KR102415978B1 - 레반-단백질 나노복합체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레반 및 상기 레반에 포집된 단백질을 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체, 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백질 전달용 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료용 조성물, 레반-단백질 나노 복합체의 제조방법 또는 효소 고정화 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 레반 및 상기 레반에 포집된 단백질을 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체, 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백질 전달용 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료용 조성물, 레반-단백질 나노 복합체의 제조방법 또는 효소 고정화 방법에 관한 것이다.
과당(fructose) 중합체로 알려진 레반(levan)은 일부 식물체와 미생물에서 극소량으로 발견되는 천연 바이오폴리머이며 고온에서만 녹는 이눌린과 달리 저온에서도 녹는 수용성 과당중합체이기 때문에 식의약품산업 이외에도 기능성화장품, 농축산 분야, 공업용 재료 등 다양한 산업에서 수요가 확대되고 있는 기능성 물질이다. 레반은 일본에서 식품첨가물로, 한국에서 식품원료로 허가되어 식품 소재로 제과, 식품 등 원료로 사용되고 있다. 빙점을 낮춰주는 효과가 있어 수산물 유통 보존제로 활용되고, 피부보습에 의한 탄력 증강 및 세포증식 효과로 화장품산업에도 사용되며, 설사 방지와 정장작용 기능이 있어 사료첨가제로 활용되고 있다. 더불어 레반의 물리적 특성을 활용한 친환경 소재로서 화장품 산업에서 레반은 피부 표면에 필름을 형성하고 수분 증발을 막는 보습제로 이미 사용되고 있으며 피부 멜라닌 생성 효소의 활성을 억제하여 미백효과가 있는 것으로 알려져 있다.
레반은 레반을 구성하는 과당의 carboxyl group과 hydroxyl group에 의해 양친매성을 가지며 특정조건을 가진 수용액상에서 매우 안정적인 globular confirmation을 갖기 때문에 나노파티클 제조가 가능하므로 본 발명에서는 레반의 이러한 특성을 이용하여 산업적으로 유용한 다양한 단백질과 나노복합체를 제조하고 이의 응용기술을 개발한 것이다.
인체 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 인간의 체내에 존재하는 53개의 아미노산으로 구성된 표피 성장인자로서, 노년의 피부에 EGF를 공급하면 피부표면의 수용체와 결합하여 세포 내부로 신호전달되고 섬유아세포가 활성화되어서 콜라겐과 엘라스틴의 생성이 증가됨에 따라 피부가 탄력이 생기고 재생효과가 나타난다. EGF는 대부분 생물공학 기술로 재조합 생산되며 화상 등의 피부 재생 분야와 같은 의약품 분야에 사용되어 왔고, 현재 인체 성장인자를 포함한 화장품이 시중에 수십 종 판매되고 있으나 제품에 따라서 EGF 함유 농도를 명확히 표현하지 않고 있으며 실제 농도가 수십에서 수 백배 차이가 나기 때문에 실제 피부재생 효과를 확인하기 어려운 문제가 있다. 또한 EGF의 피부투과율은 0.03%에 불과하여 실제 활성을 나타내기 위해서는 첨가량을 대폭 높이거나 투과율을 개선할 수 있는 delivery 기술 개발이 필요하다. 따라서 기능성화장품에 EGF 등의 인체 성장 인자의 첨가량을 높이기 위해서는 인체 성장 인자의 생산단가를 낮출 수 있는 바이오신기술이 필요하며 미량의 성분을 사용하더라도 기능성 화장품 성분으로서 효과를 증진시킬 수 있는 새로운 전달(delivery) 기술과의 접목이 필요하다.
현재 성장 인자와 같은 다양한 유효성분을 화장품용으로 사용하기 위해 생체세포막의 구성성분인 인지질(phospholipid)을 주성분으로 지질-이중막 (lipid-bilayer) 구조로서 그 내부에 수용성 물질을 봉입 시킬 수 있는 리포좀(liposome) 기술이 보편적으로 이용되고 있다. 그러나 EGF와 같은 수용성 단백질에 대해서 상대적으로 봉입 효율(loading effciency)이 20~30% 수준으로 매우 낮으며 리포좀의 전체 무게 대비 봉입된 단백질의 양은 지극히 적은 값을 갖는 편이며, 친수성 활성 물질의 누출이 심하고 제조과정 중 환경 오염을 초래하는 등의 기술적 한계가 있다.
또한 동물 사료의 기능 개선을 위하여 사용되는 효소 첨가제 중 대표적인 phytase나 xylanase의 경우 사료 제조 과정, 유통 및 보관과정에서 효소 활성이 저하되는 문제가 발생하고 있어 안정화 기술이 필요하며 동물 소화기관 내에서도 활성의 안정적 유지가 필수적이므로 효소의 내열성 및 내산성을 증진할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
이에 따라, 효모에서 인체 상피세포 성장인자를 대량 생산하는 방법(한국공개특허 제10-2012-0047838호), 레반슈크라제 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 레반 생산방법(한국공개특허 제10-2016-0142191호) 및 레반-산화세륨 나노입자 복합체(한국공개특허 제10-2017-0008636호), 유방암 표적용 레반 나노입자 및 이의 제조방법(한국특허 제10-2014-0067714호), 난용성약물의 용해도 개선을 위해 항진균제 레반 나노복합 조성물 제조방법 (한국특허 제10-2011-0064152호) 기술이 개발되었다. 하지만, 레반-단백질 나노 복합체를 이용한 피부주름개선용, 피부 재생용, 피부 보습용, 피부 미백용 화장료 조성물 또는 사료첨가제용 조성물에 대하여는 개발된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 단백질성 물질을 효율적으로 봉입 시킬 수 있는 새로운 나노구조체 물질로서 바이오폴리머인 레반(levan) 또는 카르복시메틸 레반(carboxymethyl levan)을 이용하여, 레반-단백질 나노 복합체를 제조함으로서 피부재생, 주름개선, 보습 및 미백 기능을 보유한 새로운 기능성 화장품 원료, 산업용 생물촉매 리파제 및 사료첨가제를 제조하여 각각의 기능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 레반 및 상기 레반에 포집된 단백질을 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백질 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 또는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레반과 단백질을 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 균질화하는 단계를 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레반을 담체로 이용하여 효소를 고정화시키는 단계를 포함하는, 효소 고정화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 레반 및 상기 레반에 포집된 단백질을 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 레반-단백질 나노 복합체는 일 예로 EGF와 같은 수용성 단백질의 포집율을 상승시키고, 불안정한 단백질의 안정화를 통하여 장기 보관을 가능하게 할 수 있으므로, 단백질을 포함하는 다양한 조성물의 제조에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 단백질성 물질을 효율적으로 봉입시킬 수 있는 새로운 나노구조체 물질로서 바이오폴리머인 레반(levan) 또는 카르복시메틸 레반(carboxymethyl levan)을 이용하여 레반-단백질 나노 복합체를 제조함으로써, 수용성 단백질의 포집율을 상승시키고, 불안정한 단백질의 안정화를 통하여 장기 보관을 가능하게 도모한다. 또한, 상기 나노 복합체는 피부재생, 주름개선 등에 효과가 있어 기능성 화장품 소재로서 활용이 가능하다는 점에서 그 의의가 크다.
본 발명에서 용어 "레반(levan)"이란, 과당(C6H12O6)의 중합체를 통상적으로 일컫는다. 상기 레반은 또한 레불로산, 폴리프럭토산, 플로프럭토스 및 폴리 에불란으로도 지칭된다. 상기 레반은 과당 고리들 간에 베타-(2->6) 결합을 가진 다당류로서, 일반적으로 미생물 또는 식물체에 의해 만들어지는 천연 바이오폴리머이다. 일반적으로, 식품산업 또는 화장품 산업에서 주로 사용된다.
본 발명의 목적상 상기 레반은 단백질성 물질을 효율적으로 봉입시키는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 바이오폴리머인 레반이 단백질을 봉입하여 레반-단백질 나노 복합체를 제조함으로써 상처치유, 피부재생, 주름개선, 보습 및 미백에 효과를 갖는 조성물에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 레반은 관능기로 수식된 것인 것일 수 있으며, 일 예로 단백질과 결합할 수 있는 반응기를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 레반은 레반 또는 카르복시메틸레반인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 레반으로 분류되는 폴리머라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 목적상 단백질은 치료용, 사료용 및 산업용 단백질인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 용어 "치료용 단백질"은 질병 혹은 질환의 치료를 위한 단백질을 말하며, 구체적으로, 상기 단백질은 유사 인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 형질전환 성장 인자(trans-forming growth factor, TGF), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth fac-tor, PDGF), 뼈유래 성장 인자(bone-derived growth factor, BDF), 케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte Growth Factor, KGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 노긴(Noggin), 티모신(thymosin), BMP7 (Bone morphogenetic protein 7), 성장호르몬 (Human Growth Hormone, hGH), 인슐린 (insulin), GLP-1(glucagon-like peptide 1), 엑서나타이드(exenitide), 인터루킨(interleukins), 인터페론(interferons), scFv, Fab, 치료용 항체, 인간 세럼 알부민(human serum albumin), 및 HAS 융합단백질(HSA fusion proteins)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 용어 "사료용 단백질"은 가축의 증체를 위하여 사료에 첨가되는 단백질을 말하며, 구체적으로, 상기 단백질은 피타제(Phytase), 자일라나제(Xylanase), NSP(non-starch polysaccharides) 분해 효소, 및 항균 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
구체적으로, 상기 용어 "산업용 단백질"은 여러가지 물질 생산공정에서 사용되는 다양한 효소를 말하며, 구체적으로, 상기 단백질은 리파제(lipase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명에서 용어 "레반-단백질 나노 복합체"는 레반으로 분류되는 폴리머 내에 단백질을 포집한 형태의 나노(nano) 크기의 복합체를 말한다. 상기 나노입자의 내부에 단백질이 포집되어 형성된 복합체를 의미한다. 상기 나노입자는 종래의 약물전달체보다도 작은 크기인 10 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 입자로서 내부에 다양한 지용성 약물을 포집할 수 있는데, 상기 약물로서 단백질이 포집할 경우, 상기 단백질은 레반 나노입자의 내부에 단순히 포집된 것일 뿐, 상기 레반 나노입자와 어떠한 화학적 연결을 형성하지 않고, 단순한 복합체를 형성할 수 있다.
구체적으로, 상기 레반-단백질 나노 복합체는 레반 또는 카르복시메틸레반 및 단백질로 구성될 수 있는데, 상기 레반과 단백질의 혼합비는 특별히 제한되지 않으나, 일 예로, 5:1 내지 1:5(중량비)에서 100:1 내지 1:100(중량비)이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 레반-단백질 나노 복합체는 나노입자 부위에 상기 레반 및 단백질 이외에도 단백질의 포집 효율을 향상시키기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질의 포집 효율을 향상시키기 위한 성분은 가교제로서 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)나 글리옥살(glyoxal)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 레반-단백질 나노복합체의 제조는 염석법(salting-out)을 이용하여 수행하여 제작하였다 (도 2). 단백질의 봉입 효율을 확인하기 위하여 형광단백질(GFP)를 이용하여 나노복합체를 제조 후 봉입율을 확인한 결과 95% 이상의 GFP가 나노복합체 내로 봉입됨을 확인할 수 있었고, GFP에 의해 나노복합체가 녹색 빛을 발하는 것을 확인되었다(도 3 및 도 4). 레반-EGF 나노 복합체에 봉입된 EGF의 효율을 확인하기 위하여 EGF 용액, 혼합 용액, 교반 후 용액, 원심분리 후 상등액 각각의 단계에서 샘플을 취하여 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며(도 5), 나노복합체의 EGF 봉입율이 약 80% 이상이며, 레반-EGF 나노복합체 제조 방법과 동일한 방법으로 제조한 카르복시메틸 레반-EGF 나노복합체의 EGF 봉입율은 85%인 것으로 확인하였다(도 6).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백질 전달용 조성물을 제공한다. 상기 용어 "레반-단백질 나노 복합체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "단백질 전달용"은 질병 또는 질환을 치료하는 약물 또는 단백질이 타겟 부위에 위치될 수 있도록 도모하는 용도를 말한다. 상기 '단백질 전달용 조성물'은 '약물 전달용 조성물' 용어와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 단백질 전달용 조성물은 단백질 또는 약물 전달용 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 단백질 또는 약물 전달용의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질 또는 약물 전달용 은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경구패치 등의 경구형 제형, 외용제, 외용패치제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질 또는 약물 전달용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 용어 "레반-단백질 나노 복합체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 피부주름개선용, 피부재생용, 피부보습용 또는 피부미백용인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 피부 미용과 관련된 용도라면 모두 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 레반으로 분류되는 폴리머 내에 피부미용 유효성분을 포함할 수 있으며, 피부미용 유효성분으로 알려져 있는 단백질이라면 어느 것이나 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 화장료 조성물에 피부미용 유효성분은 1종 이상 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 피부 외용제로 적용되는 것으로서, 제형으로는 전신용 또는, 얼굴, 손 또는 발 등을 위한 부분용 크림, 로션, 에센스, 젤, 또는 연고 등을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물의 제조방법은 일반적으로 유화제형에 필요한 유상에 지방알코올을, 글리세릴하이드록시프로필 알킬디모늄클로라이드는 수상 또는 유상에 첨가하여 유화시켜 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제 등의 통상적인 피부 외용제 성분에 포함되는 성분을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 때에는 유연화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오르히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탄액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 레반-EGF 나노복합체의 주름개선효과를 확인한 결과, 대조군에 비하여 콜라겐 생성능이 증가하고, 아쿠아포린3의 발현량이 증가함을 확인하였다. 이는 이는 본 발명의 조성물이 피부주름 개선 및 피부 보습에 효과적인 화장료 조성물로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 또는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "상처 치유"란 피부 세포의 손상으로 인한 상처를 치료하는 것을 의미하며, 상기 상처는 생체가 손상된 것을 모두 아우르는 의미로서, 창상(創傷)이라고도 한다. 상기 치료는 본 발명의 약학 조성물을 상처가 난 개체에 투여하여, 상처가 악화되는 것을 억제 또는 지연시키거나, 상처의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 "개체"는 상처가 나거나, 상처가 날 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라, 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 및 고양이등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "피부 재생"이란 피부 보습 증가, 피부 탄력 증진, 피부 두께 증가, 피부 주름 개선, 피부 자극 완화 및 피부 손상 회복 작용을 모두 통칭하는 것이며, 구체적으로는 물리적인 요인에 의한 피부 손상으로부터 피부를 재생시키는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 피부 섬유아세포(fibroblast cell) 또는 각질형성세포를, 증식 또는 이동시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 EGF 나노복합체의 활성분석을 위하여 섬유아세포인 NIH/3T3 세포계와 HaCaT 세포계를 이용하여 세포증식 및 상처치유효과 실험을 수행한 결과, 모든 실험군에서 시료의 농도가 증가할수록 세포증식도가 증가하는 곡선을 확인할 수 있었다(도 9). 또한, 세포에 상처모사를 진행한 후 레반-EGF 나노복합체(EGF-LNF), 카르복시레반-EGF 나노복합체(EGF-CMLNF)의 처리 전후 효과를 비교한 결과, 모든 시험군에서 대조군(무처리군) 대비 확연하게 상처 간격이 감소하였으며(도 10), 카르복시레반-EGF 나노복합체에서 안정성 증가를 확인할 수 있었다(도 13). 이는 본 발명의 조성물이 상처 치유 또는 피부 재생에 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 본 발명의 조성물은 in vitro에서 피부세포의 증식 및 이동을 촉진하는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 피부 세포는 각질형성세포주 또는 인간 진피 섬유아세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 레반-단백질 나노 복합체의 함량은 약학적 조성물이 상처 치유 또는 피부 재생 효과를 나타내는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량 대비 레반-단백질 나노 복합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 상처 치료라는 목적상 피부 외용제의 형태로 제공될 수 있다. 구체적으로, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 겔제 또는 에어로졸제 등의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 상처 치료에 일반적으로 사용되는 화합물, 예컨대 항생제, 항염증제, 피부치료용 조제, 마취제 및 진통제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이는, 각각의 제형에 따라 약간씩 변화될 수 있으며, 구체적으로는 피부 외용제의 형태로 제공되는 경우에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 상처부위의 감염을 방지하거나 감염으로 인한 상처의 악화를 방지하기 위하여 상처부위에 항생제, 항균제 등의 약제를 공급할 수 있고, 또한 통증의 완화를 위하여 국소 마취제 및 진통제 등을 공급할 수 있으며, 상처 치유시 과도한 염증반응을 방지하기 위하여 항히스타민제와 같은 항염증제를 공급할 수 있다. 다양한 기능성 약제들을 함유시켜 공급함으로써, 사용상의 편리성을 도모하고, 효율적인 상처 치유에 도움이 되는 환경을 조성함으로써 상처치유 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 상처가 유발된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처의 치유 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 상처의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 상처 치유 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 경피를 통해 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 일 예로, 피부주름개선, 피부재생, 피부보습 또는 피부미백의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다. 또한, 레반-단백질 나노 복합체에 포함되는 단백질의 특징에 따라 그 효과가 달라질 수 있다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 레반-단백질 나노 복합체를 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 상기 레반-단백질 나노 복합체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정 보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 피부 주름, 피부 재생, 피부 보습 또는 피부 미백의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 사료용 조성물은 사료의 기능성 강화를 위한 효소라면 모두 포함될 수 있으며, 구체적으로, Phytase, Xylanase, NSP(non-starch polysaccharides) 분해 효소, 및 항균 펩타이드 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 레반-단백질 나노 복합체에 포함되는 단백질의 특징에 따라 그 효과가 달라질 수 있다.
상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조 사료에 해당한다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 레반과 단백질을 반응시키는 단계; 및 상기 반응물을 균질화하는 단계를 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 용어 "레반", "단백질"및 "레반-단백질 나노 복합체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 레반을 담체로 이용하여 효소를 고정화시키는 단계를 포함하는, 효소 고정화 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 효소는 여러가지 물질 생산공정에서 사용되는 다양한 효소인 산업용 단백질일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 리파제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 레반-단백질 나노 복합체는 단백질의 포집율을 상승시키고, 불안정한 단백질의 안정화를 통하여 장기 보관을 가능하게 도모한다. 또한, 상기 나노 복합체는 포함된 단백질에 따라서 기능성 화장품 소재 및 사료첨가제로서 활용이 가능하다.
도 1은 레반과 카르복시메틸 레반 가수분해 산물의 HPLC 분석을 통한 치환도 분석에 대한 결과를 나타낸다. L은 레반, CML은 카르복시메틸 레반에 대한 결과 분석을 보여주고 있으며, Mono-S는 1가 치환과당, Di-S는 2가 치환과당, DS는 치환도 (degree of substitution)를 의미한다.
도 2는 레반-단백질 나노복합체의 제조 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 레반-단백질 나노복합체의 GFP 봉입율 확인한 결과를 나타내며, 제조된 레반-단백질 나노복합체를 나타낸다.
도 4는 나노복합체 내 봉입된 GFP의 형광도 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 레반-단백질 나노복합체의 EGF 봉입율 확인한 결과를 나타낸다. M은 단백질 마커를 나타내며, 1번은 EGF-용액, 2번은 혼합용액, 3번은 교반 후 용액, 4번은 원심분리 후 상등액에 대한 결과를 나타낸다.
도 6는 카르복시메틸 레반을 이용한 EGF 나노복합체 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. M는 단백질 마커를 나타내며, 1번은 EGF-용액, 2번은 원심분리 후 상등액에 대한 결과를 나타낸다.
도 7은 주사전자현미경을 이용한 나노복합체의 입도분석한 결과를 나타낸다. 1번은 레반입자(x10,000), 2번은 레반-GFP 나노 복합체 입자(x10,000), 3번은 레반-GFP 나노 복합체 입자(x50,000), 4번은 카르복시메틸 레반-GFP 나노 복합체 입자(x50,000)를 나타낸다.
도 8은 레반-EGF 나노 복합체로부터 EGF의 제어방출 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 EGF 및 EGF 나노 복합체 종류별 3T3 세포증식 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 레반-EGF 나노복합체의 상처치유효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 레반-EGF 나노복합체의 콜라겐생성능을 확인한 그래프이다.
도 12은 레반-EGF 나노복합체의 아쿠아포린 3 발현량을 확인한 그래프이다.
도 13은 레반-EGF 나노복합체의 안정성을 확인한 그래프이다.
도 14는 레반-Phytase 나노복합체의 Phytase 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M는 단백질 마커를 나타낸다.
도 15는 레반-Xylanase 나노복합체의 Xylanase 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질용액, NF는 나노복합체 제조 후 상등액, 여기에서 수치는 단백질과 레반의 질량비를 나타낸다.
도 16은 가교제를 첨가한 조건에서 레반-Phytase 나노복합체의 제조 및 그 포집율을 확인한 결과이다. S는 단백질 용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 17은 레반-Phytase 나노복합체의 고온안정성을 확인한 그래프이다.
도 18은 레반-Phytase 나노복합체의 펩신저항성을 확인한 그래프이다.
도 19은 레반-TLL 나노복합체의 TLL 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질 용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 2는 레반-단백질 나노복합체의 제조 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 레반-단백질 나노복합체의 GFP 봉입율 확인한 결과를 나타내며, 제조된 레반-단백질 나노복합체를 나타낸다.
도 4는 나노복합체 내 봉입된 GFP의 형광도 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 레반-단백질 나노복합체의 EGF 봉입율 확인한 결과를 나타낸다. M은 단백질 마커를 나타내며, 1번은 EGF-용액, 2번은 혼합용액, 3번은 교반 후 용액, 4번은 원심분리 후 상등액에 대한 결과를 나타낸다.
도 6는 카르복시메틸 레반을 이용한 EGF 나노복합체 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. M는 단백질 마커를 나타내며, 1번은 EGF-용액, 2번은 원심분리 후 상등액에 대한 결과를 나타낸다.
도 7은 주사전자현미경을 이용한 나노복합체의 입도분석한 결과를 나타낸다. 1번은 레반입자(x10,000), 2번은 레반-GFP 나노 복합체 입자(x10,000), 3번은 레반-GFP 나노 복합체 입자(x50,000), 4번은 카르복시메틸 레반-GFP 나노 복합체 입자(x50,000)를 나타낸다.
도 8은 레반-EGF 나노 복합체로부터 EGF의 제어방출 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 EGF 및 EGF 나노 복합체 종류별 3T3 세포증식 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 레반-EGF 나노복합체의 상처치유효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 레반-EGF 나노복합체의 콜라겐생성능을 확인한 그래프이다.
도 12은 레반-EGF 나노복합체의 아쿠아포린 3 발현량을 확인한 그래프이다.
도 13은 레반-EGF 나노복합체의 안정성을 확인한 그래프이다.
도 14는 레반-Phytase 나노복합체의 Phytase 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M는 단백질 마커를 나타낸다.
도 15는 레반-Xylanase 나노복합체의 Xylanase 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질용액, NF는 나노복합체 제조 후 상등액, 여기에서 수치는 단백질과 레반의 질량비를 나타낸다.
도 16은 가교제를 첨가한 조건에서 레반-Phytase 나노복합체의 제조 및 그 포집율을 확인한 결과이다. S는 단백질 용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 17은 레반-Phytase 나노복합체의 고온안정성을 확인한 그래프이다.
도 18은 레반-Phytase 나노복합체의 펩신저항성을 확인한 그래프이다.
도 19은 레반-TLL 나노복합체의 TLL 봉입율을 확인한 결과를 나타낸다. S는 단백질 용액, N은 나노복합체 제조 후 상등액, M은 단백질 마커를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 레반-단백질 나노복합체의 제조 확인
실시예 1-1. 카르복시메틸 레반의 제조
카르복시메틸화(carboxymethylaion)는 다당체의 1차/2차 알코올 작용기를 에테르화시켜 카르복시메틸기로 치환하는 반응이다. 레반의 특성을 개질하고 다양한 용도 개발을 위해 카르복시메틸 레반을 제조하였다. 반응은 클로로아세트산과 수산화나트륨을 1:2 몰농도 준비한 반응 용액에 레반을 6%의 농도로 추가하여 50℃에서 5시간 동안 교반과 함께 반응하였다. 5시간 반응 후 반응온도를 상온으로 낮춰준 후 염산용액을 이용하여 pH 7.0으로 중화시켰다. 중화된 반응액으로부터 카르복시메틸 레반을 회수하기 위하여, 반응액 부피와 동일한 부피의 에탄올 용액에 반응액을 천천히 첨가하여 침전시켰다. 침전된 카르복시메틸 레반은 동결건조 후 분쇄하여 치환도 분석 및 나노복합체의 제조에 사용하였다.
카르복시메틸 레반의 치환도 분석을 위해서 1% 레반용액과 카르복시메틸 레반용액에 황산을 4% 농도로 추가한 후 121℃에서 15분 동안 열처리를 통해 가수분해하였다. 가수분해 후 수산화나트륨을 이용하여 용액의 pH를 5로 맞춰준 후 HPLC 분석을 통해 단당류의 치환도 분석을 실시하였다.
실험결과 레반 가수분해 산물에서는 과당과 소량의 포도당만 검출된 반면, 카르복시메틸 레반은 과당과 1가 치환과당 2가 치환과당이 검출되었고, 이는 하나의 과당단위 내 평균 1.31개의 알코올기가 카르복시메틸기로 치환된 것으로 환산되었다(도 1).
실시예 1-2. 레반-GFP 나노복합체의 제조
녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)은 238개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 녹색형광을 방출하는 특징으로 인해 생물학적 마커로 널리 응용되고 있다. 레반-단백질 나노복합체의 단백질 봉입 효과를 시각적으로 검증하기 위하여, GFP를 나노복합체 내로 봉입시킨 후 형광도를 측정하였다. 이를 위해 증류수를 이용하여 5 g/L의 농도로 레반 및 카르복시메틸 레반용액을 제조한 후 아세트산을 이용하여 pH를 3.0으로 적정하였다. GFP 용액은 20% 황산나트륨용액에 1 g/L의 농도로 제조하였다.
레반-GFP 나노복합체의 제조는 염석법(salting-out)을 이용하여 수행하였다(도 2). 레반용액은 증류수를 이용하여 5 g/L의 농도로 제조한 후 아세트산을 이용하여 pH를 3.0으로 적정하였다. GFP 용액은 20% 황산나트륨용액에 1 g/L의 농도로 제조하였다.
레반-GFP 나노복합체는 상기 준비된 레반 용액 10 mL을 교반하면서 이에 GFP 용액 10 mL을 주사기를 이용하여 0.5 mL/min의 속도로 한 방울씩 첨가하였다. GFP 용액 첨가 후 교반 속도를 500 rpm 이상으로 올려주어 30분 동안 염석 반응을 유도하였다. 염석 반응 후 반응액을 고속유화기를 사용하여 균질화시킨 후 13,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 레반-GFP 나노복합체을 회수하여 추후 실험에 사용하였다.
두 종의 나노복합체의 제조 후 봉입율을 확인한 결과 95% 이상의 GFP가 나노복합체 내로 봉입됨을 확인할 수 있었고, GFP에 의해 나노복합체가 녹색 빛을 발하는 것을 육안으로 확인할 수 있었다(도 3).
제조된 GFP 나노복합체의 형광도를 관찰하기 위하여 0.5% GFP 나노복합체 용액을 PBS 버퍼를 이용하여 제조하였다.
부유상태의 GFP 나노복합체 용액과 이를 원심분리하여 GFP 나노복합체을 침전시킨 시료에 자외선을 조사한 결과 녹색형광이 대부분 나노복합체와 함께 침전된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 나노복합체에 GFP가 성공적으로 봉입되어 있음을 검증할 수 있었다(도 4).
실시예 2. 화장료 조성물 및 약학 조성물용 나노복합체 제조
실시예 2-1. 레반-EGF 나노복합체의 제조
레반-EGF 나노복합체의 제조를 위해 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 분비생산된 EGF (한국특허 10-1291241)와 효모에서 분비생산된 레반슈크라제의 효소반응을 통해 설탕으로부터 제조된 레반(한국특허 10-1826927)을 이용하여 EGF 용액과 레반 용액을 각각 준비하였다. 레반 용액은 증류수를 이용하여 5 g/L의 농도로 제조한 후 아세트산을 이용하여 pH를 3.0으로 적정하였다. EGF 용액은 20% 황산나트륨용액에 1 g/L의 농도로 제조하였다.
레반-EGF 나노복합체는 상기 준비된 레반용액 10 mL을 교반하면서 이에 EGF 용액 10 mL을 주사기를 이용하여 0.5 mL/min의 속도로 한 방울씩 첨가하였다. EGF 용액의 첨가 후 교반속도를 500 rpm 이상으로 올려주어 30분 동안 염석반응을 유도하였다. 염석반응 후 반응액을 고속유화기를 사용하여 균질화시킨 후 13,000 rpm에서 10분동안 원심분리를 통해 레반-EGF 나노복합체을 회수하여 추후 실험에 사용하였다.
레반-EGF 나노복합체에 봉입된 EGF의 효율을 확인하기 위하여 EGF 용액, 혼합용액, 교반 후 용액, 원심분리 후 상등액 각각의 단계에서 샘플을 취하여 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
분석결과 최종단계인 원심분리 후 레반-EGF 나노복합체에 봉입된 EGF의 양은 EGF 용액 대비 약 20% 수준을 보여, 나노복합체의 EGF 봉입율은 약 80% 이상으로 확인하였다(도 5, 표 1).
상기 레반-EGF 나노복합체 제조 방법과 동일한 방법으로 제조한 카르복시메틸 레반-EGF 나노복합체의 EGF 봉입율은 85%로 확인하였다(도 6).
| Sampling No. | 1 | 2 | 3 | 4 |
| Protein (mg/mL) | 0.20 ± 0.00 | 0.13 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 | 0.04 ± 0.00 |
| Entrapment yield (%) | 0.0 | 36.2 | 40.6 | 80.6 |
실시예 2-2. 전자현미경을 이용한 EGF 나노복합체의 입도분석
상기 제조된 EGF 나노복합체의 입도를 확인을 위해 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 입도분석을 실시하였다.
분석결과, 기존 5 마이크론 크기의 레반입자를 이용한 EGF 나노복합체의 입도는 300에서 800 나노미터로 확인되었다(도 7).
실시예 2-3. 나노복합체의 단백질 제어방출 확인
상기 내용과 같이, EGF 나노복합체과 같은 레반 나노입자는 그 구조적 특성에 의해 봉입된 분자가 물리적으로 매우 안정하며 제어방출이 가능하므로 다양한 단백질성 약물전달 시스템으로 응용이 가능하다.
상기 개발한 EGF 나노복합체의 제어방출 효과를 확인하기 위하여 제조된 EGF 나노복합체에 1X PBS 버퍼를 첨가한 후 시간 경과에 따라 EGF 나노복합체으로부터 방출되는 EGF의 양을 분석하였다. 실험은 5 mg의 EGF 나노복합체을 1 mL의 1X PBS 버퍼에 녹인 후 물리적 충격을 준 실험군과 주지 않은 실험군으로 나누어 37℃에 안치하여 수행하였으며 1 시간 간격으로 샘플을 취하여 상등액에 방출된 EGF의 양을 Bradford법으로 확인하였다.
실험결과 물리적 충격을 통해 EGF 나노복합체는 봉입된 EGF를 방출하지만, 물리적 충격 없이도 5 mg의 EGF 나노복합체로부터 5시간에 걸쳐 시간당 평균 0.13 mg의 봉입하고 있는 EGF를 서서히 자연적으로 방출하는 것으로 확인되었다(도 8).
실시예 2-4. EGF 나노복합체의 활성 분석
상기 제조된 EGF 나노복합체의 활성분석을 위하여 섬유아세포인 NIH/3T3 세포계를 이용하여 세포증식 및 상처치유효과 실험을 수행하였다.
세포증식 실험은 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 환원효소와 특이적으로 반응하는 테트라졸리움을 처리함으로써 세포의 증식도를 판별하는 MTT assay로 수행하였다. 이를 위해 96-well plate에 2Х104/mL개의 세포수를 접종하여 혈청이 함유된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 하루 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지와 함께 준비한 다양한 형태의 EGF 시료를 mL당 0.1 pg에서 100 ng까지 첨가하여 48시간 배양한 후, DOGEN社의 EZ-CYTOX 제품을 이용하여 세포증식도를 비교하였다. 사용된 시료는 레반-EGF 나노복합체 (EGF-LNF), 카르복시레반-EGF 나노복합체(EGF-CMLNF)이고, 양성대조군으로 시그마알드리치社에서 시판중인 EGF(SIGMA-EGF)와 효모로부터 생산된 EGF(KRIBB-EGF)를 사용하였다.
실험결과 모든 실험군에서 시료의 농도가 증가할수록 세포증식도가 증가하는 곡선을 확인할 수 있었다. 각 곡선을 토대로 계산된 중간 유효량(ED50)은 EGF의 경우 양성대조군과 유사한 500 pg/mL로 확인되었고, 이에 결정된 고유활성도는 2.0Х106 IU/mg 임을 확인하였다. 이는 세계보건기구의 EGF 활성기준인 1.4Х106 IU/mg을 상회하는 수치이다(도 9).
상처치유 효과 비교를 위해 3T3 세포를 12-well plate에 4Х104/mL의 농도로 접종한 후 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
48시간 후 플레이트가 세포로 가득 찬 상태에서 멸균된 파이펫 팁을 이용하여 plate에 상처모사를 진행한 후 레반-EGF 나노복합체 (EGF-LNF), 카르복시레반-EGF 나노복합체 (EGF-CMLNF)의 처리 전후 효과를 비교하였다. 양성대조군으로 시그마알드리치社에서 시판중인 EGF(SIGMA-EGF)를 사용하였고 음성대조군으로는 시료를 녹인 완충액만을 사용한 무처리군(untreated)을 사용하였다. 처리 전(T0)과 시료를 처리후 24시간(T24) 동안 배양하여 상처 간격의 감소 정도를 확인하였다.
실험결과, 모든 시험군에서 무처리군 대비 확연하게 상처 간격이 감소되었다 (도 10). 따라서 레반-EGF 및 카르복시메틸레반-EGF 나노복합체로 포집되어도 EGF 활성에는 영향이 없음을 확인할 수 있었다.
레반-EGF 나노복합체의 복합 기능성 분석을 ㈜엘리드에 의뢰하였다. 분석 항목은 EGF에 의한 주름개선효과를 확인하는 콜라겐 생성능과 레반에 의한 보습효과를 확인하는 아쿠아포린 3(aquaporin 3) 발현율이다.
콜라겐 생성능의 경우 인체 유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast cell line)에 상기 제조된 나노복합체를 0.1, 1, 10, 100 ppm으로 처리한 뒤 24시간동안 배양하여 생성되는 콜라겐의 양을 Procollagen Type I C-Peptide PIP EIA kit로 정량분석하여 이를 무처리군과 비교하였다.
실험결과, 레반-EGF 나노복합체의 콜라겐 생성능은 모든 처리농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 무처리군 대비 0.1 ppm 농도에서 4.19%, 1 ppm 농도에서 4.55%, 10 ppm 농도에서 6.90%, 100 ppm 농도에서 9.10%의 콜라겐 생성능을 각각 나타내었다(도 11).
아쿠아포린 3 발현율의 경우 인체 유래 각질 세포 (HaCaT cell line)에 제조된 나노복합체를 0.1, 1, 10, 100 ppm으로 처리한 뒤 24시간동안 배양하여 세포에서 RNA를 추출하고, cDNA를 생성한 뒤 RT-qPCR을 통해 유전자 발현량을 분석하였다.
실험결과, 레반-EGF 나노복합체 처리군에서는 모든 처리농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 무처리군 대비 0.1 ppm 농도에서 1.06, 1 ppm 농도에서 1.17, 10 ppm 농도에서 1.29, 100 ppm 농도에서 1.37의 아쿠아포린3 발현량을 각각 나타내었다(도 12).
자유상태(free-enzyme)의 EGF와 본 발명에서 제조한 카르복시레반-EGF 나노복합체 (EGF-CMLNF)의 안정성을 비교하는 실험을 수행하였다. 자유상태의 EGF 시료는 씨그마알드리치社에서 판매하고 있는 EGF (E9644)를 구매하여 실험에 사용하였다. 실험은 동일한 EGF 농도의 시료를 25 °C에서 8주간 안치하며 1주 간격으로 샘플링하여 각 시료의 세포증식효과를 상기 방법대로 수행하였다.
실험결과, 도 13과 같이 자유상태의 EGF는 안치와 동시에 활성이 급감하는 양상의 그래프를 보인 반면, 카르복시레반-EGF 나노복합체의 경우는 4주간 세포증식효과가 유지되다가 서서히 감소하는 양상의 그래프를 보임으로써 EGF의 안정성이 크게 향상된 조성물임을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 사료첨가제용 나노복합체의 제조
실시예 3-1. 레반-Phytase 나노복합체의 제조
레반-Phytase 나노복합체의 제조는 상기 실시예와 마찬가지로 염석법을 이용하여 수행하였다. 이를 위해 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 분비생산된 예르시니아 와우테르시(Yersinia wautersii) 유래의 Phytase (YwPhy)를 1 g/L의 농도로 20% 황산나트륨용액에 준비한 뒤, 500 rpm으로 교반중인 5 g/L 레반용액(pH 3.0)에 한 방울씩 첨가하여 염석반응을 유도하였다. 염석반응 후 반응액을 고속유화기를 사용하여 균질화시킨 후 13,000 rpm에서 10분동안 원심분리를 통해 레반-EGF 나노복합체을 회수하여 추후 실험에 사용하였다.
레반-Phytase 나노복합체에 봉입된 Phytase의 효율을 확인하기 위하여 제조 전/후의 상등액을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
분석결과 최종단계인 원심분리 후 레반-Phytase 나노복합체에 봉입된 Phytase 의 양은 제조 전 용액 대비 약 68% 수준을 보여, 나노복합체의 Phytase 봉입율은 약 32%로 확인하였다(도 14).
실시예 3-2. 레반-Xylanase 나노복합체의 제조
레반-Xylanase 나노복합체의 제조는 상기 실시예와 마찬가지로 염석법을 이용하여 수행하였다. 이를 위해 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 분비생산된 네오칼리마스티그균목(Uncultured Neocallimastigales) 유래의 Xylanase (XynR8)를 1 g/L의 농도로 20% 황산나트륨용액에 준비하였다. 상기 실시예에서 레반나노복합체에 의한 Phytase의 봉입율은 32% 수준이었기 때문에, XynR8의 경우 포집율 증대효과를 확인하고자 레반용액을 10, 20, 30, 40 g/L로 제조한 뒤 각각 나노복합체 제조에 사용하였다. 제조방법은 상기 실시예와 동일하게 교반중인 레반용액(pH 3.0)에 단백질용액을 한 방울씩 첨가하여 염석반응을 유도하였다. 염석반응 후 반응액을 고속유화기를 사용하여 균질화시킨 후 13,000 rpm에서 10분동안 원심분리를 통해 레반-EGF 나노복합체을 회수하여 추후 실험에 사용하였다.
레반-Xylanase 나노복합체에 봉입된 Xylanase의 효율을 확인하기 위하여 제조 전/후의 상등액을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
분석결과 최종단계인 원심분리 후 레반-Xylanase 나노복합체에 봉입된 Xylanase는 사용된 단백질:레반 질량비 1:10에서 60%, 1:20에서 67%, 1:30에서 64%, 1:40에서 70%로 확인되어 단백질 대비 레반의 사용량이 많을수록 봉입율이 서서히 증가하는 양상을 보였다(도 15).
실시예 3-3. 사료첨가제용 레반 나노복합체의 포집율 향상
상기 방법으로 제조한 사료첨가제용 단백질인 phytase의 레반 나노복합체 내 포집율은 각각 32%로, 이는 제조된 다른 단백질인 xylanase(70%), EGF (85%)와 비교하여 포집율이 크게 저하된 결과를 보였다. 레반-단백질 나노복합체의 포집율은 목적단백질 물리화학적 특성(분자량, 등전점, 고염 및 고산도용액에서의 안정성 등)에 영향을 받을 수 있으나, 다양한 단백질 각각의 고유한 특성에 일반적으로 적용할 수 있는 포집율 향상에 대한 연구는 아직 진행된 바 없다. 따라서 본 실시예에서는 레반과 포집단백질의 물리화학적 특성을 변화시키지 않고 포집율을 향상시키기 위하여 글루타르알데하이드를 적용한 레반-단백질의 가교형성을 유도하였다.
이를 위해 1%의 글루타르알데하이드가 첨가된 레반용액을 준비한 후, 교반중인 레반용액에 단백질용액을 한 방울씩 첨가하여 염석반응을 유도하였다. 이 후 상기 실시예와 동일한 방법으로 균질화 및 원심분리를 통해 회수한 시료를 이용하여 SDS-PAGE로 분석한 결과, 가교제를 첨가한 레반-phytase 나노복합체의 포집율은 83.7%로 기존 32%대비 포집율이 크게 향상됨을 확인하였다(도 16). 제조된 레반-Phytase 나노복합체는 회수하여 동결건조한 후, 분말화된 상태로 추후 실험에 사용하였다.
실시예 3-4. 레반-Phytase 나노복합체의 안정성 효과 검증
레반-Phytase 나노복합체는 사료첨가제의 목적을 가지기 때문에, 사료제조공정인 펠릿팅(pelleting)의 고온조건에 대한 저항성(내열성)과, 강산성 위소화효소인 펩신에 대해 저항성을 가져야 한다.
먼저, 내열성을 측정하기 위하여 동결건조된 레반-Phytase 나노복합체를 50mM sodium acetate (pH5.5) 버퍼에 용해시켰다. 내열성 측정은 50℃에서 23시간 동안 열처리 후, 잔류 phytase 활성을 측정하여 분석하였다. Phytase 활성 측정은 ammonium molybdate blue assay 방법으로 수행되었다. 이를 위하여 2mM phytic acid sodium salt hydrate(Sigma-Aldrich) 기질 45ul와 효소 5ul 혼합하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 반응 후 5% TCA용액 50ul를 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 2% ammonium molybdate와 2.5% ferrous sulfate 용액을 혼합한 reagent 75ul를 이용하여 발색시킨 후 400nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성단위(unit)는 1분당 유리된 1 umole의 무기인산을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 대조군으로는 정제된 YwPhy를 사용하였다.
정제된 Ywphy 효소의 내열성을 확인한 결과 열처리 시간이 지날수록 활성이 감소하여 7시간 열처리 후 잔존 활성은 50%로 감소했으며, 23시간 반응후에는 31.6%이상 활성이 남아있었다. 이에 반해 제조된 레반-Phytase 나노복합체의 경우 23시간 반응하였어도 93%이상 활성이 유지됨을 확인하였다(도 17).
다음으로, 단백질 분해효소에 대한 레반-Phytase 나노복합체의 효과를 확인해 보기 위하여 Pepsin을 처리하여 잔존 phytase 활성을 비교해 보았다. 이를 위해 glycine-HCl (pH2.0) 버퍼에 2mg 효소를 첨가한 후, pepsin을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군으로 나누어 37℃에서 20시간 동안 반응 후 잔존 phytase 활성을 확인하였다. 대조군으로는 정제된 YwPhy를 사용하였다.
분석결과, 도 18과 같이 YwPhy는 내산성이 있는 효소이기 때문에 pH2.0 에서도 높은 활성을 유지하여 20시간 반응 후 87%의 활성을 유지함을 확인하였다. 반면, 각각의 효소에 20 ng pepsin을 처리한 경우 레반-Phytase 나노복합체와 Ywphy 모두 시간이 지날수록 활성은 감소했으나, 감소폭에 차이를 보여 20시간 반응 후 잔존 활성이 정제 효소는 7.6%인 것에 비해 레반-Phytase 나노복합체는 29.8%로 확인되었다. 따라서 레반-Phytase 나노복합체의 경우, 자유상태(free-enzyme) Phytase에 비해 고온, 고산도 조건에서 20시간이상 안치된 후에도 내열성은 3배, pepsin에 의한 저항성은 약 4배 증가된 것으로 판단된다(도 18).
실시예 4. 레반을 이용한 산업효소 고정화
실시예 4-1. 레반-리파제 나노복합체의 제조
레반-리파제 나노복합체의 제조는 상기 실시예와 마찬가지로 염석법을 이용하여 수행하였다. 이를 위해 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 분비생산된 써모마이세스 라누지노수스 유래의 리파제 TLL (한국특허출원 제10-2018-0088644호)를 1 g/L의 농도로 20% 황산나트륨용액에 준비한 뒤, 500 rpm으로 교반중인 5 g/L 레반용액(pH 3.0)에 한 방울씩 첨가하여 염석반응을 유도하였다. 염석반응 후 반응액을 고속유화기를 사용하여 균질화시킨 후 13,000 rpm에서 10분동안 원심분리를 통해 레반-TLL 복합체을 회수하여 추후 실험에 사용하였다.
레반 나노복합체에 봉입된 TLL의 효율을 확인하기 위하여 제조 전/후의 상등액을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
분석결과 최종단계인 원심분리 후 레반나노복합체에 봉입된 TLL의 양은 제조 전 용액 대비 약 95% 수준으로 매우 효율적인 봉입이 확인되었다(도 19).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (17)
- 레반 및 상기 레반에 포집된 단백질을 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체로서, 상기 단백질은 표피 성장 인자(EGF, Epidermal growth factor), 피타제(phytase), 자일라나제(xylanase) 및 리파제(lipase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 레반-단백질 나노 복합체.
- 제1항에 있어서, 상기 레반은 관능기로 수식된 것인 것인, 레반-단백질 나노 복합체.
- 제2항에 있어서, 상기 레반은 카르복시메틸레반인 것인, 레반-단백질 나노 복합체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백질 전달용 조성물.
- 제1항의 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름개선용, 피부탄력증진용, 피부보습용 또는 피부미백용인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물로서, 유효성분인 단백질이 표피 성장 인자(EGF, Epidermal growth factor)인 것인, 화장료 조성물.
- 제1항의 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 또는 피부 재생용 약학적 조성물로서, 유효성분인 단백질이 표피 성장 인자(EGF, Epidermal growth factor)인 것인, 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 경피를 통해 투여되는 것인, 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
- 제1항의 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제1항의 레반-단백질 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물.
- 레반과 단백질을 반응시키는 단계; 및
상기 반응물을 균질화하는 단계를 포함하는, 레반-단백질 나노 복합체의 제조방법으로서, 상기 단백질은 표피 성장 인자(EGF, Epidermal growth factor), 피타제(phytase), 자일라나제(xylanase) 및 리파제(lipase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 제조방법.
- 레반을 담체로 이용하여 효소를 고정화시키는 단계를 포함하는, 효소 고정화 방법으로서, 상기 효소는 리파제인 것인, 효소 고정화 방법.
- 삭제
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