CN114432243B - 一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用 - Google Patents

一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用，其制备方法包括以下步骤：油酸和瓜尔豆胶进行反应，得到疏水改性瓜尔豆胶：γ‑聚谷氨酸与活化后的疏水改性瓜尔豆胶反应，得到γ‑聚谷氨酸‑瓜尔豆胶胶束单体；伴刀豆蛋白A活化后与胶束上瓜尔豆反应，得到γ‑聚谷氨酸‑瓜尔豆胶胶束单体‑瓜尔豆胶胶束。本发明制备得到了具有控制血糖功能的材料构建纳米运输体系，可用于开发新型功能性材料、制备高效能胰岛素输运体系。

Description

一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用。
背景技术
糖尿病分为I型和II型糖尿病，是目前世界范围内最普遍的代谢性疾病之一，它的主要特征是体内葡萄糖代谢明显减少或者丧失，最终导致蛋白质、碳水化合物和脂肪代谢的紊乱。其直接发病原因主要有胰岛素分泌不足、胰岛素失活或者二者同时存在。没有足够有效的胰岛素而导致身体组织，尤其是肝脏、肌肉和脂肪组织不能吸收并利用血液循环中的葡萄糖，由此产生高血糖水平而被称为高血糖症。
胰岛素(insulin,INS)可以调节糖代谢，具有降低血糖的作用，是治疗糖尿病的首选药物，到目前为止,皮下注射给药是胰岛素最主要的给药途径。尽管大量的事实证明这种给药方式是很有效的,但这样却会导致局部胰岛素过多症,刺激平滑肌细胞增殖,使葡萄糖转化成动脉壁的脂类物质等。另外，心理压力上的痛苦、生理的不良影响、治疗方式的不便、相关治疗费用高昂、给药方式有一定的危险性、易感染疾病、对胰岛素产生依赖、而且在胰岛素注射部位会由于胰岛素局部沉淀而导致局部肥大以及脂肪沉淀等都是长期注射给药固有的缺点。由于直接口服给药的生物利用度极低，因此近年来，研究者们主要利用天然或人工聚合物、金属或无机化合物等材料合成纳米粒、脂质体、微囊与微球和胶束等各种载体来制备胰岛素的剂型，可减少胃肠道对胰岛素的破坏与降解。
对于有效的胰岛素口服输运系统的开发，通常需要考虑到消化道内环境、吸收屏障和在高血糖血液环境下药物释放等因素。有研究表明，结肠是多肽类和蛋白类药物口服后主要的吸收部位，因此定位于结肠吸收的药物载体可能更有利于胰岛素被机体吸收进入体循环，进一步发挥降血糖效果。
近年来，由于易得性、无毒性和可生物降解性，被广泛认为是药物应用。由于其亲水性，不同类型的瓜尔豆胶(Guar gam，GG)基质已被开发出来，以口服控制的亲水性药物。由于其受控的药物释放特性、对宽pH范围的稳定性以及对肠液中微生物降解的敏感性，GG也被认为是一种针对结肠特定药物的载体。近几年各种策略已在结肠内进行，包括时间依赖性的传递系统，依赖于药物的传递系统和使用细菌来控制药物释放模式的递送系统。因此，基于瓜尔豆胶的基质在胃中会膨胀到最小，因此抑制了胶囊化的药物分子的释放；药物进入肠道后，由于其碱性性质，瓜尔豆胶基质结构打开，其中包裹的药物被释放并且吸收。
研究表明，胰岛素是一种剂量依赖性药物，剂量的准确对患者的健康十分重要。葡萄糖响应体系能够响应环境中葡萄糖浓度的变化，智能调节胰岛素的释放量。该体系可一次性输运较多胰岛素，减少患者服药次数，延长其在体内的作用时间，提高输运体系的生物利用度以达到更好的控糖功效，长时间内维持患者正常的血糖水平。
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种水溶性高分子阴离子天然氨基酸均聚物，目前人们主要通过多种杆菌合成并分泌到细胞外的发酵液后进行提纯得到，是由D,L-谷氨酸单体经γ-酰胺键结合形成的。γ-PGA由于无自身抗原性，而且生物相容性良好、由于可形成氢键而水溶性强、由于具有肽键易被酶作用而具有可降解性，并且利于化学修饰，因此在生物医学领域有较好的应用前景。γ-PGA为侧链为羧基的酸性聚电解质，pKa＝2.23，在pKa等值pH上下变化时，解离程度会发生突变，使其溶解性也会发生突变，因此γ-PGA是一种具有pH敏感性的天然可降解材料。在胃肠道生理环境中，γ-PGA首先是经过胃部，胃酸环境的pH＝1.2，小于其pKa值，γ-PGA呈α螺旋状，又由于γ-PGA带正电产生静电排斥作用而呈紧密的球状，稳定包裹药物不被分解；接着γ-PGA再到肠道，肠液环境中pH逐渐升高趋近于中性，γ-PGA也随之离子化呈无规则线团状，有利于药物在肠液中的释放，达到pH响应的效果。
瓜尔豆胶(Guar gam，GG)的主要成分是一种天然植物来源的多糖，它是由半乳糖和甘露糖按1:2的比例组成的非离子型半乳甘露聚糖。其分子主链是聚甘露糖，D-吡喃甘露糖单元之间由β-(1,4)糖苷键连接，侧链是一分子α-D-吡喃半乳糖，绝大多数情况下是由α-(1,6)糖苷键连接在每两个甘露糖分子的第二个糖残基上，瓜尔豆胶分子结构与纤维素很相似，这种相似的分子结构使它和纤维素一样有着很强的亲和性。瓜尔豆胶具有很强的水溶性，
伴刀豆球蛋白A(ConA)是一种从刀豆中提取且对富含甘露糖的糖类有特异性高亲和的植物糖蛋白，在中性条件下以四聚体的形式存在，有四个和糖蛋白结合的位点，每个单体都能够与糖残基结合。伴刀豆球蛋白A其中一侧的一个或两个位点可以结合糖残基。
在口服运输体系的研究中，如何使纳米体系在酸碱度变化巨大的胃肠道中保持稳定，如何使纳米粒子在肠部高效吸收，如何使纳米粒子在糖尿病病人的高血糖血液环境中稳定且持续发挥作用是糖尿病纳米口服运输体系的重点难点。现有口服胰岛素递送技术由于使用合成材料，其生物相容性较差，容易导致毒副作用；并且单一载体材料构建的纳米颗粒其抵御胃肠道消化降解的能力也不足
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种响应pH和葡萄糖的纳米载体及其应用，将两种及以上的天然材料结合构建的纳米胰岛素载体能够有效提高胰岛素在体内输运的稳定性及递送效果。
本发明的第一个目的是提供一种响应pH和/或葡萄糖的纳米载体的制备方法。
本发明的第二个目的是提供所述的制备方法制备到的纳米载体。
本发明的第三个目的是提供所述纳米载体制备pH和/或葡萄糖响应的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述纳米载体作为pH和/或葡萄糖响应的药物载体的应用。
本发明的第五个目的是提供一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子。
本发明的第六个目的是提供一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子的制备方法。
本发明的第七个目的是提供所述的制备方法制备得到的装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子。
本发明的第八个目的是提供所述的纳米粒子在制备药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明，利用不同物质基团之间的结合合成包裹胰岛素的γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶-伴刀豆蛋白A(γ-PGA-GG-Con A)纳米颗粒。具体的：首先，为了形成两亲性的胶束单体，利用油酸对瓜尔豆胶(guar gum,GG)进行疏水改造：结构式为CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7COOH的油酸是天然动植物中的不饱和十八烯酸，可以通过酰化反应的高效催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)和脱水剂N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的催化将瓜尔豆胶上的羟基与油酸上的羧基进行脱水反应得到疏水改性的瓜尔豆胶；然后，通过羰基二咪唑(CDI)将pH感应性的γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid,γ-PGA)上的氨基与瓜尔豆胶上的羧基反应形成具有两亲性的γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶(γ-PGA-GG)胶束单体，利用胶束单体自组装形成纳米胶束，同时将胰岛素负载进胶束中，解决了纳米粒子在胃肠部不同pH环境下不能稳定存在的问题，并且提升了体系在通过胃部消化系统时的稳定性，避免在通过胃肠道时的消化破坏；然后利用伴刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)与甘露糖残基特有的亲和力，与胶束上瓜尔豆胶的糖残基结合，使纳米粒子在胃肠道低糖环境下稳定而在糖尿病病人的高血糖血液环境下实现纳米粒子的解离；最后利用透析法将胰岛素(insulin,INS)包裹在胶束疏水核内，最终形成了一种搭载胰岛素的双重响应γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶纳米胶束(γ-PGA-GG-ConA-INS纳米粒子)。探究其热稳定性、结构以及在体内和体外实验，均发现这种此种方法和成的纳米胶束有良好的pH和高葡萄糖感应性，并且能够起到控制释放胰岛素的能力，以及在体外环境中对细胞的低毒性。
其中，γ-聚谷氨酸是一种谷氨酸γ位上酰胺键聚合的同质多肽，在pH低于4.0时呈α螺旋，在中性条件下呈无规则线性结构，具有明显的pH响应性；瓜尔豆胶是一种天然多糖，其中甘露糖与半乳糖比例为2:1，十二烷基疏水改性的瓜尔豆胶与亲水的γ-聚谷氨酸通过化学键结合形成两亲性胶束单体；凝集素可以特异性结合某些糖类，有一个以上的糖结合位点；伴刀豆球蛋白A(ConA)是植物凝集素的一种，有四个和糖蛋白结合的位点，特异性结合吡喃羰基甘露糖，因此从刀豆中提取的ConA对血糖中的甘露糖残基有特异性高亲和能力，在中性条件下以四聚体的形式存在，有四个和糖蛋白结合的位点；由于糖尿病患者的血糖浓度过高，因此血液中的过多的葡萄糖与瓜尔豆胶上的糖残基结合伴刀豆球蛋白A的结合位点能力强，血糖竞争性的与刀豆球蛋白A结合从而致使伴刀豆球蛋白A从胶束单体上脱离下来。
具体的，由于钙离子，锰离子是刀豆蛋白的金属阳离子活化剂，因此，可先用钙离子和锰离子在pH＝7的磷酸缓冲溶液下活化伴刀豆球蛋白A的四聚体与糖残基的结合能力，再将伴刀豆球蛋白A与已形成的γ-多聚谷氨酸-瓜尔豆胶(γ-PGA-GG)胶束上的糖残基结合使胶束更加稳定。在口服以此胶束为载体的胰岛素药物进入结肠中被吸收时，若因糖尿病患者的血糖浓度过高，而使血液中的葡萄糖比瓜尔豆胶上的糖残基结合伴刀豆球蛋白A的结合位点能力强,致使伴刀豆球蛋白A从胶束单体上脱离下来，同时又因γ-聚谷氨酸在结肠中的中性条件下离子化成无规则状而导致胶束单体不稳定后胰岛素将被释放出来。
对输运体系的表征研究中，采用红外波普、TEM、动态光散射分析等检测纳米体系的结构。红外波谱的数据表明γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子已成功合成，TEM图像表明体系为直径在500nm左右的均匀圆形结构，动态光散射分析也表明粒子具有较小的粒径。同时，粒子带负电，其带电量相对较大，粒子间静电斥力帮助小粒径的粒子分散，避免其团聚，这辅助了粒子保持小粒径，促进其被肠上皮吸收，也帮助维持了粒子的稳定性，这有助于粒子通过M细胞穿过肠上皮，进入机体血液循环。与现有技术中的白蛋白纳米载体或聚乙二醇等纳米载体相比，本发明制备的纳米粒子的粒径较小，更倾向于具备较高吸收率。此外，热重分析表明，载体的包裹减缓了胰岛素的热分解速率，在室温到一定高温区间中具有良好的稳定性。
对γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的体外释放研究表明，发明制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子在模拟单一胃肠和单一高糖环境下都具有较好的稳定性，这一特点符合对于纳米粒子设计的目的。在单一的pH＝1.5到pH＝7.4的范围内γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子表现稳定没有明显释放胰岛素的现象，在单一的血糖浓度0到18mg/ml范围内亦没有明显释放胰岛素的现象，而且在中性pH并具有高糖环境下该体系具有良好的响应性并达到较好的胰岛素释放效果。
体外动物实验，对STZ诱导的SD小鼠长期口服胰岛素输运体系后的血糖、血浆胰岛素水平以及针对肌肉、肝组织的胰岛素免疫组织化学染色方面的研究表明：服用γ-PGA-GG-INS纳米粒子的STZ诱导SD小鼠与对照组在毒副作用上无明显差异，服用γ-PGA-GG-INS纳米粒子的STZ诱导SD小鼠血糖于口服后3h血糖和血浆胰岛素水平达到峰值，并在较长时间内出于稳定状态，γ-PGA-GG-INS纳米粒子具有降血糖的功能，该输运体系均保持了胰岛素的活性，能够有效运用于STZ诱导一型糖尿病小鼠的治疗。
综上所述，γ-PGA-GG-INS纳米粒子最终的Zeta电位仍负值证明了INS被包裹进入了胶束内，每个合成步骤中胶束的电位绝对值都保持在近20mV，此结果显示胶束稳定性较好。红外光谱结果显示，粒子均成功合成，并装载了胰岛素。γ-PGA-GG胶束单体的粒径约为300nm、γ-PGA-GG-Con A胶束粒径约400-500nm，γ-PGA-GG-INS纳米粒子粒径约600nm，透射电镜观察其粒径外观近似球形，粒子直径约为500～600nm，透射电镜结果与粒径检测结果相符，外观近球形。粒子在体外缓冲液的释放实验表明单一条件下的pH和葡萄糖环境粒子具有较低释放效果，在模拟体内中性pH和高糖条件下具有明显响应的释放模式。研究使用STZ构建小鼠糖尿病模型，成模标准由空腹血糖值确定(大于13mmol/L)，同时可以看出成模后小鼠的饮水量、进食量都高于对照组，体重也有明显增长。体内研究表明，使用该体系运载胰岛素，可以使胰岛素通过口服途径输运至血液循环，达到控制血糖的作用。
在以胰岛素为输运示例的输运研究中，该γ-PGA-GG-INS纳米粒子在体内外均具有较好的输运与疾病治疗效果。体外释放研究表明，单一环境下体系具有较好的稳定性，在模拟血液pH并具有高水平血糖的缓冲体系中具有较为显著的感应性释放情况，这在一定程度上决定了实际输运过程中的药物作用效果。在体肠段吸收表明，包裹胰岛素的体系可以促进自身较为显著被小肠绒毛吸收，这与瓜尔豆胶是弱碱性物质，在肠道内的药物依赖度较高，能提高在肠道内的吸收效果有关。体内药效研究表明粒子都能够进行口服胰岛素的输运，具有较好的降血糖效果。
因此本发明要求保护一种响应pH和/或葡萄糖的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
S1.油酸和瓜尔豆胶进行反应，得到疏水改性瓜尔豆胶(改性GG)：
S2.γ-聚谷氨酸与活化后的疏水改性瓜尔豆胶反应，得到γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体(γ-PGA-GG胶束单体)；
S3.伴刀豆蛋白A活化后，与胶束上瓜尔豆反应，得到γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体-瓜尔豆胶胶束(γ-PGA-GG-Con A胶束)。
优选地，步骤S1中，油酸和瓜尔豆胶的用量比为2～6ml：1～3g。
更优选地，步骤S1中，油酸和瓜尔豆胶的用量比为4ml：1g。
优选地，步骤S1中，瓜尔豆胶的DMSO溶液、油酸、4-二甲氨基吡啶、和二环己基碳二亚胺充分混匀，充分反应。
优选地，步骤S1中，充分反应为搅拌反应12～36h。
更优选地，步骤S1中，充分反应为搅拌反应24h。
优选地，步骤S2中，使用N,N'-羰基二咪唑活化疏水改性瓜尔豆胶。
更优选地，步骤S2中，使用N,N'-羰基二咪唑和疏水改性瓜尔豆胶于DMSO充分溶解充分反应，活化疏水改性瓜尔豆胶。
优选地，步骤S2中，以质量计算，N,N'-羰基二咪唑和疏水改性瓜尔豆胶的用量比为0.2～0.5：0.6～1.0。
更优选地，步骤S2中，以质量计算，N,N'-羰基二咪唑和疏水改性瓜尔豆胶的用量比为0.1g：0.4g。
优选地，步骤S2中，以质量计算，活化后的改性瓜尔豆胶与γ-聚谷氨酸的用量比为1：1～1.5。
更优选地，步骤S2中，以质量计算，活化后的改性瓜尔豆胶与γ-聚谷氨酸的用量比为1：1。
优选地，步骤S2中，活化后的疏水改性瓜尔豆胶与DMSO和吡啶的混合液充分混合后，逐滴加入三甲胺与吡啶的混合液中，最后与γ-聚谷氨酸充分混合。
更优选地，活化后的疏水改性瓜尔豆胶、DMSO和吡啶的混合液、三甲胺与吡啶的混合液和γ-聚谷氨酸的用量比0.1～0.3g：10～30ml：500～800μl：0.1～0.3g。
进一步优选地，活化后的疏水改性瓜尔豆胶、DMSO和吡啶的混合液、三甲胺与吡啶的混合液和γ-聚谷氨酸的用量比0.1g：10ml：700μl：0.1g。
更优选地，DMSO和吡啶的混合液中DMSO和吡啶的摩尔比为1～3：0.5～1。
进一步优选地，DMSO和吡啶的混合液中DMSO和吡啶的摩尔比为1.5：1。
更优选地，三甲胺与吡啶的混合液中三甲胺与吡啶的摩尔比为1～3：0.5～1。
进一步优选地，三甲胺与吡啶的混合液中三甲胺与吡啶的摩尔比为1：1。
优选地，步骤S3中，Ca2+和Mn2+活化伴刀豆蛋白A。
更优选地，步骤S3中，含KCl、CaCl2、MnCl2磷酸缓冲液和伴刀豆蛋白A充分反应，活化伴刀豆蛋白A
进一步优选地，步骤S3中，含0.05～0.2M KCl、0.05～0.2mM CaCl2和0.05～0.2mMMnCl2的磷酸缓冲液和伴刀豆蛋白A充分反应3～12h，活化伴刀豆蛋白A。
再进一步优选地，步骤S3中，含0.1M KCl、0.1mM CaCl2和0.1mM MnCl2 pH＝7的磷酸缓冲液和伴刀豆蛋白A充分反应6h，活化伴刀豆蛋白A。
优选地，步骤S3中，活化后的伴刀豆蛋白A，重悬于PBS中，于γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体混合，冰浴搅拌至形成均匀乳液，纯化，即得。
更优选地，步骤S3中，以质量计，伴刀豆蛋白A和γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体的用量比为1～2：2～6。
进一步优选地，步骤S3中，以质量计，伴刀豆蛋白A和γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体的用量比为1：4。
本发明还要求保护以下内容：
所述的制备方法制备到的纳米载体。
所述纳米载体制备pH和/或葡萄糖响应的药物中的应用。
所述纳米载体作为pH和/或葡萄糖响应的药物载体的应用。
以及一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子，所述纳米粒子为所述的纳米载体装载有药物。
优选地，药物为胰岛素。
一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子的制备方法，分散所述纳米粒子的γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束，与药物混合，再进行γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束的自组装。
优选地，γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束分散于磷酸缓冲液，与DMSO充分混合，逐滴滴入药物溶液，充分搅拌后纯化。
更优选地，以质量计，γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束与药物的用量比为2～5：1～2。
再进一步优选地，以质量计，γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束与药物的用量比为2：1。
优选地，4℃条件下反应，以保护胰岛素活性。
优选地，药物为胰岛素。
所述的制备方法制备得到的装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护所述的纳米粒子在制备药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明由天然材料瓜尔豆胶为主要结构的口服药物输运体系，并在其基础上进一步使用γ-聚谷氨酸与伴刀豆蛋白A进行修饰，应用材料中不同基团的结合形成纳米颗粒，成功制备了基于瓜尔豆胶、伴刀豆蛋白A和γ-聚谷氨酸的胶束，采用透析法包裹胰岛素得到装载胰岛素的口服纳米粒子，该纳米粒子的成分保证了其具备极低毒性，粒子具有较小粒径，与基于人工合成的聚合物(聚乙二醇、聚半乳糖醛酸等)构建的输运体系相比，具有极重要的优势。该纳米粒子的瓜尔豆胶、纳米级粒径都可以促进纳米药物穿过小肠上皮，并进入血液循环成功发挥作用。对生理环境中的pH及血糖浓度变化做出响应。该体系在输运胰岛素的应用中效果显著，也可以延用于其它水溶性蛋白质或不稳定大分子药物的口服输运。其能够具备较高的载药率，在经过消化肠道过程中具有较好的稳定性，并且具有较强的小肠吸收率，在体内研究中，也能够特异性的在高糖血液环境中成功释放胰岛素以发挥胰岛素的效应，在较长时间内控制血糖水平。其具备应用于胰岛素药物口服输运研究与应用的潜力。本发明创新性的制备得到了具有控制血糖功能的材料构建纳米运输体系，在开发新型功能性材料、制备高效能胰岛素输运体系方面，有重要的意义和价值。
本发明制备的输运体系的选材与设计从源头上保证了其具有极低毒性。其包括由来源于豆科植物成分的瓜尔豆胶、对人体和环境均无毒并在生物医学领域有良好应用前景的γ-聚谷氨酸等组成，同时表明该体系不仅毒性低，而且在治疗糖尿病的应用中，可以使输运体系本身就具有对疾病的治疗效果。这是在药物输运领域中的一次创新，即应用天然的、具有治疗功能的物质制备药物输运体系，使载药输运体系从多方面达到治疗作用，具备多重的疾病治疗效果。
在输运体系的构造中，本发明创新性的使用pH和葡糖糖双感应性的性质，使用γ-聚谷氨酸在胃部酸性条件下结构稳定而在结肠中的中性条件下离子化成无规则状而导致胶束单体不稳定后胰岛素将被释放出来，使得材料具有pH敏感性。利用伴刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)对富含甘露糖的糖类有特异性高亲和能力使体系能在高糖条件下达到特异性作用的效果。这种体系的构建使得合成的纳米颗粒与传统体系的纳米颗粒相比，具有良好的灵敏性。
附图说明
图1为γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的制备示意图。
图2为GG、γ-PGA-GG、γ-PGA-GG-Con A和γ-PGA-GG-Con A-INS粒径分析。
图3为GG、γ-PGA-GG、γ-PGA-GG-Con A和γ-PGA-GG-Con A-INS的Zeta电位分析。
图4为GG、γ-PGA-GG、γ-PGA-GG-Con A和γ-PGA-GG-Con A-INS的红外光谱结果。
图5为GG、γ-PGA-GG、γ-PGA-GG-Con A和γ-PGA-GG-Con A-INS的透射电镜结果。
图6为γ-PGA-GG-ConA-INS的热重结果。
图7为纳米胶束载药量和包封率测定结果。
图8为纳米胶束在不同pH条件下的释放结果。
图9为纳米胶束在不同pH一定葡萄糖浓度条件下的释放结果。
图10为纳米胶束在不同葡萄糖条件下的释放。
图11为T1D小鼠建模饮食图；图中两组曲线分别为正常组与一型糖尿病造模组
图12为T1D小鼠建模饮水图；图中两组曲线分别为正常组与一型糖尿病造模组
图13为T1D小鼠建模血糖图；图中两组曲线分别为正常组与一型糖尿病造模组。
图14为1D小鼠治疗数据统计图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、细胞株
人克隆结肠癌细胞(Caco-2细胞株)和人肝癌细胞(HepG2)由广州药学院提供，经本实验室传代培养。
2、实验动物
实验小鼠均为SPF级SD雄鼠，购自南方医科大学实验动物中心。
3、主要试剂
油酸，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，二环己基碳二亚胺(DCC)，瓜尔豆胶，羰基二咪唑，γ-聚谷氨酸，牛胰岛素购自sigma公司；伴刀豆蛋白A购自北京索莱宝生物科技有限公司；2000D透析袋，二甲基亚砜(DMSO)购自广州源晶生物科技有限公司。
4、仪器
紫外分光光度计、红外光谱检测仪、电镜、Sigma高速冷冻离心机、冷冻干燥机、磁力搅拌器、旋转蒸发仪、烘箱、液相色谱仪、扫描电镜、Thermo CO2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂-磁力搅拌器，高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。
实施例1γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的制备
γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的制备路线如图1所示。
一、改性瓜尔豆胶的制备
将0.1g瓜尔豆胶经干燥后加入10ml DMSO中，充分搅拌至完全溶解，加入0.4ml油酸，加入25mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和25mg二环己基碳二亚胺(DCC)磁力搅拌器下搅拌24小时，透析过夜(5000Da，纯水透析48h)，得到疏水改性的瓜尔豆胶(改性GG)，该疏水改性的瓜尔豆胶更有利于胶束的形成。
二、γ-PGA-GG胶束单体合成
利用N,N'-羰基二咪唑(CDI)催化γ-聚谷氨酸上氨基与疏水改性瓜尔豆胶上的羟基反应，形成两亲性聚合物。
具体地：
瓜尔豆胶活化羟基：将得到的疏水改性瓜尔豆胶0.1g和N,N'-羰基二咪唑0.3g加入10ml DMSO中溶解，室温下反应24h，最后透析，得到活化后的疏水改性瓜尔豆胶。
胶束单体合成(聚谷氨酸与瓜尔豆胶偶联)：首先，将0.1g活化后的疏水改性瓜尔豆胶加入10ml DMSO和吡啶的混合液，其中DMSO与吡啶的摩尔比＝1.5:1；然后逐滴加入700μl的三甲胺与吡啶的混合液，其中三甲胺与吡啶摩尔比＝1:1的溶液；最后加入0.1g的γ-聚谷氨酸，室温反应48h，超纯水透析48h。制得γ-PGA-GG胶束单体。
三、γ-PGA-GG胶束单体与伴刀豆蛋白A(Con A)的结合
将50mg Con A溶于10ml pH＝7的磷酸缓冲液(含0.1M KCl、0.1mM CaCl2和0.1mMMnCl2)中，静置6h，利用Ca2+和Mn2+激活Con A四聚体与糖残基的结合能力，5000rpm离心5min，去上清取沉淀，将上述沉淀重悬于PBS中，得到活化的ConA重悬液；然后将0.2gγ-PGA-GG胶束单体纯粉加入刀豆蛋白溶液中，冰浴搅拌至形成均匀乳液，超纯水中冰浴10000Da透析24h，制得γ-PGA-GG-Con A胶束。
四、γ-PGA-GG-Con A包裹胰岛素
将20mg上一步制备的γ-PGA-GG-Con A胶束加入1ml磷酸缓冲液中，搅拌30min后加入10ml DMSO，继续搅拌1h后缓慢滴入1ml胰岛素溶液(10mg/ml)，4℃下搅拌30min，γ-PGA-GG-Con A胶束自组装的过程中将胰岛素包裹其中，最后超纯水中冰浴透析24h，8000rpm离心10min重复两次，冷冻干燥，获得装载胰岛素的纳米胶束(PGA-GG-Con A-INS纳米粒子)。
实施例2粒径检测与Zeta电位分析
一、实验方法
分别取实施例1制备的改性GG、γ-PGA-GG胶束单体、γ-PGA-GG-Con A胶束及PGA-GG-Con A-INS纳米粒子各1mg溶于2mL PBS中，用超纯水稀释成100倍，超声10分钟，使其分布均匀。将测试杯分别用酒精和超纯水清洗干净，Zeta Sizer Nano ZS90型激光纳米粒度仪测定粒径与Zeta电位。
二、实验结果
图2是马尔文粒径检测仪对各个步骤中制备的胶束粒径的检测结果。粒径检测图中a图显示反相微乳法制备的改性GG纳米胶束(改性的GG由于具有两亲性，在溶液中会自组装形成胶束)平均粒径为100～200nm左右；b图显示γ-PGA-GG胶束单体平均粒径在300nm左右；c图显示γ-PGA-GG胶束单体结合Con A以后粒径不到200nm；d图显示γ-PGA-GG装载INS以后粒径在500nm左右。
为了探究PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的在合成过程中的电位变化，用马尔文Zetaszier Nano-ZS仪分别检测实施例1制备的改性GG、γ-PGA-GG胶束单体、γ-PGA-GG-Con A胶束和γ-PGA-GG-ConA-INS纳米粒子，四种样品的电位情况。结果如图3显示，改性GG在与γ-PGA结合后，纳米粒子的zeta电位由正转负趋势，这与γ-PGA自身携带大量羧基导致，并且验证γ-PGA是在胶束外部即亲水外表面，而最终PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的Zeta电位仍负值证明了INS被包裹进入了PGA-GG-Con A胶束内，每个合成步骤中胶束的电位绝对值都保持在近20mV，显示胶束稳定性较好。
实施例3红外光谱检测
一、实验方法
将实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米胶束进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。
二、实验结果
傅里叶转换红外光谱检测中谱图4a在3440cm-1和845cm-1有一强的吸收峰，是瓜尔豆胶上糖残基的-OH伸缩振动，在3012cm-1处吸收峰为C-H的特征谱带，在963cm-1有一强的吸收峰，为糖残基上C-O-C的振动产生。谱图4b在1635cm-1有一强吸收峰，为γ-PGA上的C＝O的伸缩振动，1454cm-1的较强吸收峰为-NH2；谱图4c在1608cm-1和1419cm-1处出现了两个峰，即为Con A上的-NH2振动峰；谱图4d在3154cm-1处出现较强峰，为INS氨基上的N-H振动峰，而在599cm-1处出现的峰为S-S伸缩振动峰。结果说明胰岛素成功被包裹进实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米胶束中。
实施例4透射电镜观察
一、实验方法
将实施例1制备的改性GG、γ-PGA-GG胶束单体、γ-PGA-GG-Con A胶束和γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子，分别悬浮于超纯水中，将溶液滴在透射电镜专用铜网的石蜡膜上，溶剂挥发出去，透射电镜(TEM，JEM-2100HR显微镜，200keV电子动能)测定纳米粒形貌。
二、实验结果
图5透射电镜的结果显示，实施例1制备的改性GG的TEM图显示通过油酸改性的瓜尔豆胶已经具备两亲性结构，形成了透明度较高的圆球，直径径大致为300nm；实施例1制备的γ-PGA-GG胶束单体的TEM图显示在多聚谷氨酸与瓜尔豆胶连接以后圆形胶束的直径进一步增大，约400～500nm；实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A胶束的TEM图显示纳米胶束在结合过Con A以后粒径变化不大，约500nm，并且显示出黑色实体部分。最终实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的TEM结果显示其直径有所增大，约为600nm。
实施例5纳米胶束热稳定性分析
一、实验方法
取实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS胶束(约5毫克)放入陶瓷锅，在氮气条件下用Mastersizer 2000热重分析仪测定胶束的重量随着温度逐渐升高而产生的变化，即热重曲线(TG)，其中，温度从25℃升至700℃，升温速度为10℃/min。
二、实验结果
结果如图6所示，温度从25℃升至700℃，升温速度为10℃/min。结果显示，实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子在0～250℃条件下的稳定性较好，期间的质量损失可能是由水蒸发造成的，大约有20％的质量损失，在250～450℃实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子约损失80％，而正常人体的温度在37℃左右，故实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子符合口服药的要求。
实施例6纳米胶束载药量和包封率的测定
一、实验方法
首先绘制胰岛素标准曲线。分别配置不同浓度的胰岛素溶液(0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.001mg/ml、0.0005mg/ml、和0.0001mg/ml)，使用德国Perkin ElmerLambda25紫外分光光度计测定其在276nm的紫外吸收光谱。依据其吸收峰绘制标准曲线，计算曲线的线性拟合方程与拟合度。
使用高速离心机将实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子悬液使用高速离心机离心，11000rpm/min，10℃，30min。取上清后应用紫外分光光度计测定其胰岛素吸收光谱，并依据其在绘制标准曲线的波长处的吸光值换算胰岛素含量。计算载药量(DL)和包封率(EE)。
二、实验结果
结果如图7所示，纳米颗粒的胰岛素包封率达到78.6％左右，具有较好的胰岛素包封效果，此外载药量达到了33.7％，是一种具有良好载药性能的纳米颗粒；这些数据说明纳米颗粒能够有效负载胰岛素，并且具有良好的载药性能。
实施例7纳米胶束在不同pH条件下胰岛素的释放
一、实验方法
取制实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒四份，各0.2mg，放入37℃恒温水浴的2ml盐酸溶液(pH分别为1.3、3.0、5.0和6.8)和PBS溶液(pH7.4)中，100r/min搅拌，并且在30min，1h，2h，4h和6h时5000r/min离心30s取上清，按照上述光谱方法检测溶液中胰岛素浓度。
二、实验结果
结果显示(图8)，在pH为1.3、3.0、5.0、6.8和PBS溶液(pH＝7.4)中实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子表现出了一定的稳定性，在不同pH溶液中释放的胰岛素量大部分都低于40％。这证明了在单一的溶液pH变化中粒子对胰岛素具有一定的保护作用，符合对粒子设计的要求。
实施例8纳米胶束在不同pH和一定葡萄糖浓度条件下的释放
一、实验方法
取实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子样品放入37℃恒温水浴的含有葡萄糖浓度为1.8mg/ml pH分别为1.3、3、5、6.8、7.4的PBS溶液中，搅拌后依次在适当时间离心取上清溶液检测溶液中胰岛素浓度。
二、实验结果
结果显示(图9)在高糖碱性环境中胰岛素释放量最大，证明了实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子能够有效响应环境的pH以及葡萄糖；在高糖及碱性的环境中释放出胰岛素。
实施例9纳米胶束在不同葡萄糖条件下的释放
一、实验方法
取实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子六份，每份0.2mg，分别加入37℃恒温水浴的2ml含有葡萄糖(浓度分别为0，0.5，0.8，1.4，1.8mg/ml)的PBS缓冲液中，依次在适当时间5000r/min离心30s取上清，按照上述光谱方法检测溶液中胰岛素浓度。
二、实验结果
图10显示了在不同糖浓度中胰岛素的释放情况，在酸性环境下，无论环境中葡萄糖浓度高低变化，纳米颗粒中胰岛素释放率均低于25％，显示出纳米颗粒能够有效响应pH环境，在酸性环境中减少胰岛素释放。
实施例10γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子对于糖尿病小鼠模型血糖指标的影响
一、I型糖尿病小鼠模型建立
1、实验方法
购买6周龄雄性昆明小鼠，适应环境一周，取4只做对照组(Control)，其余8只分为两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)。将两组模型组小鼠禁食一夜，测量血糖，使用pH＝4.4的柠檬酸缓冲液在注射前冰浴避光配制链脲佐菌素溶液，浓度为10mg/ml。对两组模型组小鼠按100mg/kg的剂量进行腹腔注射，分笼饲养，记录注射后8天内的生理指标(饮食量，饮水量)，比较Control组，STZ-treated rat 1组，STZ-treated rat2组之间的生理指标差异，验证模型构建是否成功。
建模后一周内持续测量血糖，测量方法为在给建模鼠禁食一夜后，使用罗氏活力型血糖仪监测空腹血糖，血糖浓度持续高于11mmol/l的老鼠为建模成功(T1Drat)。
2、实验结果
图11及图12显示了两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)与对照组(Control)之间在注射链脲佐菌素后的饮食及饮水变化；图11中，两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)的饮食量与对照组(Control)比较显示出明显的上升趋势，且两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)之间并未发现明显的差异，这一结果证明了链脲佐菌素注射后一型糖尿病模型构建的稳定性；图12中，两个模型组(STZ-treated rat1，STZ-treated rat 2)的饮水量与对照组(Control)比较同样显示出明显的上升趋势，且两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)之间并未发现明显的差异，这一结果证明了一型糖尿病模型构建的成功，两个模型组(STZ-treated rat 1，STZ-treated rat 2)都显示出明显的症状；此外，血糖检测结果显示注射链脲佐菌素后小鼠血糖显著上升，图13中T1Drat组与Control组比较，血糖明显上升至11mmol/l以上，表明建模成功。
二、口服降糖实验
1、选取血糖相对稳定在11mmol/l以上的9只I型糖尿病模型小鼠作为实验鼠，3只为给药组(γ-PGA-GG-ConA组，给予实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子，给药量为胰岛素含量50IU/kg体重，单次口服0.5ml溶液)，3只为生理盐水对照组(saline组，单次口服0.5ml生理盐水溶液)，3只为胰岛素皮下注射组(Insulin S.C.组，给药量为胰岛素含量5IU/kg体重，皮下注射0.5ml溶液)，在给药0、0.5、1、2、3、4、6、8小时时取尾静脉血液200微升，使用罗氏活力型血糖仪测定血糖。并将数据制成折线图分析。
2、选取血糖相对稳定在11mmol/l以上的8只一型糖尿病模型小鼠作为实验鼠3只为给药组(γ-PGA-GG-ConA组，给予实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子，给药量为胰岛素含量50IU/kg体重，单次口服0.5ml溶液每日2次)，3只为对照组(control(T1Drat)组，单次口服0.5ml生理盐水溶液)，另取4只正常小鼠，不做任何处理，作为正常组(control(normal rat)组)。对上述三组小鼠进行为期20天的连续治疗，每天记录生理指标(饮食量，饮水量，体重)，用以检测纳米颗粒在长期给药的治疗效果。
二、实验结果
单次口服给药药效结果如图14A所示：其中给药组(γ-PGA-GG-Con A组)在口服实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子后，在8h内对T1D小鼠显示出持续缓慢的降血糖效果，在口服灌喂纳米粒子后2h内降糖效果最显著。相较于胰岛素皮下注射组(InsulinS.C.组)，实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子灌喂组降血糖效果更为缓慢，但展现出了同胰岛素皮下注射组(Insulin S.C.组)相同的短期降血糖效果。3h后胰岛素皮下注射组(Insulin S.C.组)血糖快速升高，而给药组(γ-PGA-GG-Con A组)血糖回升更为缓慢，胰岛素皮下注射组(Insulin S.C.组)在6h时已恢复到原来的高血糖水平，而给药组(γ-PGA-GG-Con A组)在8h时才回到高血糖水平，这也在体内实验中说明实施例1制备的γ-PGA-GG-Con A-INS纳米粒子的缓释功能。
在长期治疗过程中，本实验收集了不同组20天的治疗数据，图14中B、C为饮水饮食统计数据，可以明显看出在约治疗一周后给药组(γ-PGA-GG-Con A组)同对照组(control(T1Drat)组)及正常组(control(normal rat)组)相比有了明显下降趋势，并且对照组(control(T1Drat)组)在正常饲养一周后饮水饮食相比正常组有了一定程度的上升，这是糖尿病的症状之一。图14中D中体重变化数据也从小鼠的个体水平说明给药组(γ-PGA-GG-Con A组)改善了糖尿病模型“多饮多尿多食少体重”中体重减轻的病症。在治疗期间与对照组(control(T1Drat)组)体重持续下降的趋势比较，给药组(γ-PGA-GG-Con A组)显示出显著的体重上升；证明了实施例1中制备的纳米颗粒具有一定的缓解一型糖尿病症状的能力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种响应pH和/或葡萄糖的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.油酸和瓜尔豆胶进行反应，得到疏水改性瓜尔豆胶：
S2.γ-聚谷氨酸上的氨基与活化后的疏水改性瓜尔豆胶反应，得到γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体，具体的，利用N,N'-羰基二咪唑催化γ-聚谷氨酸上氨基与疏水改性瓜尔豆胶上的羟基反应；
S3.伴刀豆蛋白A活化后与胶束上瓜尔豆胶反应，得到γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体-瓜尔豆胶胶束。
2.权利要求1所述的制备方法制备到的纳米载体。
3.一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子为权利要求2所述的纳米载体装载有药物。
4.根据权利要求3所述的纳米粒子，其特征在于，药物为胰岛素。
5.一种装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子的制备方法，其特征在于，分散权利要求2所述纳米载体的γ-聚谷氨酸-GG胶束单体-瓜尔豆胶胶束，与药物混合，再进行γ-聚谷氨酸-瓜尔豆胶胶束单体-瓜尔豆胶胶束的自组装。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，药物为胰岛素。
7.权利要求6所述的制备方法制备得到的装载药物的pH和/或葡萄糖响应的纳米粒子。
8.权利要求3或7所述的纳米粒子在制备药物中的应用。
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