CN105056212B - 一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒及制备方法 - Google Patents
一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种肠溶材料包衣的包裹着胰岛素及细胞穿透肽Tat的壳聚糖纳米粒及其制备方法，本发明是由肠溶材料尤特奇S100、胰岛素、细胞穿透肽及壳聚糖制备而成。制备的肠溶包衣胰岛素壳聚糖纳米粒口服给药后，由于肠溶材料尤特奇S100的保护作用可以大大的降低壳聚糖纳米粒在胃部及小肠上部释放其装载的内容物的量。当壳聚糖纳米粒到达消化道下端时，由于pH值的上升，壳聚糖纳米粒表面的肠溶包衣材料开始溶解并暴露出壳聚糖纳米粒，壳聚糖纳米粒在弱碱性的条件下被破坏，从而释放出里面的细胞穿透肽及胰岛素。细胞穿透肽促进结肠上皮细胞对胰岛素的吸收，从而提高了胰岛素的口服生物利用度。
Description
技术领域
本发明所涉及可用于生物医药技术领域的纳米粒及其制备方法，特别涉及一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒及其制备方法。
背景技术
胰岛素在临床上被广泛的用于治疗Ⅰ型糖尿病，目前其主要给药方式为皮下注射。糖尿病患者为了控制自己的血糖水平需要每天多次的注射胰岛素(Ins)，给患者的身心带来了极大的痛苦和日常生活的诸多不便。口服给药系统被认为是患者顺应性最好、最自然、最安全的一种给药方式，但胰岛素口服生物利用度非常低，基本没有药理效应。其主要原因：一是胰岛素在消化道中容易被酸及酶降解失活；二是胰岛素的分子量较大，跨越消化道粘膜上皮细胞的能力差，无法被有效的吸收。
为了解决胰岛素口服生物利用度低的问题，研究者们提出了许多方案，如：对胰岛素分子进行修饰，加入吸收促进剂，在处方中加入酶抑制剂，发展新的药物传递系统来包裹胰岛素，像微球、脂质体、纳米粒给药系统。
细胞穿透肽是一类能够通过生物膜进入细胞的短肽，它们在较低的溶度条件下，就可以在不对细胞膜造成明显损伤的条件下透过细胞膜进入到各种细胞中；它们还能够高效促进各种物质包括蛋白质，纳米粒进入细胞。有文献报道一种提高胰岛素生物利用度的策略(Journal Controlled Release,2007,118:177-184)，是将胰岛素与一种细胞穿透肽(寡聚精氨酸)混合后注射到大鼠的回肠部位。然而由于胰岛素和细胞穿透肽口服后在胃肠道中不稳定，易被胃酸、胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，这种没有经过任何处理的胰岛素与细胞穿透肽的混合液只有通过直接注射到小肠段的手段才能起作用，通过口服给药无法有效提高胰岛素的生物利用度。
与消化道的其他部位相比较，结肠拥有有利于胰岛素吸收的生理条件，如蛋白酶的密度及活性相对较低、相对较温和的pH条件、粘液的更新速度较慢，内容物的滞留时间较长，这些条件使结肠成为蛋白质药物吸收较为理想的部位。
文献(Journal of Applied Polymer Science,1997,63(1):125-132.International Journal of Pharmaceutics,2002,249(1-2):139-147)报道用离子交联法制备了包裹着胰岛素的壳聚糖纳米粒，此方法制备的纳米粒在胃酸环境下不稳定，不能够保护其所包裹的物质。文献(沈阳药科大学学报,2006,23(2):65-69)报道用羟丙基甲基纤维素酞酸酯(HP55)对用离子交联法制备的装载着Ins的壳聚糖纳米粒进行肠溶包衣以提高胰岛素的口服结肠吸收，但胰岛素的口服生物利用度有待提高。
本发明采用壳聚糖纳米粒包裹胰岛素及细胞穿透肽Tat，再对制备好的纳米粒用尤特奇S100进行包衣。一方面解决了壳聚糖纳米粒同时包裹胰岛素和细胞穿透肽两种物质的技术难题，从而实现用细胞穿透肽Tat增加胰岛素的跨肠道细胞转运，提高胰岛素的口服吸收生物利用度。另一方面，解决了胰岛素和细胞穿透肽Tat口服后在胃肠道中的稳定性问题，使得细胞穿透肽Tat能够发挥提高药物跨膜转运吸收的活性，使胰岛素能够顺利到达人体最佳吸收部位，起到良好的治疗效果。本发明比现有技术方法制备出的壳聚糖纳米粒具有更好的稳定性。
发明内容
本发明的一个目的是使用简单方便可控的制备方法----离子交联法来制备一种包裹胰岛素与细胞穿透肽Tat的壳聚糖纳米粒，并且通过肠溶材料尤特奇S100对该纳米粒进行包衣，获得一种提高胰岛素口服结肠吸收的纳米载体。用尤特奇S100包衣的壳聚糖纳米粒在胃及小肠低pH值的环境下不会有明显的内容物释放，当尤特奇S100包衣的壳聚糖纳米粒运动到小肠底部pH值较高环境中时尤特奇S100开始溶解，包裹在尤特奇S100里面的壳聚糖纳米粒暴露在肠腔中。壳聚糖纳米粒在肠腔中缓慢释放所包裹的细胞穿透肽Tat及胰岛素。当壳聚糖纳米粒进入结肠时，发生去质子化，壳聚糖纳米粒被破坏，胰岛素和Tat被完全释放到结肠中，Tat促进结肠上皮细胞对胰岛素的吸收。因而提高了胰岛素的口服生物利用度。
本发明在制备包裹胰岛素和细胞穿透肽Tat的壳聚糖纳米粒时，采用壳聚糖与胰岛素先混合的办法，这可使胰岛素与壳聚糖的分子间相互作用增加，从而提高胰岛素的包封率，包封率高达80％。本发明采用壳聚糖与三聚磷酸钠离子交联的方法制备壳聚糖纳米粒，纳米粒的整个制备过程不加入任何有机溶剂，制备条件温和简便。与现有的壳聚糖纳米粒的制备方法相比，本发明操作简便，可以较好保护胰岛素及肽Tat的活性。
本发明所使用的肽Tat是常用的细胞穿透肽中的一种。当包裹胰岛素和肽Tat口服到达结肠后，壳聚糖纳米粒在该环境中不稳定，纳米粒被破坏，胰岛素及肽Tat释放进入结肠肠腔，肽Tat促进结肠上皮细胞对胰岛素的吸收，从而起到增加胰岛素口服的生物利用度。
本发明的壳聚糖纳米粒制备方法比现有技术方法制备出的壳聚糖纳米粒具有更好的物理化学稳定性。所用的肠溶材料尤特奇S100为甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(1:2)共聚物，具有成膜性好，溶于乙醇、丙酮，在pH小于6.8的水溶液中不溶，可以保护其包裹的纳米粒，在消化道下段当pH大于6.8的环境中开始溶解并对其包衣的纳米粒失去保护作用。通过上述方法把无水乙醇挥发完全后，尤特奇S100析出并沉降在壳聚糖纳米粒的表面形成肠溶包衣膜，使得用本发明制备的壳聚糖纳米粒在消化道上部不会被破坏具有良好的稳定性，从而使结肠成为本发明药物的主要释放及吸收部位。
本发明所述的一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒，其组成成分为壳聚糖、尤特奇S100、细胞穿透肽Tat和胰岛素，其中细胞穿透肽Tat的氨基酸序列为GRKKRRQRRRP，细胞穿透肽Tat与壳聚糖的质量比为1.0:(3.5～4.5)，细胞穿透肽Tat与壳聚糖的质量比为1.0:(3.5～4.0)，胰岛素与壳聚糖的质量比为1.0:(1.5～2.5)。该纳米粒的制备步骤如下：
(a)将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，制备成壳聚糖溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5～6.0后，加入细胞穿透肽Tat使溶解；
(b)在室温搅拌的条件下，将胰岛素溶液缓慢加到(a)中的壳聚糖与细胞穿透肽Tat的混合液中，继续搅拌1小时；
(c)在室温搅拌的条件下，将三聚磷酸钠水溶液缓慢加到(b)所得的溶液中，继续搅拌0.5小时，形成纳米粒悬浮液；
(d)在室温搅拌的条件下，将尤特奇S100的无水乙醇溶液缓慢加到(c)所得的纳米粒悬浮液中，继续搅拌12小时，即得一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒。
本发明所述的一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒优选的制备过程如下：
(1)称取分子量5-10万道尔顿、脱乙酰度大于85％的壳聚糖粉末7-9mg，溶于0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5～6.0，将壳聚糖溶液置于恒温磁力搅拌器上室温匀速搅拌；称取肽Tat粉末1.75-2.57mg(使Tat与壳聚糖的质量比为1:(3.5～4.0))，置于壳聚糖溶液中溶解。
(2)称取胰岛素粉末2.8-6mg(使胰岛素与壳聚糖的质量比为1:(1.5～2.5))，溶于0.01mol/L的盐酸溶液2ml中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.5，在室温搅拌的条件下，将胰岛素溶液加到(1)所得的壳聚糖溶液中搅拌混合1小时。
(3)称取三聚磷酸钠粉末1.56-2.57mg(使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:(3.5～4.5))，溶于水形成1mg/mL的三聚磷酸钠的溶液，在室温搅拌的条件下，将三聚磷酸钠溶液加到(2)所得的溶液中搅拌混合0.5小时，使其形成纳米粒悬浮液。
(4)称取包衣材料尤特奇S100粉末2mg溶于无水乙醇溶液，形成浓度为2mg/mL的尤特奇S100无水乙醇溶液，在室温搅拌的条件下，将尤特奇S100无水乙醇溶液加到(3)所得的纳米粒悬浮液中继续搅拌12小时，即得尤特奇S100包衣的胰岛素纳米粒悬浮液。
本发明通过考查各种影响因素，获得了最佳处方工艺(但是该最佳处方和工艺不限制本发明的其他权利要求)。
本发明所制备的一种提高胰岛素口服吸收的壳聚糖纳米粒(即称ES-Tat-cNPs)最佳处方工艺如下：
称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，然后把此溶液置于一放在磁力搅拌器上的容器中搅拌，再称取2mg的肽Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)加入，搅拌至溶解，然后称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌1小时后，再称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的三蒸水中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌0.5小时，使其形成纳米粒混悬液，然后再称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及肽Tat的壳聚糖纳米粒。
本发明的优势在于：本发明是在20℃搅拌的条件下先让细胞穿透肽Tat溶于带正电的壳聚糖溶液，再让带正电的壳聚糖溶液和带负电荷胰岛素溶液充分的结合，再加入带负电荷的三聚磷酸钠与壳聚糖通过离子交联法形成纳米粒。待上述溶液形成稳定的纳米粒混悬液后再加入尤特奇S100的无水乙醇溶液。整个制备过程简单可控，不会对胰岛素的生物活性造成影响。并且所制备的纳米粒平均粒径小于150nm，对胰岛素和细胞穿透肽Tat的包封率分别大于80％和50％，解决了壳聚糖纳米粒同时包裹胰岛素和细胞穿透肽Tat两种物质的技术难题。本发明制备的肠溶包衣的胰岛素壳聚糖纳米粒粒口服给药后，由于肠溶材料尤特奇S100的保护作用可以大大的降低壳聚糖纳米粒在胃部及小肠上部释放其装载的内容物的量。当壳聚糖纳米粒到达消化道下端时，由于pH值的上升，壳聚糖纳米粒表面的肠溶包衣材料开始溶解并暴露出壳聚糖纳米粒，壳聚糖纳米粒在弱碱性的条件下被破坏，从而释放出里面的细胞穿透肽及胰岛素。细胞穿透肽促进结肠上皮细胞对胰岛素的吸收，从而提高了胰岛素的口服生物利用度。
本发明通过以下各项实验结果来表达其优异之处。
根据本发明方法所制备的尤特奇S100包衣的包裹胰岛素或异硫氰酸荧光素标记的胰岛素(FITC-Ins)及Tat的壳聚糖纳米粒称为ES-Tat-cNPs(为上述最优工艺所制)，用于实验对照的包裹胰岛素及Tat的壳聚糖纳米粒称为Tat-cNPs，用于实验对照的尤特奇S100包衣的包裹胰岛素(或FITC-Ins)的壳聚糖纳米粒称为ES-cNPs。
用于实验对照的Tat-cNPs的制备方法为：称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，然后把此溶液置于一放在磁力搅拌器上的容器中搅拌，然后称取2mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)加入，搅拌至溶解。然后称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌1小时后。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的三蒸水中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液。
用于实验对照的ES-cNPs的制备方法为：称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，然后把此溶液置于一放在磁力搅拌器上的容器中搅拌。称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌1小时后。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒子混悬液。称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中。在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌12小时即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素的壳聚糖纳米粒子。
(一)纳米粒的表征结果
根据上述方法所制备的ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs混悬液滴加到覆有支持膜的铜网上，自然风干5min，用滤纸吸去多余的液体；滴加磷钨酸溶液染色3min，用滤纸吸去多余的液体，自然风干；将铜网放置在透射电镜下放大到适宜倍数观察并拍照记录。本发明方法所用的离子交联法制备的壳聚糖纳米粒ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs外观均为球形或是近球形，粒径分布较均匀，见附图1及附图2。
本发明方法所用的离子交联法所制备的纳米粒ES-Tat-cNPs，具有120.6nm±4.2的平均粒径，PDI为0.13±0.05。胰岛素的包封率为83.6±2.03％，Tat的包封率51.2±5.0％。具有较高的包封率和较小的粒径。
(二)体外释放实验
本发明的体外释放实验是在pH1.2的盐酸缓冲液，pH6.8和pH7.4的磷酸盐缓冲液中进行的，实验方法和结果如下。
方法：取Tat-cNPs，ES-Tat-cNPs混悬液在4℃的条件35000rpm超速离心35min，超速离心后弃去上清液所得到的沉淀用蒸馏水洗涤三次，分别用10mL的pH1.2的盐酸缓冲液、pH6.8的磷酸盐缓冲液和pH7.4的磷酸盐缓冲液分散于试管中。将试管放置于37℃，转速为100rpm的恒温振荡器中孵育，并在设置的时间点，分别取1mL的样品(同时补充1mL新鲜的释放介质到试管中)放入超滤管中(截留分子量为10万)3000rpm离心5min，并用释放介质洗涤离心3次，合并滤液。并用高效液相色谱法测定滤液中的Ins的含量，计算释放百分数。结果见表1和表2及附图3～附图5所示。
表1纳米粒在pH1.2和pH6.8的释放介质中的累计释放数据(％)
表2纳米粒在pH7.4的释放介质中的累计释放数据(％)
从附图3中可知：Tat-cNPs，ES-Tat-cNPs在pH1.2的盐酸缓冲液中的释放行为有着非常明显的不同：Tat-cNPs在pH1.2的盐酸缓冲液中15min内释放了70％的胰岛素，30min内胰岛素几乎完全释放；然而，ES-Tat-cNPs在pH1.2的盐酸缓冲液没有明显的突释行为，且4小时的累积释放量小于15％。在pH1.2的盐酸缓冲液中Tat-cNPs不稳定，纳米粒没有肠溶材料尤特奇S100的保护会被破坏，胰岛素被快速的释放到释放介质中；而ES-Tat-cNPs在尤特奇S100的保护下没有被破坏，降低了胰岛素在释放介质的释放。
从附图4、附图5中可知，Tat-cNPs，ES-Tat-cNPs在pH6.8的磷酸盐缓冲液和pH7.4的磷酸盐缓冲液中释放行为没有明显的差异。在pH6.8的磷酸盐缓冲液中ES-Tat-cNPs中尤特奇S100膜开始溶解使得Tat-cNPs暴露在释放介质中，壳聚糖纳米粒在pH6.8的磷酸盐缓冲液的释放介质中逐渐达到一个稳定的状态，避免了胰岛素的大量释放。在pH7.4的磷酸盐缓冲液中Tat-cNPs和ES-Tat-cNPs中的壳聚糖发生去质子化，导致纳米粒被破坏，胰岛素被快速大量的释放到释放介质中。
(三)Caco-2细胞中的转运和摄取实验
由于荧光分光光度法在分析测定中具有灵敏度高、选择性好等的优点，本发明在通过细胞转运及细胞摄取实验对纳米粒进行评价时以异硫氰酸荧光素(FITC)标记胰岛素(FITC-Ins)，作为模型药物制备ES-Tat-cNPs和ES-cNPs，采用荧光分光光度法分析测定FITC-Ins。
本发明的壳聚糖纳米粒的体外Caco-2细胞评估实验是通过比较Caco-2细胞对尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins及Tat的壳聚糖纳米粒和尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的壳聚糖纳米粒中FITC-Ins的转运及摄取的效率来实现的。尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins及Tat的壳聚糖纳米粒(ES-Tat-cNPs)与尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的壳聚糖纳米粒(ES-cNPs)的制备方法如下：
尤特奇S100的包裹FITC-Ins及Tat的壳聚糖纳米粒：称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，称为溶液A。称取2mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中并称为溶液B，在室温下将溶液B置于磁力搅拌器上搅拌。称取4mg的FITC-Ins，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C1。在室温搅拌的条件下将溶液C1缓慢加入到溶液B中，继续搅拌1小时形成溶液D1。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液D1中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液F1。称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液F1中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins及Tat的壳聚糖纳米粒。因用到FITC-Ins，整个制备过程最好在避光条件下进行。
尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的壳聚糖纳米粒：称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，称为溶液A。在室温条件下将溶液A置于磁力搅拌器上搅拌。称取4mg的FITC-Ins，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C1。在室温搅拌的条件下将溶液C1缓慢加入到溶液A中，继续搅拌1小时形成溶液G1。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液G1中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液H1。称取2mg尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液H1中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹FITC-Ins的壳聚糖纳米粒。整个制备过程在避光的条件下进行。
细胞转运实验：将ES-Tat-cNPs和ES-cNPs混悬液在4℃的条件35000rpm超速离心35min，离心后的沉淀用蒸馏水洗涤3次。随后，沉淀用汉克平衡盐溶液(HBSS)分散后用0.22微米的微孔滤膜过滤备用。培养好的Caco-2细胞用1.5mL的HBSS在细胞培养箱中孵育半小时，然后弃去HBSS，细胞培养板的上室部分别加入0.5ml的处理好了的两种纳米粒溶液，下室加入1.5ml的HBSS，放入细胞培养箱中37℃孵育。在设定的时间点把细胞培养板从细胞培养箱取出并从下室取0.1ml的样品溶液装入到棕色容量瓶中，同时补充等量的新鲜HBSS溶液到下室，并把细胞培养板放回细胞培养箱中孵育。然后在避光条件往棕色容量瓶加丙酮稀释，用荧光分光光度计测量荧光强度计算Caco-2细胞对FITC-Ins的转运效率。激发波长为490nm，发射波长为516nm。结果见表3及附图6所示。
细胞摄取实验：将ES-Tat-cNPs和ES-cNPs分别根据实施例2中所述方法进行超速离心。离心后的沉淀用蒸馏水洗涤3次。随后，沉淀用HBSS分散后用0.22微米的微孔滤膜过滤备用。培养好的Caco-2细胞用1.5mL的HBSS在细胞培养箱中孵育半小时，然后弃去HBSS，加入1.5mL的处理好了的两种纳米粒溶液，放入细胞培养箱中37℃孵育。在预设的时间点，将细胞培养板取出，用4℃的HBSS洗涤细胞3次，加入100μL 4℃RIPA细胞裂解液冰浴孵育20min使细胞裂解。待细胞裂解完全后加入0.25％trypsin-0.02％EDTA，1000rpm离心5min。取上清液。取上清液用丙酮稀释，然后在避光条件下用荧光分光光度计测定荧光强度计算Caco-2细胞对FITC-Ins的摄取效率。结果见表3及附图6、7所示。
表3纳米粒在Caco-2细胞中的转运及摄取效率(％)
从附图6中可知：Caco-2细胞对ES-Tat-cNPs中FITC-Ins的转运效率是Caco-2细胞对ES-cNPs中FITC-Ins的转运效率的4倍左右。这证明本发明所制备的ES-Tat-cNPs有一个良好的促进细胞对FITC-Ins的转运的左右。
从附图7中可知：经过ES-Tat-cNPs处理的Caco-2细胞的摄取效率是ES-cNPs处理的Caco-2细胞3倍。这证明本发明所制备的ES-Tat-cNPs具有增强细胞对FITC-Ins摄取的左右。
(四)降血糖研究
本发明在体内的评估是通过比较ES-Tat-cNPs和ES-cNPs分别在糖尿病大鼠及健康的巴马小香猪上的降血糖效果及巴马小香猪的血浆胰岛素含量来实现的。
将ES-Tat-cNPs(20IU/kg)、ES-cNPs(20IU/kg)、胰岛素溶液(20IU/kg)和生理盐水结肠部位注射施用给糖尿病大鼠。将纯的胰岛素溶液(1IU/kg)皮下注射(SC)到糖尿病大鼠体内作为阳性对照。在设定的时间点，从被处理的大鼠尾部静脉收集血液样品。并且用罗氏血糖仪测定血糖含量。通过血液样品中的葡萄糖含量与初始值的百分比来绘制降糖效率曲线。结果见表4及附图8所示。
表4大鼠实验中各种降血糖效果(％)
| 时间(h) | 生理盐水 | INS | 皮下注射INS | ES-cNPs | ES-Tat-cNPs |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 0.5 | 103.78±3.23 | 108±6.94 | 101.5±6.16 | 114.1±3.52 | 93.43±4.82 |
| 1 | 105.04±7.36 | 103.2±3.86 | 92.83±9.52 | 98.29±4.72 | 76.06±3.01 |
| 2 | 110.5±8.4 | 96±6.58 | 47.92±10.39 | 94.14±2.06 | 68.38±4.88 |
| 4 | 107.89±4.81 | 98±5.41 | 126.03±1.95 | 85.24±2.27 | 66.73±6.54 |
| 6 | 120.16±5.49 | 112±9.97 | 122.64±2.74 | 101.78±3.94 | 79.22±8.13 |
| 8 | 118.06±2.92 | 118±9.86 | 124.9±4.71 | 121.89±3.61 | 90.04±3.59 |
| 12 | 117.96±7.06 | 116.3±8.1 | 124.15±3.95 | 119.01±6.49 | 115.02±5.90 |
| 24 | 119.86±2.07 | 120.4±10.44 | 125.28±1.07 | 125.31±7.95 | 110.75±7.21 |
从附图8中可知：ES-Tat-cNPs较ES-cNPs显示更好的降糖效果，ES-Tat-cNPs的最大降糖百分数为66.06％，而ES-cNPs为85.24％。ES-Tat-cNPs的药理相对生物利用度为14.30％，是ES-cNPs的2.16倍。
巴马小香猪中口服ES-Tat-cNPs和ES-cNPs体内研究
将6只健康的巴马小香猪随机分为两组，分别灌胃口服将ES-Tat-cNPs(10IU/kg)和ES-cNPs(10IU/kg)混悬液。在设定的时间点，从巴马小香猪前腔静脉收集血液样品。所收集的血液样品分为两部分：一部分立即用罗氏血糖仪测定血糖含量，通过血液样品中的葡萄糖含量与初始值的百分比来绘制降糖效率曲线；另外一部分加入肝素钠后13000rpm离心5分钟，离心后取上清液用ELISA试剂盒测定血浆胰岛素的含量，并绘制胰岛素含量与时间的曲线图。结果见表5及附图9所示。血浆中胰岛素含量如表6及附图10所示。
表5巴马小香猪降血糖效果
| 时间(h) | ES-cNPs(％) | ES-Tat-cNPs(％) |
| 0 | 100 | 100 |
| 0.5 | 93.6±10.5 | 94.5±8.4 |
| 1 | 89.7±7.4 | 96.1±9.3 |
| 2 | 108.5±5.9 | 103.5±5.8 |
| 4 | 94.6±8.4 | 92.4±4.1 |
| 6 | 88.2±8.3 | 78.9±5.6 |
| 8 | 78.3±5.7 | 64.3±7.2 |
| 10 | 73.4±6.1 | 60.8±9.4 |
| 12 | 80.3±5.9 | 66.27±7.1 |
| 16 | 97.6±8.7 | 95.4±8.3 |
| 24 | 90.5±3.1 | 85.8±4.4 |
| 30 | 94.4±6.1 | 98.2±6.3 |
| 36 | 92.1±9.3 | 95.6±7.4 |
表6巴马小香猪血浆胰岛素含量
| 时间(h) | ES-cNPs(ng/mL) | ES-Tat-cNPs(ng/mL) |
| 0 | 0.328368 | 0.56635 |
| 0.5 | 0.737258 | 0.746899 |
| 1 | 0.047616 | 0.895005 |
| 2 | 0.314233 | 0.670013 |
| 4 | 1.059656 | 2.811467 |
| 6 | 1.65509 | 4.985433 |
| 8 | 2.070955 | 6.584627 |
| 10 | 3.43215 | 3.93772 |
| 12 | 2.077485 | 2.27956 |
| 16 | 0.43939 | 0.374657 |
| 24 | 0.53599 | 0.713977 |
| 30 | 0.223518 | 0.336824 |
| 36 | 0.566646 | 0.670857 |
从附图9及附图10中可知：巴马小香猪口服ES-Tat-cNPs和ES-cNPs后，胰岛素的主要吸收部位为结肠。ES-Tat-cNPs组的最低降血糖效果达到60.8％，而ES-cNPs组只有73.4％。此外，ES-Tat-cNPs组胰岛素的最大血药浓度为6.5846ng/mL，而ES-cNPs组只有为3.432ng/mL。ES-Tat-cNPs口服生物利用度为ES-cNPs的1.73倍。表明本发明方法所制备的ES-Tat-cNPs具有增强胰岛素口服结肠吸收的功能。
附图说明
图1为本发明制备的ES-Tat-cNPs透射电镜图像。
图2为Tat-cNPs的透射电镜图像。
图3为在pH＝1.2中，胰岛素从ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中释放的曲线。
图4为在pH＝6.8中，胰岛素从ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中释放的曲线。
图5为在pH＝7.4中，胰岛素从ES-Tat-cNPs及Tat-cNPs中释放的曲线。
图6为本发明制备的ES-Tat-cNPs和ES-cNPs在Caco-2细胞中的转运效率曲线。
图7为本发明制备的ES-Tat-cNPs和ES-cNPs在Caco-2细胞中的摄取效率曲线。
图8显示的为在对疾病模型结肠注射施用根据本发明方法制备的ES-Tat-cNPs、ES-cNPs、生理盐水、胰岛素溶液或皮下施用胰岛素溶液之后血液葡糖糖含量与时间的曲线图。
图9显示的为在对健康大动物模型口服施用根据本发明方法制备的ES-Tat-cNPs和ES-cNPs之后血液葡糖糖含量与时间的曲线图。
图10显示的为在对健康大动物模型口服施用根据本发明方法制备的ES-Tat-cNPs和ES-cNPs之后血浆胰岛素含量与时间的曲线图。
具体实施
实施例1
称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5，称为溶液A。称取2mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中并称为溶液B，在室温下将溶液B置于磁力搅拌器上搅拌。称取4.2mg的胰岛素，溶于2mL0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C。在室温搅拌的条件下将溶液C缓慢加入到溶液B中，继续搅拌1小时形成溶液D。称取2.3mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液D中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液F。称取2mg的ES溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液F中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及Tat的壳聚糖纳米粒。
实施例2
称取分子量为5万道尔顿脱乙酰度为85％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，称为溶液A。称取2.3mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中并称为溶液B，在室温下将溶液B置于磁力搅拌器上搅拌。称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C。在室温搅拌的条件下将溶液C缓慢加入到溶液B中，继续搅拌1小时形成溶液D。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液D中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液F。称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液F中，继续搅拌12小时即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及Tat的壳聚糖纳米粒。
实施例3
称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为85％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5，称为溶液A。称取2mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中并称为溶液B，在室温下将溶液B置于磁力搅拌器上搅拌。称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C。在室温搅拌的条件下将溶液C缓慢加入到溶液B中，继续搅拌1小时形成溶液D。称取2.3mg的三聚磷酸钠溶于2mL的蒸馏水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液D中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液F。称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液F中，继续搅拌12小时即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及Tat的壳聚糖纳米粒。
实施例4
称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，称为溶液A。称取2mg的Tat(氨基酸序列GRKKRRQRRRP)，溶于溶液A中并称为溶液B，在室温下将溶液B置于磁力搅拌器上搅拌。称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，称为溶液C。在室温搅拌的条件下将溶液C缓慢加入到溶液B中，继续搅拌1小时形成溶液D。称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的三蒸水中并称为溶液E，在室温搅拌的条件下将溶液E缓慢加入到溶液D中，继续搅拌0.5小时形成纳米粒混悬液F。称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中称为溶液I。在室温搅拌的条件下将溶液I缓慢加入到混悬液F中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及Tat的壳聚糖纳米粒。
Claims (2)
1.一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒，其特征在于，该纳米粒由壳聚糖、三聚磷酸钠、尤特奇S100、细胞穿透肽Tat和胰岛素制成；
所述三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1.0:3.5～4.5，细胞穿透肽Tat与壳聚糖的质量比为1.0:3.5～4.0，胰岛素与壳聚糖的质量比为1.0:1.5～2.5；
该纳米粒的制备工艺包含以下步骤：
(a)将壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，制备壳聚糖溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.5～6.0，加入细胞穿透肽Tat使溶解；
(b)在室温搅拌的条件下，将胰岛素盐酸溶液缓慢加到(a)中的壳聚糖与细胞穿透肽Tat的混合液中，继续搅拌1小时；
(c)在室温搅拌的条件下，将三聚磷酸钠水溶液缓慢加到(b)所得的溶液中，继续搅拌0.5小时，形成纳米粒悬浮液；
(d)在室温搅拌的条件下，将尤特奇S100的无水乙醇溶液缓慢加到(c)所得的纳米粒悬浮液中，继续搅拌12小时，即得一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种提高胰岛素口服结肠吸收的壳聚糖纳米粒，其特征在于，该纳米粒的最优制备工艺如下：
称取分子量为10万道尔顿脱乙酰度为95％的壳聚糖粉末8mg，溶于4ml的0.2％的醋酸溶液中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，然后把此溶液置于一放在磁力搅拌器上的容器中搅拌，再称取2mg的肽Tat，氨基酸序列GRKKRRQRRRP，加入，搅拌至溶解，然后称取4mg的胰岛素，溶于2mL的0.1mol/L的盐酸溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌1小时后，再称取2mg的三聚磷酸钠溶于2mL的三蒸水中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌0.5小时，使其形成纳米粒混悬液，然后再称取2mg的尤特奇S100溶于1mL的无水乙醇溶液中，在室温搅拌的条件下将其缓慢加入到搅拌器上的容器中，继续搅拌12小时，即形成尤特奇S100包衣的包裹胰岛素及肽Tat的壳聚糖纳米粒。
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