CN113521247A - 一种聚离子复合物纳米材料多肽载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚离子复合物纳米材料多肽载体及其制备方法，所述载体是由透明质酸钠与多粘菌素B硫酸盐络合而成的聚离子复合物纳米材料。所述聚离子复合物纳米材料多肽载体的粒径在100‑200nm之间，聚离子复合物表面电荷近中性，能够有效降低多粘菌素B的毒性，并发挥其故有的药物活性。所述聚离子复合物纳米材料多肽载体的制备方法简便、可控性好，生产成本低、产品性能稳定，易于产业化推广。

Description

一种聚离子复合物纳米材料多肽载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物载体，属于制药学应用技术领域。

背景技术

抗生素的使用在细菌感染的治疗上取得了巨大成效，但是传统抗生素使用所带来的耐药性和毒副作用极大地限制了其广泛和有效的应用，耐药性迫使抗生素大剂量给药，又更大程度加剧了对组织和器官产生的高毒性。多粘菌素B是一种抗生素，分子式为C₄₃H₈₂N₁₆O₁₂。对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌及嗜血杆菌等多种阴性菌有抑制作用，对其他抗生素耐药的菌株，该品也敏感。作为对抗革兰氏阴性“超级细菌”的最终治疗方法，在ICU病人治疗中被广泛使用。但由于其严重的肾毒性及神经阻滞作用，导致多粘菌素B在临床应用中收到极大限制。因此，目前细菌感染仍然是全球最大的卫生挑战之一。而开发新的抗生素，则要求大量的经济，劳动力和时间成本，难以立即解决目前的技术问题。

近年来，已经证明了用于抗生素输送的抗菌纳米颗粒和纳米级载体在体外和体内模型及临床中治疗细菌感染(包括抗药性抗生素)的有效性。但多粘菌素B的肾毒性大，需要策略以使该毒性最小化并确保实现抗菌药物的有效剂量。纳米抗生素(nano-antibiotics)是目前发展的一种新型抗生素体系，可以在纳米尺度输送药物，逃避细菌的耐药机制，被认为是一种有前途的控制细菌感染方法。

由于多粘菌素B的毒性与其两亲性和阳离子性有关。因此，目前最大限度地降低毒性的策略是减少阳离子残基的数量和两亲性特征或合成前药(阳离子基团被掩蔽以产生带负电荷的衍生物)。然而，这两种策略往往导致抗菌活性的丧失，因为多粘菌素B的活性与这些阳离子所带正电荷的存在直接相关。聚合物药物的合成已被用作替代物，但该策略仍然依赖于多粘菌素B(或衍生物)的共价连接到聚合物骨架，导致活性损失。

本发明的目的就是提供一种多肽载体，所述载体能够在药物递呈过程中有效降低多粘菌素B的毒性，并保持其药物活性，从而能够有效发挥多粘菌素B的药物活性，并解决因使用多粘菌素B所带来的耐药性和毒副作用问题。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种聚离子复合物纳米材料多肽载体，所述载体是由透明质酸钠与多粘菌素B聚合而成的聚离子复合物纳米材料。

在本发明的一个优选技术方案中，所述透明质酸钠的分子量为6000～10000g/mol。

在一个更为优选的技术方案中，所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为(0.3～0.5)：2.5。

在一个尤为优选的技术方案中，所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为0.4：2.5。

其次，本发明还提供了一种制备上述聚离子复合物纳米材料多肽载体，所述方法包括将分子量为6000～10000g/mol的透明质酸钠溶液和多粘菌素B硫酸盐溶液加入避光瓶中混合搅拌的步骤。

在本发明的一个优选技术方案中，加入避光瓶中的所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为(0.3～0.5)：2.5。

在一个更为优选的技术方案中，所述透明质酸钠溶液的浓度为2.5mM；所述多粘菌素B硫酸盐溶液的浓度为0.3～0.5mM。

在本发明的另一个优选技术方案中，将所述透明质酸钠溶液和多粘菌素B硫酸盐溶液以600-800μL/min的流速加入避光瓶。

在本发明的一个优选技术方案中，所述搅拌的速度为300～500RPM；搅拌的时间为24小时。

在本发明的另一个优选技术方案中，所述搅拌的温度为37℃。

本发明利用阴离子聚电解质透明质酸(HA)与阳离子抗菌肽多粘菌素B(PMB)通过静电吸附作用络合为聚离子复合物，即PMB分子链上质子化的氨基和HA分子链上的羧基之间可产生强静电吸引作用，PMB中的正电荷在带负电荷的HA存在下被“中和”，形成聚离子复合物。所述聚离子复合物表面电荷近中性，粒径在100-200nm之间，形状为纳米球状，大小均匀，从而成为一种纳米级的多肽载体，多肽抗菌剂被阴离子电解质静电吸附作用后仍保持正电性，使抗菌剂不必改变结构就可以被溶液屏蔽，不仅降低了抗菌剂对用药受体的毒副作用，还保持了其药物活性，得以在递送靶位发挥高效的药理活性，能够有效降低多粘菌素B的毒性，并发挥其应有的药物活性。

本发明制备工艺简单，可控性好，工艺条件简便，生产成本低、原料易得，产品性能稳定，所选用的材料为已获临床批准的医用材料，无需化学交联剂，安全性良好，为纳米制剂以后获准临床试验批准以及工业化发展提供了基础。

附图说明

图1.阳离子抗菌肽PMB与聚阴离子电解质HA自组装为聚离子复合物示意图；

图2.以[N:COOH]＝1,0.8,0.6制备的聚离子复合物动态光散射平均粒径图；

图3.HA和以[N:COOH]＝1,0.8,0.6制备的聚离子复合物表面电位图；

图4.以[N:COOH]＝0.8制备的聚离子复合物透射电镜图；

图5.以[N:COOH]＝0.8制备的聚离子复合物的抑菌区示意图；

图6.从经PBS，PMB，PMB-HA处理的小鼠(感染1×10⁹CFU)的肺组织匀浆中的细菌CFU结果；

图7.游离PMB、HA-PMB组处理24h后HPAEpiC细胞、HUVEC细胞的细胞活力示意图；

图8.经无血清培养基、游离PMB、HA、HA-PMB组处理24h后HPAEpiC细胞、HUVEC活/死细胞的染色示意图；

图9.聚离子复合物与人红细胞孵育溶血分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1：聚离子复合物纳米材料多肽载体的制备

本发明提供的聚离子复合物纳米材料多肽载体的制备原理如图1所示，图1显示了透明质酸(HA)与阳离子抗菌肽多粘菌素B(PMB)化学结构示意图，利用阴离子聚电解质透明质酸(HA)与阳离子抗菌肽多粘菌素B(PMB)通过静电吸附作用络合为聚离子复合物，即PMB分子链上质子化的氨基和HA分子链上的羧基之间可产生强静电吸引作用，PMB中的正电荷在带负电荷的HA存在下被“中和”，形成聚离子复合物纳米颗粒。抗菌剂PMB被阴离子电解质静电吸附作用后仍保持正电性，使抗菌剂不必改变结构就可以被溶液屏蔽，从而有效保持抗菌剂的活性。

制备聚离子复合物纳米材料多肽载体的详细步骤如下：

1.溶液制备

1.1将透明质酸钠溶于水中，得澄清透明质酸溶液(简称HA溶液)，溶液为2.5mM，本发明实施例中浓度单位mM是指mM/L；本发明实施例采用的阴离子聚电解质透明质酸(Hyaluronicacid,HA)为天然多糖类高分子材料，分子式是(C₁₄H₂₁NO₁₁)n，又称玻尿酸，可商业化获得。透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通过糖苷键交替连接而成的大分子酸性粘多糖。HA分子中含有较多羟基和羧基，赋予了其很好的保湿性和清除自由基的功能，在医学、药学和化妆保健品方面得到广泛的开发和利用。透明质酸因其良好的保水性、润滑性、黏弹性、生物降解性及生物相容性，被广泛应用于骨科、眼科、软组织填充等领域的各类生物医用材料中。在本发明的实施方案中，透明质酸钠的分子量为6000～10000g/mol。此分子量的透明质酸链长适宜，使粒径在100-200nm左右。若分子量增大，HA链更长，合成出的纳米复合物粒径就会很大(可能超出纳米级)且更容易团聚。

在溶液配制中，优选地，透明质酸钠溶于去离子水中。优选的，为了更好的使透明质酸钠溶于水中，可以振荡。所述振荡为涡旋振荡。所得溶液为澄清透明的透明质酸溶液。

1.2将多粘菌素B硫酸盐(PMB)溶于水中，得多粘菌素B硫酸盐溶液(简称PMB溶液)，PMB溶液的浓度为0.3～0.5mM；所述多粘菌素B分子式为C₄₃H₈₂N₁₆O₁₂。多粘菌素系由多粘芽胞杆菌(bacilluspolymyxa)产生的一组多肽类抗生素，常用其硫酸盐，即，硫酸多粘菌素B，英文名：Polymyxin B Sulfate(Aerosporin)，为白色结晶性粉末，分子量为1301.56，易溶于水，有引湿性，可商业化获得。

在溶液配制中，为了更好的使PMB溶于水中，可以振荡，得PMB溶液。所述振荡为涡旋振荡。所得溶液为澄清透明的PMB溶液

2.将HA溶液和PMB溶液以一定的比例及一定的流速加入避光瓶中，搅拌，获得纳米胶体溶液。所得纳米胶体溶液为澄清透明的纳米胶体溶液。

所述HA溶液和PMB溶液的配比比例，本发明实施例按照PMB与HA的摩尔比确定，即正电基团和负电基团的摩尔比例确定。当使用过量正电荷时(即阳离子抗菌肽PMB过量时)会得到絮凝的不稳定悬浮液。这些宏观聚集体的存在表明中性凝聚体正在形成，在悬浮状态下不稳定，最终导致相分离。在本发明的一个优选实施例中，PMB与HA的摩尔比为(0.3～0.5)：2.5。

关于所述的流速，HA溶液和PMB溶液以相同的流速加入避光瓶。以相同的流速加入主要为了保证体系内正负电基团大致相同，而不是同一时间体系里正电多或者负电多。

优选的，流速可以为600-800μL/min。例如，可以为600μL/min、700μL/min、800μL/min。流速过快会导致粒子聚集。

在将HA溶液和PMB溶液加入到避光瓶中时，可通过蠕动泵将HA溶液和PMB溶液泵入棕色瓶中。由于PMB见光易分解，采用避光瓶进行避光。其中，所述避光瓶为黑色瓶，棕色瓶等。

在本发明配制步骤中，所述的搅拌的速度为300～500RPM；搅拌的时间为24小时，搅拌的温度为37℃。

1.3不同投料比[N:COOH]比的聚离子复合物纳米制剂的制备

按照表1给出的投料比制备了具有可选的[N:COOH]比的聚离子复合物纳米制剂。

1.3.1按照表1所述的投料比配制溶液

表1 HA-PMB制备的投料比

注：表1中对应多粘菌素B硫酸盐与透明质酸的摩尔比为0.3,04,0.5：2.5时对应多粘菌素B上氨基与透明质酸上羧基的摩尔比为0.6,0.8和1，一分子的PMB五个氨基对应透明质酸上一个羧基，因此有N:COOH＝5×(MPMB：MHA)的换算关系。

1.3.2两种物质都用2.5mL去离子水溶解。用棕色离心管装PMB，PMB需避光。

1.3.3将按比例配制的溶液通过蠕动泵以相同的流速泵入棕色瓶中，棕色瓶放在磁力搅拌器上搅拌，蠕动泵的流速为700μL/min，磁力搅拌器的温度为37℃，搅拌速度为300～500RPM。

1.3.4当药物与材料的溶液通过蠕动泵全部泵入棕色瓶后，所得到的混合溶液继续放在磁力搅拌器上搅拌，磁力搅拌器的温度为37℃，搅拌速度为300～500RPM，搅拌时间为24小时。24h后，即得到聚离子复合物溶液。

实施例2.HA-PMB聚离子复合物的表征

2.1水合粒径和表面电位的测定

将上述制备的聚离子复合物稀释后取1ml于马尔文动态光散射仪上测水合粒径和表面电位。

对[N:COOH]＝1、0.8、0.6的聚离子复合物进行动态光散射(DLS)表征可以看到其水合半径在100-280nm之间(如图2所示)，通过动态光散射测量的聚离子复合物流体动力学直径会稍大于TEM测量的直径，因为在完全水合的条件下测量流体动力学直径，纳米颗粒周围会有一层“水膜”，这与要求完全脱水并伴有纳米颗粒收缩的TEM表征相反，所以导致DLS测量出来的粒径会稍大于TEM表征出来的直径。

对透明质酸和[N:COOH]＝1、0.8、0.6纳米颗粒进行Zeta电位表征(如图3所示)，可以看出透明质酸约为-42±0.7mV，而包裹了多粘菌素B的聚离子复合物表面的负电荷比透明质酸少，其中[N:COOH]＝1的聚离子复合物表面电荷近中性，为-0.32±0.04mV，这也能从侧面验证多粘菌素B与透明质酸很好地络合在一起。

2.2透射电子显微镜的表征

将以[N:COOH]＝0.8制备的聚离子复合物20μL滴于200目的铜网上，晾干后于80Kv的透射电子显微镜下进行采集图像，观察聚离子复合物的形态。

对[N:COOH]＝0.8的聚离子复合物进行了透射电镜(TEM)的表征，200nm比例尺下采集图像，发现其粒径在100-200nm之间(如图4所示)，形状为纳米球状，大小较均匀。而其他比例的纳米颗粒的电镜结果大小不均一，分散度较差，因此最终确定[N:COOH]＝0.8的聚离子复合物为较好的配比。

本发明所提出的负载多粘菌素B的聚离子复合物纳米制剂，由于纳米结构的固有物理化学性质大的表面积与体积比，可以将一种或多种抗生素与靶向分子一起加载到纳米结构上开发用于联合治疗的治疗方式，这可能有助于针对特定病原体，也可能是克服抗生素耐药性的长期策略。

实施例3.聚离子复合物的体外抗菌活性(抑菌圈测定)

铜绿假单胞菌的培养

本发明所用实验菌株为铜绿假单胞菌耐药型菌株MDR-PA，所用培养基为LB培养基。液体培养时，摇床转速为200rpm，其余按照方法说明进行。

将铜绿假单胞菌在LB液体培养基中与37℃培养18h，然后将20μL培养的细菌溶液添加到100mL灭菌并冷却的LB琼脂(40℃)中，然后将带有细菌的LB琼脂倒入无菌的培养皿中，直至0.4厘米的高度。LB琼脂凝固后，对称将灭菌后的牛津杯放到制备好的平板培养基上，轻轻加压，使其与培养皿接触无空隙，分别加入150μL游离的PMB和HA-PMB(其中PMB与HA的浓度比为0.4:2.5)聚离子复合物(PMB含量：20μg/ml)于两个牛津杯中。然后将培养皿在37℃培养箱中保持18h，并观察到出现抑菌区，使用游标卡尺测量抑菌圈的直径，十字交叉法测每个抑菌圈两次，取平均值。

结果发现(如图5所示)，两组抑菌圈大小大致相当，HA-PMB组抑菌圈直径为31.3±0.12mm,PMB单独作用组抑菌圈直径为32.5±0.07mm(如表3)，抗菌活性没有受到影响，与前面测定的最小抑菌浓度相对应，也能说明包裹了材料的PMB没有影响其体外抗菌活性。

表2抑菌圈直径

实施例4.聚离子复合物的体内抗菌活性

铜绿假单胞菌肺部感染模型

4.1造模：取ICR小鼠40只，体重13-15g，随机分为正常对照组、模型对照组、PMB-HA给药组、PMB给药组，每组10只。除正常对照组外，各组将小鼠用异氟烷轻度麻醉，分别以1×10⁹cfu/mL多重耐药铜绿假单胞菌滴鼻感染，每只50uL，感染2h。

4.2给药：感染后2h第一次给药，隔6h后第二次给药，剂量为1.5mg/kg(其中PMB与HA的浓度比为0.4:2.5)，静脉给药100μL。最后一次给药24h后小鼠脱颈椎处死，称重，取血，然后解剖取肺组织。

4.3肺组织细菌载量

将肺在10mL无菌盐水中匀浆。离心肺匀浆悬浮液(4000×g，10℃，15分钟)，倒出，并用无菌生理盐水以原始体积的10倍重悬。随后将样品连续10倍稀释，并铺在Mueller-Hinton琼脂平板上，每个平板100μL。在恒温培养箱中于30℃孵育24小时后，计数菌落数。

4.4肺组织细菌载量结果

评估了HA-PMB纳米复合物对小鼠铜绿假单胞菌急性肺部感染的抗菌活性。(如图6所示)结果发现用HA-PMB纳米复合物处理的小鼠相较于模型组的细菌数量明显减少，肺组织细菌载量为2.68×10⁸CFU，比模型组的细菌载量6.5×10¹⁴CFU降低超过6个数量级，说明包裹了材料没有对其抗菌效果产生影响，仍保留与游离PMB相当的体内抗菌功效。从肉眼观察肺组织也可以看出，模型组肺组织的颜色明显较深，出现严重的组织充血或出血的现象；用游离PMB和HA-PMB纳米复合物处理的小鼠肺组织颜色较浅，呈粉红色。

实施例5.聚离子复合物的体外相容性

5.1细胞毒性

5.1.1对HPAEpiC人肺泡上皮细胞的细胞活力测定

HPAEpiC人肺泡上皮细胞以每孔5000个接种于96孔板中生长24h，生长到70-80％左右，用无血清的培养基将冻干后的聚离子复合物溶解为256μg/ml，然后用无血清的培养基依次二倍稀释，使浓度梯度为256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，游离的PMB也按照此浓度梯度稀释，与细胞共孵育24h，然后用CCK8试剂盒测定各孔的细胞活力。

5.1.2对HUVEC人脐静脉内皮细胞的细胞活力测定

除细胞换为HUVEC人脐静脉内皮细胞外，其余操作步骤同上。

结果发现(如图7所示，左图为HUVEC细胞，右图为HPAEpiC细胞)，从游离PMB组观察到典型的剂量依赖性细胞毒性。随着PMB剂量的增加，细胞的存活率逐渐降低。相比之下，当细胞在8-256μg/ml的宽浓度范围内用HA-PMB(其中PMB与HA的浓度比为0.4:2.5)纳米复合物处理时，两种细胞都有超过90％的细胞保持存活，验证了HA-PMB纳米复合物良好的细胞相容性。而且在非常高的浓度(相当于游离PMB的浓度256μg/mL)下，用HA-PMB纳米复合物处理的细胞活力都高于游离PMB，如HUVEC细胞在浓度为相当于游离PMB 256μg/mL处理时，游离PMB的细胞活力接近50％，而用HA-PMB聚离子复合物处理的细胞活力都在90％以上，说明包裹了材料的PMB对细胞损伤更小，安全性更好，达到了提高PMB生物相容性的目的。

5.2活/死细胞染色

5.2.1铺细胞：HPAEpiC细胞、HUVEC细胞以每孔5×10⁴/1ml接种于24孔板中生长20-24h，细胞密度生长到70-80％左右即可。

5.2.2点药液：依次将无血清培养基、游离PMB(150μg/ml)、HA(10mg/ml)、HA-PMB(相当于游离PMB150μg/ml含量)(其中PMB与HA的浓度比为0.4:2.5)组加入孔中，周围的孔加1ml的1×PBS/孔，只用中间4×2孔，每组两个平行孔。然后放进培养箱与细胞共孵育24h。

5.2.3染色：用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)与碘化丙啶(PI)对细胞进行染色，钙黄绿素和PI的浓度分别为2μM和8μM，每孔钙黄绿素和PI各500μL，与细胞共孵育20分钟。吸出染色液，用PBS洗涤两遍，避光。

进行了活/死细胞染色实验，以进一步验证细胞安全性，即在钙黄绿素-AM的作用下，活细胞会产生绿色荧光，而PI会进入死细胞并发出红色荧光。结果发现(如图8所示)，游离PMB组存在比其它各组更明显的红色荧光，说明HA-PMB组处理24小时后死细胞数量明显少于游离PMB组，显示出优异的生物相容性，这与CCK-8测定的结果一致的定性说明了包裹了材料会使细胞相容性更优异。HA组与无血清空白对照组处理的不同细胞都发出的强绿色荧光，这与以前的报道相一致，即透明质酸药物载体无毒且已用于多种药物应用。

5.3溶血毒性

溶血毒性是指红细胞破裂，使血红蛋白从细胞内逸出的现象，从人全血中分离出红细胞，并用PBS溶液稀释至其体积的1/4。将稀释的红细胞(0.1mL)与PBS溶液(0.4mL)作为阴性对照，将水(0.4mL)作为阳性对照，将PBS溶液与HA-PMB(0.4mL)(其中PMB与HA的浓度比为0.4:2.5)作为实验样品混合。孵育3小时后，用紫外可见分光光度计(n＝3)监测541nm上清液的吸光度(C)。样品的溶血率＝[C(sample)-C(NS)/C(H20)-C(NS)]x 100％，

溶血率<5％时视为不发生溶血。结果发现(如图9所示)，即使PMB的浓度高达1024μg mL^-1，聚离子复合物也没有产生溶血现象，溶血率均在5％以下，可在体内安全使用。

Claims (10)

1.一种聚离子复合物纳米材料多肽载体，其特征在于，所述载体是由透明质酸钠与多粘菌素B硫酸盐聚合而成的聚离子复合物纳米材料。

2.根据权利要求1所述的聚离子复合物纳米材料多肽载体，其特征在于，所述透明质酸钠的分子量为6000～10000g/mol。

3.根据权利要求2所述的聚离子复合物纳米材料多肽载体，其特征在于，所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为(0.3～0.5)：2.5。

4.根据权利要求3所述的聚离子复合物纳米材料多肽载体，其特征在于，所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为0.4：2.5。

5.一种制备权利要求1-4任一所述聚离子复合物纳米材料多肽载体，其特征在于，所述方法包括将分子量为6000～10000g/mol的透明质酸钠溶液和多粘菌素B硫酸盐溶液加入避光瓶中混合搅拌的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，加入避光瓶中的所述多粘菌素B硫酸盐与所述透明质酸钠的摩尔比为(0.3～0.5)：2.5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述透明质酸钠溶液的浓度为2.5mM；所述多粘菌素B硫酸盐溶液的浓度为0.3～0.5mM。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述透明质酸钠溶液和多粘菌素B硫酸盐溶液以600-800μL/min的流速加入避光瓶。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述搅拌的速度为300～500RPM；搅拌的时间为24小时。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述搅拌的温度为37℃。

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