CN113304124B - 一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液及其制备方法，纳米粒由壳聚糖和三聚磷酸钠(TPP)在溶液中进行离子交联反应制得，透明质酸通过电荷吸附作用包裹于壳聚糖纳米粒表面，纳米粒作为胰岛素的载体，在口服后保护胰岛素通过胃部，避免胃酸和蛋白酶对胰岛素的破坏作用，到达小肠后纳米粒被小肠细胞吸收，进入到血液循环系统，发挥降低和控制血糖水平的作用。本发明公开的纳米粒液制备过程简单，使用天然生物材料，避免有毒有害化学试剂，且室温储藏过程中稳定性高，胰岛素的载药效率高，在肠胃中缓释效果好，缓释后化学结构和生物活性不发生改变，具有广阔的应用前景。

Description

一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体地，涉及一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液及其制备方法。

背景技术

全国和世界范围内，随着人口老龄化和生活习惯的变化，糖尿病患者人群的人数逐年增加，糖尿病人群的健康管理是一个重要的个人和社会问题。虽然部分药物，例如格华止和某些中草药制剂具有较好的控制血糖的作用，但是对于晚期和严重糖尿病患者，胰岛素依然是一种最有效和可靠的控制血糖的药物。胰岛素分子量为5.8kDa，由51个氨基酸残基构成的2条肽链组成，是人体内具有降低血糖的主要激素。

目前胰岛素的给药方式主要是腹部皮下注射。这种方式会引起一定的痛苦，患者的配合程度低，特别是每天都需要进行注射，还可能会引起皮肤感染。由于糖尿病患者抵抗力低下，皮肤伤口愈合缓慢，长期注射胰岛素还可能导致注射处伤口溃烂，影响用药。同时胰岛素通过注射的方式虽然可以快速控制血糖，但是容易导致血糖过低，同时缓释效果差，需要多次进行给药，进一步降低了患者的配合程度。

口服给药是大部分患者更加容易接受的一种给药方式。但是对于胰岛素来说，直接口服后面临胃酸的强酸作用和蛋白酶的降解作用，无法产生降血糖的生物活性。纳米药物载体是一大类新型的载药体系，粒径一般小于200nm，颗粒分布均一，稳定性好，可以作为多种药物的递送体系，保护和控制药物的释放，提高其稳定性和生物利用度。用于口服胰岛素的纳米药物载体需要满足如下条件才可能用于胰岛素口服给药：在胃部不释放或者释放很少，在小肠加速释放或者可以透过小肠上皮细胞被血液吸收，制备过程简单，制备材料生物相容性高，制备过程无有毒有害物质，制备材料和制备过程均不影响胰岛素的高级结构和生物活性，纳米粒子促进胰岛素的肠道吸收，显著降低血糖并有较长的缓释时间等。满足上述要求的口服胰岛素纳米递送体系较少，因此有必要研究开发高效稳定的口服胰岛素纳米递送体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液及其制备方法，用以解决胰岛素口服给药胰岛素易被降解，生物活性低的技术问题。且本发明提供的制备方法为离子凝胶法和电荷吸附法，制备过程简单，无有毒有害试剂材料，胰岛素稳定性高，胰岛素的高级结构和生物活性稳定，缓释效果好，控制血糖时间长，应用前景广阔。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液，包括载胰岛素纳米粒、透明质酸和去离子水，且该纳米粒溶液的平均粒径在154-185nm，分散系数低于0.3。

所述载胰岛素纳米粒通过以下步骤制成：

步骤一、在600r/min搅拌状态下，向酸性壳聚糖醋酸溶液中同时缓慢滴加胰岛素盐酸溶液和三聚磷酸钠溶液，滴加完全后继续搅拌60min，然后将反应液置于离心管中在室温，14000r/min条件下离心2min，弃上清液，取沉淀并水洗3次去除未反应的壳聚糖、胰岛素和三聚磷酸钠，获得载胰岛素纳米粒。

进一步地，步骤一中壳聚糖为高粘度壳聚糖、中粘度壳聚糖和低粘度壳聚糖，优选低粘度壳聚糖。

进一步地，步骤一中酸性壳聚糖醋酸溶液的pH为5.0-6.5，优选地为5.3。

进一步地，步骤一中酸性壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度为1.5mg/mL；胰岛素盐酸溶液中胰岛素的浓度为1mg/mL；三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.5mg/mL；壳聚糖和三聚磷酸钠加入的质量比为3-6：1，优选地为5：1。

一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液的制备方法，包括以下步骤：

步骤X、将载胰岛素纳米粒溶于去离子水中，用醋酸的缓冲溶液将pH调至5.5，充分溶解后，在搅拌状态下，向此溶液中缓慢滴加透明质酸溶液，滴加完全后继续搅拌30min，然后将反应液置于离心管中在室温，14000r/min条件下离心2min，弃上清液，取沉淀并水洗3次去除未反应的透明质酸，最后溶解于蒸馏水中，获得一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液。

进一步地，步骤X中醋酸的缓冲溶液的pH为5.5；载胰岛素纳米颗粒和透明质酸的加入质量比为10-25：1。

进一步地，步骤X中透明质酸溶液的浓度为0.1mg/mL。

本发明的有益效果：

本发明提供的制备方法制备的纳米颗粒平均粒径在154-185nm，分散系数低于0.3，均一性较高，透射电镜显示其呈近似球形，表面具有透明质酸包裹层，胃消化液中释放量低，在小肠消化液中释放量高，释放前后胰岛素的高级结构不发生变化，该纳米粒对细胞基本无毒，细胞吸收效率高，可以透过小肠上皮细胞进入到血液循环系统，动物实验表面该纳米粒可以显著降低糖尿病小鼠血糖浓度，和注射胰岛素相比作用时间更长，降血糖效果更好。

与现有技术相比，本发明具有的优势如下：

1、本发明采用原料均为天然生物材料，生物相容性高，采用制备方法温和，无有毒有害试剂，绿色环保；

2、本发明不涉及大型精密仪器，对于仪器设备的要求较低；

3、本发明在制备胰岛素壳聚糖纳米粒过程中，引入了三聚磷酸钠，以利用三聚磷酸钠优异的粒子交联能力，促进形成胰岛素壳聚糖纳米颗粒内核，使得载胰岛素纳米粒的粒径更加均匀，使得其粒径分布在154-185nm，且可以促进后续胰岛素壳聚糖纳米在水体系中分散更加均匀和稳定，使得胰岛素壳聚糖纳米分散系数低于0.3，均一性较高；且三聚磷酸钠具有pH调节性能，其缠绕在载胰岛素外，以形成口服胰岛素壳聚糖纳米的pH响应机制；且三聚磷酸钠在壳聚糖和透明质酸之间起到桥梁作用，促进透明质酸对壳聚糖的包裹性，使得透明质酸包裹胰岛素壳聚糖纳米在胃液环境中保持了胰岛素的高级结构和降血糖生物活性；

4、纳米粒对胰岛素具有很好的保护作用，可以顺利通过胃消化液，胰岛素稳定性高，在肠道中促进胰岛素的释放，同时释放后其蛋白质的高级结构不发生变化，稳定发挥降血糖生物活性，同时在肠道中缓释时间长，显著优于注射胰岛素；

5、本发明制备出了一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液，患者可口服给药，与注射相比，患者的痛苦小，不需要多次给药，血糖控制平稳；且本发明纳米粒溶液降糖效果好，降糖持续时间长，效果显著，胰岛素生物利用度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3中纳米颗粒和胰岛素荷载纳米粒的水动力学参数优化结果；

图2为实施例4中的透射电镜图像：

(a)壳聚糖纳米粒(CNP)，标尺为100nm；

(b)透明质酸包裹壳聚糖纳米粒(HCP)；

(c)胰岛素负载的壳聚糖纳米粒(INS-CNP)；

(d)胰岛素负载的透明质酸包裹壳聚糖纳米粒(INS-HCP)，标尺200nm；

(e-f)为(b)的放大图，红色箭头表示透明质酸的涂层；

图3为实施例5中胰岛素包封结果：

(a)不同pH条件下透明质酸纳米粒子(HCPs)的负载效率；

(b)不同pH条件下透明质酸纳米粒子(HCPs)的负载能力；

图4为实施例6中在pH为2.0、6.8和7.4条件下，透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子中胰岛素的释放曲线；其中，(a)pH2.0及6.8条件下透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子的胰岛素释放曲线；(b)在pH7.4条件下透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子的胰岛素释放曲线；(c)在pH2.0条件下壳聚糖纳米粒及透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子的粒径大小分布；

图5为实施例7中透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子释放的胰岛素和纯胰岛素的二级和三级结构结果；其中，(a)天然胰岛素溶液和透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子释放的胰岛素的圆二色谱图；(b)天然胰岛素溶液和透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子释放的胰岛素的荧光光谱。

图6为实施例8中4℃条件下30天内壳聚糖纳米粒子和透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子的大小和多分散系数的变化；

图7为实施9中不同浓度透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子处理Caco-2细胞的活力，数据以均数±SD表示(n＝6)；

图8为实施例10中胰岛素负载的透明质酸纳米粒子随时间的转移，Caco-2细胞对胰岛素负载的透明质酸包裹壳聚糖纳米粒子的摄取能力。蓝色荧光为DAPI染色的细胞核，绿色荧光为FITC染色的壳聚糖，红色荧光为罗丹明6G染色的胰岛素。比例尺分别为100μm(1.6h)和75μm(3h)；

图9为实施例11中加入胰岛素溶液或不同纳米粒子细胞跨膜电阻随时间的变化；

图10为实施例12中口服胰岛素纳米粒子或皮下注射胰岛素的降血糖作用。

具体实施方式

对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：壳聚糖纳米颗粒CNP的制备

将低粘度(5-20mPa·s)的壳聚糖(CS)充分溶解在1％乙酸溶液中，浓度为1.5mg/mL；然后将溶液的pH值调整到5.5；将三聚磷酸钠(TPP)溶于去离子水中，浓度为0.5mg/mL，调节pH至7.6；将TPP溶液(0.5mg/mL)滴加到壳聚糖溶液(1.5mg/mL)中，然后在25℃下搅拌60分钟，搅拌速度为600rpm/min，反应10分钟后高速离心分离获得壳聚糖纳米颗粒CNP，其中，CS：TPP的质量比为5：1。

实施例2：HCP和INS-HCP的制备

实施例2-1-1：HCP-1-1制备

将透明质酸钠溶于蒸馏水中，用0.5M醋酸缓冲液调节pH至5.5制得透明酸溶液，透明质酸钠的溶液浓度为0.1mg/mL；然后将此溶液滴加到按照实施例1方法制备的CNP(1.5mg/mL，pH5.5)溶液中，然后将混合溶液在室温下搅拌30分钟，搅拌速度为600rpm/min，获得具有透明质酸涂层的HA-CS/TPP(HCP)，其中，HA：CNP的质量比为8：1。

实施例2-1-2：HCP-1-2制备参照实施例2-1-1中的制备方法，其中，HA：CNP的质量比为9：1。

实施例2-1-3：HCP-1-3制备参照实施例2-1-1中的制备方法，其中，HA：CNP的质量比为10：1。

实施例2-1-4：HCP-1-4制备参照实施例2-1-1中的制备方法，其中，HA：CNP的质量比为12：1。

实施例2-2-1：INS-HCP-1的制备

将胰岛素溶解在0.1N稀释的盐酸溶液中，调节pH至2.8，胰岛素浓度为1mg/mL；然后分别滴加胰岛素和TPP溶液到1.5mg/mL的壳聚糖溶液中，然后将混合溶液在室温下搅拌30分钟，搅拌速度为600rpm/min，获得INS-CNP；然后，在室温下，将透明质酸溶液(0.1mg/mL)加入上述混合溶液中，600rpm/min搅拌30min，获得载胰岛素(INS)的HA-CS/TPP(INS-HCP)，其中，将HA：CNP的质量比分别调整为8：1。

实施例2-2-2：INS-HCP-2的制备：

参照实施例2-2-1中制备方法，其中，HA：CNP的质量比为9：1。

实施例2-2-3：INS-HCP-3制备：

参照实施例2-2-1中的制备方法，其中，HA：CNP的质量比为10：1。

实施例2-2-4：INS-HCP-4制备：

参照实施例2-2-1中的制备方法，其中，HA：CNP的质量比为12：1。

实施例3：粒径、电位和形态表征

利用马尔文粒度仪测量纳米粒子的粒径、电位和多分散系数，利用透射电镜表征纳米粒子的形态。

图1-a为不同质量比得到的CNP，CS的浓度为1.5mg/mL，粘度为＜200mPas，TPP的浓度为0.5mg/mL，粒子粒径在5：1时最小。

图1-b为不同粘度壳聚糖与TPP反应得到的CNP，CS的浓度为1.5mg/mL，TPP为0.5mg/mL，在壳聚糖为低粘度时，粒子粒径最小，优选粘度为5-20mPas的壳聚糖，浓度为1.5mg/mL，TPP浓度为0.5mg/mL，CS与TPP质量比为5：1。

图1-c为透明质酸与壳聚糖纳米粒子不同质量比粒径与多分散系数结果，可知在10：1时粒径与多分散系数最小。

图1-d为壳聚糖纳米粒子混合后不同pH条件下的粒径和多分散系数，可知在pH为5.5条件下粒径最小，多分散系数没有显著差别。

图1-e为透明质酸与壳聚糖纳米粒子混合后不同pH条件下的粒径和多分散系数，可知在pH为5.5时粒径最小，多分散系数没有显著影响。

图f为四种纳米粒子表面电位结果。加入透明质酸后，纳米粒子表面电位明显降低。

实施例4：透射电镜形态观察

如图2所示，INS-CNP和INS-HCP外观为球形，大小与DLS结果相似。此外，HCP的TEM图像显示出明显的壳结构，表明HA在CNP上被涂层(图2e，2f)。胰岛素荷载后，CNP的形状仍保持之前报道的规则球形特征。而HCP不像荷载后的HCP那样光滑和球形，这是由于上述静电相互作用导致HA和胰岛素竞争所致。

实施例5：包封率和荷载能力测定

包封率(LE)和荷载能力(LA)采用考马斯亮蓝法测定，简单地说，在制备INS-HCP后，将混合溶液的pH调整到7.4。混合溶液18000g离心10分钟，收集上清。用考马斯亮蓝法检测上清液中胰岛素浓度。在595nm处用紫外吸收法测定INS-HCP中胰岛素的LE和LA。LE和EC的计算公式如下：

LE％＝(总胰岛素质量-游离胰岛素质量/总胰岛素质量)×100％

LA％＝(总胰岛素质量-游离胰岛素质量/纳米粒子质量)×100％

如图3所示，不同pH条件下的装药效率为5.2％-38.8％，说明胰岛素的包封率与CS和TPP的混合物的最终pH有关。当INS-HCP的最终pH值调整为5.5时，包封率和荷载能力分别达到38.8％和15.1％。pH为5.0时，pH值分别为5.2％和2.2％。当最终pH从5.5移到6.0时，没有显著差异，仅下降了10％左右。但从上图的粒径结果可以看出，当CNP溶液的最终pH从5.5提高到6.0时，INS-CNP和INS-HCP的尺寸分别增加了约50nm和30nm。此外，CNP溶液最终pH调整到6.5时，荷载效率很低(3.4％)。该类型的纳米颗粒具有良好的包封性，为胰岛素的包封提供了足够的空间。因此，在接下来的实验中，CNP溶液和HA的最终pH选择为5.5。

实施例6：模拟肠胃缓释试验

将INS-HCP溶液的pH分别调整为2.0、6.8、7.4，来模拟胃肠道释放条件。简单地说，HCPs分散在不同pH的溶液中，平均分成12份等体积的溶液。溶液在37℃的磁力搅拌器上搅拌。18000g离心10min，取上清液。用考马斯亮蓝法测定胰岛素含量，记录胰岛素在595nm处的吸收值。

图4为不同pH条件下，模拟胃肠道环境的INS-HCP的释放曲线。在pH值为7.4时，释放情况与生理条件相对应，呈快速增加趋势。在图4-a中比较了不同pH值(5.5和6.0)下制备的INS-CHP的释放曲线。两种不同条件下INS-HCP的释放速率无显著差异，但pH5.5条件下制备的INS-HCP的胰岛素释放量高于pH6.0条件下制备的透明质酸纳米颗粒。此外，DLS分析表明pH为5.5的条件可以促进制备更小尺寸的INS-HCP，因此以pH为5.5为条件制备INS-HCP。INS-HCP中胰岛素的释放规律表明，HA涂层能有效保护CNP免受胃酸环境的影响，大量胰岛素在HCP中保留，然后在小肠和血液中释放。

胃肠道释放谱分为两个阶段。图4-b为两个不同的释放阶段。第一阶段为3小时内在pH＝2.0下的胰岛素释放；第二阶段是第3h到第6h，pH值提高到6.8，这是模拟小肠的释放条件。胰岛素释放谱显示在前2小时出现缓慢释放，然后在第3小时内趋于平缓。在前3h内，胰岛素保留量仍保持在较高水平。为了追踪纳米颗粒在酸性环境下的条件，测量了纳米颗粒的粒径(图4-c)。HCP和INS-HCP的粒径大小没有明显变化，而CNP和INS-CNP的大小分别变为到899.8和9.8nm，说明酸性pH引起CNPs的组装或结构破坏，而INS-HCP和INS-CNP仍能保持稳定。在接下来的3h，胰岛素在模拟肠液中的释放呈爆发性释放，但较模拟胃液中前2h的释放速度稍慢，图4-d显示INS-HCP粒径明显变大，从158.6nm增加到354.1nm，而CNP粒径从84.9nm增加到236.2nm。

实施例7：释放胰岛素结构验证

用圆二色谱和荧光光谱分别对释放后的胰岛素进行二级结构和三级结构进行分析，通过与胰岛素溶液进行对比，判断胰岛素结构是否发生明显变化。

图5为蛋白质在制备和释放后与胰岛素溶液的二级和三级结构对比。在圆二色谱图中，天然胰岛素在212nm和220nm处有两个最小值，代表主要的α-螺旋结构(图5-a)。圆二色谱图表明，天然胰岛素和INS-HCP释放的胰岛素在二级结构上没有显著差异。荧光光谱结果显示，天然胰岛素和INS-HCP的胰岛素的光谱变化不大，位移小于2-3nm。以上结果表明，胰岛素在纳米粒中包封后仍保持其空间构象。

实施例8：稳定性分析

将制备的实施例1和实施例2制备的样品置于4℃保存，考察其贮存稳定性。分别在3、7、15、30天取纳米粒子用马尔文激光粒度仪进行分析。

图6为4℃条件下30天内CNP和HCP的粒径和多分散系数值的变化。在4℃下，CNP的粒径在7天后增加了38nm，然后趋于稳定，变化不大，而HCP的尺寸在不同的时间内呈现平稳趋势，略有增加。CNP和HCP的粒径在30天内分别增大了59nm和25nm，说明HA涂层对CNP的稳定性有促进作用。

实施例9：细胞毒性试验

Caco-2细胞在DMEM培养基中培养，添加10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素和1％非必须氨基酸溶液。然后将Caco-2细胞转移到37℃、5％CO2、95％湿度的CO2培养箱中。培养2-3天后，将Caco-2细胞转移到新的培养瓶中。每天观察Caco-2细胞形态，确保正常生长条件。用MTT法测定制备的纳米粒子的细胞毒性。

图7为HCP对Caco-2细胞的细胞毒性。细胞存活率在不同浓度下超过99％，HCP浓度范围从2μg/mL到600μg/mL内对Caco-2细胞没有毒性。结果表明，INS-HCP时安全的。这一结果有力地支持了所制备的INS-HCP的生物相容性，从而保证了其在口服胰岛素给药方面的应用前景。

实施例10：细胞摄取试验

分别用FITC和罗丹明6G标记壳聚糖和胰岛素。简单地说，将1％FITC乙醇溶液与壳聚糖1％冰醋酸水溶液混合，然后在黑暗中搅拌24h。罗丹明6G(Rh)溶解在1mg/mL的乙醇溶液中，然后加入胰岛素溶液(1mg/mL)下搅拌24h。然后FITC-CS，Rh-insulin在10000rpm下离心，并用蒸馏水和乙醇清洗，直到上清中没有观察到荧光。用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察Caco-2细胞对胰岛素负载纳米粒的吸收。

图8为INS-HCP染色后细胞吸收分布，Caco-2细胞在孵育1、3、6h后，用荧光标记的INS-HCP培养。然后用CLSM观察不同时间标记胰岛素和HCP的细胞内化情况。第一列为DAPI(4，6-二氨基-2-苯吲哚)染色的细胞核发出的蓝色荧光。第二列为壳聚糖经FITC染色后的绿色荧光。第三个柱表示胰岛素负载透明质酸纳米粒子中罗丹明6G染色的胰岛素的红色荧光。第四列表示与第一、第二和第三幅图像相对应的合并图像。孵育1h后，可见微弱的绿色和红色荧光，但随着孵育时间的延长，荧光信号强度增强，表明Caco-2细胞内载胰岛素的HCPs数量增加，绿色和红色的荧光广泛分布在细胞核周围，而细胞间隙的荧光较弱。结果表明INS-HCP能良好地被细胞内化。

实施例11：

打开小肠上皮细胞层紧密连接能力测定

测定TEER值，研究CNP和HCP打开Caco-2细胞单层紧密连接的能力。将Caco-2细胞接种在Transwell培养皿上。将含有EMDM培养基的Caco-2细胞接种于顶室，基底外侧室加入EMDM培养基。第1周去除EMDM培养基，PBS洗涤2次，每2天在AP和BL室中加入新鲜EMDM培养基，每天更新EMDM培养基。用上皮伏特-欧姆计监测Caco-2细胞单层的过上皮电阻(TEER)。Caco-2细胞单层培养21-28天，直到TEER值为500-600Ω，用不同胰岛素负载纳米粒子与Caco-2细胞共孵育，在不同时间记录TEER值。

图9为INS-HCP和INS-CNP与Caco-2细胞单层进行共同孵育。在特定的时间间隔，记录TEER值。在图中，INS-CNP的TEER值明显下降，这与壳聚糖开启紧密连接的能力有关，但INS-HCP与INS-CNP的结果不相似，INS-HCP并没有引起TEER值明显下降，这意味着INS-HCP很难通过细胞间旁路通过上皮细胞运输。

实施例12：动物降血糖实验

雄性ICR小鼠(2-3周，16-18g)大鼠体重16-18g。将链脲佐菌素(STZ，50mg/kg)溶于柠檬酸缓冲液(pH4.5)中，通过腹腔注射STZ来诱导大鼠糖尿病。在注射之前，小鼠禁食一晚，自由饮水。选取血糖浓度≥16.7mmol/L的小鼠进行以下实验。小鼠分为5组，皮下注射为阳性对照，INS-HCP口服剂量为5、20IU/kg，INS-CNP口服剂量为10IU/kg，口服0.9％生理盐水为糖尿病对照。通过使用血糖仪尾部采血检测血糖水平。相对药理利用度(PA％)通过以下方法进行定量：

relativePA％＝(AAC_oral*Dose_sc)/(AAC_sc*Dose_oral)×100％

在糖尿病小鼠胃内灌胃，计算INS-HCPs和INS-CNPs的药效学和药代动力学，避免了低pH和胃内各种酶的不良影响。

图10为口服胰岛素负载纳米粒子和皮下注射胰岛素的降血糖效果。胰岛素溶液(2IU/kg)皮下注射2h后血糖水平迅速下降，6h内恢复到高血糖水平。这意味着注射胰岛素只能在短时间内降低血糖水平，然后恢复到高血糖水平。胰岛素负载的透明质酸纳米粒子口服后具有明显的降糖作用，但不同剂量的胰岛素负载的透明质酸纳米粒子有不同程度的降糖作用。INS-HCP剂量为5IU/kg时降糖作用较小，20IU/kg时降糖作用明显。此外，INS-HCP组均表现出持续的降血糖作用，且各组小鼠血糖水平下降时间较长。这可以归因于INS-HCP的可控释放能力，与模拟消解液中释放曲线的结果相一致。对于相对药物活性，INS-HCP具有良好的降糖效果，相对PA为13.8％，与INS-CNP相比有显著增加，后者相对PA仅为6.4％。结果表明，HA涂层可以显著促进INS-CNP在体内的口服吸收并具有显著的降血糖效果。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液，其特征在于，包括载胰岛素纳米粒、透明质酸和去离子水，且该纳米粒溶液的平均粒径在154-185nm，分散系数低于0.3；

所述载胰岛素纳米粒包括壳聚糖、三聚磷酸钠和胰岛素；且该载胰岛素纳米粒通过以下步骤制成：

步骤一、在搅拌状态下，向pH为5.0-6.5酸性壳聚糖醋酸溶液中同时缓慢滴加胰岛素盐酸溶液和三聚磷酸钠溶液，滴加完全后继续搅拌60min，然后在室温条件下离心，取沉淀水洗，获得载胰岛素纳米粒；其中，所述酸性壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖的浓度为1.5mg/mL，所述胰岛素盐酸溶液中胰岛素的浓度为1mg/mL，所述三聚磷酸钠溶液中三聚磷酸钠的浓度为0.5mg/mL；且壳聚糖和三聚磷酸钠加入的质量比为3-6：1；

所述口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液，通过以下步骤制成：

步骤X、将载胰岛素纳米粒溶于去离子水中，加入醋酸缓冲溶液将pH调至5.5，充分溶解后，在搅拌状态下，向此溶液中缓慢滴加0.1mg/mL的透明质酸溶液，且透明质酸溶液的pH为5.5；载胰岛素纳米颗粒和透明质酸的加入质量比为10-25：1；滴加完全后继续搅拌30min，然后在室温条件下离心，取沉淀水洗，最后溶解于蒸馏水中，获得口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液。

2.一种如权利要求1的口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、在搅拌状态下，向酸性壳聚糖醋酸溶液中同时缓慢滴加胰岛素盐酸溶液和三聚磷酸钠溶液，滴加完全后继续搅拌60min，然后在室温条件下离心，取沉淀水洗，获得载胰岛素纳米粒；

步骤X、将载胰岛素纳米粒溶于去离子水中，加入醋酸缓冲溶液将pH调至5.5，充分溶解后，在搅拌状态下，向此溶液中缓慢滴加0.1mg/mL的透明质酸溶液，且透明质酸溶液的pH为5.5，滴加完全后继续搅拌30min，然后在室温条件下离心，取沉淀水洗，最后溶解于蒸馏水中，获得口服胰岛素壳聚糖纳米粒溶液。

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