WO2024029694A1 - 레반-카테콜 복합체, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물 및 나노클러스터 - Google Patents

레반-카테콜 복합체, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물 및 나노클러스터 Download PDF

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WO2024029694A1
WO2024029694A1 PCT/KR2023/006486 KR2023006486W WO2024029694A1 WO 2024029694 A1 WO2024029694 A1 WO 2024029694A1 KR 2023006486 W KR2023006486 W KR 2023006486W WO 2024029694 A1 WO2024029694 A1 WO 2024029694A1
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levan
nanocluster
catechol
nanoclusters
catechol complex
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PCT/KR2023/006486
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황동수
림은혜
아메드 모하메드 오스만아실라
서정현
송영훈
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포항공과대학교 산학협력단
영남대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/08—Polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a levan-catechol complex, a method for producing the same, a tissue adhesive composition containing the same, and a nanocluster.
  • Tissue adhesives are rapidly gaining interest in tissue or wound closure applications due to their many advantages over traditional suturing technologies, including ease of application, strong adhesion, and effective seal against air.
  • tissue adhesive materials such as fibrin and cyanoacrylate have limitations such as high toxicity, weak tissue adhesion, and weak mechanical strength in a humid environment. Therefore, it is important to develop new biocompatible and highly adhesive materials that overcome these limitations.
  • levan is a water-soluble, biodegradable extracellular fructan containing a -(2,6)-linked backbone, sometimes with -(1,2) branches.
  • Levan a high molecular weight microorganism, can be produced commercially by Zymomonas mobilis when grown on sucrose medium.
  • Levan has excellent properties such as biodegradability and low toxicity, and exhibits anti-tumor, anti-irritant and antioxidant activities as well as high cell adhesion and proliferation performance. Additionally, levan plays an important role in metalloproteinase activation, a step involved in the healing of damaged tissues.
  • levan is one of the stickiest polysaccharides, which is due to adhesion promoted by hydrogen bonds between hydroxyl groups and the substrate and an aggregated structure composed almost entirely of flexible five-atom fructose residues, forming a compact spheroid. Therefore, levan is a potential biomedical adhesive candidate.
  • levan has a major problem in that it has a low intrinsic viscosity and can be diluted and washed away in a humid environment. For example, the adhesion of levan to porcine skin decreases with decreasing concentration, so water-resistant modifications are needed to increase adhesion in humid biomedical conditions.
  • Hydrogels are widely used in biomedicine due to their high water content, similar to extracellular matrix (ECM). Additionally, the cross-linked network structure within the hydrogel serves to prevent the hydrogel from dissolving. Therefore, hydrogels are suitable wound closure candidates that promote skin regeneration in human skin wounds by retaining surface moisture.
  • conventional hydrogels have the disadvantage of poor mechanical properties such as weak adhesion and adhesion when bent, twisted, stretched, or compressed. Accordingly, various modifications and strategies to improve the mechanical properties of hydrogels have recently been reported.
  • Marine mussels use a proteinaceous thread-like adhesive (byssi) to attach strongly to a variety of surfaces and protect themselves from being dislodged by waves.
  • Byssi is composed of 25 to 30 different mussel foot proteins (mfp), most of which play an important role in wet adhesion by forming covalent and non-covalent bonds to various inorganic/organic/metallic substrates in aqueous systems. It contains the 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) amino acid residue.
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
  • DOPA-conjugated (or catechol-conjugated) natural polymers including hyaluronic acid and polyethylene glycol, have been reported, but to date, there is no information on the conjugation of levan and catechol or their wound healing applications. am.
  • the inventors of the present invention prepared a levan-catechol complex through conjugation of levan and catechol, hydrogelated or nanoclustered it, and used it for tissue adhesion in a wet environment, wound healing, hemostasis, or drug delivery.
  • the present invention was completed by focusing on its applicability to other purposes.
  • the purpose of the present invention is to prepare a levan-catechol complex through conjugation of levan and catechol, and hydrogel or nanocluster it, so that it can be used for tissue adhesion in a wet environment, wound healing, hemostasis, or drug delivery. This is what I want to apply.
  • Another object of the present invention includes the step of treating a tissue adhesive composition containing a levan-catechol complex according to the present invention, or a tissue adhesive composition containing a nanocluster according to the present invention to an object in need thereof. To provide a tissue adhesion method.
  • the present invention provides a levan-catechol complex containing carboxymethylated levan and dopamine.
  • the carboxymethylated levan may include a repeating unit represented by the following formula (1).
  • the levan-catechol complex may include a repeating unit represented by the following formula (2).
  • the weight ratio of the carboxymethylated levan and dopamine may be 1:0.5 to 0.9.
  • the present invention provides a composition for tissue adhesion containing the levan-catechol complex according to the present invention.
  • composition for tissue adhesion may further include iron chloride, sodium periodate, horseradish peroxidase, hydrogen peroxide, fibrinogen, or a mixture thereof as a crosslinking agent.
  • the tissue adhesive composition may be used for hemostasis, wound healing, or suturing.
  • the present invention includes the steps of (a) carboxymethylating levan to obtain carboxymethylated levan; and (b) conjugating the carboxymethylated levan to dopamine through EDC-NHS coupling.
  • the present invention relates to a levan-catechol complex according to the present invention; and a nanocluster containing a hydrophobic material.
  • the nanocluster includes a core containing the hydrophobic material; and a shell surrounding the core and containing the levan-catechol complex.
  • the average diameter of the nanoclusters may be 1 to 600 nm.
  • the hydrophobic material may include magnetic nanoparticles, metal nanoparticles, drugs, or a combination thereof.
  • the magnetic nanoparticles are one or more selected from iron(II) oxide, iron(III) oxide, cobalt ferrite, zinc ferrite, nickel ferrite, manganese ferrite, iron, cobalt, nickel, manganese, FeAu, FePt, and CoNi;
  • the metal nanoparticles include gold, silica, titania and magnesium.
  • the drugs include hydrophobic drugs, nucleic acids, proteins, polypeptides, carbohydrates, inorganic substances, antibiotics, anticancer agents, antibacterial agents, steroids, anti-inflammatory painkillers, sex hormones, immunosuppressants, antivirals, anesthetics, and antiemetics.
  • the present invention provides a composition for tissue adhesion containing nanoclusters according to the present invention.
  • Nanoclusters included in the composition for tissue adhesion may include iron oxide nanoparticles as the hydrophobic material.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising the nanocluster according to the present invention.
  • the nanocluster included in the drug delivery system is a hydrophobic material and may include a magnetic nanoparticle-drug complex formed by combining magnetic nanoparticles and a drug.
  • the present invention provides a method for producing nanoclusters, including the step of (A) electrospinning a solution for preparing nanoclusters in which the levan-catechol complex according to the present invention and a hydrophobic material are dispersed onto an aqueous solution.
  • the solution for preparing nanoclusters includes a first dispersion solution in which the levan-catechol complex is dispersed in a first solvent; and a second dispersion solution in which the hydrophobic material is dispersed in a second solvent; obtained by mixing;
  • the first solvent and the second solvent are the same or different from each other, and are each independently hexane, toluene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), and dimethyl sulfoxide. It may be one or more types selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide (DMSO) and alcohol-based compounds.
  • the present invention includes the step of treating a tissue adhesive composition containing a levan-catechol complex according to the present invention, or a tissue adhesive composition containing a nanocluster according to the present invention to an individual in need thereof.
  • a tissue adhesion method is provided.
  • a levan-catechol complex is prepared through conjugation of levan and catechol, and hydrogelated or nanoclustered, to be used for tissue adhesion in a wet environment, wound healing, hemostasis, or drug delivery. It can be applied.
  • Figure 1 is (a) a schematic diagram showing the synthesis process of levan-catechol complex (LC), (b) FTIR spectra of levan, carboxymethylated levan (CM-L), and LC, (c) levan ( (top), 1 H NMR spectra of DOPA (middle) and LC (bottom), and (d) UV-VIS spectra of levan and LC.
  • Figure 4 shows the results of evaluating the tissue adhesion of LC hydrogel, (a) a schematic diagram of an in-vitro lap shear experiment, (b) an image of a lap shear experiment using a pig skin tissue surface, and (c) a lap shear-stress experiment.
  • Figure 5 shows the results of cell viability and cell migration analysis of LC hydrogel, (a) cell viability (NIH3T3 cells and HaCaT cells) after treatment with hydrogel extract, (b) optical microscope image of cell movement after treatment with hydrogel extract, and ( c) This is a graph corresponding to the scratch area closure.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • MT Masson's trichrome
  • Figure 9 shows (a) the manufacturing process of levan-catechol-iron oxide nanoclusters (LC-IO) through electrospinning of levan-catechol complex and iron oxide (magnetic nanoparticles) according to the present invention, and (b) the present invention.
  • This is a schematic diagram showing the manufacturing process of levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster (LC-IO-Dox) through electrospinning of levan-catechol complex, iron oxide, and doxorubicin (drug).
  • Figure 10 shows (a) TEM images of levan-catechol-iron oxide nanocluster (LC-IO) and levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster (LC-IO-Dox) according to the present invention, and (b) levan -This is a graph showing the diameter distribution of catechol-iron oxide nanoclusters (LC-IO).
  • Figure 11 shows (a) levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster (LC-IO-Dox) in core-shell form through electrospinning of levan-catechol complex, iron oxide and doxorubicin (drug) according to the present invention.
  • Schematic diagram showing the manufacturing process and active targeting of breast cancer through the GLUT receptor of the manufactured LC-IO-Dox, and (b) levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster in the cell (LC-IO-Dox)
  • Figure 12 shows (a) a graph of the fluorescence emission intensity of Dox (Dox standard curve) according to doxorubicin (Dox) concentration in levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster (LC-IO-Dox), and (a) over time. This is a graph of the fluorescence emission intensity of Dox.
  • Figure 13 is a graph evaluating the antibacterial activity of (a) levan, (b) carboxymethylated levan, (c) levan-catechol complex, and (d) an image of E. coli culture medium according to the treatment material.
  • Figure 14 is a graph evaluating the antibacterial activity of levan-catechol-iron oxide nanoclusters (LC-IO).
  • Figure 17 is a graph showing the cell viability and cell migration analysis results of LC-IO nanoclusters, (a) cell survival rate (L929 cells and HaCaT cells) after LC-IO nanocluster treatment, (b) scratch area closure. and (c) an optical microscope image of cell movement after nanocluster treatment.
  • Figure 18 shows the results of evaluating the wound healing efficacy of LC-IO nanoclusters.
  • (a) A schematic diagram showing a rat skin incision experiment.
  • (b) After treatment with fibrin glue (FG) and LC-IO nanoclusters and the untreated group.
  • (NT) skin incision image, and
  • Figure 19 shows the results of evaluating the wound healing efficacy of LC-IO nanoclusters, (a) images of hematoxylin and eosin (H&E) staining results 3, 7, and 14 days after incision (wound edges are indicated by black arrows); This is a graph showing (b) Masson's trichrome (MT) staining image, (c) wound surface width, and (d) epithelial tongue length.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • Figure 20 is a hematoxylin and eosin (H&E) staining image for the first skin adhesion experiment as the result of evaluating the wound healing efficacy of LC-IO nanoclusters.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • the levan-catechol complex according to the present invention its production method, and its use; And the nanocluster containing the levan-catechol complex, its manufacturing method, and its use are described in detail.
  • a levan-catechol complex comprising carboxymethylated levan and dopamine is provided.
  • levan is a natural material first discovered by Cooper in 1935 and is found in some plants such as onions and garlic, barley, cactus, and grasses, and microorganisms such as Bacillus.
  • levan can be produced by Gram-negative bacteria such as Zymomonas mobilis, Erwinia amylovor a, and Halomonas spice AAD6 .
  • Levan is a type of frutan whose monomer is formed through ⁇ -(2,6) single bonds.
  • levan Unlike inulin, which is a frutan with a structure mainly linked by ⁇ -(2,1), levan
  • ⁇ -(1,6) and ⁇ -(2,6) exist together, and while inulin has a low molecular weight and is insoluble, levan has a relatively high molecular weight and at the same time has the characteristic of very high water solubility.
  • It is a natural substance that has functions such as promoting mineral absorption and promoting the growth of lactic acid bacteria in the intestines, and is being developed for various uses as medicine and food additives.
  • carboxymethylation refers to a reaction in which hydrogen atoms bonded to carbon, nitrogen, oxygen, sulfur atoms, etc. of an organic compound are replaced with a carboxymethyl group (-CH 2 -COOH).
  • carboxymethylated levan may mean levan containing a carboxymethyl group as a substituent by replacing the hydrogen atom contained in levan with a carboxymethyl group.
  • the carboxymethylated levan may include a repeating unit represented by the following formula (1).
  • Endotoxin is LPS released from most Gram-negative bacteria and is a pyrogen that triggers a strong innate immune response.
  • the presence of endotoxin in the blood can lead to low blood pressure, respiratory failure, and reduced oxygen delivery. Accordingly, removal of endotoxins (contamination during microbial production) is necessary for biomedical applications.
  • the hydrogen atom present in the repeating unit of levan is replaced with a carboxymethyl group, as shown in the following formula (1), the endotoxin of levan is significantly reduced.
  • the levan-catechol complex may include a repeating unit represented by the following formula (2).
  • a levan-catechol complex containing a repeating unit of the following formula (2) can be formed through conjugation of carboxymethylated levan of the formula (1) with significantly reduced endotoxin and dopamine, and the levan thus formed -Catechol complex can have biocompatibility properties by significantly reducing toxicity.
  • the weight ratio of the carboxymethylated levan and dopamine may be 1:0.5 to 0.9, 1:0.6 to 0.8, or 1:0.7 to 0.8. Within the above weight ratio range, in the formation of the levan-catechol complex, conjugation of carboxymethylated levan and dopamine may be facilitated, and the resulting levan-catechol complex has improved adhesive ability to skin tissue. The effect exists.
  • a composition for tissue adhesion containing the levan-catechol complex according to the present invention is provided.
  • levan has a low intrinsic viscosity and has the disadvantage of being diluted and washed out in a humid environment.
  • the levan-catechol complex in which carboxymethylated levan and dopamine are conjugated has excellent tissue adhesion even in a humid environment. exists. Accordingly, the levan-catechol complex can be applied as a tissue adhesive composition.
  • the composition may further include iron chloride (FeCl 3 ), sodium periodate (NaIO 4 ), horseradish peroxidase and hydrogen peroxide (HRP/H 2 O 2 , horseradish peroxidase), fibrinogen, or a mixture thereof as a crosslinking agent.
  • FeCl 3 iron chloride
  • NaIO 4 sodium periodate
  • HRP/H 2 O 2 horseradish peroxidase
  • fibrinogen or a mixture thereof
  • a crosslinking agent a plurality of levan-catechol complexes may be coordinated or covalently bonded to each other to form a hydrogel.
  • the complexes coordinate with each other, they may coordinate with metal or metal ions. That is, the composition for tissue adhesion may be in the form of a hydrogel. Referring to Figure 2f, the bonding structure of the hydrogel formed depending on the type of crosslinking agent can be confirmed.
  • the tissue adhesive composition may be used for hemostasis, wound healing, or suturing. Since the levan-catechol complex has excellent hemostatic effects, wound healing promotion effects, and tissue adhesion effects, a tissue adhesive composition containing it can be applied for hemostasis, wound healing, and suturing of skin or tissue.
  • the tissue adhesive composition includes cranial nerve surgery including vascular surgery, orthopedic surgery including bone adhesion, hemostasis in patients with lacerations, femoral artery suturing, cataract incision suturing, cartilage healing, skin bonding, organ/ It can be applied to any one selected from the group consisting of gland incision hemostasis, gastrointestinal tract division, and tendon/ligament healing, but is not limited thereto.
  • the present invention includes the step of treating a tissue adhesive composition containing a levan-catechol complex according to the present invention, or a tissue adhesive composition containing a nanocluster according to the present invention to an individual in need thereof.
  • a tissue adhesion method is provided.
  • the term “individual” refers to the object of hemostasis, and more specifically, may refer to mammals such as humans or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, cows, etc. It is not limited to this.
  • Step (a) may be performed by mixing levan, sodium hydroxide, and chloroacetic acid.
  • the levan and chloroacetic acid may be mixed at a weight ratio of 1:0.7 to 1, 1:0.8 to 1, or 1:0.9 to 1.
  • Levan used as the initial raw material, is obtained through cell disruption of microorganisms using a mechanical or physical method, or cell disruption of microorganisms using a non-mechanical or chemical method ( It may have been obtained through cell disruption.
  • Step (b) may be performed by carbodiimide-promoted conjugation between the carboxyl group introduced into carboxymethylated levan and the amine group of dopamine, specifically, carboxymethylated levan, dopamine, and NHS ( It can be performed through the process of reacting a reaction mixture containing N-hydroxysuccinicimide) and EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide). More specifically, the process of reacting the reaction mixture includes adjusting the reaction mixture to pH 4 to 6 or pH 5 and then rotating the reaction mixture at 400 to 600 rpm for 5 to 30 hours, 5 to 24 hours, or 5 to 12 hours at room temperature under argon.
  • carboxylated levan, dopamine, NHS and EDC may be mixed at a weight ratio of 1:0.4 to 0.7:0.8 to 1:0.5 to 0.9, or 1:0.5 to 0.6:0.9 to 1:0.7 to 0.8.
  • carboxylated levan, dopamine, NHS and EDC may be mixed at a weight ratio of 1:0.4 to 0.7:0.8 to 1:0.5 to 0.9, or 1:0.5 to 0.6:0.9 to 1:0.7 to 0.8.
  • conjugation of carboxymethylated levan and dopamine may be facilitated, and the resulting levan-catechol complex has improved adhesive ability to skin tissue. The effect exists.
  • the levan-catechol complex according to the present invention As a present invention, the levan-catechol complex according to the present invention; And a nanocluster containing a hydrophobic material is provided.
  • nanofibers or nanoparticles using conventional electrospinning techniques, but they have the disadvantage of being easily dissolved and expanded, which reduces stability, and also only functions as a simple carrier.
  • the present invention it is easily dissolved/ruptured even in an aqueous environment through electrospinning of a mixed solution of a levan-catechol complex containing levan, a naturally occurring polysaccharide with amphipathic properties and bioactive substance functions, and a hydrophobic material.
  • We fabricated nanoclusters that not only do not swell or swell, but are also easy to recover, promote tissue adhesion in an aqueous environment, accelerate wound healing, and release therapeutic drugs.
  • the nanocluster includes a core containing the hydrophobic material; and a shell surrounding the core and containing the levan-catechol complex.
  • stable nanoclusters in the core-shell form can be formed through self-assembly through hydrophobic and electrostatic interactions.
  • the nanocluster formed at this time can maintain multifunctionality such as physiological activity and adhesive performance by the shell containing the levan-catechol complex.
  • it contains the levan-catechol complex whose toxicity is significantly reduced due to the reduction of endotoxin. As a result, it has biocompatibility characteristics.
  • the average diameter of the nanoclusters may be 1 to 600 nm, 50 to 300 nm, 100 to 200 nm, or 140 to 150 nm. Within the above average diameter range, the effects of excellent tissue adhesion, wound healing promotion ability, hemostatic efficacy, and drug release ability exist.
  • the hydrophobic material may include magnetic nanoparticles, metal nanoparticles, drugs, or a combination thereof, and the magnetic nanoparticles include iron(II) oxide, iron(III) oxide, cobalt ferrite, zinc ferrite, nickel ferrite, and manganese ferrite.
  • the metal nanoparticle is one or more selected from gold, silica, titanium, and magnesium;
  • the drugs include hydrophobic drugs, nucleic acids, proteins, polypeptides, carbohydrates, inorganic substances, antibiotics, anticancer agents, antibacterial agents, steroids, anti-inflammatory painkillers, sex hormones, immunosuppressants, antivirals, anesthetics, and antiemetics.
  • the drug is not limited to the above-mentioned types, and may include any drug that can be delivered into the human body by a carrier.
  • the drug may be a hydrophobic drug.
  • the hydrophobic drugs are doxorubicin, paclitaxel, methotrexate, 5-fluorouracil, mitomycin-C, styrene maleate neo. Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS), cisplatin, carboplatin, carmustine (BCNU), dacabazine, etoposide, and daunomycin ( It may be one or more types selected from the group consisting of daunomycin, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • the RNA may be siRNA, miRNA, or mRNA, but is not limited thereto.
  • composition for tissue adhesion containing nanoclusters according to the present invention is provided.
  • Nanoclusters included in the composition for tissue adhesion may include iron oxide nanoparticles as the hydrophobic material, and in this case, there is an effect of excellent tissue adhesion, wound healing promotion ability, and hemostatic effect.
  • the composition for tissue adhesion has the characteristic of biocompatibility by containing a levan-catechol complex whose toxicity is significantly reduced due to the reduction of endotoxin.
  • the tissue adhesive composition containing the nanoclusters may be used for hemostasis, wound healing, or suturing. Since the levan-catechol complex contained in the nanocluster has excellent hemostatic effect, wound healing promotion effect, and tissue adhesion effect, the tissue adhesive composition containing it can be used for hemostasis, wound healing, and suturing of skin or tissue. It can be applied.
  • the tissue adhesive composition includes cranial nerve surgery including vascular surgery, orthopedic surgery including bone adhesion, hemostasis in patients with lacerations, femoral artery suturing, cataract incision suturing, cartilage healing, skin bonding, organ/ It can be applied to any one selected from the group consisting of gland incision hemostasis, gastrointestinal tract division, and tendon/ligament healing, but is not limited thereto.
  • a drug delivery system including nanoclusters according to the present invention is provided.
  • the drug carrier has the characteristic of biocompatibility by containing a levan-catechol complex whose toxicity is significantly reduced due to the reduction of endotoxin.
  • the nanocluster included in the drug carrier is a hydrophobic material and may include a magnetic nanoparticle-drug complex formed by combining magnetic nanoparticles and a drug.
  • the drug complex may be an iron oxide-hydrophobic drug complex formed by combining iron oxide nanoparticles and a hydrophobic drug, and in this case, there is an effect of showing excellent drug release efficacy.
  • the electrospinning process of step (A) uses a 20 to 25 gauge or 22 to 24 gauge needle, a voltage of 20 to 25 kV or 22 to 24 kV, a flow rate of 2 to 10 or 4 to 6 ⁇ L/min, and It can be performed by electrospinning into a water bath containing an aqueous solution under magnetic stirring, applying a nozzle distance of 10 to 15 cm or 11 to 13 cm.
  • the aqueous solution contained in the water tank may be distilled water, but is not limited thereto.
  • step (B) the step of collecting nanoclusters generated simultaneously with electrospinning (spraying) using a magnet may be further included.
  • the magnet may be a neodymium magnet.
  • the nanoclusters collected as above can be stored for a long time by redispersing in 10 to 20% or 14 to 15% DMSO.
  • the solution for preparing nanoclusters includes a first dispersion solution in which the levan-catechol complex is dispersed in a first solvent; and a second dispersion solution in which the hydrophobic material is dispersed in a second solvent; obtained by mixing;
  • the first solvent and the second solvent are the same or different from each other, and are each independently hexane, toluene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), and dimethyl sulfoxide. It may be one or more types selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide (DMSO) and alcohol-based compounds.
  • the first solvent may be DMSO
  • the second solvent may be hexane, but are not limited thereto.
  • the size of the hydrophobic material dispersed in the solution for preparing nanoclusters may be 1 to 20 nm, 5 to 15 nm, or 7 to 12 nm. Within the above-mentioned size range, self-assembly is easy during electrospinning of the nanocluster production solution, and stable core-shell type nanoclusters can be produced.
  • the hydrophobic material in step (A) may include a magnetic nanoparticle-drug complex formed by combining magnetic nanoparticles and a drug.
  • the drug complex may be an iron oxide-hydrophobic drug complex formed by combining iron oxide nanoparticles and a hydrophobic drug, and in this case, there is an effect of showing excellent drug release efficacy.
  • the nanocluster finally generated by electrospinning includes a core containing the magnetic nanoparticles; a shell surrounding the core and containing the levan-catechol complex; and a hydrophobic drug dispersed in the core and shell; it may be in a core-shell form (see FIG. 19).
  • the levan-catechol-iron oxide nanocluster (LC-IO) according to the present invention carries doxorubicin inside to form a levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanocluster (LC-IO-Dox). , can be used for active targeting of breast cancer through the GLUT 5 receptor (see Figure 11a).
  • the concentration of doxorubicin in the LC-IO-Dox may be 0.1 to 10 ug/ml, 0.5 to 5 ug/ml, or 0.5 to 1.5 ug/ml, but is not limited thereto.
  • the magnetic nanoparticle-drug complex can be obtained by adding magnetic nanoparticles and a drug to a third solvent and then ultrasonication.
  • the third solvent is the same as or different from the first or second solvent, and is selected from the group consisting of hexane, toluene, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), and dimethyl It may be one or more types selected from the group consisting of sulfoxide (DMSO: dimethyl sulfoxide) and alcohol-based compounds.
  • the third solvent may be hexane, but is not limited thereto.
  • 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) was purchased from APExBIO (Boston, USA), dopamine, N-hydroxysuccinimide (NHS), and iron chloride (III ), lipopolysaccharide from Escherichia coli o55:b5(LPS), and penicillin streptomycin were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • hydrochloric acid, sodium hydroxide, isopropanol, and ethanol were purchased from Samjeon (Seoul, Korea). Additionally, PBS (10x) was purchased from LPS Solutions (Daejeon, Korea) and diluted to a final concentration of 137mM NaCl, 10mM phosphate, and 2.7mM KCl (1xPBS). Additionally, Greenplast Q prefilled syringe kit (fibrin glue kit) was purchased from GC Green Cross (Yongin, Korea), and pig skin was purchased from Why Medical (St. Paul, MN, USA). Additionally, the cell lines used in the experiments of this study were purchased from American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).
  • Fetal bovine serum was purchased from Gibco (Seoul, Korea)
  • L-Glutamine was purchased from Lonza (Walkersville, MD, USA)
  • hyperglycemic Dulbecco's modified eagle medium DMEM
  • Dulbecco's phosphate buffered saline DPBS
  • HyClone Logan, UT, USA
  • DMEM for Raw 264.7 cell line was purchased from Welgene fresh media (Gyeongsan, Korea).
  • Pierce Chromogenic Endotoxin Quantification Kit was purchased from Thermo Scientific (Rockford, IL, USA), Culture-Insert 2 well was purchased from Ibidi (Grafelfing, Germany), and Cell Counting Kit-8 was purchased from MedChemExpress (NJ, USA). Purchased.
  • mouse TNE- ⁇ and mouse IL-6 DuoSet ELISA kits were purchased from R&D Systems (Minnesota, USA), and blood was in accordance with the animal experiment ethics regulations of the Pohang University of Science and Technology Institutional Review Board (IRB number POSTECH-2022-0004). Blood was collected from rabbits according to the guidelines.
  • the levan intrinsic viscosity of zymomonas mobilis was confirmed to be 23.4 mL/g, and the molecular weight was confirmed to be ⁇ 95 kDa using the Mark-Houwink-Sakurada relationship.
  • the levan-catechol complex was synthesized by first preparing carboxymethylated levan (CM-L). Levan (2 g) was dissolved in deionized water (40 mL), and then sodium hydroxide was added at a molar ratio of 2:1 (NaOH:Levan).
  • CM-L carboxymethylated levan
  • Levan was incubated with sodium hydroxide to activate the hydroxyl group of fructan, conjugate it with chloroacetic acid, and remove endotoxin from levan, as described by Govers et al. (Govers, Coen, et al. . Bioactive carbohydrates and dietary fiber 8.1 (2016): 15-25.). Endotoxin levels of levan and carboxymethylated levan were determined using the Pierce Chromogenic endotoxin assay kit according to the manufacturer's instructions.
  • the levan-catechol complex was synthesized by carbodiimide-promoted conjugation between the carboxyl group introduced into the carboxymethylated levan (CM-L) of Preparation Example 1 and the amine group of dopamine.
  • CM-L 0.5 g
  • NHS 287.5 mg
  • EDC 479.5 mg
  • dopamine 383 mg
  • the reaction solution adjusted to pH 5 was mixed and reacted at 500 rpm for more than 12 hours at room temperature under argon.
  • the reaction solution upon completion of the reaction was dialyzed at 4°C with acidic distilled water (pH 5.5) for 2 days and deionized water for 4 hours and then lyophilized to prepare a levan-catechol complex (LC).
  • the success of the reaction was confirmed by FTIR, NMR, and UV-VIS (Optizen POP Nano Bio, Korea).
  • the degree of substitution (DS) of dopamine in the levan-catechol complex (LC) was confirmed by 1 H NMR spectrum and Arnow analysis.
  • LC hydrogels were prepared from a 10 wt% solution of levan-catechol complex (LC) dissolved in phosphate-buffered saline (1 PBS, pH 7.4).
  • NaIO 4 was added to the LC solution at a molar ratio of 2:1 (DOPA:IO 4 ) to covalently bind catechol, and the resulting hydrogel was referred to as “LC-IO 4 - “.
  • FeCl 3 was added to the LC solution at a 3:1 (catechol:Fe 3+ ) molar ratio and the pH was increased to 9 using 1N NaOH until the solution turned dark pink, and the resulting hydrogel was " It was referred to as LC-Fe 3+ ".
  • Example 3 Preparation of levan-catechol-iron oxide nanoclusters (LC-IO) and levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanoclusters (LC-IO-Dox)
  • Levan-catechol-iron oxide nanoclusters were prepared using an electrospinning device.
  • the solution for preparing nanoclusters for electrospinning is a 1 mL hexane solution in which hydrophobic IO (iron oxide; Fe 3 O 4 ) (Fe 10mM) nanoparticles of 7 to 12 nm in size are dispersed, mixed with 0.5 wt% LC (Example 1).
  • levan-catechol complex was added to 10 mL of dissolved DMSO solution and sonicated in a water bath for 1 hour.
  • the prepared nanocluster preparation solution was transferred into a syringe and electrospun into an aluminum bath containing distilled water under magnetic stirring by applying a 23 gauge needle, 23 kV voltage, 5 ⁇ L/min flow rate, and 12 cm nozzle distance.
  • the sprayed nanocluster product was collected using a neodymium magnet and then redispersed in 15% DMSO for long-term storage (see Figure 9a).
  • Figure 10a the morphological characteristics of LC-IO can be confirmed, and through Figure 10b, it can be confirmed that the average diameter of LC-IO is 200 nm or less, specifically 145.8 nm.
  • LC-IO-Dox levan-catechol-iron oxide-doxorubicin nanoclusters
  • IO-Dox iron oxide; Fe 3 O 4
  • the IO-Dox complex formed by adding 200 ⁇ g of Dox to the hexane solution and ultrasonication in a water bath for 1 hour was prepared in the same manner as the LC-IO manufacturing process. That is, 1 mL of hexane solution containing LC-IO (100 ug) dispersed in it was prepared by adding 10 mL of DMSO solution with 0.5 wt% LC dissolved in it and sonicating in a water bath for 1 hour.
  • the prepared nanocluster preparation solution was transferred into a syringe and electrospun into an aluminum bath containing distilled water under magnetic stirring by applying a 23 gauge needle, 23 kV voltage, 5 ⁇ L/min flow rate, and 12 cm nozzle distance.
  • the sprayed nanocluster product was collected using a neodymium magnet and then redispersed in 15% DMSO for long-term storage (see Figure 9b).
  • Figure 10a the morphological characteristics of LC-IO-Dox can be confirmed, and through Figure 10b, the average diameter of LC-IO-Dox is 200 nm or less, Specifically, it can be confirmed that it is 145.8 nm.
  • CM-L carboxymethylated levan
  • the cross-sectional morphology of the LC hydrogel was evaluated by scanning electron microscopy (SEM, JSM-6010LV, Jeol, Japan) at an acceleration voltage of 10 kV.
  • SEM scanning electron microscopy
  • the smoothing behavior of the hydrogel was tested by weighing the freeze-dried LC hydrogel samples and immersing them in 1x PBS (pH 7.4) at 37 °C, with three samples per group. At various times, the swollen samples were removed from the buffer, quickly wiped with filter paper, weighed, and returned to the buffer. This procedure was repeated until the expansion reached equilibrium.
  • the swelling ratio (Q) of each hydrogel was estimated according to the following equation (1):
  • Ww is the sample weight at each time point and Wd is the dry weight of the sample.
  • both covalent LC-IO 4 - and non-covalent LC-Fe 3+ showed rapid expansion during the first 30 minutes of incubation, and expansion equilibrium was observed at 3 hours. A constant weight was observed for the next 5 hours.
  • biological fluid must easily penetrate the hydrogel, and it can be seen that LC-IO 4 - exhibits a significantly higher swelling rate than LC-Fe 3+ .
  • the two hydrogels exhibit relatively uniform porosity. It was confirmed that the pores of LC-IO 4 - are somewhat smaller than those of LC-Fe 3+ , but there are more pores, which can contribute to high swelling capacity.
  • RAW 264.7 mouse macrophage-like cells were cultured in fresh Welgene DMEM supplemented with FBS (10 vol%) and penicillin-streptomycin (1 vol%) at 37°C in a humidified incubator containing 5% CO 2 .
  • Cells were seeded in a 96-well plate at a density of 2.0 ⁇ 10 4 cells (300 ⁇ L) per well and maintained for 4 hours at 5% CO 2 and 37°C. After the cells attached to the plate, the culture medium (100.0 ⁇ L) was replaced with levan or LC solution in DMEM to final concentration (1000, 500, 100, or 10 ⁇ g/mL), and the cells were cultured with medium alone to serve as a negative control. (NT) was used.
  • Levan is produced by zymomonas mobilis, a Gram-negative bacterium that releases lipopolysaccharide (LPS or endotoxin) derived from its cell membrane. Endotoxins activate the immune system by releasing various pro-inflammatory mediators such as tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) and interleukins (IL-1, 6) through monocytes and macrophages.
  • LPS lipopolysaccharide
  • IL-1 interleukins
  • Levan samples were treated under alkaline conditions of 0.62 M NaOH for 24 hours to remove endotoxin, reducing the level from untreated levan (1.57 EU/mg) to CM-L (0.14 EU/mg). The low endotoxin level (0.13 EU/mg) of LC suggests its use as a biomedical adhesive.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the concentration of TNF- ⁇ produced in the 1 mg/mL LC sample (44.4 ⁇ 2.4 pg/mL) was confirmed to be significantly lower than that of the same dose of levan sample (8279.12 ⁇ 134.6 pg/mL) (see Figure 3). .
  • levan sample 8279.12 ⁇ 134.6 pg/mL
  • Hyrogel The adhesion of Hyrogel to biological tissue was evaluated by measuring shear stress using a universal testing machine (Instron 5544, Norwood, MA, US), and the results are shown in Figure 4. Specifically, pig skin (Stellen Medical, USA) was cut into 10 ⁇ 10 mm pieces, placed in 0.1 M PBS buffer (pH 7.4), and left at 37°C for 1 hour. After attaching the left pig skin to an aluminum bar measuring 10 Fibrin glue (Green Cross, Korea) (FG) was applied to each. Then, the aluminum bars with the pig skin attached without the sample applied were overlapped, and then the two aluminum bars were fixed using clips.
  • a universal testing machine Instron 5544, Norwood, MA, US
  • fibrin glue LC-Fe 3+ and LC-IO 4 - exhibit lap shear stresses of 13.46 ⁇ 0.73 kPa, 24.46 ⁇ 1.2 kPa, and 42.17 ⁇ 0.24 kPa, respectively.
  • LC-IO 4 - shows a significantly higher value, more than 3 times that of commercially available fibrin glue (see Figure 4c).
  • the adhesive strength of the two hydrogels was much higher than that of the 10 wt% pure levan solution measured under the same wet conditions, and the iron-coordinated cross-linked hydrogel had twice the adhesive energy of fibrin glue. It was seen that the hydrogel oxidatively covalently cross-linked with periodate was found to be 4 times higher (see Figure 4f).
  • the LC hydrogel exhibits excellent adhesion to porcine skin tissue and thus exhibits excellent hemostatic effect.
  • the adhesion mechanism is the formation of covalent and non-covalent bonds between accessible nucleophilic groups on the tissue surface, such as amino, thiol and hydroxyl, with catechol groups, oxidized o-quinone groups or hydroxyl groups of levan, under wet conditions. It is believed to be caused by .
  • levan needs a functional group for underwater adhesion such as catechol to control the loss of adhesion in water, so the levan-catechol complex hydrogel of the present invention can be used even in an environment where moisture is present. It shows strong adhesion and can be supported.
  • NIH3T3 cells were cultured in DMEM containing 10.0 vol% FBS and 1 vol% penicillin-streptomycin, and HaCaT cells were cultured in 10.0 vol% FBS and 1 vol% penicillin in a humidified incubator containing 5% CO 2 at 37°C.
  • -Cultured in DMEM containing streptomycin and 2mM L-glutamine Each hydrogel was extracted by soaking the hydrogel sample (1 g) in supplemented medium (10 mL) at 37 °C for 24 h. The extract was then diluted with culture medium and the culture medium itself was used as a control.
  • NIH3T3 and HaCaT cells were seeded at a density of 5 ⁇ 10 3 cells/well in 96-well plates (200 ⁇ L) overnight at 37°C and 5% CO 2 , and then 100.0 ⁇ L of medium was replaced with extract dilutions of various concentrations (10, final adjustment to 5, 2.5, or 1.25 mg/mL). After culturing for 24, 48, or 72 hours, the culture medium was replaced with 100 ⁇ L of culture medium mixed with Cell Counting Kit-8 solution (10:1 v/v) and incubated for another 1 hour at 37°C. Cell viability was calculated using Equation 2 below.
  • OD sample , OD control , and OD blank are the samples tested at 450 nm measured using a microplate reader (Synergy HTX, USA), control (untreated cells), and blank (culture medium containing cck-8 solution) groups, respectively. is the absorbance of .
  • both LC-IO 4 - and LC-Fe 3+ were observed to ideally affect NIH3T3 and HaCaT cell growth. Low levels promoted growth and high levels inhibited growth. Both hydrogels were observed to promote HaCaT cell growth, and viability increased with increasing concentration in the range of 1.25-5 mg/mL.
  • LC-IO 4 - extract showed higher cell viability than LC-Fe 3+ extract. As the concentration increased to 10 mg/mL, the cell viability decreased, but it was still higher than the negative control.
  • NIH3T3 is a murine fibroblast cell line
  • HaCaT is an immortalized human keratinocyte cell line.
  • the blood coagulation index (BCI) of the hydrogel was evaluated as follows. First, a 100 mg sample of each hydrogel was placed in a 5 mL tube and preheated in a 37°C water bath. Gently add 100 ⁇ L of rabbit whole blood with citric acid solution (3.8% sodium citrate solution) to the tube to cover the LC hydrogel sample, then add 10 ⁇ L of 0.2 M CaCl 2 solution to coagulate while maintaining the temperature at 37 °C. It started. Deionized water (2 mL) was carefully added to dissolve the unclothed blood at a predetermined time point without disturbing the clot. The optical density of the supernatant was measured at 540 nm using a microplate reader. The absorbance of citrated whole blood (100 ⁇ L) in 2 mL of deionized water was used as a negative control (NC). BCI was calculated using Equation 3 below:
  • platelet adhesion is an important thrombosis indicator because activated platelets secrete polyps, which promotes thrombin generation and fibrin clot formation in bleeding wounds. Platelet adhesion was observed by SEM, and the results are shown in Figure 6e.
  • the microstructure of hydrogels plays a role in platelet adhesion, where hydrogels with a smooth surface microstructure play a role in adhesion to platelets compared to those with a rough surface.
  • Both LC-Fe 3+ and LC-IO 4 ⁇ showed high platelet adhesion, which could be attributed to the rough hydrogel topology ( Figure 6e). Through this, it can be confirmed that the LC hydrogel clearly accelerates clot formation and has excellent hemostatic efficacy.
  • Figure 6f is an image of measuring the weight of a hemorrhaged rat by soaking it in weighed Whatman paper;
  • Figure 6g shows the results of analyzing the amount of blood hemostatic after adding a hemostatic agent, and it can be seen that the LC hydrogel is more effective in hemostasis than the control group.
  • the in vivo wound healing ability of the LC hydrogel was evaluated using the SD rat model. All animal studies were performed in accordance with national regulations and were approved by Postech's Animal Experiment Ethics Committee (IRB number Postech-2022-0004). To evaluate the bioadhesion and wound healing properties of LC hydrogels, Sprague Dawley rats (SD 150-200 g, 7 weeks old male) were anesthetized using isoplan and their backs were shaved. Three 8 mm diameter circular incisions were made on the back of each rat using a biopsy punch. The incision was quickly closed with hydrogel (100 mg) or fibrin adhesive (positive control), and the untreated incision was used as a negative control.
  • the hydrogel was sterilized by washing with 70% ethanol and DPBS solution (3x). Wounds were imaged on days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 17, and 21, and the wound closure rate (%), which is the relative wound closure (%), was calculated using Equation 5 below: did.
  • FIG. 7a which shows an image of a skin incision after treatment with fibrin glue (FG) and hydrogel samples
  • wounds treated with LC hydrogel were compared to those treated with fibrin glue and untreated wounds (untreated group; NT).
  • FG fibrin glue
  • NT untreated wounds
  • LC-IO 4 - showed a higher healing rate than LC-Fe 3+ , which is believed to be due to the high adhesion of LC-IO 4 - .
  • Wounds treated with LC-IO 4 - healed 95.3 ⁇ 1.2% 10 days after incision, whereas untreated wounds (NT) and fibrin glue treated wounds (FG) healed 78 ⁇ 1.53% and 83.55 ⁇ 1.7%, respectively. You can check it.
  • Figure 8b also shows a Masson trichrome staining image in which the LC-IO 4 ⁇ group shows more blue-violet components indicative of cell nuclei.
  • the hydrogel of the present invention has a larger area of ⁇ u200b ⁇ u200bthe wound area compared to the control group. It can be reduced in a short period of time, supporting the excellent wound healing efficacy.
  • Figure 12 shows the fluorescence intensity of Dox at an emission wavelength of 555 nm, which was confirmed for 72 hours using Levanase enzymatic digestion of LC-IO-Dox nanoclusters containing Dox, a therapeutic drug.
  • the reason is believed to be the toxicity of the nanoparticles themselves to microorganisms, their ability to cause osmotic stress and/or reduce water activity and compete with bacterial uptake of essential nutrients. Considering its antibacterial activity, levan is a good candidate for wound healing applications. Antibacterial agents are important in wound healing because they help prevent or reduce bacterial infections. Wounds can provide an entry point for bacteria to proliferate and cause infections that slow or prevent the healing process. Therefore, before reconstruction of blood tissue occurs, it is important to supply the wound area with nutrients necessary to promote cell growth. Nutrients or metabolites that are not well utilized by microorganisms but can be utilized by human cells are desirable.
  • nanoclusters formed in solution can be easily collected by magnetism and resuspended in water or 0.1 PBS for use with minimally invasive procedures. Lab shear stress testing was used to evaluate the nanocluster adhesive ability to join two porcine skin surfaces mimicking human skin tissue (Figure 15a).
  • LC-IO nanoclusters showed high adhesive strength (30.12 ⁇ 1.2 kPa), which was twice higher than commercially available fibrin glue (13.47 ⁇ 1.8 kPa).
  • the adhesive strength increased with increasing concentration of nanoclusters until saturation was reached and then decreased where the limited adhesive surface available on the substrate was almost occupied.
  • the nanoclusters exhibited higher adhesion energy and Young's modulus compared to fibrin glue and showed the same pattern of shear strength.
  • inorganic nanoparticles that can cause hemolysis may limit their use as hemostatic agents (Figure 16a).
  • the present invention evaluated the organic nanoclusters prepared according to the present invention and their effect on red blood cells using hemolysis analysis (FIG. 16). The cut indicates a 5% hemolysis percentage.
  • Hemolysis rate was assessed according to a previously described method (Suneetha, Maduru, Kummara Madhusudana Rao, and Sung Soo Han. ACS omega 4.7 (2019): 12647-12656.). Citrated rabbit whole blood (sodium citrate solution 3.8%) was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes to separate PRP (platelet-rich plasma), and red blood cells (RBCs) were washed four times with DBPS and used for hemolysis analysis.
  • PRP platelet-rich plasma
  • RBCs red blood cells
  • the LC-IO nanoclusters showed a hemolysis percentage of less than 1%, indicating that the LC-IO nanoclusters are suitable for blood and are a promising material for biomedical applications. You can check it.
  • L929 cells were cultured in PRMI 1640 containing 10.0 vol% FBS and 1 vol% penicillin-streptomycin
  • HaCaT cells were cultured in humidified DMEM containing 10.0 vol% FBS, 1 vol% penicillin-streptomycin, and 2 mM L-glutamine. Cultured in an incubator at 37°C with 5% CO 2.
  • L929 and HaCaT cells were seeded at a density of 5 ⁇ 10 3 cells/well in 48-well plates (200 ⁇ L) and incubated overnight at 37°C and 5% CO 2 .
  • the medium was replaced with nanocluster solutions of various concentrations (25, 50, 100, 200, and 400 ⁇ g/mL). After 24, 48, or 72 h of incubation, the culture medium was replaced with 200 ⁇ L of culture medium mixed with Cell Counting Kit-8 solution (10:1 v/v) and incubated at 37°C for an additional 1 h. Cell viability was calculated using Equation 2 described in Experimental Example 5 above. OD values were measured at 450 nm using a microplate reader (Synergy HTX, USA).
  • the cell scratching assay was performed using Culture-Insert 2 wells to form a cell-free gap 500 ⁇ 100 ⁇ m wide before adding the nanocluster solution.
  • Culture-Insert After attaching two wells to a 24-well plate, 70 ⁇ L cell suspension with densities of 3 ⁇ 10 5 and 1.5 ⁇ 10 5 cells/mL for HaCaT cells and L9292 cells, respectively, was added to each well and The cell culture medium filling the area was incubated at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. Culture-Inset 2 well with attached cells was removed, non-attached cells were removed by washing with DPBS, and nanocluster solution was added.
  • LC-IO nanoclusters were observed to ideally affect L929 and HaCaT cell growth.
  • the viability of the treated LC-IO nanoclusters increased with increasing concentration in the range of 25-400 ⁇ m/mL, promoting HaCaT cell growth.
  • LC-IO nanoclusters were applied to L929 and HaCaT cells during the wound-scratch test to evaluate the effect of LC-IO nanoclusters on cell migration.
  • Figure 17c it can be seen that L929 and HaCaT cells treated with LC-IO nanoclusters migrated much faster than the control cells during co-incubation for 24 and 48 hours, as shown in Figure 17b.
  • LC-IO nanoclusters show faster closure (scratch closure) after 24 and 48 hours compared to the control group.
  • the excellent cell proliferation and fast migration data obtained for the LC-IO nanoclusters are very useful for wound healing applications.
  • Rats were euthanized 3, 7 and 14 days after incision, wound size was measured and wounds were harvested for subsequent hematoxylin and eosin (H&E) analysis and histological examination using Masson's trichrome (MT). One wound area was excised and fixed in P-formaldehyde solution (3.7 wt%).
  • FIG 18b which shows an image of a skin incision after treatment with samples of fibrin glue (FG) and LC nanoclusters, wounds treated with LC nanoclusters were divided into fibrin glue-treated and untreated wounds (untreated group; NT). ), you can see that it was closed much faster from the first day.
  • FG fibrin glue
  • NT untreated wounds
  • FIGS 18 b and c show images of skin at multiple time points showing the wound dynamics starting from the first day after incision and expressed as percentage of recovered area relative to the day 0 area.
  • 86% of the wounds in the LC-IO nanocluster treated group had recovered, while only 63% and 6% of the fibrin glue and untreated wounds (NT) had recovered, respectively.
  • the regenerated rat tissue was histologically examined at 3, 7, and 14 days after incision to further investigate the ability of the nanoclusters to accelerate wound healing.
  • H&E staining results are shown in Figure 19a, where numerous new blood vessels were observed in the group treated with LC-IO nanoclusters 3 days after incision, indicating faster angiogenesis, which is important for wound repair.
  • Newly formed blood vessels contribute to the creation of temporary granulation tissue, support the growth of new tissue, and deliver nutrients and oxygen to the expanded tissue needed to support the healing process. Without sufficient angiogenesis, wounds may take longer to heal and may be more susceptible to infection. Additionally, the angiogenesis process helps remove waste and dead cells from the wound site, further aiding the healing process.
  • wounds treated with LC-IO nanoclusters showed faster re-epithelialization, and newly formed epithelial tongue was observed only in the group treated with LC-IO nanoclusters from day 3.
  • Growth, migration, and epithelialization are important steps in the wound healing process because they involve the migration and proliferation of epithelial cells to cover the wound surface and restore the skin's protective barrier function. This process is important for preventing infection, promoting tissue regeneration, and maintaining homeostasis. Restoration of the epidermis through epithelialization is a hallmark of successful wound healing.
  • the wound surface width of the nanocluster group was shorter compared to the fibrin glue and untreated groups.
  • Masson's trichrome stain is a type of histochemical stain used to determine collagen distribution in regenerated tissue. Keratin and muscle fibers are stained red, collagen is stained blue, cytoplasm is stained light red or pink, and cell nuclei are stained dark brown or black. The deeper the blue, the more mature collagen it contains.
  • the MT results at day 14 ( Figure 19b) show that treatment with LC-IO nanoclusters not only brought the wound closer together, but also led to faster remodeling of the granulation tissue into a more mature collagen content structure. A higher collagen index may indicate a greater number of fibroblasts. This is because fibroblasts play a role in producing and organizing collagen fibers.
  • HMEC01 a human vascular cell line, and HDfn, a human skin fibroblast cell, were cultured in PRMI 1640 containing 10.0 vol% FBS and 1 vol% penicillin-streptomycin, and LC-IO was incubated under 5% CO 2 conditions at 37°C in a humidified incubator. Cultured in conditions with nanoclusters.
  • the levan-catechol complex (LC) according to the present invention, the LC hydrogel containing the same, and the LC nanocluster have an adhesion to wet pig skin that is about 3 times better than that of pure levan and commercially available fibrin glue adhesive. was confirmed.
  • the levan-catechol complex showed a low immune response close to the negative control due to the low level of endotoxin after synthesis, and thus, the LC hydrogel and LC nanocluster containing levan-catechol were biocompatible. Confirmed.
  • LC hydrogel and LC nanoclusters showed excellent tissue adhesion, hemostatic properties, and wound healing promotion effects, confirming that they can be applied as potential alternative wound dressings and tissue adhesives for bleeding control and wound treatment.
  • the LC nanocluster according to the present invention can be applied as a drug delivery system by being equipped with a drug release function.

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Abstract

본 발명은 레반-카테콜 복합체, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물 및 나노클러스터에 관한 것으로, 구체적으로, 레반과 카테콜의 접합을 통하여 레반-카테콜 복합체를 제조하고, 이를 하이드로겔화 또는 나노클러스터화 시킴으로써, 습윤 환경에서의 조직 접착 용도, 상처 치유 용도, 지혈 용도 또는 약물 전달 용도에 응용할 수 있다.

Description

레반-카테콜 복합체, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물 및 나노클러스터
본 발명은 레반-카테콜 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조직 접착용 조성물 및 나노클러스터에 관한 기술이다.
조직 접착제는 적용 용이성, 강한 접착력, 공기에 대한 효과적인 밀봉 등 기존 봉합 기술 대비 많은 이점으로 인해 조직 또는 상처 봉합 적용 분야에서 빠르게 관심을 받고 있다. 그러나 피브린, 시아노아크릴레이트와 같은 상업적으로 이용가능한 조직 접착 재료는 높은 독성, 약한 조직 접착력, 습한 환경에서 약한 기계적 강도 등의 한계가 있다. 따라서 이러한 한계를 극복하는 새로운 생체적합성 및 고접착 소재의 개발이 중요한 실정이다.
한편, 레반(levan)은 때때로 -(1,2) 가지가 있는 -(2,6) 연결된 백본을 포함하는 수용성 생분해성 세포외 프럭탄이다. 고분자량 미생물인 레반은 자당 배지에서 자랄 때 zymomonas mobilis에 의해 상업적으로 생산될 수 있다. 레반은 생분해성 및 낮은 독성 등의 뛰어난 특성을 가지고 있으며, 항종양, 항자극 및 항산화 작용 뿐만 아니라 높은 세포 부착 및 증식 성능을 나타낸다. 또한, 레반은 손상된 조직의 치유와 관련된 단계인 메탈로프로테이나제 활성화에서 중요한 역할을 한다. 더욱이, 레반은 가장 끈끈한 다당류 중 하나인데, 이는 수산기와 기질 사이의 수소 결합에 의해 촉진되는 접착력과 거의 전적으로 유연한 5원자 과당 잔기로 구성되어 있어 조밀한 회전 타원체를 형성하는 응집 구조에 의해 기인된다. 따라서 레반은 잠재적인 생의학용 접착제 후보이다. 이러한 이점에도 불구하고, 레반은 고유 점도가 낮고, 습한 환경에서 희석 및 씻겨 나갈 수 있다는 큰 문제점이 존재한다. 예를 들어, 돼지 피부에 대한 레반의 접착력은 농도가 감소함에 따라 감소하므로, 습한 생물 의학 조건에서 접착력을 높이려면 내수성 변형이 필요하다.
하이드로겔은 세포외 기질(ECM)과 유사한 높은 수분 함량으로 인해 생물 의학에서 널리 사용된다. 또한, 하이드로겔 내의 가교 네트워크 구조는 하이드로겔이 용해되는 것을 방지하는 역할을 한다. 따라서, 하이드로겔은 표면 수분을 유지하여 인간 피부 상처에서 피부 재생을 촉진하는 적합한 상처 봉합 후보이다. 그러나 종래 하이드로겔은 구부리거나, 비틀거나, 늘리거나, 압축할 때 약한 접착력과 부착력 등의 열악한 기계적 특성을 가지는 단점이 존재하였다. 이에 따라 하이드로겔의 기계적 특성을 개선하기 위한 다양한 변형 및 전략이 최근 보고되는 추세이다.
바다 홍합은 다양한 표면에 강력하게 부착하고 파도에 의한 이탈로부터 자신을 보호하기 위해 단백질성 실과 같은 접착제(byssi)를 사용한다. Byssi는 25~30종의 다양한 홍합발 단백질(mussel foot protein, mfp)로 구성되어 있으며, 대부분은 수성 시스템에서 다양한 무기/유기/금속 기질에 공유 및 비공유 결합을 형성함으로써, 습식 접착에 중요한 역할을 하는 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA) 아미노산 잔기를 포함한다. 홍합 접착 거동에 영감을 받아 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한 다양한 DOPA-접합(또는 카테콜-접합) 천연 고분자가 보고된 바 있으나, 현재까지 레반 및 카테콜의 접합 또는 이의 상처 치유 용도에 대해서는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 레반과 카테콜의 접합을 통하여 레반-카테콜 복합체를 제조하고, 이를 하이드로겔화 또는 나노클러스터화 시킴으로써, 습윤 환경에서의 조직 접착 용도, 상처 치유 용도, 지혈 용도 또는 약물 전달 용도에 응용할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 레반과 카테콜의 접합을 통하여 레반-카테콜 복합체를 제조하고, 이를 하이드로겔화 또는 나노클러스터화 시킴으로써, 습윤 환경에서의 조직 접착 용도, 상처 치유 용도, 지혈 용도 또는 약물 전달 용도에 응용하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직접착용 조성물, 또는 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 조직 접착 방법을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카르복시메틸화된 레반 및 도파민을 포함하는 레반-카테콜 복합체를 제공한다.
상기 카르복시메틸화된 레반은 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000001
상기 화학식 1에서,
상기 n, m은 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+m=1이다.
상기 레반-카테콜 복합체는 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000002
상기 화학식 2에서,
상기 n, x는 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+x=1이다.
상기 카르복시메틸화된 레반 및 도파민의 중량비는 1 : 0.5 내지 0.9일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물을 제공한다.
상기 조직 접착용 조성물은 염화철, 과요오드산나트륨, 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 가교제로 더 포함할 수 있다.
상기 조직 접착용 조성물은 지혈용, 상처 치유용 또는 봉합용일 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 레반을 카르복시메틸화 하여 카르복시메틸화된 레반을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 카르복시메틸화된 레반을 EDC-NHS 커플링을 통하여 도파민에 접합하는 단계;를 포함하는 레반-카테콜 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체; 및 소수성 물질을 포함하는 나노클러스터를 제공한다.
상기 나노클러스터는 상기 소수성 물질을 함유하는 코어; 및 상기 코어를 감싸고 상기 레반-카테콜 복합체를 함유하는 쉘;을 포함하는 코어-쉘 형태일 수 있다.
상기 나노클러스터의 평균 직경은 1 내지 600 nm일 수 있다.
상기 소수성 물질은 자성 나노입자, 금속 나노입자, 약물 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 자성 나노입자는 산화철(II), 산화철(III), 코발트 페라이트, 징크 페라이트, 니켈 페라이트, 망간 페라이트, 철, 코발트, 니켈, 망간, FeAu, FePt 및 CoNi 중에서 선택되는 1종 이상이고; 상기 금속 나노입자는 금, 실리카, 타이타니아 및 마그네슘 중에서 선택되는 1종 이상이며; 상기 약물은 소수성 약물, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물을 제공한다.
상기 조직 접착용 조성물에 포함되는 나노클러스터는 상기 소수성 물질로서 산화철 나노입자를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
상기 약물 전달체에 포함되는 나노클러스터는 소수성 물질로서, 자성 나노입자 및 약물이 결합되어 형성된 자성 나노입자-약물 복합체를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, (A) 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체, 및 소수성 물질이 분산된 나노클러스터 제조용 용액을 수용액 상에 전기 방사하는 단계;를 포함하는 나노클러스터의 제조방법을 제공한다.
상기 나노클러스터 제조용 용액은, 제1 용매에 상기 레반-카테콜 복합체가 분산된 제1 분산용액; 및 제2 용매에 상기 소수성 물질이 분산된 제2 분산용액;을 혼합하여 수득되는 것이고; 상기 제1 용매 및 제2 용매는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 헥산(hexane), 톨루엔(toluene), 테트라하이드로퓨란(THF: tetrahydrofuran), 다이메틸포름아미드(DMF: dimethylforamide), 다이메틸 설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide) 및 알코올계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직접착용 조성물, 또는 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 조직 접착 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 레반과 카테콜의 접합을 통하여 레반-카테콜 복합체를 제조하고, 이를 하이드로겔화 또는 나노클러스터화 시킴으로써, 습윤 환경에서의 조직 접착 용도, 상처 치유 용도, 지혈 용도 또는 약물 전달 용도에 응용할 수 있다.
한편, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 (a) 레반-카테콜 복합체(LC)의 합성 과정을 나타낸 모식도, (b) 레반, 카르복시메틸화된 레반(CM-L) 및 LC의 FTIR 스펙트럼, (c) D2O에서 레반(상단), DOPA(중간) 및 LC(하단)의 1H NMR 스펙트럼, 및 (d) 레반과 LC의 UV-VIS 스펙트럼이다.
도 2는 LC 하이드로겔의 팽윤 거동 및 형태 분석 결과로서, (a) 37°C(n = 3) 및 1x PBS 조건에서 하이드로겔의 팽윤 거동, (b) 팽윤 전후의 하이드로겔의 사진 이미지, (c) 건조 하이드로겔 LC-Fe3+ 및 LC-IO4 -의 SEM 이미지, (d) 평균 기공 면적, (e) 하이드로겔 다공성(%)을 나타낸 그래프 및 LC 하이드로겔의 가교제에 따른 가교결합 상태를 나타낸 이미지이다.
도 3은 LC 하이드로겔의 면역원성 분석 결과로서, 0.5 μg/mL LPS 및 서로 다른 농도(n = 6)에서 levan와 LC에 노출된 후 Raw 264.7 세포로부터 방출된 (a) TNF-α 및 (b) IL-6 사이토카인 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 LC 하이드로겔의 조직 접착력 평가 결과로서, (a) In-vitro lap shear 실험의 개략도, (b) 돼지 피부 조직 표면을 사용한 lap shear 실험의 이미지, (c) lap shear-stress 실험을 통해 얻은 Strain-stress 곡선 그래프, (d) 최대 lap shear-stress 그래프, (e) 영률 및 (f) 접착 에너지(n = 5) 그래프이다.
도 5는 LC 하이드로겔의 세포 생존율 및 세포 이동 분석 결과로서, (a) 하이드로겔 추출물 처리 후 세포 생존율(NIH3T3 세포 및 HaCaT 세포), (b) 하이드로겔 추출물 처리 후의 세포 이동 광학 현미경 이미지, 및 (c) 스크래치 영역 폐쇄(closure)에 상응하는 그래프이다.
도 6은 LC 하이드로겔의 in vitro 지혈 효능 평가로서, (a) 용혈 및 (c) 응고 상태를 보여주는 이미지와, (b) 용혈률(%)(n=3) 그래프, (d) 다양한 시점에서의 BCI, 및 (e) (i) LC-Fe3+와 (ii) LC-IO4 -에서 혈소판 접착의 SEM 이미지; 및 in vivo 지혈 효능 평가로서, (f) Rat의 간을 활용한 지혈모델로 지혈되는 정도를 확인한 실험 이미지, 및 (g) Rat의 간에 지혈제를 처리했을 때, 피가 용출된양을 비교한 실험 결과 그래프이다.
도 7은 LC 하이드로겔의 상처 치유 효능 평가 결과로서, (a) 피브린글루(FG) 및 하이드로겔 샘플(LC-Fe3+ 및 LC-IO4 -)로 처리한 후와 무처리 군(NT)의 피부 절개 이미지, 및 (b) 무처리 군(NT), 피브린글루(FG), LC-Fe3+ 및 LC-IO4 - 처리한 피부 절개의 상처봉합율 %(n = 5)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 LC 하이드로겔의 상처 치유 효능 평가 결과로서, (a) 절개 후 3, 7 및 14일 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과 이미지(상처 가장자리는 검은색 화살표로 표시됨), (b) Masson's trichrome(MT) 염색 이미지, (c) 상처 표면 폭, (d) 상피 혀 길이 및 (e) 절개 7일 후 상처의 호중구 수(n = 3)를 나타낸 그래프이다.
도 9는 (a) 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체 및 산화철(자성 나노입자)의 전기방사를 통한 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO)의 제조과정, 및 (b) 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체, 산화철 및 독소루비신(약물)의 전기방사를 통한 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 10은 (a) 본 발명에 따른 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO) 및 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)의 TEM 이미지, 및 (b) 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO)의 직경 분포를 나타낸 그래프이다.
도 11은 (a) 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체, 산화철 및 독소루비신(약물)의 전기방사를 통해, 코어-쉘 형태의 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)의 제조 과정을 나타낸 모식도와 제조된 LC-IO-Dox의 GLUT 수용체를 통한 유방암의 능동적 표적화를 나타낸 모식도, 및 (b) 세포내에 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)가 들어갔을때, 몸에 존재하는 효소에 의해서 분해되어 항암제인 Dox가 분출되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 12는 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)에서 (a) 독소루비신(Dox) 농도에 따른 Dox의 형광 방출 강도 그래프(Dox standard 커브), 및 (a) 시간 경과에 따른 Dox의 형광 방출 강도 그래프이다.
도 13은 (a) 레반, (b) 카복시메틸화된 레반, (c) 레반-카테콜 복합체의 항균 활성을 평가한 그래프, 및 (d) 처리 물질에 따른 대장균 배양 배지의 이미지이다.
도 14는 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO)의 항균 활성을 평가한 그래프이다.
도 15는 LC-IO 나노클러스터의 조직 접착력 평가 결과로서, (a) In-vitro lap shear 실험의 개략도, (b) lap shear-stress 실험을 통해 얻은 Strain-stress 곡선 그래프, (c) LC-IO의 농도에 따른 최대 lap shear-stress 그래프, (d) LC-IO의 농도에 따른 영률 및 (f) 접 LC-IO의 농도에 따른 접착 에너지(n = 5) 그래프이다.
도 16은 LC-IO 나노클러스터의 in vitro 지혈 효능 평가 결과로서, (a) 용혈 상태를 보여주 이미지와, 및 (b) 용혈률(%)(n=3)을 나타낸 그래프이다.
도 17은 LC-IO 나노클러스터의 세포 생존율 및 세포 이동 분석 결과로서, (a) LC-IO 나노클러스터 처리 후 세포 생존율(L929 세포 및 HaCaT 세포), (b) 스크래치 영역 폐쇄(closure)를 나타내는 그래프 및 (c) 나노클러스터 처리 후의 세포 이동 광학 현미경 이미지이다.
도 18은 LC-IO 나노 클러스터의 상처 치유 효능 평가 결과로서, (a) 랫트의 피부 절개 실험을 나타낸 모식도, (b) 피브린글루(FG) 및 LC-IO 나노클러스터로 처리한 후와 무처리 군(NT)의 피부 절개 이미지, 및 (c) 무처리 군(NT), 피브린글루(FG) 및 LC-IO 나노클러스터 처리한 피부 절개의 상처봉합율 %(n = 5)을 나타낸 그래프이다.
도 19는 LC-IO 나노 클러스터의 상처 치유 효능 평가 결과로서, (a) 절개 후 3, 7 및 14일 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과 이미지(상처 가장자리는 검은색 화살표로 표시됨), (b) Masson's trichrome(MT) 염색 이미지, (c) 상처 표면 폭 및 (d) 상피 혀 길이를 나타낸 그래프이다.
도 20은 LC-IO 나노 클러스터의 상처 치유 효능 평가 결과로서, 1차 피부접착 실험에 대한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지이다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 여러 가지 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 도면에서의 요소의 형상은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해 과장되었다.
본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도; 및 상기 레반-카테콜 복합체를 포함하는 나노클러스터, 이의 제조방법 및 이의 용도에 대하여 상세히 설명한다.
레반-카테콜 복합체
본 발명에 따르면, 카르복시메틸화된 레반 및 도파민을 포함하는 레반-카테콜 복합체가 제공된다.
상기 레반(levan)은 1935년 쿠퍼(Cooper)에 의해 처음 발견된 천연 소재로 양파와 마늘을 비롯하여 보리, 선인장, 목초 등의 일부 식물체와 바실러스(Bacillus) 등의 미생물에서 발견된다. 구체적인 예로, 레반은 Zymomonas mobilis, Erwinia amylovora 및 Halomonas spice AAD6와 같은 그람 음성 박테리아에 의해 생설될 수 있다. 레반은 단위체가 β-(2,6) 단일 결합을 통해 형성된 프락탄(frutan)의 일종으로, 주로 β-(2,1)으로 연결된 구조를 가지는 프락탄인 이눌린(inulin)과 달리, 레반의 경우 β-(1,6)과 β-(2,6)이 같이 존재하고, 이눌린은 저분자량의 불용성 성질을 나타내는 반면, 레반은 상대적으로 고분자량으로 이루어져 있으며 동시에 매우 높은 수용성을 나타내는 특징을 가지고 있으며, 미네랄 흡수촉진, 장내 유산균 생육 촉진 등의 기능을 가지고 있어, 의약품, 식품의 첨가제 등으로 그 이용성이 다양하게 개발되고 있는 천연물질이다.
본 발명에서 카르복시메틸화(carboxymethylation)란, 유기화합물의 탄소, 질소, 산소, 황 원자 등과 결합한 수소원자를 카르복시메틸기(-CH2-COOH)로 치환하는 반응을 의미한다. 구체적인 예로, 상기 카르복시메틸화된 레반이란, 레반에 함유된 수소원자를 카르복시메틸기로 치환함으로써 카르복시메틸기를 치환기로 함유하는 레반을 의미할 수 있다.
상기 카르복시메틸화된 레반은 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 것일 수 있다.
엔도톡신(endotoxin)은 대부분의 그람 음성 박테리아에서 방출되는 LPS로서, 강력한 선천적 면역 반응을 유발하는 발열인자(pyrogen)이고, 혈액 내 엔도톡신의 존재는 저혈압, 호흡 부전 및 산소 전달 감소로 이어질 수 있다. 이에 따라, 생의학 응용을 위해서는 엔도톡신(미생물 생산 중 오염)의 제거가 필요하다. 본 발명에서는 하기 화학식 1과 같이 레반의 반복단위 내 존재하는 수소원자가 카르복시메틸기로 치환됨에 따라 레반의 엔도톡신이 현저하게 감소되는 효과가 존재한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000003
상기 화학식 1에서,
상기 n, m은 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+m=1이다.
상기 레반-카테콜 복합체는 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함하는 것일 수 있다. 위 전술한 바와 같이, 엔도톡신이 현저히 감소된 상기 화학식 1의 카르복시메틸화된 레반과 도파민의 접합을 통하여 하기 화학식 2의 반복단위를 포함하는 레반-카테콜 복합체를 형성할 수 있으며, 이에 따라 형성되는 레반-카테콜 복합체는 독성이 현저히 감소함으로써 생체적합성의 특성을 갖을 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000004
상기 화학식 2에서,
상기 n, x는 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+x=1이다.
본 발명의 화학식에서 "＊"는 동일하거나 상이한 원자 또는 화학식과 연결되는 부분을 의미한다.
상기 카르복시메틸화된 레반 및 도파민의 중량비는 1 : 0.5 내지 0.9, 1 : 0.6 내지 0.8 또는 1 : 0.7 내지 0.8일 수 있다. 상기한 중량비 범위 내에서는 상기 레반-카테콜 복합체의 형성에 있어서, 카르복시메틸화된 레반과 도파민의 접합이 용이할 수 있으며, 이에 따라 형성되는 레반-카테콜 복합체는 피부 조직에 대한 접착 능력이 향상되는 효과가 존재한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물이 제공된다. 종래 레반은 고유 점도가 낮고, 습한 환경에서 희석 및 씻겨 나갈 수 있다는 단점이 존재하였는데, 본 발명에 따라 카르복시메틸화된 레반 및 도파민이 접합된 레반-카테콜 복합체의 경우 습한 환경에서도 조직 접착력이 우수한 효과가 존재한다. 이에 따라, 레반-카테콜 복합체를 조직 접착용 조성물로 응용할 수 있다.
상기 조성물은 염화철(FeCl3), 과요오드산나트륨(NaIO4), 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소(HRP/H2O2, horseradish peroxidase), 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 가교제로 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조직 접착용 조성물이 상기한 가교제를 더 포함하는 경우, 복수의 레반-카테콜 복합체는 서로 배위결합되거나 공유결합되어 하이드로겔화 될 수 있다. 상기 복합체가 서로 배위결합하는 경우, 금속 또는 금속 이온을 매개로 하여 배위결합하는 것일 수 있다. 즉, 상기 조직 접착용 조성물은 하이드로겔 형태일 수 있다. 도 2f를 참조하면, 가교제의 종류에 따라 형성되는 하이드로겔의 결합 구조를 확인할 수 있다.
상기 조직 접착용 조성물은 지혈용, 상처 치유용 또는 봉합용일 수 있다. 상기 레반-카테콜 복합체는 우수한 지혈 효과, 상처 치유 촉진 효과 및 조직 접착 효과를 갖기 때문에, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물을 지혈 용도, 상처 치유 용도, 피부 또는 조직의 봉합 용도로 응용할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 조직 접착용 조성물은, 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈, 대퇴동맥의 봉합, 백내장 절개 봉합, 연골 치유, 피부 접합, 장기/분비선 절개면 지혈, 위장관 분합 및 힘줄/인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직접착용 조성물, 또는 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 조직 접착 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, “개체”는 지혈의 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 레반을 카르복시메틸화 하여 카르복시메틸화된 레반을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 카르복시메틸화된 레반을 EDC-NHS 커플링을 통하여 도파민에 접합하는 단계;를 포함하는 레반-카테콜 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 레반, 수산화나트륨 및 클로로아세트산을 혼합하는 과정을 통하여 수행될 수 있다. 이 때, 상기 레반 및 클로로아세트산은 1 : 0.7 내지 1, 1 : 0.8 내지 1 또는 1 : 0.9 내지 1의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 중량비 범위 내에서 레반의 엔도톡신(endotoxin)이 현저하게 감소되는 효과가 존재한다. 이에 따라, 형성되는 레반-카테콜 복합체의 독성이 감소하여 생체적합성이 우수한 이점이 존재한다.
상기 초기 원료로 사용되는 레반 (Levan)은 기계적인 방법 또는 물리적인 방법을 이용한 미생물의 세포 파쇄(cell disruption)를 통해 수득한 것이거나, 비기계적인 방법 또는 화학적인 방법을 이용한 미생물의 세포 파쇄(cell disruption)를 통해 수득한 것일 수 있다.
상기 (b) 단계는 카르복시메틸화된 레반에 도입된 카르복시기와 도파민의 아민기 간의 카르보디이미드-촉진 접합(carbodiimide-promoted conjugation)에 의해 수행될 수 있으며, 구체적으로, 카르복시메틸화 레반, 도파민, NHS(N-hydroxysuccinicimide) 및 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 포함하는 반응 혼합물을 반응시키는 과정을 통하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 반응 혼합물을 반응시키는 과정은 반응 혼합물을 pH 4 내지 6 또는 pH 5로 조정 후 아르곤 하의 실온 조건에서 5 내지 30 시간, 5 내지 24 시간 또는 5 내지 12 시간 동안 400 내지 600 rpm으로 혼합한 후, 1 내지 10 ℃, 2 내지 6 ℃ 또는 3 내지 5 ℃에서 pH 5 내지 6 또는 pH 5.5의 산성 증류수로 1 내지 3일 또는 2일 동안 투석하고 이어서 탈이온수로 1 내지 10 시간 또는 3 내지 5 시간 동안 투석한 후 동결건조하여 수행될 수 있다.
이 때, 카르복실화레반, 도파민, NHS 및 EDC는 1 : 0.4 내지 0.7 : 0.8 내지 1 : 0.5 내지 0.9, 또는 1 : 0.5 내지 0.6 : 0.9 내지 1 : 0.7 내지 0.8의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기한 중량비 범위 내에서는 상기 레반-카테콜 복합체의 형성에 있어서, 카르복시메틸화된 레반과 도파민의 접합이 용이할 수 있으며, 이에 따라 형성되는 레반-카테콜 복합체는 피부 조직에 대한 접착 능력이 향상되는 효과가 존재한다.
레반-카테콜 복합체를 포함하는 나노클러스터
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합; 및 소수성 물질을 포함하는 나노클러스터가 제공된다. 종래 전기방사 기법을 이용하여 나노섬유나 나노입자를 제조하는 경우가 존재하였으나, 쉽게 용해 및 팽창되어 안정성이 떨어질 뿐만 아니라 단순 담체(carrier)로서의 기능만을 가지는 단점이 존재하였다. 반면, 본 발명에서는 양친매성 성질과 생리활성(bioactive substance) 기능을 지닌 천연 유래 다당류인 레반을 함유하는 레반-카테콜 복합체와 소수성 물질의 혼합용액의 전기방사를 통하여, 수성환경에서도 쉽게 용해/파열되거나 팽창되지 않을 뿐만 아니라, 회수가 쉽고, 수성환경에서 조직 접착을 촉진하며, 상처 치유 속도를 가속화며, 치료용 약물 방출이 가능한 나노클러스터를 제조하였다.
상기 나노클러스터는 상기 소수성 물질을 함유하는 코어; 및 상기 코어를 감싸고 상기 레반-카테콜 복합체를 함유하는 쉘;을 포함하는 코어-쉘 형태일 수 있다. 레반-카테콜 복합체와 소수성 물질의 혼합용액의 전기방사 과정에서 소수성 상호작용 및 정전기적 상호작용에 의한 자기 조립을 통하여 코어-쉘 형태의 안정적인 나노클러스터가 형성될 수 있다. 이 때 형성된 나노클러스터는 레반-카테콜 복합체를 함유하는 쉘에 의하여 생리활성 기능과 접착 성능 등의 다기능성을 유지할 수 있으며, 특히, 엔도톡신의 감소로 독성이 현저히 저하된 레반-카테콜 복합체를 포함함으로써 생체적합성의 특성을 갖는다.
상기 나노클러스터의 평균 직경은 1 내지 600 nm, 50 내지 300 nm, 100 내지 200 nm 또는 140 내지 150 nm일 수 있다. 상기한 평균 직경 범위 내에서, 우수한 조직 접착력, 상처 치유 촉진능, 지혈 효능 및 약물 방출능을 나타내는 효과가 존재한다.
상기 소수성 물질은 자성 나노입자, 금속 나노입자, 약물 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 자성 나노입자는 산화철(II), 산화철(III), 코발트 페라이트, 징크 페라이트, 니켈 페라이트, 망간 페라이트, 철, 코발트, 니켈, 망간, FeAu, FePt 및 CoNi 중에서 선택되는 1종 이상이고; 상기 금속 나노입자는 금, 실리카, 타이타이나 및 마그네슘 중에서 선택되는 1종 이상이며; 상기 약물은 소수성 약물, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다. 상기 약물은 상기한 종류에만 한정되는 것은 아니며, 담지체에 의하여 인체 내로 전달될 수 있는 것이라면 어느 것을 포함하여도 무방하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약물은 소수성 약물일 수 있다. 이 때, 상기 소수성 약물은 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide) 및 다우노마이신(daunomycin) 으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이 때, 상기 RNA는 siRNA, miRNA 또는 mRNA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물이 제공된다.
상기 조직 접착용 조성물에 포함되는 나노클러스터는 상기 소수성 물질로서 산화철 나노입자를 포함하는 것일 수 있으며, 이 경우 우수한 조직 접착력, 상처 치유 촉진능 및 지혈 효능을 나타내는 효과가 존재한다. 또한, 상기 조직 접착용 조성물은 엔도톡신의 감소로 독성이 현저히 저하된 레반-카테콜 복합체를 포함함으로써 생체적합성의 특성을 갖는다.
상기 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물은 지혈용, 상처 치유용 또는 봉합용일 수 있다. 상기 나노클러스터에 포함되는 레반-카테콜 복합체는 우수한 지혈 효과, 상처 치유 촉진 효과 및 조직 접착 효과를 갖기 때문에, 이를 포함하는 조직 접착용 조성물을 지혈 용도, 상처 치유 용도, 피부 또는 조직의 봉합 용도로 응용할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 조직 접착용 조성물은, 혈관 외과 영역을 포함한 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착을 포함한 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈, 대퇴동맥의 봉합, 백내장 절개 봉합, 연골 치유, 피부 접합, 장기/분비선 절개면 지혈, 위장관 분합 및 힘줄/인대 치유로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노클러스터를 포함하는 약물 전달체가 제공된다. 상기 약물 전달체는 엔도톡신의 감소로 독성이 현저히 저하된 레반-카테콜 복합체를 포함함으로써 생체적합성의 특성을 갖는다.
상기 약물 전달체에 포함되는 나노클러스터는 소수성 물질로서, 자성 나노입자 및 약물이 결합되어 형성된 자성 나노입자- 약물 복합체를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물 복합체는 산화철 나노입자 및 소수성 약물이 결합되어 형성된 산화철-소수성 약물 복합체일 수 있으며, 이 경우 우수한 약물 방출 효능을 나타내는 효과가 존재한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (A) 본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체 및 소수성 물질이 분산된 나노클러스터 제조용 용액을 수용액 상에 전기 방사하는 단계;를 포함하는 나노클러스터의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 (A) 단계의 전기 방사 과정은 20 내지 25 gauge 또는 22 내지 24 gauge 니들을 사용하여, 20 내지 25 kV 또는 22 내지 24 kV 전압, 2 내지 10 또는 4 내지 6 μL/min 유속 및 10 내지 15 cm 또는 11 내지 13 cm의 노즐 거리를 적용하여 자기 교반 하에 수용액을 함유하는 수조에 전기 방사하여 수행될 수 있다. 이 때 수조 내 함유되는 수용액은 증류수일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 (A) 단계 이후, (B) 전기 방사(분사)와 동시에 생성된 나노클러스터는 자석을 사용하여 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 자석은 네오디뮴 자석일 수 있다. 상기와 같이 수집된 나노클러스터는 10 내지 20% 또는 14 내지 15% DMSO에 재분산시켜 장기 보관이 가능하다.
상기 나노클러스터 제조용 용액은, 제1 용매에 상기 레반-카테콜 복합체가 분산된 제1 분산용액; 및 제2 용매에 상기 소수성 물질이 분산된 제2 분산용액;을 혼합하여 수득되는 것이고; 상기 제1 용매 및 제2 용매는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 헥산(hexane), 톨루엔(toluene), 테트라하이드로퓨란(THF: tetrahydrofuran), 다이메틸포름아미드(DMF: dimethylforamide), 다이메틸 설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide) 및 알코올계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 용매는 DMSO이고, 제2 용매는 헥산일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (A) 단계에서, 나노클러스터 제조용 용액에 분산된 소수성 물질의 크기는 1 내지 20 nm, 5 내지 15 nm 또는 7 내지 12 nm일 수 있다. 상기한 크기 범위 내에서, 나노클러스터 제조용 용액의 전기 방사 시 자기 조립이 용이하여 안정적인 코어-쉘 형태의 나노클러스터가 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (A) 단계의 소수성 물질은 자성 나노입자 및 약물이 결합되어 형성된 자성 나노입자-약물 복합체를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약물 복합체는 산화철 나노입자 및 소수성 약물이 결합되어 형성된 산화철-소수성 약물 복합체일 수 있으며, 이 경우 우수한 약물 방출 효능을 나타내는 효과가 존재한다.
이와 같이, 상기 소수성 물질이 자성 나노입자-소수성 약물 복합체인 경우 전기 방사에 의하여 최종적으로 생성되는 나노클러스터는, 상기 자성 나노입자를 함유하는 코어; 상기 코어를 감싸고 상기 레반-카테콜 복합체를 함유하는 쉘; 및 상기 코어와 쉘에 분산된 소수성 약물;을 포함하는 코어-쉘 형태일 수 있다(도 19 참조).
유방암은 여성에게 가장 흔한 암으로, Warburg effect라 불리는 Glut 5 수용체의 과발현을 일으키는 높은 에너지를 소비한다. 안트라사이클린 계열의 항생제인 독소루비신(Dox)은 DNA 복제의 핵심 효소인 토포이소머라제 II(topo II)를 억제하여 항암 작용을 하나, Dox 기반 화학 요법은 특별히 유방암 세포를 표적으로 하지 않는 단점이 존재한다. 도 19를 참조하면, 본 발명에 따른 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO)는 내부에 독소루비신을 담지하여 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)를 형성함으로써, GLUT 5 수용체를 통한 유방암의 능동적 표적화에 활용할 수 있다(도 11a 참조). 이 경우, 상기 LC-IO-Dox 내 독소루비신의 농도는 0.1 내지 10 ug/ml, 0.5 내지 5 ug/ml 또는 0.5 내지 1.5 ug/ml일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자성 나노입자-약물 복합체는 제3 용매에 자성 나노입자 및 약물을 첨가한 후 초음파 처리하여 수득할 수 있다. 상기 제3 용매는 상기 제1 용매 또는 제2 용매와 동일하거나 상이하며, 헥산(hexane), 톨루엔(toluene), 테트라하이드로퓨란(THF: tetrahydrofuran), 다이메틸포름아미드(DMF: dimethylforamide), 다이메틸 설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide) 및 알코올계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 제3 용매는 헥산일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 일 구현예를 이용하여 설명한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에서 설명된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이런 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
<재료>
zymomonas mobilis(자이모모나스 모빌리스)(MW=95 kDa, DP= 587)의 레반(Levan)은 Realbiotech(공주, 대한민국)에서 구입하였고, 클로로아세트산과 과요오드산나트륨은 Junsi Chemical(Tokyo, Japan)에서 구입하였으며, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)는 APExBIO(Boston, USA)에서 구입하였으며, 도파민, N-히드록시숙신이미드(NHS), 염화철(III), Escherichia coli o55:b5(LPS)의 지질다당류, 및 페니실린 스트렙토마이신은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 또한, 염산, 수산화나트륨, 이소프로판올, 및 에탄올은 삼전(서울, 한국)에서 구입하였다. 또한, PBS(10x)는 LPS 솔루션(대전, 한국)에서 구입하여 137mM NaCl, 10mM 인산염 및 2.7mM KCl(1x PBS)의 최종 농도로 희석하였다. 또한, Greenplast Q 프리필드 시린지 키트(피브린 글루 키트)는 GC녹십자(용인, 대한민국)에서, 돼지 피부는 Stellen Medical(St. Paul, MN, USA)에서 구입하였다. 또한, 본 연구의 실험에 사용된 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(서울, 대한민국)에서, L-Glutamine은 Lonza(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였고, 고혈당 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM), Dulbecco phosphate buffered saline(DPBS)은 HyClone(Logan, UT, USA)에서 구입하였으며, Raw 264.7 세포주용 DMEM은 Welgene fresh media(경산, 대한민국)에서 구입하였다. 또한, Pierce Chromogenic Endotoxin 정량 키트는 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입했고, Culture-Insert 2 웰은 Ibidi(Grafelfing, Germany)에서 구입하였으며, Cell Counting Kit-8은 MedChemExpress(NJ, USA)에서 구입하였다. 또한, 마우스 TNE-α 및 마우스 IL-6 DuoSet ELISA 키트는 R&D Systems(Minnesota, USA)에서 구입하였으며, 혈액은 포항공과대학교 임상시험심사위원회의 동물실험윤리규정(IRB 번호 POSTECH-2022-0004)에 의거하여 토끼로부터 채혈하였다.
<실시예>
제조예 1: 카르복시메틸화된 레반(CM-L) 제조 및 내독소 제거
zymomonas mobilis의 레반 고유 점도는 23.4 mL/g로 확인하였고, 분자량은 Mark-Houwink-Sakurada 관계를 사용하여 ~95kDa로 확인하였다. 레반-카테콜 복합체는 먼저 카르복시메틸화된 레반(CM-L)을 제조하여 합성하였다. 레반(2 g)을 탈이온수(40 mL)에 용해시킨 후 수산화나트륨을 2:1(NaOH:레반) 몰비로 첨가하였다. 상기 용액을 500 rpm에서 24 시간 동안 교반한 후, 클로로아세트산(1.92g)이 용해된 1N NaOH(5mL) 용액을 1시간에 걸쳐 천천히 첨가한 후 수득한 용액을 60℃에서 12시간 동안 교반하였다. 합성된 카르복시메틸화 레반(CM-L) 시료를 묽은 NaOH 또는 HCl로 중화시킨 후 이소프로판올로 침전시켜 정제하였다. 침전된 CM-L을 여과하여 수집하고, 상온에서 진공 건조시킨 후, FTIR 분광법(Nicolet iS50, USA) 및 13C NMR(Bruker AV 500 NMR)로 특성화하였다. 레반은 Govers et al.에 의해 기술된 바와 같이 수산화나트륨과 함께 배양하여 프룩탄(fructan)의 수산기를 활성화하고, 이를 클로로아세트산과 결합시키고, 레반에서 내독소를 제거하였다(Govers, Coen, et al. Bioactive carbohydrates and dietary fibre 8.1 (2016): 15-25.). 레반 및 카르복시메틸화된 레반의 내독소 수준은 제조업체의 지침에 따라 피어스 발색성(Pierce Chromogenic) 내독소 분석 키트를 사용하여 확인하였다.
실시예 1: 레반-카테콜 복합체(LC)의 제조
레반-카테콜 복합체는 상기 제조예 1의 카르복시메틸화된 레반(CM-L)에 도입된 카르복실기와 도파민의 아민기 간의 카르보디이미드-촉진 접합(carbodiimide-promoted conjugation)에 의해 합성하였다. CM-L(0.5 g)을 탈이온수(100mL)에 용해시킨 후 NHS(287.5 mg) 및 EDC(479.5 mg)를 상기 용액에 첨가하여 반응용액을 수득하였다. 상기 반응용액을 1시간 동안 교반한 후, 도파민(383 mg)를 첨가하고 pH를 5로 조정하였다. pH5로 조정된 반응용액을 아르곤 하에 실온에서 12시간 이상 500rpm으로 혼합하여 반응시켰다. 반응이 완료된 반응용액을 4℃에서 산성증류수(pH 5.5)로 2일간, 탈이온수로 4시간 동안 투석한 후 동결건조하여, 레반-카테콜 복합체(LC)를 제조하였다. 반응 성공 여부는 FTIR, NMR, UV-VIS(Optizen POP Nano Bio, Korea)로 확인하였다. 또한, 레반-카테콜 복합체(LC)에서 도파민의 치환도(DS)는 1H NMR 스펙트럼 및 Arnow 분석으로 확인하였다.
실시예 2: 레반-카테콜 복합체(LC) 하이드로겔의 제조
LC 하이드로겔은 인산염 완충 식염수(1 PBS, pH 7.4)에 용해된 10 중량% 레반-카테콜 복합체(LC) 용액으로 제조하였다. NaIO4를 2:1(DOPA:IO4) 몰비로 LC 용액에 첨가하여 카테콜을 공유 결합시켰고, 생성된 하이드로겔을 "LC-IO4 -"로 지칭하였다. 또한, FeCl3를 3:1(카테콜:Fe3 +) 몰비로 LC 용액에 첨가하고 용액이 진한 분홍색으로 변할 때까지 1N NaOH를 사용하여 pH를 9로 증가시켰으며, 생성된 하이드로겔은 "LC-Fe3+"로 지칭하였다.
실시예 3: 레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO) 및 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)의 제조
레반-카테콜-산화철 나노클러스터(LC-IO)는 전기 방사 장치를 이용하여 제조하였다. 전기 방사를 위한 나노클러스터 제조용 용액은, 7~12 nm 크기의 소수성 IO(iron oxide; Fe3O4)(Fe 10mM) 나노입자가 분산되어 있는 1 mL 헥산 용액을 0.5wt% LC(실시예 1의 레반-카테콜 복합체)가 용해된 DMSO 10mL 용액에 첨가하고 수조에서 1시간 동안 초음파 처리하여 준비하였다. 그 다음, 준비된 나노클러스터 제조용 용액을 주사기에 옮겨 담은 후 23 gauge 니들, 23 kV 전압, 5 μL/min 유속 및 12 cm 노즐 거리를 적용하여 자기 교반 하에 증류수를 함유하는 알루미늄 수조에 전기 방사하였다. 분사된 나노클러스터 생성물은 네오디뮴 자석을 사용하여 수집한 후 장기 보관을 위해 15% DMSO에 재분산시켰다(도 9a 참조). 도 10a를 통하여 LC-IO의 형태학적 특징을 확인할 수 있으며, 도 10b를 통하여 LC-IO의 평균 직경은 200 nm 이하, 구체적으로는 145.8 nm임을 확인할 수 있다.
한편, 치료용 약물이 포함된 레반-카테콜-산화철-독소루비신 나노클러스터(LC-IO-Dox)의 제조는 IO(iron oxide; Fe3O4) (Fe 10mM) 나노입자가 분산되어 있는 1 mL 헥산 용액에 Dox 200 μg을 첨가한 후 수조 초음파 처리를 1시간 동안 진행하여 형성된 IO-Dox 복합체를, LC-IO 제조 과정과 같은 방식으로 제조하였다. 즉, LC-IO(100 ug)가 분산되어 있는 1 mL 헥산 용액을 0.5wt% LC가 용해된 DMSO 10mL 용액에 첨가하고 수조에서 1시간 동안 초음파 처리하여 준비하였다. 그 다음, 준비된 나노클러스터 제조용 용액을 주사기에 옮겨 담은 후 23 gauge 니들, 23 kV 전압, 5 μL/min 유속 및 12 cm 노즐 거리를 적용하여 자기 교반 하에 증류수를 함유하는 알루미늄 수조에 전기 방사하였다. 분사된 나노클러스터 생성물은 네오디뮴 자석을 사용하여 수집한 후 장기 보관을 위해 15% DMSO에 재분산시켰다(도 9b 참조). 도 10a를 통하여 LC-IO-Dox의 형태항적 특징을 확인할 수 있으며, 도 10b를 통하여 LC-IO-Dox의 평균 직경은 200 nm 이하, 구체적으로는 145.8 nm임을 확인할 수 있다.
<실험예>
각각의 실험은 적어도 3 번 수행되었고, 결과는 평균 ± 표준 오차로 제시하였다. one-tailed t-test을 사용하여 통계적 유의성을 결정하고, p <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 1. 레반-카테콜 복합체의 특성화
레반은 먼저 레반 사슬에 카르복시메틸기을 도입하여 도파민에 접합하였다. 카르복시메틸기는 이후 EDC 화학을 통해 아민과 반응시켰다. 복합체의 성공적인 형성은 도 1b에 표시된 레반(Levan) 및 카르복시메틸화된 레반(CM-L)의 스펙트럼과 함께 FTIR 분광법으로 확인하였다. 후자의 스펙트럼에서 약 1718 및 1604 cm-1의 새로운 밴드는 각각 COOH 및 COO- 형태의 C=O 그룹의 스트레칭 진동에 할당될 수 있다. 또한, CM-L의 13C NMR 스펙트럼은 카르복실 탄소에 해당하는 180ppm에서 새로운 피크를 나타내며, 이는 CM-L의 성공적인 형성과 일치함을 확인하였다.
EDC 화학은 CM-L의 카르복실기를 도파민의 아민기와 연결하는 데 적용하였다. 합성된 레반-카테콜 복합체(LC)는 FTIR 및 1H NMR 분광법 및 Arnow 분석으로 특성화하였다. LC의 FTIR 스펙트럼(도 1b)은 CM-L(~1718 cm-1)보다 높은 약 1727cm-1에서 카르복실 피크를 나타내며, CM-L의 카복실레이트(COO-)의 나트륨염이 DOPA의 아민기에 접합(conjugation)되었고, 1635 cm-1에서 피크가 아미드-기 굽힘에 할당되었다는 증거를 제공한다.
도파민/CM-L 접합은 1H NMR 분광법으로 확인하였으며(도 1c) DOPA의 방향족(6.5-7ppm) 및 메틸렌 양성자(3.1 및 2.8ppm)에 해당하는 피크의 존재가 밝혀졌다. LC에서 카테콜 그룹의 치환도(DS)는 다음 방정식을 통하여 계산하였다: DS = Aaromatic / (3 × A4.07), 여기서 Aaromatic 및 A4.07은 카테콜 모이어티의 방향족 양성자 피크와 δ 4.07(levan의 H6) 피크의 통합 면적으로, 각각 LC에 대해 약 0.07의 DS 값을 초래하였다.
또한, 레반 사슬에 도파민이 성공적으로 그래프트 되었음을 확인하기 위해 Arnow 분석법도 사용하였다. LC의 UV-vis 스펙트럼(도 1d)은 LC의 카테콜 그룹에 기인한 500 nm에서의 현저한 흡수를 보여주는 반면 순수한 레반의 스펙트럼은 이 피크를 나타내지 않음을 확인하였다. 레반 사슬의 카테콜 치환 정도는 도파민에 대한 표준 흡광도-농도 곡선으로부터 0.068로 계산되었다.
실험예 2. LC 하이드로겔 형태 및 팽윤거동 평가
LC 하이드로겔의 단면 형태는 10kV 가속전압에서 주사전자현미경(SEM, JSM-6010LV, Jeol, Japan)으로 평가하였다. 하이드로겔을 동결 건조시키고 절단하고 금을 코팅해서 관찰하였다.
하이드로겔의 평윤거동은 동결 건조된 LC 하이드로겔 시료의 무게를 측정하고 37°C에서 1x PBS(pH 7.4)에 담그고 그룹당 3개의 샘플을 테스트하였다. 다양한 시간에 팽창된 샘플을 완충액에서 꺼내고 여과지로 빠르게 닦고 무게를 잰 다음 완충액에 다시 넣었다. 팽창이 평형 상태에 도달할 때까지 이 절차를 반복하였다. 각 하이드로겔의 팽윤비(Q)는 다음 식 (1)에 따라 추정하였다:
[식 1]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000005
여기서 Ww는 각 시점의 샘플 중량이고 Wd는 샘플의 건조 중량이다.
도 2를 참조하면, 공유결합 LC-IO4 - 및 비공유결합 LC-Fe3+ 둘 다 배양 초기 30분 동안 빠른 팽창을 나타냈고, 팽창 평형은 3시간에 관찰되었으며,. 다음 5시간 동안 일정한 무게가 관찰되었다. 세포 성장을 위해서는 생물학적 유체가 하이드로겔에 쉽게 침투해야 하는데, LC-IO4 -는 LC-Fe3+보다 상당히 높은 팽윤율을 나타냄을 확인할 수 있다. 도 2c의 SEM 이미지에서 볼 수 있듯이, 두 하이드로겔은 상대적으로 균일한 다공성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. LC-IO4 -의 기공은 LC-Fe3+의 기공보다 다소 작지만 더 많은 기공이 있어 높은 팽윤 용량에 기여할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3. 레반 및 레반-카테콜 복합체(LC)의 in vitro 면역원성 평가
RAW 264.7 마우스 대식세포 유사 세포는 FBS(10 vol%) 및 페니실린-스트렙토마이신(1 vol%)이 보충된 신선한 Welgene DMEM에서 37°C에서 5% CO2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 2.0×104개 세포(300μL)의 밀도로 시딩하고 5% CO2 및 37℃ 조건에서 4시간 동안 유지시켰다. 세포가 플레이트에 부착된 후, 배양 배지(100.0μL)를 최종 농도(1000, 500, 100 또는 10 μg/mL)가 되도록 DMEM 중의 레반 또는 LC 용액으로 교체하고, 세포는 배지 단독으로 배양하여 음성 대조군(NT)으로 사용하였다. 이전에 보고된 바와 같이, 500 ng/mL의 지질다당류(LPS)로 RAW 264.7 세포를 자극하면 세포 독성 없이 최적 수준의 TNF-α가 방출되었다. 따라서 이를 양성 대조군으로 선택하였다(Nayak, Kaur, & Buttar, 2016). 24시간 동안 처리한 후 각 상등액을 수집하여 추가 사용 전까지 -20 °C에서 보관하였다. 배양 상청액의 IL-6 및 TNF-α 농도는 제조업체의 지침에 따라 DuoSet ELISA 키트를 사용하여 결정하였다. IL-6 및 TNF-α의 농도는 표준 곡선을 사용하여 확인하였다.
현재, 레반의 면역원성에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 레반은 세포막에서 파생된 지질다당류(LPS 또는 내독소)를 방출하는 그람 음성 박테리아인 zymomonas mobilis에 의해 생성된다. 엔도톡신은 단핵구와 대식세포를 통해 종양괴사인자(TNF-α)와 인터루킨(IL-1,6)과 같은 다양한 전염증 매개체를 방출함으로써 면역계를 활성화시킨다. 레반 시료는 내독소를 제거하기 위해 24시간 동안 0.62 M NaOH의 알칼리 조건에서 처리되었으며, 처리되지 않은 레반(1.57 EU/mg)에서 CM-L(0.14 EU/mg)로 수준이 감소하였다. LC의 낮은 내독소 수준(0.13 EU/mg)은 생물의학 접착제로 사용할 수 있음을 시사한다.
레반과 LC의 면역원성은 Raw 264.7 세포에서 평가되었으며, 도 3을 참조하면, 24시간 동안 샘플에 노출된 후 방출된 사이토카인의 양을 확인할 수 있다. 리포폴리사카라이드(LPS)가 양성 대조군으로 사용하였는데, LPS는 그람 음성 박테리아의 세포벽의 주요 구성 요소이며 면역원성이 높고 최고의 단핵구/대식세포 활성화제 중 하나이다. 내독소 제거 전에 레반은 1-0.1 mg/mL 농도에서 높은 수준의 사이토카인 생산을 보였고 높은 내독소 수준으로 인해 10 μg/mL에서 낮은 반응을 보였다. LC에서 낮은 수준의 내독소는 음성 대조군에 가까운 낮은 면역 반응을 초래하였다. 예를 들어, 1 mg/mL LC 샘플(44.4 ± 2.4 pg/mL)에서 생성된 TNF-α 농도는 동일한 용량의 levan 샘플(8279.12 ± 134.6 pg/mL) 보다 급격히 낮음을 확인하였다(도 3 참조). 여기서, 염증 매개체 유도가 내독소 의존적이며, 상기 LC는 낮은 면역원성을 가져 생체 적합성이 우수하다는 결론을 내릴 수 있다.
실험예 4. 돼지 피부를 이용한 LC 하이드로겔의 조직 접착력 실험
만능재료시험기(Instron 5544, Norwood, MA, US)를 이용하여 전단응력 측정을 통해 생체 조직에 대한 하이르로겔의 접착력을 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 돼지 껍데기(stellen Medical, USA)를 10 ×10 mm 크기로 잘라 0.1 M PBS buffer(pH 7.4)에 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 방치완료한 돼지 껍데기를 10×100 mm 크기의 알루미늄 바에 순간접착제(3M)를 이용하여 부착한 후, 돼지 껍데기의 표면에 시료로 LC-Fe3+ 및 LC-IO4 - 하이드로겔과 양성대조군으로서 피브린글루(녹십자, 한국)(FG)를 각각 도포하였다. 그런 다음, 시료가 도포되지 않은 돼지 껍데기가 부착된 알루미늄 바를 겹쳐준 후, 클립을 사용하여 2개의 알루미늄 바를 고정하였다. 고정된 2개의 알루미늄 바를 100 % 상대습도 및 상온(RT)에서 2시간 동안 배양한 후, 10 kN 로드셀(load cell)을 이용하여 10 mm/min의 크로스 헤드(cross head) 속도로 2개의 알루미늄 바가 완전히 분리될 때까지의 전단응력을 측정하였다(도 4a 참조).
도 4를 참조하면, 피브린글루, LC-Fe3+ 및 LC-IO4 -는 각각 13.46 ± 0.73 kPa, 24.46 ± 1.2 kPa 및 42.17 ± 0.24 kPa의 중첩 전단 응력(lap shear stresses)을 나타냄을 확인할 수 있으며, LC-IO4 -는 상업적으로 이용 가능한 피브린 글루보다 3배 이상의 상당히 높은 값을 나타냄을 확인할 수 있다(도 4c 참조). 또한, 두 하이드로겔의 접착 강도는 동일한 습윤 조건에서 측정된 10wt% 순수 레반 용액의 접착 강도보다 훨씬 더 높았으며, 또한, 철을 매개로 배위가교된 하이드로겔은 피브린글루보다 2배의 접착에너지를 보였으며, 과요오드산염을 매개로 산화적으로 공유가교된 하이드로겔은 4배 더 높은 것으로 나타났다(도 4f 참조).
이러한 결과는 LC 하이드로겔이 돼지 피부 조직에 대한 우수한 접착력을 나타내므로 우수한 지혈 효과를 보임을 나타낸다. 더불어, 접착 메커니즘이 습한 조건에서, 카테콜 그룹, 산화된 o-퀴논 그룹 또는 레반의 하이드록실 그룹과 함께 아미노, 티올 및 하이드록실과 같은 조직 표면의 접근 가능한 친핵체 그룹 사이의 공유 및 비공유 결합의 형성에 기인하는 것으로 판단된다. 즉, 생체 조직에 대한 접착력을 높이기 위해 레반이 수중에서 접착력이 사라지는 것을 제어하기 위해서 카테콜 같은 수중접착을 위한 작용기가 필요하여, 본 발명의 레반-카테콜 복합체 하이드로겔이 수분이 존재하는 환경에서도 강한 접착력을 나타냄 뒷받침할 수 있다.
실험예 5. LC 하이드로겔의 세포 생존력 및 이동 평가
in vitro 실험 전에 NIH3T3 및 HaCaT 세포를 사용하여 하이드로겔 세포 생존력을 평가하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
NIH3T3 및 HaCaT 세포에 대한 하이드로겔 세포독성은 CCK-8 검정을 사용하여 평가하였다. NIH3T3 세포는 10.0 vol% FBS 및 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 배양하였으며, HaCaT 세포는 37°C에서 5% CO2를 포함하는 가습된 인큐베이터에서 10.0 vol% FBS, 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 하이드로겔 샘플(1g)을 보충 배지(10mL)에 37°C에서 24시간 동안 담가 각 하이드로겔을 추출하였다. 그런 다음 추출물을 배양 배지로 희석하고 배양 배지 자체를 대조군으로 사용하였다. NIH3T3 및 HaCaT 세포를 5% CO2 및 37°C에서 밤새 96웰 플레이트(200μL)에 5×103 세포/웰의 밀도로 접종한 후 배지 100.0μL를 다양한 농도의 추출물 희석액으로 교체하였다(10, 5, 2.5 또는 1.25 mg/mL로 최종 조정). 배양 배지는 24, 48 또는 72시간 배양 후 배양액을 Cell Counting Kit-8 용액(10:1 v/v)과 혼합한 100 μL의 배양액으로 교체하고 37°C에서 1시간 더 배양하였다. 세포 생존율(Cell viability)은 하기 식 2를 사용하여 계산하였다.
[식 2]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000006
여기서 ODsample, ODcontrol 및 ODblank는 각각 마이크로플레이트 리더(Synergy HTX, USA)를 사용하여 측정한 450nm에서 테스트된 샘플, 대조군(미처리 세포) 및 블랭크(cck-8 용액이 포함된 배양 배지) 그룹의 흡광도입니다.
한편, 하이드로겔 세포 생존력 및 이동 평가에서 하이드로겔 추출물을 첨가하기 전에 Culture-Insert 2 웰을 사용하여 세포 스크래치(Cell scratching) 분석을 수행하여 500 ± 100 μm 폭의 무세포 갭을 형성하였다. Culture-Insert 2개의 웰을 24웰 플레이트에 부착한 후 3 x 105 세포/mL(70μL) 밀도의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하고 외부 영역을 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양된 세포 배양 배지로 채웠다. 세포가 부착된 Culture-Inset 2 웰을 제거하고 부착되지 않은 세포를 DPBS로 세척하여 제거한 후 하이드로겔 추출물을 첨가하였다. 간격 폐쇄(Gap closure)는 광학 현미경(Optika, Italy)에 의해 24시간 간격으로 모니터링하고 이미지화 하였다.
도 5a를 참조하면, LC-IO4 - 및 LC-Fe3+ 모두 NIH3T3 및 HaCaT 세포 성장에 이상적으로 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 낮은 수준에서는 성장을 촉진하고 높은 수준에서는 성장을 억제하였다. 두 하이드로겔 모두 HaCaT 세포 성장을 촉진하는 것으로 관찰되었으며, 1.25-5 mg/mL 범위에서 농도가 증가함에 따라 생존력이 증가함을 확인하였다. LC-IO4 - 추출물은 LC-Fe3+ 추출물보다 높은 세포 생존율을 보였다. 농도가 10 mg/mL로 증가함에 따라 세포생존율이 감소하였지만 여전히 음성대조군에 비하여 높음을 확인할 수 있다. 동일한 2상 패턴(biphasic pattern)이 LC-Fe3+ 추출물로 처리된 NIH3T3 세포에 대해 관찰되었으며, 이는 LC-IO4 - 추출물보다 NIH3T3 세포 성장을 더 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 농도가 증가함에 따라 생존력이 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나 10 mg/mL에서도 LC-IO4 - 추출물은 70% 이상의 세포 생존율을 나타내어 LC 하이드로겔이 생체 적합성을 나타낸다.
다음으로 상처-스크래치 테스트 동안 HaCaT 및 NIH3T3 세포에 5 mg/mL의 하이드로겔 추출물을 적용하여 하이드로겔이 세포 이동에 미치는 영향을 평가하였다. 도 5b를 참조하면, 하이드로겔 추출물로 처리된 NIH3T3 세포가 24시간 및 48시간 동안 공동 배양(co-incubation)하는 동안 대조군의 세포보다 훨씬 빠르게 이동함을 확인할 수 있으며, LC-Fe3+ 및 LC-IO4 - 추출물과 대조군은 24시간 후 각각 약 74%, 64% 및 24%의 스크래치 폐쇄(scratch closure)를 나타냄을 확인할 수 있다. LC-Fe3+로 처리한 상처는 48시간 후에 치유된 반면 대조군은 62%로 높은 상처 부위를 보였다. 반면, LC-Fe3+ 추출물만이 HaCaT 세포에 적용했을 때 24시간 동안 대조군과 상당히 다른 행동을 이끌어냈고, 상처의 40%가 회복된 반면 대조군은 21%만 회복되었다. NIH3T3은 뮤린(murine) 섬유아세포 세포주인 반면, HaCaT는 불멸화된(immortalized) 인간 각질세포 세포주이다. 이 두 가지 유형의 세포는 손상 후 조직 재생에 필수적이다.
상기 두 LC 하이드로겔에 대해 얻은 우수한 세포 증식 및 빠른 이동 데이터는 상처 치유 응용 분야에 매우 유용하다.
실험예 6. LC 하이드로겔의 In vitro 및 In vivo 지혈 효능 평가
(1) In vitro 지혈 효능 평가
LC 하이드로겔의 지혈 효능을 평가하기 위하여, 혈액 응고 지수(BCI), 용혈 분석 및 혈소판 부착 실험을 수행하였다.
하이드로겔의 혈액 응고 지수(BCI)는 다음과 같이 평가하였다. 먼저, 각 하이드로겔의 100mg 샘플을 5mL 튜브에 넣고 37°C 수조에서 예열하였다. 100 μL의 구연산 용액이 포함된 토끼 전혈(구연산나트륨 용액 3.8%)을 튜브에 부드럽게 첨가하여 LC 하이드로겔 샘플을 덮은 후 37 °C에서 온도를 유지하면서 0.2M CaCl2 용액 10 μL를 첨가하여 응고를 시작하였다. 탈이온수(2 mL)를 조심스럽게 첨가하여 미리 설정된 시점에서 응고(clot)를 방해하지 않으면서, 응고를 시작한 혈액(unclothed blood)을 용해시켰다. 상등액의 광학 밀도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540nm에서 측정하였다. 2 mL의 탈이온수에서 구연산 전혈(100μL)의 흡광도를 음성 대조군(NC)으로 사용하였다. BCI는 하기 식 3을 사용하여 계산하였다:
[식 3]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000007
한편, 용혈률과 혈소판 부착은 공지된 방법(Suneetha, Maduru, Kummara Madhusudana Rao, and Sung Soo Han. ACS omega 4.7 (2019): 12647-12656.)에 따라 평가하였다. 구연산 용액이 포함된 토끼 전혈을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 분리하여 각 하이드로겔 샘플에 대한 혈소판 부착을 평가하였다. 적혈구(RBC)를 DBPS로 4회 세척한 후 용혈 분석에 사용하였다. 하이드로겔 혈액 적합성을 평가하기 위해 희석된 RBC(DPBS 1x에서 10 v/v %) 500 μL를 마이크로튜브의 하이드로겔 샘플 100 mg에 첨가한 다음 37 °C에서 1시간 동안 배양하였다. 또한, 0.1% Triton-X 및 DPBS(100μL)를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 3500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 수집하고 540 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다. 용혈률은 하기 식 4를 사용하여 계산하였다(각 그룹에 대해 3회 진행):
[식 4]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000008
국제 표준에 따라, 5% 용혈 값은 본 실험에서 용혈 없음에 해당하는 것으로 간주하였다. 혈소판 부착을 평가하기 위해 하이드로겔을 37°C에서 1시간 동안 혈소판이 풍부한 혈장 현탁액에서 배양하였다. 그런 다음, 하이드로겔을 DPBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 혈소판을 제거하고 부착된 혈소판을 1% 글루타르알데히드 용액에서 2시간 동안 배양하여 고정시켰다. 그런 다음, 하이드로겔을 DPBS로 헹구고 에탄올 용액에서 점차적으로 탈수시킨 다음 동결 건조시켰다. 부착된 혈소판의 형태는 SEM(JSM-6010LV, Jeol, Japan)으로 분석하였다.
성공적인 지혈은 응고가 혈액 손실을 방지할 뿐만 아니라 형성된 섬유소와 혈소판 응고가 염증 세포와 섬유아세포를 포함하여 염증 단계에서 세포에 필요한 시간적 격자(temporal lattice) 역할을 하기 때문에 후속 상처 치유를 촉진한다. 하이드로겔의 체외 혈액 응고 능력은 전 혈액-응고 분석을 사용하여 평가하였으며, 여기서 더 큰 혈액 응고 지수(BCI)는 더 느린 응고를 나타낸다. 도 6c 및 6d에서 볼 수 있듯이, LC-IO4 -는 30초 후 BCI가 7.65 ± 0.03%인 반면 LC-Fe3+는 10.27 ± 0.4이였으며, 이에 비해 혈액 전용 샘플(NT)의 BCI는 36.6 ± 0.53%임을 확인할 수 있다. 이 샘플은 8.03±0.21%의 BCI를 달성하는 데 6분이 필요했으며, 이는 LC 하이드로겔이 혈액 응고 속도를 상당히 증가시킨다는 것을 보여준다. 조직 접착 물질은 중요한 안전 요소인 혈액 적합성이 필요하다. 용혈률은 접착 물질에 의해 파괴된 적혈구의 비율을 의미한다. 낮은 용혈은 우수한 혈액 적합성에 해당한다. 도 6a는 LC 하이드로겔의 용혈률이 3% 미만임을 나타내는데, 이는 제한 값인 5% 미만이며 하이드로겔이 혈액 적합성이며, 지혈 응용 분야에서 유망한 재료임을 확인할 수 있다.
한편, 혈소판 접착은 활성 혈소판이 출혈 상처에서 트롬빈 생성과 피브린 응고 형성을 촉진하는 폴립을 분비하기 때문에 중요한 혈전증 지표이다. 혈소판 접착은 SEM에 의해 관찰하였으며, 그 결과는 도 6e에 나타내었다. 하이드로겔의 미세 구조는 혈소판 접착에서, 부드러운 표면 미세 구조를 갖는 하이드로 겔은 거친 표면이 있는 것과 비교하여 혈소판에 부착되는 역할을 한다. LC-Fe3+ 및 LC-IO4 -는 모두 거친 하이드로 겔 토폴로지에 기인할 수 있는 높은 혈소판 접착력을 나타냈다(도 6e). 이를 통하여, LC 하이드로 겔은 응고(clot) 형성을 명확하게 가속화하여, 지혈 효능이 우수함을 확인할 수 있다.
(2) In vivo 지혈 효능 평가
쥐의 간 천공 상처 모델을 통해 지혈 활성을 평가하였다((Du, Xinchen, et al. Nature communications 12.1 (2021): 4733.). 쥐의 복부를 절개한 후 간을 들어올려 미리 무게를 잰 여과지 위에 놓았다. 그 후 간을 10mm 길이로 절개하여 출혈을 일으켰다. 그런 다음 LC-Fe3+ 및 LC-IO4 - 을 적용하고 대조군(NT)에 대한 치료를 하지 않고 혈액 손실을 측정하였다(n = 3).
도 6f는 출혈된 쥐를 중량이 측정된 왓트만 용지에 적셔서 중량을 측정하는 이미지이며, 도 6g는 지혈제를 첨가한 다음에 지혈되는 혈액의 양을 분석한 결과로서, LC 하이드로겔은 대조군에 비해 지혈에 효능이 우수함을 할 수 있다.
실험예 7. LC 하이드로겔의 In vivo 상처 치유 능력 평가
LC 하이드로겔의 in vivo 상처 치유 능력을 SD 래트 모델을 사용하여 평가하였다. 모든 동물 연구는 국가 규정에 따라 수행하였으며 Postech의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았다(IRB 번호 Postech-2022-0004). LC 하이드로 겔의 생체 접착 및 상처 치유 특성을 평가하기 위해, Sprague Dawley 래트(SD 150-200 g, 7 주 남성)를 이소플란을 사용하여 마취시키고 등을 면도하였다. 생검 펀치를 사용하여 각 래트의 후면에 3 개의 직경 8mm의 원형 절개를 가하였다. 절개는 하이드로겔(100 mg) 또는 피브린 접착제(양성 대조군)에 의해 신속하게 봉합하였으며, 처리되지 않은 절개부는 음성 대조군으로 사용하였다. 하이드로겔을 70% 에탄올 및 DPBS 용액 (3x)으로 세척하여 멸균하였다. 상처는 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 17 및 21 일에 촬영했으며, 하기 식 5를 사용하여 상대 상처 폐쇄(relative wound closure)(%)인 상처봉합률(%)을 계산하였다.
[식 5]
Figure PCTKR2023006486-appb-img-000009
여기서 Ato와 Atn은 0 일 및 n 일에 상처 면적이다(n = 1, 3 .... 21).
래트를 이식 후 3, 7 일 및 14 일 후에 안락사시켰고, 상처 크기를 측정 한 후 Masson's trichrome(MT)을 사용하여 후속 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 분석 및 조직학적 조사에 대해 상처를 함유한 상처 부위를 절제하고 P- 포름 알데히드 용액 (3.7 wt%)에 고정시켰다.
피브린글루(FG)와 하이드로겔 샘플로 치료한 후 피부 절개 이미지를 나타낸 도 7a를 참조하면, LC 하이드로겔로 처리된 상처는 피브린글루 처리된 상처와 처리되지 않은 상처(무처리군; NT)에 비해 첫날부터 훨씬 더 빨리 폐쇄되었음을 확인할 수 있다. 또한, LC-IO4 -가 LC-Fe3+보다 높은 치유율을 보였는데, 이는 LC-IO4 -의 높은 접착력 때문일 것으로 판단되다. LC-IO4 -로 처리한 상처는 절개 10일 후 95.3 ± 1.2% 회복된 반면, 처리되지 않은 상처(NT) 및 피브린 접착제 처리 상처(FG)는 각각 78 ± 1.53% 및 83.55 ± 1.7% 치유되었음을 확인할 수 있다.
또한, 재생된 래트 조직을 절개 후 3, 7, 14일에 조직학적으로 검사하여 상처 치유를 가속화하는 하이드로겔의 능력을 추가로 조사했으며, 그 결과는 도 8a에 나타내었다. 무처리군(NT)에서 염증을 나타내는 수많은 호중구가 관찰되었고, 하이드로겔 처리군은 호중구가 훨씬 적었다. LC-IO4 - 및 LC-Fe3+ 그룹의 새로 형성된 상피 혀(epithelial tongue)는 7일 후 각각 2.56 ± 0.13 및 2.36 ± 0.20 mm 길이로 무처리군(1.62 ± 0.02 mm)보다 상당히 길었다. 또한 도 8b는 LC-IO4 - 군이 세포핵을 나타내는 청자색 구성 요소를 더 많이 나타내는 Masson trichrome 염색 이미지를 나타낸다. 결과적으로, 무처리(대조군) 군보다 하이드로겔에 의해 처리된 상처 부위에서 더 많은 세포가 재생됨을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이를 통하여, 본 발명의 하이르도겔은 대조군들에 비해 창상 부위 면적이 빠른 시간 안에 줄어들어, 상처 치유 효능이 우수함을 뒷받침할 수 있다.
실험예 8. LC-IO-Dox 나노클러스터의 약물 방출 평가
도 12는 치료용 약물인 Dox가 포함된 LC-IO-Dox 나노클러스터를 Levanase 효소분해를 이용하여 72시간 동안 확인한 555nm 방출 파장에서의 Dox의 형광강도를 나타낸다.
도 12를 참조하면 free Dox가 방출되는 실험을 통해서, 스탠다드 커브를 작성하였으며(도 12a), 이를 통해서, 증류수 또는 1x PBS에서 LC-IO-Dox 나노클러스터에서 방출되는 양을 정량하였다.(도 15b) 이를 통하여, LC-IO-Dox 나노클러스터 내에 Dox가 잘 로딩되었음을 확인할 수 있으며, 이로부터 능동적 표적화를 통해 암세포에 적용되었을 때 나노클러스터의 팽창(swelling) 또는 가수분해에 의해 항암제인 Dox가 분출함을 확인할 수 있다.
실험예 9. 레반, 카르복시메틸화된 레반, 카테콜-레반 복합체 및 LC-IO 나노클러스터의 항균 활성 평가
레반, 카르복시메틸화된 레반, 카테콜-레반 복합체 및 LC-IO 나노클러스터의 항균 활성을 대장균(E. coli)을 이용하여 평가하였으며, 레반, 카르복시메틸화된 레반 및 카테콜-레반 복합체에 대한 결과는 도 13, LC-IO 나노클러스터에 대한 결과는 도 14에 나타내었다[NC: 음성 대조군, PC: 양성 대조군(Ampicilin, 1uM)].
구체적으로, 시료의 농도를 달리하여 처리한 후 OD 값을 이용하여 세균의 성장을 측정하여 대장균에 대한 레반(levan), 카르복시메틸화된 레반(CM-levan) 및 레반-카테콜 복합체(levan-catechol)의 항균 활성을 평가하였다(도 13). 그 결과, 순수 레반(levan)은 3시간 배양 후 대장균의 성장에 대한 억제 효과를 나타냈으며 농도가 증가함에 따라 항균 활성이 증가하였다(도 13a). 카르복시메틸화된 레반은 더 빠른 대장균의 성장에 대한 억제 효과를 보였고, 단독 레반과 비교하여 농도에 따른 OD 값의 유사한 양상을 나타내어 유의한 차이는 없었다(도 13b). 그러나, 레반-카테콜 복합체의 경우 15 mg/mL 이상의 농도에서 억제에 유의한 차이가 없었으며 OD 값은 12시간 이후 시간이 지남에 따라 점차 증가하였다(도면 미도시). 이는 배양 배지가 갈색으로 변하고 OD 값을 방해하는 카테콜 그룹의 산화 때문인 것으로 판단된다(도 13c 및 도 13d). OD 값을 확인하기 위해 콜로니 형성 분석(도 14)을 수행했는데, LC-IO 나노클러스터로 처리한 후 형성된 콜로니의 수가 농도가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
한편, 레반-카테콜 산화철 나노클러스터의 경우, 나노클러스터의 색상이 OD 값을 방해하기 때문에 콜로니 형성 단위만을 사용하여 대장균의 억제를 평가하였다(도 14). 농도가 증가함에 따라 세균의 생존율은 감소하였고, 35mg/mL에서는 세균의 51%가 생존하였다. 그러나 다른 유도체와 비교하여 나노클러스터는 낮은 억제 능력을 나타냈는데, 박테리아 세로로 레반이 대사될 수 있기 때문일것으로 추론됩니다 이는 박테리아 세포로 레반이 대사될 수 있기 때문일 것으로 추론된다.. 레반이 박테리아를 죽이는 이유는, 나노파티클 자체의 미생물에 대한 독성, 삼투 스트레스를 유발하고/하거나 수분 활동을 감소시키고 필수 영양소의 박테리아 흡수와 경쟁하는 능력 때문인 것으로 판단된다. 레반의 항균 활성을 고려할 때 레반은 상처 치유 응용 분야에 적합한 후보이다. 항균제는 박테리아 감염을 예방하거나 줄이는 데 도움이 되기 때문에 상처 치유에 중요하다. 상처는 박테리아가 증식하여 치유 과정을 늦추거나 방해하는 감염을 일으킬 수 있는 진입점을 제공할 수 있다. 따라서 혈액 조직의 재건이 이루어지기 전에 세포 성장 촉진에 필요한 영양분을 상처 부위에 공급하는 것이 중요하며, 미생물은 잘 활용하지 않으나, 인간세포에 활용될 수 있는 영양분이나 대사물이 바람직하다.
실험예 10. 돼지 피부를 이용한 LC-IO 나노클러스터의 조직 접착력 실험
만능재료시험기(Instron 5544, Norwood, MA, US)를 이용하여 전단응력 측정을 통해 생체 조직에 대한 LC-IO 나노클러스터의 접착력을 평가하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, 레반-카테콜 복합체를 나노클러스터화 함으로써 나노클러스터의 큰 표면적에 의한 접착 능력을 활용하면 레반-카테콜 복합체의 수중 접착력을 향상시키고 저장 능력을 향상시킬 가능성이 있다. 또한, 용액 내 형성된 나노클러스터는 자성에 의해서 용이하게 수집이 가능하고 물 또는 0.1 PBS에 재현탁하여 최소 침습 절차와 함께 사용할 수 있다. 랩 전단 응력 테스트는 인간 피부 조직을 모방한 두 개의 돼지 피부 표면을 결합하는 나노클러스터 접착 능력을 평가하는 데 사용되었다(도 15a). 5 mg/mL의 낮은 농도에서도 LC-IO 나노클러스터는 시중에서 판매되는 피브린글루(13.47±1.8 kPa)에 비해 두 배 더 높은 높은 접착 강도(30.12±1.2 kPa)를 나타냈다. 접착 강도는 포화 상태에 도달할 때까지 나노클러스터의 농도가 증가함에 따라 증가한 다음 기판에서 사용할 수 있는 한정된 접착 표면이 거의 점유된 곳에서 감소하였다. 또한, 나노클러스터는 피브린글루에 비해 더 높은 접착 에너지와 영률을 나타내었고 전단 강도와 동일한 패턴을 보였다.
실험예 11. LC-IO 나노클러스터의 In vitro 지혈 효능 평가
LC 하이드로겔의 지혈 효능을 평가하기 위하여, 용혈 분석을 수행하였다.
용혈을 일으킬 수 있는 무기 나노입자의 적용은 지혈제로서의 사용을 제한할 수 있다(도 16a). 본 발명에서는 이러한 문제점을 극복하기 위해 본 발명에 따라 제조된 유기 나노클러스터와 적혈구에 대한 영향을 용혈 분석을 사용하여 평가하였다(도 16). 컷으로 5% 용혈 백분율 가리킨다.
용혈률은 앞서 기술한 방법에 따라 평가하였다(Suneetha, Maduru, Kummara Madhusudana Rao, and Sung Soo Han. ACS omega 4.7 (2019): 12647-12656.). 구연산 토끼 전혈(sodium citrate solution 3.8%)을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 PRP(platelet-rich plasma)를 분리하고 적혈구(RBC)를 DBPS로 4회 세척한 후 용혈 분석에 사용하였다. 하이드로겔 혈액적합성을 평가하기 위해 500 μL의 희석된 RBC(DPBS 1x에서 10 v/v %)를 마이크로튜브에서 다양한 농도의 나노클러스터 용액 100 μL에 첨가한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 또한, 0.1% Triton-X 및 DPBS(100μL)를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 3500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 수집하고 540 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다. 용혈률은 상기 실험예 6에서 기술하였던 식 4를 사용하여 계산하였다
도 16b 및 16c를 참조하면, 35mg/mL의 농도에서도 LC-IO 나노클러스터는 1% 미만의 용혈 백분율을 나타냈으며 이를 통하여, LC-IO 나노클러스터가 혈액에 적합하고 생물의학 응용 분야에서 유망한 재료임을 확인할 수 있다.
실험예 12. LC-IO 나노클러스터의 세포 생존력 및 이동 평가
L929 및 HaCaT 세포에 대한 나노클러스터의 세포독성을 CCK-8 검정을 사용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다. L929 세포는 10.0 vol% FBS 및 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PRMI 1640에서 배양하였으며 HaCaT 세포는 10.0 vol% FBS, 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 포함된 DMEM에서 가습 배양기에서 37°C에서 5% CO2 조건으로 배양하였다.. L929 및 HaCaT 세포를 48웰 플레이트(200μL)에 5×103 세포/웰의 밀도로 시딩하고 5% CO2 및 37°C에서 밤새 배양한 후 배지를 다양한 농도의 나노클러스터 용액으로 교체하였다( 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL). 배양 24, 48 또는 72시간 후 배양 배지를 Cell Counting Kit-8 용액(10:1 v/v)과 혼합된 200 μL의 배양 배지로 교체하고 추가 1시간 동안 37°C에서 배양하였다. 세포 생존율은 상기 실험예 5에 기술하였던 식 2를 사용하여 계산하였다. OD값을 마이크로플레이트 판독기(Synergy HTX, 미국)를 활용해서 450nm에서 측정하였다.
세포 스크래칭 분석은 나노클러스터 용액을 첨가하기 전에 500 ± 100 μm 폭의 무세포 갭을 형성하기 위해 Culture-Insert 2 웰을 사용하여 수행하였다. Culture-Insert 2개의 웰을 24웰 플레이트에 부착한 후 HaCaT 세포 및 L9292 세포에 대해 각각 3 x 105 및 1.5 x 105 세포/mL의 밀도를 갖는 70 μL 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하고 바깥쪽 영역을 채워진 세포 배양 배지는 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 부착된 Culture-Inset 2 웰을 제거하고 부착되지 않은 세포를 DPBS로 세척하여 제거한 후 나노클러스터 용액을 첨가하였다. 갭 폐쇄는 광학 현미경(Optika, Italy)에 의해 24시간 간격으로 모니터링하였고 이미지화하였으며 스크래치 폐쇄 백분율은 상기 실험예 7에 기술하였던 식 5에 의하여 분석되하였고, 각 그룹에 대해 3회 시도하였다(식 5에서 Ato와 Atn은 0 일 및 n 일에 상처 면적이다(n = 24, 48).
도 17a를 참조하면, LC-IO 나노클러스터는 L929 및 HaCaT 세포 성장에 이상적으로 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 두 세포에 대하여 처리된 LC-IO 나노클러스터는 25-400 μm/mL 범위에서 농도가 증가함에 따라 생존력이 증가하여, HaCaT 세포 성장을 촉진하는 것으로 되었다. 결과적으로, LC-IO 나노클러스터는 25-400 μm/mL 범위에서 100% 이상의 세포 생존율을 나타내어 생체 적합성을 나타냄을 확인할 수 있다.
다음으로 상처-스크래치 테스트 동안 L929 및 HaCaT 세포에 200 μg/mL의 LC-IO 나노클러스터를 적용하여 LC-IO 나노클러스터가 세포 이동에 미치는 영향을 평가하였다. 도 17c를 참조하면, LC-IO 나노클러스터로 처리된 L929 및 HaCaT 세포가 24시간 및 48시간 동안 공동 배양(co-incubation)하는 동안 대조군의 세포보다 훨씬 빠르게 이동함을 확인할 수 있으며, 도 17b를 참조하면, LC-IO 나노클러스터는 대조군 대비 24 및 48 시간 후 보다 빠른 폐쇄(scratch closure)를 나타냄을 확인할 수 있다. 상기 LC-IO 나노클러스터에 대해 얻은 우수한 세포 증식 및 빠른 이동 데이터는 상처 치유 응용 분야에 매우 유용하다.
실험예 13. LC-IO 나노클러스터의 In vivo 상처 치유 능력 평가
LC 나노클러스터의 in vivo 상처 치유 능력을 SD 래트 모델을 사용하여 평가하였다. 모든 동물 연구는 국가 규정에 따라 수행하였으며 Postech의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았다(IRB 번호 Postech-2022-0004).
1차원 피부접착실험의 경우(도 18d] 이소플루란으로 쥐를 마취하고 등을 면도를 한 후 피부 절개는 길이 1.5 cm, 깊이 3.0 mm의 좁은 피부 상처를 만들었다. 절개부를 10 μl LC-IO 나노클러스터 용액(25 mg/ml), 피브린글루로 처리하거나(FG), 또는 처리하지 않았다(NT). 쥐가 마취 상태에 있는 동안 상처 부위를 3분 동안 고정시켰다. 절개 7일 후 래트를 안락사시키고, 상처 부위를 포함하는 1cm X 2cm 피부를 절제하고 p-포름알데히드 용액(3.7wt%)에 고정하고 파라핀에 포매한 다음 단면 절편을 H&E으로 염색하였다(도 20).
한편, LC 나노클러스터의 생체 접착 및 상처 치유 특성을 평가하기 위해, Sprague Dawley 래트(SD 150-200 g, 7 주 수컷)를 이소플루란을 사용하여 마취시키고 등을 면도하였다. 생검 펀치를 사용하여 각 래트의 후면에 3 개의 직경 8 mm의 원형 절개를 가하였다. 절개는 절개부를 10 μl 나노클러스터 용액(25 mg/ml), 피브린 글루(양성 대조군)에 의해 신속하게 봉합하였으며, 처리되지 않은 절개부는 음성 대조군(NT)으로 사용하였다. 상처는 0, 1, 3, 5, 7, 10 및 14일에 촬영했으며, 상기 실험예 7에 기술하였던 식 5를 사용하여 상대 상처 폐쇄(relative wound closure)(%)인 상처봉합률(%)을 계산하였다(식 5에서, Ato와 Atn은 0 일 및 n 일에 상처 면적이다(n = 1, 3, 7 .... 14).
래트를 절개 후 3, 7 일 및 14 일 후에 안락사시켰고, 상처 크기를 측정 한 후 Masson's trichrome(MT)을 사용하여 후속 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 분석 및 조직학적 조사에 대해 상처를 함유한 상처 부위를 절제하고 P- 포름 알데히드 용액 (3.7 wt%)에 고정시켰다.
피브린글루(FG)와 LC 나노클러스터의 샘플로 치료한 후 피부 절개 이미지를 나타낸 도 18b를 참조하면, LC 나노클러스터로 처리된 상처는 피브린글루 처리된 상처와 처리되지 않은 상처(무처리군; NT)에 비해 첫날부터 훨씬 더 빨리 폐쇄되었음을 확인할 수 있다.
LC-IO 나노클러스터의 생체 내 접착력을 평가하기 위해 SD 속도 모델의 뒷면에 1차원 상처를 만들어 나노입자와 접착한 상처의 사진 이미지를 나타낸 도 18d를 참조하면, LC-IO 나노클러스터로 처리한 상처 부위에서 상처 가장자리는 서로 매끄럽게 접착되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 두 조직이 서로 완벽하게 접착되고 정렬될 수 있도록 하는 작은 크기의 나노클러스터 때문인 것으로 판단된다. 반면, 피브린글루가 도포된 상처 부위에는 접착제가 완벽한 상처 부위의 두 조직 사이의 직접적인 접촉이 이루어지지 않았다. 이 결과는 H&E 및 MT 염색과 더 일치하는 경우 나노클러스터가 단단한 거시적 접촉 형성하여 조직의 빠른 복원을 유도함을 의미한다. 도 20를 참조하면, LC-IO 나노클러스터 그룹의 육아 조직 면적은 다른 두 그룹에 비해 좁음을 확인할 수 있다.
SD 쥐 모델의 전체 두께 절개는 LC-IO 나노클러스터의 치유 능력을 평가하는 데 사용되었다. 도 18 b 및c는 상처의 동역학을 절개 후 첫날부터 시작하여 0일 영역을 기준으로 회복된 영역 백분율로 표시한 여러 시점의 피부 이미지를 보여준다. 7일 기준으로 LC-IO 나노클러스터 처리군은 상처의 86%가 회복되었으며 피브린글루와 미처리 상처(NT)는 각각 63%와 6%만 회복되었다. 재생된 쥐 조직은 상처 치유를 가속화하는 나노클러스터의 능력을 더 조사하기 위해 절개 후 3, 7, 14일에 조직학적으로 검사하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과는 도 19a에 나타냈으며, 절개 3일 후 LC-IO 나노클러스터로 처리된 그룹에서 수많은 새로운 혈관이 관찰되었으며 이는 상처 복구에 중요한 더 빠른 혈관신생을 나타낸다. 새로 생성된 혈관은 임시 육아 조직 생성에 기여하고 새로운 조직의 성장을 지원하고 치유 과정을 지원하는 데 필요한 확장 조직에 영양과 산소를 전달한다. 혈관신생이 충분하지 않으면 상처가 치유되는 데 시간이 더 오래 걸리고 감염에 더 취약할 수 있다. 또한 혈관신생 과정은 상처 부위에서 노폐물과 죽은 세포를 제거하는 데 도움을 주어 치유 과정을 더욱 돕는다. 또한, LC-IO 나노클러스터로 처리한 상처는 더 빠른 재상피화를 보였으며, 3일째부터 새로 형성된 상피 혀가 LC-IO 나노클러스터로 처리한 그룹에서만 관찰되었다. 성장과 이주, 상피화는 상처 표면을 덮고 피부의 보호 장벽 기능을 회복하기 위해 상피 세포의 이동 및 증식을 수반하기 때문에 상처 치유 과정에서 중요한 단계이다. 이 과정은 감염 예방, 조직 재생 촉진 및 항상성 유지에 중요하다. 상피화를 통한 표피의 복원은 성공적인 상처 치유의 특징이다. 나노클러스터 그룹의 상처 표면 폭은 피브린글루 및 처리되지 않은 그룹에 비해 더 짧았다.
Masson's trichrome stain(MT)은 재생 조직의 콜라겐 분포를 결정하는 데 사용되는 일종의 조직화학적 염색이다. 케라틴과 근육 섬유는 붉은색, 콜라겐은 파란색, 세포질은 연한 빨간색 또는 분홍색, 세포핵은 짙은 갈색 또는 검은색으로 염색된다. 파란색의 깊이가 깊을수록 더 성숙한 콜라겐이 함유되어 있다. 14일째 MT 결과(도 19b)는 LC-IO 나노클러스터로 처리하면 상처가 더 가까워질 뿐만 아니라 육아 조직이 더 성숙한 콜라겐 함량 구조로 더 빠르게 리모델링된다는 것을 보여준다. 콜라겐 지수가 높을수록 섬유아세포의 수가 많다는 것을 나타낼 수 있다. 섬유아세포는 콜라겐 섬유를 생성하고 구성하는 역할을 하기 때문이다.
실험예 14. LC-IO 나노클러스터의 In vitro 세포주에서 Differentially Expressed Genes (DEGs) 분석
LC 나노클러스터의 in vivo & in vitro 상처 치유 능력을 이해하기 위해서 RNAseq 분석을 통해 표준유전체가 완료된 인간 유전체를 활용해서, 인간을 상처치유 대상으로 LC-IO 나노클러스터가 인간상처치유에 관여하는 유전자가 무엇인지 확인하기 위해서 유전자 발현 변화와 패턴 (Differentially Expressed Genes (DEGs)) 분석을 실시하였다. 인간혈관세포주인 HMEC01, 인간 피부 fibroblast 세포인 HDfn을 10.0 vol% FBS 및 1 vol% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PRMI 1640에서 배양하였으며, 가습 배양기에서 37°C에서 5% CO2 조건으로 LC-IO 나노클러스터가 있는 조건에서 배양하였다. 배양 후 배지를 버린후, 1mL trizol로 세포를 넣고 -70°C 에 급속냉동 시킨후, ㈜ROKIT Genomics에 시험분석을 의뢰하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 표 2에 첨부하였다. 하기 표 1 및 표 2를 참조하면, 주로 혈관생성 및 상처치료 관련된 유전자들이 LC-IO 나노클러스터 처리군보다 과다 발현된 것을 확인할 수 있다.
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본 발명에 따른 레반-카테콜 복합체(LC) 및 이를 포함하는 LC 하이드로겔, 및 LC 나노클러스터는 젖은 돼지 피부에 대한 접착력이 순수 레반 및 상업적으로 이용가능한 피브린글루 접착제 접착력보다 약 3배 더 이상 우수함을 확인하였다. 또한, 레반-카테콜 복합체는 합성 후 낮은 수준의 엔도톡신으로 인해 음성 대조군에 가까운 낮은 면역 반응을 보였으며, 이에 따라, 레반-카테콜을 포함하는 LC 하이드로겔 및 LC 나노클러스터는 생체적합성이 있음을 확인하였다. 또한, LC 하이드로겔 및 LC 나노클러스터는 뛰어난 조직 접착력, 지혈 특성 및 상처 치유 촉진 효과를 나타내어, 출혈 조절 및 상처 치료를 위한 잠재적인 대체 상처 드레싱 및 조직 접착제로 응용할 수 있음을 확인하였다. 더불어, 본 발명에 따른 LC 나노클러스터는 약물 방출 기능을 탑재함으로써 약물 전달체로 응용할 수 있음을 확인하였다.
이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 것이다. 또한 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하는 것이며, 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있다. 즉 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위 내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 저술한 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 구현하기 위한 최선의 상태를 설명하는 것이며, 본 발명의 구체적인 적용 분야 및 용도에서 요구되는 다양한 변경도 가능하다. 따라서 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한 첨부된 청구 범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 카르복시메틸화된 레반 및 도파민을 포함하는 레반-카테콜 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카르복시메틸화된 레반은 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함하는 것인, 레반-카테콜 복합체:
    [화학식 1]
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    상기 화학식 1에서,
    상기 n, m은 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+m=1이다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 레반-카테콜 복합체는 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함하는 것인, 레반-카테콜 복합체:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2023006486-appb-img-000213
    상기 화학식 2에서,
    상기 n, x는 각각 반복단위 내 몰분율로서, 0.7≤n≤0.95, 0.05≤m≤0.3, n+x=1이다.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 카르복시메틸화된 레반 및 도파민의 중량비는 1 : 0.5 내지 0.9인, 레반-카테콜 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조직 접착용 조성물은 염화철, 과요오드산나트륨, 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 가교제로 더 포함하는 것인, 조직 접착용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 조직 접착용 조성물은 지혈용, 상처 치유용 또는 봉합용인, 조직 접착용 조성물.
  8. (a) 레반을 카르복시메틸화 하여 카르복시메틸화된 레반을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 카르복시메틸화된 레반을 EDC-NHS 커플링을 통하여 도파민에 접합하는 단계;를 포함하는 레반-카테콜 복합체의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 레반-카테콜 복합체; 및 소수성 물질을 포함하는 나노클러스터.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 나노클러스터는 상기 소수성 물질을 함유하는 코어; 및 상기 코어를 감싸고 상기 레반-카테콜 복합체를 함유하는 쉘;을 포함하는 코어-쉘 형태인, 나노클러스터.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 나노클러스터의 평균 직경은 1 내지 600 nm인, 나노클러스터.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 자성 나노입자, 금속 나노입자, 약물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 나노클러스터.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 자성 나노입자는 산화철(II), 산화철(III), 코발트 페라이트, 징크 페라이트, 니켈 페라이트, 망간 페라이트, 철, 코발트, 니켈, 망간, FeAu, FePt, CoNi 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 금속 나노입자는 금, 실리카, 타이타니아 및 마그네슘 중에서 선택되는 1종 이상이며,
    상기 약물은 소수성 약물, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 무기 물질, 항생제, 항암제, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제. 항히스타민제, 국소 마취제, 항혈관형성제, 혈관활성제, 항응고제, 면역조절제, 세포독성제, 항체, 신경전달물질, 정신작용약, 올리고누클레오티드, 지질, 세포, 조직, 암 화학요법제 및 백신으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질인, 나노클러스터.
  14. 제9항에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 나노클러스터는 소수성 물질로서, 산화철 나노입자를 포함하는 것인, 조직 접착용 조성물.
  16. 제9항에 따른 나노클러스터를 포함하는 약물 전달체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 나노클러스터는 소수성 물질로서, 자성 나노입자 및 약물이 결합되어 형성된 자성 나노입자-약물 복합체를 포함하는 것인, 약물 전달체.
  18. (A) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 레반-카테콜 복합체, 및 소수성 물질이 분산된 나노클러스터 제조용 용액을 수용액 상에 전기 방사하는 단계;를 포함하는 나노클러스터의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 나노클러스터 제조용 용액은, 제1 용매에 상기 레반-카테콜 복합체가 분산된 제1 분산용액; 및 제2 용매에 상기 소수성 물질이 분산된 제2 분산용액;을 혼합하여 수득되는 것이고,
    상기 제1 용매 및 제2 용매는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 헥산(hexane), 톨루엔(toluene), 테트라하이드로퓨란(THF: tetrahydrofuran), 다이메틸포름아미드(DMF: dimethylforamide), 다이메틸 설폭사이드(DMSO: dimethyl sulfoxide) 및 알코올계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 나노클러스터의 제조방법.
  20. 제5항에 따른 레반-카테콜 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 조직 접착 방법.
  21. 제14항에 따른 나노클러스터를 포함하는 조직 접착용 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하는 단계;를 포함하는 조직 접착 방법.
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