NY EE.UU.) a 37°C en una atmósfera húmeda con un contenido del 5%.

Ensayo de actividad antibacteriana

Las bacterias se cultivaron hasta la mitad de la fase logarítmica en caldo Todd-Hewitt (OD₆₂₀“ 0,4), se cosecharon por centrifugación a 3.500 rpm durante 10 min y se lavaron dos veces en tampón TBS. Las suspensiones bacterianas se ajustaron a 2 *109 unidades formadoras de colonias (ufc) por ml. Las bacterias se diluyeron en TBS y se incubaron con diferentes concentraciones de colágeno tipo VI o de péptidos de colágeno tipo VI. Las bacterias incubadas con TBS o péptido antimicrobiano LL-37 3 ^{j M}(Innovagen, Lund, Suecia) se utilizaron como controles negativos o positivos, respectivamente. Las muestras se incubaron durante 2 h a 37 °C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO₂. Se sembraron diluciones seriadas en placas de agar, se incubaron durante la noche a 37 °C y, a continuación, se determinó el número de ufc contando las colonias visibles. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Microscopía electrónica de barrido

Para la microscopía electrónica de transmisión por emisión de campo (FESEM) de alta resolución, las muestras se fijaron durante la noche a temperatura ambiente con 2,5% de glutaraldehído en tampón cacodilato. A continuación se lavaron con tampón de cacodilato y se deshidrataron con una serie ascendente de etanol del 50% (v/v) al etanol absoluto. A continuación, las probetas se sometieron a secado en punto crítico con dióxido de carbono y se utilizó etanol absoluto como disolvente intermedio. Las muestras de tejido se montaron en soportes de aluminio, se bombardearon con 20 nm de paladio/oro y se examinaron en un microscopio electrónico de barrido Philips/FEI XL 30 FESEM utilizando un detector de electrones secundarios Everhart-Tornley.

Resultados y conclusiones

El colágeno tipo VI y los péptidos derivados del colágeno tipo VI son antimicrobianos contra patógenos de mamíferos multirresistentes a los fármacos

Para evaluar los posibles efectos antibacterianos del colágeno tipo VI y sus péptidos, se trataron bacterias con preparaciones purificadas de esta proteína y sus péptidos. Las bacterias tratadas con tampón TBS o con el péptido de catelicidina LL-37 sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente. Los resultados de los ensayos de recuento de viables muestran la eliminación de patógenos humanos multirresistentes (Fig 14A-C). El tratamiento durante 2 h a 37 °C inhibió significativamente el crecimiento bacteriano en comparación con las bacterias de control tratadas con TBS. En particular, la eficacia de la eliminación bacteriana fue comparable a la del péptido antimicrobiano humano "clásico" LL-37, o incluso mejor.

Las propiedades de eliminación del colágeno de tipo VI están asociadas a la alteración de las membranas de Streptococcus y Pseudomonas, según se ha determinado mediante microscopía electrónica

Para una comprensión más detallada del mecanismo de destrucción subyacente, se inocularon biopsias de piel humana con MRSA y MRPA (como sistemas modelo) en presencia o ausencia de colágeno tipo VI y se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido. La figura 15 muestra el efecto bactericida de esta molécula tal como se ha indicado. En presencia de perturbaciones de la membrana de colágeno de tipo VI, se observaron blebbing y exudación de contenido citoplasmático. Los acontecimientos de desestabilización de la membrana a gran escala conducen finalmente a la desintegración de las células bacterianas en una mezcla de vesículas de membrana y eyectas citoplasmáticas. En conjunto, los datos presentados en las Figuras 14 y 15 muestran que el colágeno tipo VI y/o partes de esta molécula ejercen actividad antimicrobiana contra patógenos humanos multirresistentes mediante mecanismos que incluyen la ruptura de membranas. El efecto antimicrobiano depende de la dosis a concentraciones fisiológicas de pH y sal.

Ejemplo D

Introducción

El propósito de este estudio fue evaluar los efectos antimicrobianos de péptidos anfipáticos derivados de la secuencia de aminoácidos del colágeno VI, en un modelo de infección in vivo en ratones, de infección bacteriana con una Pseudomonas aeruginosa invasora (abreviada como P. aeruginosa).

Materiales y procedimientos

Microorganismos y condiciones de cultivo

Se cultivó P aeruginosa cepa 15159 durante la noche en caldo Todd-Hewitt (THB, Gibco, Grand Island, NY USA) a 37°C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO₂.

Experimentos con animales

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Local de Ética de la Universidad de Lund. Los animales se alojaron en condiciones estándar de luz y temperatura y tuvieron libre acceso a comida y agua estándar de laboratorio. Las bacteriasP aeruginosa 15159 se cultivaron hasta la mitad de la fase exponencial (A620 ~ 0,5), se lavaron y diluyeron en PBS hasta 2 *108 ufc/ml, y se mantuvieron en hielo hasta la inyección. Los ratones BALB/c hembra, de 8 semanas de edad, fueron anestesiados con isoflurano e inyectados por vía intraperitoneal con 100 μl de la solución bacteriana, seguida de la inyección de 100 μl de SFV33 o péptido GVR28 (1 mg/mL) después de 15 minutos, o con 100 μl de PBS solo (grupo de control).

Resultados

Efecto del tratamiento con péptidos derivados del colágeno VI en la supervivencia de ratones infectados

Se demostró un efecto beneficioso de SFV33 y GVR28 en estudios de supervivencia murina. Los ratones infectados por vía intraperitoneal fueron tratados con una dosis única de SFV33 o GVR2815 minutos después de la infección, y se registró la supervivencia. La figura 17 muestra que el 50% de los ratones infectados tratados con PBS murieron durante las primeras 12 horas. En cambio, en los grupos tratados con SFV33 y GVR28 se observó una mortalidad del 50% de los animales a las 24 horas. Comparando la tasa de mortalidad global de los grupos SFV33/GVR28 y PBS, los grupos de animales tratados con el péptido mostraron una supervivencia prolongada cuando el experimento se dio por finalizado a las 29 horas.

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51. Chu, M. L., Conway, D., Pan, T C., Baldwin, C., Mann, K., Deutzmann, R., y Timpl, R. (1988) Secuencia de aminoácidos del dominio de triple hélice del colágeno humano tipo VI. The Journal of biological chemistry 263, 18601-18606

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 5 de la cadena a3 del colágeno tipo VI; y

(b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con una secuencia según una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 5;

en el que el polipéptido tiene entre 20 y 200 aminoácidos de longitud; y

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en el que:

(i) los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos y virus; y/o

(ii) el polipéptido es capaz de unirse a la membrana del microorganismo; y/o

(iii) el polipéptido es capaz de provocar la rotura de la membrana de los microorganismos; y/o

(iv) el polipéptido es capaz de promover el cierre de la herida; y/o

(v) el polipéptido es capaz de mostrar un efecto antimicrobiano mayor o igual que el del LL-37.

3. Un polipéptido según la reivindicación 1 o 2, en el que:

(i) los microorganismos son bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, opcionalmente en los que los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia co li, estreptococos del grupo A (p. ej. Streptococcus pyogenes), estreptococos del grupo B (p. ej. Streptococcus agalactiae), estreptococos del grupo C (p. ej. Streptococcusdysgalactiae), estreptococos del grupo D (p. ej.Enterococcus faecalis), estreptococos del grupo F (p. ej. Streptococcus anginosus), estreptococos del grupo G (p. ej. Streptococcus dysgalactiae equisimilis), estreptococos alfahemolíticos (p.ej. Streptococcusviridans, Streptococcus pneumoniae), Streptococcus bovis, Streptococcus mitis, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptococcusmutans, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi), Haemophilus influenzae b (Hib), Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus cloacae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis , Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA), Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA), Escherichia coli multirresistente (MREC), Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) y Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP); y/o

(ii) los microorganismos son bacterias resistentes a uno o más agentes antibióticos convencionales, opcionalmente en los que

el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA), Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA), Escherichia coli multirresistente (MREC), Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) y Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP).

4. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que: (i) el polipéptido es sustancialmente no tóxico para las células de mamífero; y/o

(ii) el polipéptido es capaz de ejercer un efecto antiendotóxico; y/o

(iii) el polipéptido se deriva de un dominio del Factor von Willebrand tipo A; y/o

(iv) el polipéptido se deriva de la cadena a3 del colágeno tipo VI; y/o

(v) el polipéptido se deriva del dominio N₂, N3 o C1 de la cadena a3 del colágeno tipo VI; y/o

(vi) el polipéptido tiene una carga neta positiva, opcionalmente en la que la carga del polipéptido varía entre 2 y 9; y/o

(vii) el polipéptido tiene al menos un 30% de residuos hidrófobos.

5. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que:

(i) el polipéptido tiene entre 20 y 150 aminoácidos de longitud , por ejemplo entre 20 y 100, 20 y 50, 20 y 40 o 25 y 35 aminoácidos de longitud; y/o

(ii) el polipéptido comprende uno o más aminoácidos que están modificados o derivatizados; opcionalmente, en el que el uno o más aminoácidos están modificados o derivatizados por PEGilación, amidación, esterificación, acilación, acetilación y/o alquilación; y/o

(iii) el polipéptido es un polipéptido recombinante.

6. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de identidad según una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 o 5.

7. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones predentes, o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico, opcionalmente en la que el vector es un vector de expresión.

8. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector según la reivindicación 7.

9. Un procedimiento de fabricación de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende:

(i) cultivar una población de células huésped según la reivindicación 8 en condiciones en las que se exprese dicho polipéptido, y aislar el polipéptido de las mismas; o bien

(ii) síntesis en fase líquida o sólida del polipéptido.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 junto con un excipiente, diluyente, vehículo, tampón o adyuvante farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en la que

la composición farmacéutica es adecuada para su administración a través de una vía seleccionada del grupo que consiste en administración oral, administración parenteral y administración tópica.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que la composición se presenta en forma de gel polimérico, opcionalmente en la que el polímero comprende colágeno.

12. Un dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas, o material para uso en el mismo, que está recubierto, impregnado, mezclado o asociado de otro modo con una composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, opcionalmente en el que:

(i) el dispositivo, implante, producto para el cuidado de heridas o material es para su uso en cirugía de baipás, circulación extracorpórea, cuidado de heridas y/o diálisis; y/o

(ii) la composición farmacéutica está recubierta, pintada, pulverizada o aplicada de otro modo a una sutura, prótesis, implante, apósito para heridas, catéter, lente, injerto cutáneo, sustituto cutáneo, pegamento de fibrina o vendaje; y/o

(iii) el dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas o material para su uso comprende o consiste en un polímero, metal, óxido metálico y/o cerámica.

13. Un kit que comprende una composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11 o un dispositivo médico, implante, producto para el cuidado de heridas o material para su uso en el mismo, según la reivindicación 12.

14. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, o una composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 u 11 para uso en medicina.

15. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, o una composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 u 11 para su uso en el tratamiento curativo y/o profiláctico de infecciones microbianas, opcionalmente en el que:

(i) la infección microbiana es una infección sistémica; y/o

(ii) la infección microbiana es resistente a uno o más agentes antibióticos convencionales; y/o

(iii) la infección microbiana está causada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, estreptococos del grupo A (p. ej., Streptococcus pyogenes), estreptococos del grupo B (p. ej., Streptococcus agalactiae), estreptococos del grupo C (p. ej., Streptococcus dysgalactiae), estreptococos del grupo D (p. ej., Entero-coccus faecalis), estreptococos del grupo F (p. ej., Streptococcus faecalis). Streptococcus dysgalactiae), estreptococos del grupo D (p. ej. Entero-coccus faecalis), estreptococos del grupo F (p. ej. Streptococcus anginosus), estreptococos del grupo G (p. ej. Streptococcus dysgalactiae equisimilis), estreptococos alfahemolíticos (p. ej. Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae), Streptococcus bovis, Streptococcus mitis, Streptococcus anginosus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptococcus mutans, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi), Haemophilus influenzae b (Hib), Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus cloacae, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis , Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MRPA), y Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA), Escherichia coli multirresistente (MREC), Staphylococcus epidermidis multirresistente (MRSE) y Klebsiella pneumoniae multirresistente (MRKP); y/o

(iv) la infección microbiana está causada por un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) y Pseudomonas aeruginosa multirresistente ( PPAr); y/o

(v) el polipéptido, la molécula de ácido nucleico o la composición farmacéutica es para su uso en combinación con uno o más agentes antimicrobianos adicionales, opcionalmente en el que el uno o más agentes antimicrobianos adicionales se selecciona del grupo que consiste en: polipéptidos antimicrobianos y antibióticos.

16. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, o una composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 u 11 para su uso en el cuidado de heridas.

17. Un procedimiento para eliminar microorganismos in vitro que comprende poner en contacto los microorganismos con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, o una composición farmacéutica según las reivindicaciones 10 u 11.