CN102988295A - 一种穿膜肽修饰的纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及穿膜肽修饰的纳米粒，具体涉及一种口服多肽、蛋白类药物的纳米粒递释系统及其制备方法；所述的纳米粒递药系统由由纳米粒、纳米粒表面修饰的穿膜肽和纳米粒包封的多肽蛋白药物组成，其平均粒径范围介于10-500nm；该穿膜肽修饰的纳米粒可与细胞表面带负电的葡糖胺聚糖发生电性吸引，继而发生细胞内吞，使其作为一个整体被摄取入胞，口服后具有穿透消化道黏膜的能力，可将其携载的多肽蛋白类药物递送至全身血液循环，提高此类药物的口服生物利用度。本发明提高了多肽、蛋白类药物在消化道内的稳定性，降低穿膜肽的用量，减少其可能导致的毒副作用。

Description

一种穿膜肽修饰的纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种穿膜肽修饰的纳米粒，尤其涉及一种口服多肽、蛋白类药物的纳米粒递释系统及其制备方法。

背景技术

本领域公知，蛋白质、多肽类药物分子量大、亲水性强，很难透过生物膜的磷脂双分子层到达细胞内；蛋白质、多肽类药物在体内会很快被各种酶降解，如消化道内的胰蛋白酶、细胞质内的氨肽酶等。因此，蛋白、多肽类药物的口服给药一直是药学界研究的难点。为了提高这些大分子药物的体内吸收，有研究在药物中加入吸收促进剂(Pharm.Res.，2000，17(7)：825)、蛋白酶抑制剂(Pharm.Res.，1994，11：1496；Int.J.Pharm.，1997，157：17-25)、生物粘附剂(J.Control.Rel.，2002，17：81(3)：281)等；还有研究对药物本身采用化学修饰(Nat.Biotechnol.，2002；20(8)：800-804)或采用定位释药(Res.Ther.Drug Carrier Syst.，2002，19(6)：499；中国发明专利：00117990)的方式提高药物的口服吸收。为减少因采用吸收促进剂或酶抑制剂可能引入的毒副作用并提高多肽、蛋白类药物的体内稳定性，有研究将此类药物制成微粒给药系统，如脂质体、油性乳剂、微球、纳米粒(Int.J.Pharm.，2002，249(1-3)：139；Drug Dev.Ind.Pharm.，1989；15：1601-1634；中国发明专利：03110974；200880117641；200880117641；01115327；200510118381；200810228848；200310110762；200410013846；200510020091；200710110506)等，但是该些载体系统的口服吸收效率尚有待提高。还有研究在纳米载药系统表面修饰一定的功能基团促进其透过消化道黏膜屏障吸收进入全身血液循环，如可被消化道黏膜上皮细胞识别或转运的配体、底物分子(Adv.Drug Deliv.Rev.，2001，46：59-73)等。

穿膜肽(cell-penetrating peptides)是一类具有很强的穿透细胞膜能力的短肽。穿膜肽在生理条件下带有正电荷，它既可以从生物体内提取，也可以通过人工合成(中国发明专利：200680049953)。有报道，穿膜肽最初是从HIV病毒中发现的反式激活蛋白TAT，能够跨膜转运至细胞质和细胞核中。自此之后，许多穿膜肽如Oligoarginine(寡聚精氨酸短肽)、Penetratin(果蝇控制触角基因的同源异构结构域)、Pvec等不断的被发现并用于探索研究。其中研究最多的是TAT、Penetratin和Oligoarginine。穿膜肽已经成功地应用于蛋白、多肽、核苷酸及小分子物质的递释，这类药物载体的优势在于穿膜效率高、细胞毒性小，在药物递释系统中有广阔应用前景(中国发明专利：200810155949)。目前，现有技术的穿膜肽均由L-构型氨基酸构成，其在体内容易被各种酶降解，D-构型的短肽对各种酶的耐受性较强，在口服给药系统中备受关注。目前，有报道利用穿膜肽修饰包载多肽蛋白类药物的脂质体提高药物细胞摄取(Bioconjugate.Chem.，2006，17：935-942)；而更多的研究利用穿膜肽与生理条件下荷负电的多肽蛋白类药物形成物理复合物来提高药物体内生物利用度(Biochem.Biophys.Res.，2005，335：734-738；J.Control.Rel.，2008，132：21-25；J.Control.Rel.，2009，136：179-186；J.Control.Rel.，2005，118：177-184；J.Control.Rel.，2009，133：103-108；J.Control.Rel.，2008，131：94-99；Int.J.Pharm.，2009，381：49-55；J.Control.Rel.，2010，146：16-22；Biochim.Biophys.Acta.，2010，1798：2274-85；J.Control.Rel.，2010，143：302-310；Int.J.Pharm.，2010，388：209-212；J.Control.Rel.，2010，148：187-196；J.Colloid.Interf.Sci.，2010，351：433-441)。但是实验证实，该类复合物在体内的稳定性差，在胃部的酸性环境下和被胃肠道内的消化液稀释后易发生解离，影响穿膜肽携载的多肽、蛋白药物的吸收。另外，所述物理复合物受药物的电性限制，只能携载生理条件下荷负电的多肽和蛋白药物，应用上具有很大的局限性。目前尚未见有关用L-/D-构型穿膜肽进行表面修饰的纳米粒给药系统的报道。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种穿膜肽修饰的纳米粒，尤其是一种口服多肽、蛋白类药物的纳米粒递释系统及其制备方法。

本发明以穿膜肽修饰的纳米粒作为口服给药的载体系统，通过纳米载体的包裹提高多肽、蛋白类药物的体内生物稳定性，利用穿膜肽强大的穿膜能力，增加纳米粒的细胞摄取能力，提高药物的生物利用度，能较好的解决现有技术存在的，由于多肽、蛋白类药物分子量大、亲水性强、体内易分解、半衰期短，因而口服生物利用度低，采用注射途径给药，患者耐受性差等问题。

本发明利用纳米粒包载方法解决穿膜肽只能通过静电相互作用携载生理条件下荷负电多肽或蛋白的问题，拓展穿膜肽在口服给药领域的应用范围。

本发明的纳米粒递药系统由可生物降解材料构成，表面修饰有穿膜肽(cell-penetrating peptides)，可与细胞表面带负电的葡糖胺聚糖发生电性吸引，继而发生细胞内吞，使纳米粒作为一个整体被摄取入胞，口服后具有穿透消化道黏膜的能力，可将其携载的多肽蛋白类药物递送至全身血液循环，提高此类药物的口服生物利用度。

具体而言，本发明的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，由纳米粒、纳米粒表面修饰的穿膜肽和纳米粒包封的多肽蛋白药物组成，其平均粒径范围介于10-500nm，优选20-400nm，更优选50-300nm；所述纳米粒由可生物降解材料与聚乙二醇化的可生物降解材料按重量比1∶99-95∶5(w/w)混合制成；所述穿膜肽通过聚乙二醇化的可生物降解材料末端的活性基团修饰于纳米粒表面，修饰量占聚乙二醇化的可生物降解材总量的20％-100％；所述多肽蛋白药物的剂量占纳米粒总重的0.1％-40％(w/w)。

本发明中，纳米粒由可生物降解材料与聚乙二醇(PEG)化的可生物降解材料按一定比例混合制成，具有生物相容性好，能够在体内降解吸收的特点；其中，可生物降解材料包括乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、聚己内酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述材料的混合物和共聚物；还包括聚氨基酸、明胶或阿拉伯胶、壳聚糖、海藻酸盐和透明质酸盐等天然或半合成的可生物降解材料，以及上述材料二种或二种以上的混合物。

所述的可生物降解材料优选合成的聚酯类高分子材料，如聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚丙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物。本发明的一个实施例中首选乳酸-羟基乙酸共聚物，其平均分子量范围介于5,000-500,000之间，优选的平均分子量范围介于5,000-100,000之间，进一步优选的平均分子量范围介于5,000-50,000之间。

所述乳酸-羟基乙酸共聚物分子中，乳酸单体的含量为30％-95％，优选的乳酸单体含量为40％-80％，分子末端为游离羧基、醇羟基或其它封闭基团。

本发明中，为了获得理想的释放与降解速度，也可将具有不同分子量、乳酸单体含量和末端基团的PLGA混合使用。

本发明中，用于制备纳米粒的另外一种材料为聚乙二醇(PEG)化的上述任何一种可生物降解材料，其可生物降解部分优选聚酯类高分子材料，本发明的一个实施例中首选乳酸-羟基乙酸共聚物，分子组成、结构与分子量范围同上述；所述的聚乙二醇部分的平均分子量范围介于200-50,000之间，优选的平均分子量范围介于1,000-20,000之间，更优选的平均分子量范围介于2,000-10,000之间。

本发明所述的聚乙二醇一端通过酰胺键或酯键与可生物降解材料相连，另一端带有活性基团，用于修饰穿膜肽；所述活性基团为马来酰亚胺(MAL)或琥珀酰亚胺(NHS)，可与穿膜肽通过二硫键或酰胺键相连。

本发明所述纳米粒中，可生物降解材料与聚乙二醇化的可生物降解材料的重量比为1∶99-95∶5(w/w)，其重量比优选20∶80-90∶10(w/w)，更优选40∶60-80∶20(w/w)。

本发明所述的纳米粒表面修饰的穿膜肽为在生理pH条件下荷正电，并具有很强穿透细胞膜能力的短肽，其包括从HIV病毒中发现的反式激活蛋白TAT(Science 1999，285：1569-1572)、果蝇控制触角基因的同源异构结构域Penetratin(Nat.Cell Biol.2004，6：189-196)、甘丙肽的N-端片段与黄峰毒素的复合物Transportan(Nat.Biotechnol.1998，16：857-861)、HSV-1结构蛋白VP-22(Cell，1997，88：223-233)、寡聚精氨酸短肽Poly(Arg)_n(n＝4-20)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：13003-1300)、来源于人降钙素的HCT(9-32)(Biochemistry，1998，37：16582-16590)和来源于鼠钙黏着蛋白的Pvec(Exp.Cell Res.，2001，269：237-244)等；所述的穿膜肽的氨基酸序列如下示：

TAT：PGRKKRRQRRPPQ

Penetrat in：RQIKIWFQNRRMKWKK

Transportan：GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL

VP-22：DAATATRGRSAASRPTERPRAPAR-SASRPRRPVD

Poly(Arg)_n：RRR…R_n    n＝4-20

HCT(9-32)：LGTYTQDFNKTFPQTAIGVGAP

Pvec：LLIILRRRIRKQAHAHSK

上述穿膜肽L-和D-构象的对映异构体均可在本发明中应用于修饰纳米粒表面，而且D-构象穿膜肽修饰的纳米粒口服后较其L-构象的对映异构体修饰的纳米粒具有更高的生物利用度。上述穿膜肽在纳米粒表面的修饰量占聚乙二醇化可生物降解材料摩尔量的20％-100％，优选40％-100％，进一步优选60％-100％。

本发明中，所述穿膜肽优选L-和D-构象的寡聚精氨酸短肽Poly(Arg)_n(n＝4-20)；该穿膜肽由L-和D-构象的精氨酸通过肽键连接成，其聚合度n介于4-20之间，优选4-12，进一步优选6-10。

本发明中，所述穿膜肽通过二硫键或酰胺键与聚乙二醇化的可生物降解材料末端的马来酰亚胺(MAL)或琥珀酰亚胺(NHS)活性基团相连接；当穿膜肽与聚乙二醇末端的马来酰亚胺相连接时，其肽链末端需增加一个半胱氨酸(Cys)，该半胱氨酸可在温和条件下与马来酰亚反应生成二硫键。本发明以L-和D-构象的寡聚精氨酸短肽为例，其连接半胱氨酸后的肽链序列为Poly(Arg)_n-Cys(n＝4-20)，其中，寡聚精氨酸短肽的聚合度优选4-12，进一步优选6-10。

本发明所述的口服纳米粒中可以包封任何治疗有效剂量的多肽和/或蛋白药物，其剂量占纳米粒总重的0.1％-40％(w/w)，优选1％-20％(w/w)；所述的多肽和/或蛋白药物包括但不限于胰岛素、促黄体生成素释放激素(LHRH)、LHRH激动剂、生长激素、生长抑素、降钙素、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、骨生长因子、干扰素、白细胞介素、神经生长因子、生长激素释放因子、血管紧张素、促甲状腺素释放激素、血管生成抑制素、血管内皮抑素、胰高血糖素、内啡肽、杆菌肽、多粘菌素、单克隆抗体和疫苗，以及上述二种或二种以上药物的组合物；或包载上述多肽和/或蛋白药物稳定形式的复合物，其中稳定形式的药物复合物可参见专利CN1187120A，其公开内容在此引入作为参考；

本发明中所述多肽和/或蛋白药物优选胰岛素与促黄体生成素释放激素(LHRH)，所述的LHRH包括亮丙瑞林、曲普瑞林、高舍瑞林、那法瑞林等。

本发明所述穿膜肽修饰的口服纳米粒可采用药剂学专业的技术人员所熟知的方法制备，包括乳化-溶剂挥发法(又称液中干燥法)、相分离法、高压均质法、超临界萃取法、喷雾干燥法、低温喷雾萃取法等。

本发明中，穿膜肽修饰到纳米粒表面的方法为：预先将穿膜肽与聚乙二醇化的可生物降解材料反应，生成穿膜肽修饰的聚乙二醇化可生物降解材料，再用该材料制备纳米粒，其包括步骤：

(1)制备穿膜肽修饰的聚乙二醇化可生物降解材料，

(2)用穿膜肽修饰的材料制备纳米粒。

其中，穿膜肽修饰聚乙二醇化可生物降解材料通常利用其本身所具有的功能基团如-COOH、-NH₂或-SH与聚乙二醇化可生物降解材料相应的功能基团反应。下面以-SH与马来酰亚胺反应为例进行说明：称取适量的序列中含有Cys的穿膜肽(如Poly(L/D-Arg)_n-Cys(n＝4-20))与马来酰亚胺-聚乙二醇化可生物降解材料(如MAL-PEG-PLGA)，二者摩尔比为1.2∶1，将穿膜肽溶于适量0.1M的pH7.4PBS中，马来酰亚胺-聚乙二醇化可生物降解材料溶于适量二甲基甲酰胺(DMF)中，将后者加到穿膜肽溶液中，磁力搅拌1h。待反应结束后，利用透析的方法分离游离穿膜肽和穿膜肽修饰的聚乙二醇化可生物降解材料。整个反应过程用薄层色谱监测，分别将反应前得两种溶液、反应结束后的混合溶液以及透析结束后的溶液点板，用氯仿∶甲醇∶正丁醇∶氨水＝6.75∶2.25∶1∶0.5的展开剂展开，观察不同样品的保留情况，检测反应是否完全，游离穿膜肽是否除尽。得到穿膜肽修饰的聚乙二醇化可生物降解材料后采用药剂学领域常规的方法制备纳米粒，如乳化-溶剂挥发法(又称液中干燥法)、相分离法、高压均质法、超临界萃取法等。调整经穿膜肽修饰和未修饰材料比可以控制纳米粒表面修饰穿膜肽的量，得到所需纳米粒。

或，本发明所述的穿膜肽修饰到纳米粒表面的方法为：采用先制备纳米粒，再将穿膜肽修饰到纳米粒表面聚乙二醇的活性反应基团上，其包括步骤：

(1)制备纳米粒；

(2)对纳米粒表面进行穿膜肽修饰。

其中，纳米粒的制备可以采用药剂学领域的常规方法，如乳化-溶剂挥发法(又称液中干燥法)、相分离法、高压均质法、超临界萃取法等。下面以乳化-溶剂挥发法为例：称取处方量的可生物降解材料和聚乙二醇化的可生物降解材料，用二氯甲烷溶解，加入处方量多肽和/或蛋白药物水溶液，冰浴条件下间断超声形成w/o初乳，将初乳中加入适量含有表面活性剂的外水相，冰浴条件下间断超声，形成w/o/w体系，于旋转蒸发仪上减压蒸发除去二氯甲烷，得到所需纳米粒；制得纳米粒后，通过上凝胶柱除去纳米粒分散介质中的表面活性剂，将适量的穿膜肽加入到制得的纳米粒水溶液中搅拌，使穿膜肽与纳米粒表面聚乙二醇上的活性基团反应，经过透析除去未反应的游离穿膜肽，即得所需表面修饰穿膜肽的纳米粒。

本发明所述的纳米粒递药系统与现有技术相比，其口服后借助纳米粒表面修饰的穿膜肽，可迅速透过消化道上皮黏膜吸收进入血液循环。经体外和体内研究结果表明，该纳米粒递药系统能明显提高多肽蛋白类药物的透膜效率和生物利用度。另一方面，本发明所述的纳米粒递药系统可在消化道内缓慢释放其包封的多肽和/或蛋白药物，避免其直接与胃肠道内苛刻的pH环境和消化酶接触，进而能够提高其在胃肠道内的稳定性。

本发明的纳米粒递药系统具有如下优点：

1，将多肽、蛋白类药物包载于可生物降解材料构成的纳米粒中，解决了穿膜肽只能通过静电相互作用携载生理条件下荷负电多肽或蛋白的问题，同时可提高多肽、蛋白类药物在消化道内的稳定性，避免其被酸碱环境和消化酶分解；

2，穿膜肽修饰于纳米粒表面，无需再通过静电相互作用携载多肽或蛋白药物，与现有的物理混合纳米粒递药系统相比可降低穿膜肽的用量，更有效地利用其增加细胞摄取的功能，有助于获得更高的口服生物利用度，并减少其可能导致的毒副作用。

附图说明

图1：实施例2制备纳米粒的粒径分布。

图2：实施例3制备纳米粒的粒径分布。

图3：实施例4体外Caco-2细胞摄取结果。

图4：实施例5体外Caco-2细胞转运结果。

图5：实施例6大鼠体内的药效学评价结果。

具体实施方式

以下为本发明的实施例。给出具体实施例的目的是为了进一步阐明本发明，但并不限制其保护范围。

实施例1

分别称取40mg PLGA和40mg MAL-PEG-PLGA溶解于5mL丙酮与乙醇(8∶2)混合溶剂中构成有机相。在不断搅拌下，将有机相滴入到30mL 0.2％的聚山梨酯-80(Tween80)水溶液中。搅拌半小时后旋蒸，使丙酮-乙醇挥发完全，固化得到PLGA/MAL-PEG-PLGA纳米粒分散体系。在中性纳米粒溶液中加入适量的Poly(Arg)_n-Cys(n＝4-20)溶液，搅拌反应半小时，透析除去游离的Poly(Arg)_n-Cys得所需的Poly(Arg)_n修饰的纳米粒。

实施例2

按质量比90∶10分别称取PLGA与MAL-PEG-PLGA，二者溶于1.0mL二氯甲烷中，加入50μL 7.5mg/mL胰岛素水溶液，间断超声乳化30s，再加入0.5％胆酸钠水溶液2mL，间断超声乳化30s，将制得的复乳转移至20mL含0.5％胆酸钠的水溶液中，旋转蒸发20min以除去有机溶剂，25000g/min低温离心30min得所需纳米粒。用Hepes缓冲盐重新分散纳米粒，加入适量Poly(Arg)_n-Cys(n＝4-12)溶液，搅拌反应半小时，透析除去游离的Poly(Arg)_n-Cys，得所需表面修饰Poly(Arg)_n且包载胰岛素的纳米粒。经检测，该纳米粒的载药量为2.1％(w/w)。

实施例3

按质量比80∶20分别称取PLGA与MAL-PEG-PLGA，二者溶于1.0mL二氯甲烷中，加入50μL 2mg/mL亮丙瑞林水溶液，间断超声乳化30s，再加入0.5％胆酸钠水溶液2mL，间断超声乳化30s，将制得的复乳转移至20mL含0.5％胆酸钠的水溶液中，旋转蒸发20min以除去有机溶剂，25000g/min低温离心30min得所需纳米粒。用Hepes缓冲盐重新分散纳米粒，加入适量Poly(Arg)_n-Cys(n＝6-10)溶液，搅拌反应半小时，透析除去游离的Poly(Arg)_n-Cys，得所需表面修饰Poly(Arg)_n且包载亮丙瑞林的纳米粒。经检测，该纳米粒的载药量为1.4％。

实施例4

将复苏后养至3～4代的Caco-2细胞以50,000/孔铺24孔板，培养2周后进行细胞摄取实验。先用pH 7.4HBSS缓冲盐清洗三遍，分别加入包载香豆素-6(一种用于定位纳米粒的荧光探针)的纳米粒(C6-NP)和表面修饰穿膜肽且包载香豆素-6的纳米粒(CPP-C6-NP)溶液各1mL，37℃5％CO₂条件下孵育2h，之后HBSS洗两遍将NP清洗干净，加入新鲜培养液，用荧光显微镜观察细胞摄取情况。

实施例5

将复苏后养至3～4代的Caco-2细胞铺板。将细胞按50,000个/cm²接种到Millicell^TM的Apical侧，接种后每两天换液一次，一周后每日换液，培养至21天。测细胞跨膜电阻(TEER)，当TEER＞500Ω·cm²时，可以验证膜的完整性。取符合转运条件的Millicell^TM膜，实验前用空白pH 7.4HBSS等渗溶液于37℃培养20min，然后用HBSS清洗三遍，洗去细胞分子层表面的杂质。在Apical(肠腔侧)分别加入包载香豆素-6的纳米粒(C6-NP)和表面修饰穿膜肽且包载香豆素-6的纳米粒(CPP-C6-NP)溶液各400μL作为供给液，在Baselateral(基底侧)加入600μL pH 7.4HBSS作为接受液。将Millicell^TM放在37℃恒温条件下培养，分别于15min、30min、1h、1.5h、2、4h时取200μL接受液，同时补加200μL 37℃空白pH 7.4HBSS。将收集到样品溶液用荧光分光光度计进行检测。

实施例6

实验大鼠在体给药，将大鼠分成3组，给药前禁食12h，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，麻醉后将大鼠背位固定于手术台板上，保持37℃体温。切开腹腔，用37℃生理盐水缓缓将所选肠段内容物冲洗干净。手术后半个小时，在体给药组给予胰岛素纳米粒水溶液、穿膜肽-胰岛素纳米粒水溶液(剂量50IU·kg^-1)；阳性对照组于皮下注射胰岛素水溶液(剂量1IU·kg^-1)，分别于给药后0、5、15、30、60、120、180、240、300、360min尾静脉取血0.2mL，采用血糖试剂盒的方法测定血糖值，并计算其相对于零时血糖值的变化率，绘制血糖变化百分率和时间的关系曲线。

实施例7

按质量比70∶30分别称取PLA与MAL-PEG-PLA，二者溶于1.0mL二氯甲烷中，加入50μL 10mg/mL曲普瑞林水溶液，间断超声乳化30s，再加入0.5％胆酸钠水溶液2mL，间断超声乳化30s，将制得的复乳转移至20mL含0.5％胆酸钠的水溶液中，旋转蒸发20min以除去有机溶剂，25000g/min低温离心30min得所需纳米粒。用Hepes缓冲盐重新分散纳米粒，加入适量TAT-Cys溶液，搅拌反应半小时，透析除去游离的TAT-Cys，得所需表面修饰TAT且包载曲普瑞林的纳米粒。经检测，该纳米粒的载药量为5.6％。

实施例8

按质量比60∶40分别称取聚己内酯(PCL)与MAL-PEG-PCL，二者溶于1.0mL二氯甲烷中，加入50μL 20mg/mL重组人生长激素(rhGH)水溶液，间断超声乳化30s，再加入0.5％胆酸钠水溶液2mL，间断超声乳化30s，将制得的复乳转移至20mL含0.5％胆酸钠的水溶液中，旋转蒸发20min以除去有机溶剂，25000g/min低温离心30min得所需纳米粒。用Hepes缓冲盐重新分散纳米粒，加入适量Penetratin-Cys溶液，搅拌反应半小时，透析除去游离的Penetratin-Cys，得所需表面修饰Penetratin且包载rhGH的纳米粒。经检测，该纳米粒的载药量为12.7％。

实施例9

称取适量Transportan-Cys与MAL-PEG-聚原酸酯，二者摩尔比为1.2∶1，将Transportan-Cys溶于0.1M的pH7.4PBS中，MAL-PEG-聚原酸酯溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，将后者加到Transportan-Cys溶液中，磁力搅拌1h。待反应结束后，利用透析的方法分离游离Transportan-Cys和Transportan-PEG-聚原酸酯，纯化后的产物冻干备用。按质量比40∶60分别称取聚原酸酯与Transportan-PEG-聚原酸酯，采用超临界萃取法制备表面修饰Transportan且包载干扰素的纳米粒。

实施例10

称取适量Pvec与NHS-PEG-聚酸酐，二者摩尔比为1.5∶1，将Pvec溶于0.1M的pH7.4PBS中，NHS-PEG-聚酸酐溶于DMF中，将后者加到Pvec溶液中，磁力搅拌1h。待反应结束后，利用透析的方法分离游离Pvec和Pvec-PEG-聚酸酐，纯化后的产物冻干备用。按质量比30∶70分别称取聚酸酐与Pvec-PEG-聚酸酐，采用高压均质法制备表面修饰Pvec且包载降钙素的纳米粒。

Claims (22)

1.一种穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，由纳米粒、纳米粒表面修饰的穿膜肽和纳米粒包封的多肽蛋白药物组成，其平均粒径范围介于10-500nm；

所述纳米粒由可生物降解材料与聚乙二醇化的可生物降解材料按重量比1∶99-95∶5(w/w)混合制成；

所述穿膜肽通过聚乙二醇化的可生物降解材料末端的活性基团修饰于纳米粒表面，修饰量占聚乙二醇化的可生物降解材总量的20％-100％；

所述多肽蛋白药物的剂量占纳米粒总重的0.1％-40％(w/w)。

2.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒其平均粒径范围为20-400nm。

3.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒其平均粒径范围为50-300nm。

4.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，制备纳米粒的可生物降解材料选自乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、聚己内酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述材料的混合物和共聚物，或选自聚氨基酸、明胶或阿拉伯胶、壳聚糖、海藻酸盐和透明质酸盐天然或半合成的可生物降解材料，以及上述材料二种或二种以上的混合物。

5.根据权利要求4所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的制备纳米粒的可生物降解材料选自聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙交酯或丙交酯-乙交酯共聚物。

6.根据权利要求5所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的制备纳米粒的可生物降解材料为乳酸-羟基乙酸共聚物，其平均分子量范围介于5,000-500,000之间；所述乳酸-羟基乙酸共聚物分子中，乳酸单体的含量为30％-95％，分子末端为游离羧基、醇羟基或其它封闭基团。

7.根据权利要求5所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的乳酸-羟基乙酸共聚物，其平均分子量为5,000-100,000，其中，乳酸单体的含量为40％-80％。

8.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的聚乙二醇化可生物降解材料分子中可生物降解部分选自乳酸和羟基乙酸的单聚或共聚物、丙交酯和乙交酯的单聚或共聚物、聚己内酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯，以及上述材料的混合物和共聚物，或选自聚氨基酸、明胶或阿拉伯胶、壳聚糖、海藻酸盐和透明质酸盐天然或半合成的可生物降解材料，以及上述材料二种或二种以上的混合物；所述聚乙二醇部分的平均分子量范围介于200-50,000之间，其一端通过酰胺键或酯键与可生物降解材料相连，另一端带有马来酰亚胺或琥珀酰亚胺等活性基团，可用于修饰穿膜肽。

9.根据权利要求8所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的聚乙二醇化可生物降解材料分子中可生物降解部分选自聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚丙交酯或丙交酯-乙交酯共聚物。

10.根据权利要求8所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的聚乙二醇化可生物降解材料分子中其可生物降解部分选自乳酸-羟基乙酸共聚物。

11.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量范围为1,000-20,000。

12.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量范围为2,000-10,000。

13.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的可生物降解材料与聚乙二醇化可生物降解材料的重量比为20∶80-90∶10(w/w)。

14.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的可生物降解材料与聚乙二醇化可生物降解材料的重量比为40∶60-80∶20(w/w)。

15.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽选自L-和D-构象的TAT、Penetratin、Transportan、VP-22、寡聚精氨酸短肽Poly(Arg)_n、HCT(9-32)或Pvec；所述穿膜肽在纳米粒表面的修饰量为聚乙二醇化可生物降解材料的40％-100％。

16.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽在纳米粒表面的修饰量为聚乙二醇化可生物降解材料的60％-100％。

17.根据权利要求15所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽为L-和D-构象的寡聚精氨酸短肽Poly(Arg)_n，精氨酸的聚合度n介于4-20之间。

18.根据权利要求15所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽中精氨酸的聚合度n介于4-12之间。

19.根据权利要求15所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽中精氨酸的聚合度n介于6-10之间。

20.根据权利要求15所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述穿膜肽为末端连接有半胱氨酸(Cys)的L-和D-构象的寡聚精氨酸短肽Poly(Arg)_n-Cys，精氨酸的聚合度n介于4-20之间。

21.根据权利要求1所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒包封的多肽蛋白药物为治疗有效剂量的多肽蛋白药物，选自胰岛素、促黄体生成素释放激素、LHRH激动剂、生长激素、生长抑素、降钙素、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、骨生长因子、干扰素、白细胞介素、神经生长因子、生长激素释放因子、血管紧张素、促甲状腺素释放激素、血管生成抑制素、血管内皮抑素、胰高血糖素、内啡肽、杆菌肽、多粘菌素、单克隆抗体和疫苗，以及上述二种或二种以上药物的组合物；所述的多肽蛋白药物的剂量占纳米粒总重的1％-20％(w/w)。

22.根据权利要求21所述的穿膜肽修饰的纳米粒，其特征在于，所述多肽蛋白药物选自胰岛素或促黄体生成素释放激素。

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