CN108721605B - 一种装载有胰岛素的纳米粒子及其应用 - Google Patents

一种装载有胰岛素的纳米粒子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种装载有胰岛素的纳米粒子，由葡甘露聚糖、刀豆蛋白A和交联剂进行可逆的交联反应得到。本发明开发出由天然聚合物制备的葡萄糖感应型胰岛素口服纳米粒子，利用该纳米粒子可以构建葡萄糖感应型胰岛素口服输运体系，该体系具有葡萄糖感应性的、可控血糖的、低毒的输运体系的基本特性；在体内应用的效果较好，具有缓慢、较长时间的降糖作用，提高了胰岛素口服输运体系的控血糖疗效，在糖尿病治疗、天然聚合物医疗功能的开发等领域具有较大的应用潜力。

Description

一种装载有胰岛素的纳米粒子及其应用
技术领域
本发明涉及糖尿病的治疗技术领域，更具体地，涉及一种装载有胰岛素的纳米粒子及其应用。
背景技术
糖尿病是一种内分泌疾病，表现为持续高血糖，易诱发患者的眼、心脏、肾、足、血管、神经等组织器官的并发症。目前，全世界的糖尿病患者人数仍不断增加,糖尿病成为危害人类健康的疾病之一。胰岛素给药是I型糖尿病治疗的首选,主要为注射治疗，但长期频繁注射导致患者依从性差，局部皮下组织、细胞增生或硬化，以及高胰岛素反应。因此，许多研究致力于应用纳米材料，经口服途径输运胰岛素，可减轻患者长期注射的不适。另外，口服纳米输运体系具有较好的黏膜渗透和肠上皮吸收效果，在药物缓释、控释方面也具有一定的优越性。纳米粒、胶束、凝胶、脂质体等载体类型在胰岛素口服输运中得到了较广泛的开发和应用。
构建口服纳米输运载体的材料主要有人工合成聚合物和天然聚合物，相较于人工合成聚合物，天然聚合物材料具有毒性低、易降解、生物相容性好等优势。此外，天然聚合物材料还具有潜在的医用价值，可同时作为输运载体和疾病治疗药物。民族植物学研究发现了约800种具有降血糖潜力的植物，并确定了部分降糖活性物质的化学结构及控糖作用机制。因此，使用具有降血糖作用的天然聚合物制备胰岛素口服纳米输运载体，可对糖尿病起到双重治疗的功效。其中，葡甘露聚糖（KGM）是一类植物来源的、水溶性的、主要由甘露糖和葡萄糖以β – 1 , 4键结合的非离子型线性多糖。研究表明，它不仅具有天然材料毒性小、易降解、生物相容性良好的特性，还具有降血糖，改善糖尿病并发症的作用。
研究表明，胰岛素是一种剂量依赖性药物，剂量的准确对患者的健康十分重要。葡萄糖响应体系能够响应环境中葡萄糖浓度的变化，智能调节胰岛素的释放量。该体系可一次性输运较多胰岛素，减少患者服药次数，延长其在体内的作用时间，提高输运体系的生物利用度以达到更好的控糖功效，长时间内维持患者正常的血糖水平。
目前用于研究的葡萄糖响应体系主要有苯硼酸基团（PBA）体系，葡萄糖氧化酶（GOD）体系，以及伴刀豆球蛋白（ConA）体系。ConA体系对于葡萄糖的专一性强，受其它分子干扰较小。ConA是一种从刀豆中提取的糖结合蛋白，可以特异性地与葡萄糖、葡甘露聚糖结合。研究发现，ConA与葡萄糖、葡甘露聚糖的结合能力有差异，当环境内同时存在葡萄糖和KGM，且葡萄糖浓度较低时，ConA优先与KGM结合，聚集形成小球；当出现较高浓度的葡萄糖时，葡萄糖可竞争性地与ConA结合，使小球结构松散。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用毒性低、易降解、具有控制血糖作用的天然聚合物葡甘露聚糖（KGM），可与糖发生特异性结合的天然材料伴刀豆蛋白A（Con A）、以及天然交联剂三偏磷酸钠进行可逆的交联，形成装载药物的葡萄糖感应型口服纳米粒子。在此基础上进一步，装载的药物为胰岛素（INS），探究这种装载胰岛素的KGM-INS-ConA纳米粒子在口服输运体系中的基本特性及其体内应用效果。
本发明的第一个目的是一种装载有药物的葡萄糖感应型可口服的纳米粒子。
本发明的第二个目的是一种装载有药物的纳米粒子的制备方法。
本发明的第三个目的是以上任一所述制备得到的装载有药物的纳米粒子。
本发明的第四个目的是以上所述纳米粒子在构建药物口服输运体系中的应用。
本发明的第五个目的是以上所述纳米粒子在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明利用KGM与ConA进行可逆交联，形成装载药物的纳米粒子，当所述药物为胰岛素时，制备得到装载胰岛素的KGM-INS-ConA纳米粒子，探究KGM-INS-ConA纳米粒子的输运效能及其体内的血糖控制效果。
本发明首先将KGM、胰岛素溶解于水相中并进行搅拌，加入活化后的ConA及交联剂三偏磷酸钠，在搅拌过程中形成装载胰岛素的KGM-INS-ConA纳米粒子。
在纳米粒子的表征测定研究中，利用红外波谱验证纳米粒子的化学组成，利用马尔文粒度仪检测粒子的粒径大小，利用透射电镜观察粒子大小、形态及分散情况，利用热重分析和差示扫描量热分析检测粒子的热稳定性。同时，使用透射电镜观察粒子在低、高糖溶液中的结构松紧变化与孔隙度，使用圆二色谱分析粒子输运的胰岛素在制备和释放后的结构完整性。
在纳米粒子的体内应用研究中，使用链脲佐菌素（STZ）诱导构建I型糖尿病大鼠模型，结扎结肠并灌药孵育，观察纳米粒子输运的胰岛素被小肠绒毛吸收的情况。同时，使糖尿病大鼠口服纳米粒子，定量检测其一次服药后的血糖水平变化，并检测胰岛素在大鼠体内的生物利用度。
因此，本发明要求保护一种装载有药物的葡萄糖感应型可口服的纳米粒子，所述纳米粒子由葡甘露聚糖、刀豆蛋白A和交联剂进行可逆的交联反应得到。
优选地，所述交联剂为三偏磷酸钠。
优选地，所述药物为胰岛素。
最优选地，本发明要求保护一种装载有胰岛素的葡萄糖感应型可口服的纳米粒子，所述纳米粒子由葡甘露聚糖、刀豆蛋白A和三偏磷酸钠进行可逆的交联反应得到。
一种装载有药物的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
S1. 将药物加入葡甘露聚糖溶液，充分混匀得到混合溶液1，其中药物与葡甘露聚糖的质量比为1: （10.5～9.5）；
S2. 向刀豆蛋白A溶液中加入KCl溶液、CaCl2溶液、MnCl2溶液，混合均匀得到混合溶液2，进行活化，其中，混合溶液2中刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度 比为 （1～0.96）×105:（1.02～0.98）×104:（1.02～0.98）:（1.02～0.98）；
S3. 将步骤S2混合溶液、交联剂加入步骤S1得到的药物和葡甘露聚糖的混合混合溶液2，充分摇匀得到混合溶液3，混合溶液3中交联剂的浓度为0.12～0.13mg/ml，混合溶液3中葡甘露聚糖与刀豆蛋白A的质量浓度比为1 : （1.02～0.98）；
S4. 将步骤S3得到的溶液置于PBS溶液中，搅拌，使葡甘露聚糖和刀豆蛋白A交联，形成装载药物的纳米粒子，PBS溶液与混合溶液3的体积比为（29～31）:1；
S5. 将步骤S4得到的溶液离心，收集沉淀，洗涤干燥，冻干得到纳米粒子粉末。
优选地，步骤S1中，药物与葡甘露聚糖的质量比为1:10。
优选地，步骤S2中，溶液中刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度比为9.8×104: 1×104:1: 1。。
优选地，步骤S3中，混合溶液3中交联剂的浓度为0.125mg/ml。
优选地，步骤S3中，混合溶液3中葡甘露聚糖与刀豆蛋白A的质量浓度比为1 ：1。
优选地，所述药物为胰岛素。
优选地，步骤S2中，活化的条件为室温下匀速振荡6 h。
优选地，步骤S3中，充分摇匀的条件为4 ℃下充分摇匀1 h。
优选地，步骤S4中，PBS溶液的pH为6.8。
优选地，步骤S4中，搅拌的条件为搅拌4 h。
优选地，步骤S5中，离心的条件为离心5000 rpm 1 h。
最优选地，一种装载有药物的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
S1. 将药物加入葡甘露聚糖溶液，充分混匀得到混合溶液1，其中药物与葡甘露聚糖的质量比为1:10；
S2. 向刀豆蛋白A溶液中加入KCl溶液、CaCl2溶液、MnCl2溶液，混合均匀得到混合溶液2，室温下匀速振荡6 h进行活化，其中，混合溶液2中刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度比为9.8×104: 1×104:1: 1；
S3. 将步骤S2混合溶液、交联剂加入步骤S1得到的药物和葡甘露聚糖的混合溶液3，4 ℃下充分摇匀1 h，其中，混合溶液3中交联剂的浓度为0.125mg/ml，混合溶液3中葡甘露聚糖与刀豆蛋白A的质量浓度比为1 : 1；
S4. 将步骤S3得到的溶液置于pH为6.8的PBS溶液中，搅拌4 h，使葡甘露聚糖和刀豆蛋白A交联，形成装载药物的纳米粒子，PBS溶液与混合溶液3的体积比为（29～31）:1；
S5. 将步骤S4得到的溶液离心5000 rpm 1 h，收集沉淀，洗涤干燥，冻干得到纳米粒子粉末。
最优选地，一种装载有胰岛素的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
S1. 将胰岛素加入葡甘露聚糖溶液，充分混匀得到混合溶液1，其中药物与葡甘露聚糖的质量比为1:10；
S2. 向刀豆蛋白A溶液中加入KCl溶液、CaCl2溶液、MnCl2溶液，混合均匀得到混合溶液2，室温下匀速振荡6 h进行活化，其中，混合溶液2中刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度比为9.8×104: 1×104:1: 1；
S3. 将步骤S2混合溶液、三偏磷酸钠加入步骤S1得到的药物和葡甘露聚糖的混合溶液3，4 ℃下充分摇匀1 h，其中，混合溶液3中交联剂的浓度为0.125mg/ml，混合溶液3中葡甘露聚糖与刀豆蛋白A的质量浓度比为1 : 1；
S4. 将步骤S3得到的溶液置于pH为6.8的PBS溶液中，搅拌4 h，使葡甘露聚糖和刀豆蛋白A交联，形成装载药物的纳米粒子，PBS溶液与混合溶液3的体积比为（29～31）:1；
S5. 将步骤S4得到的溶液离心5000 rpm 1 h，收集沉淀，洗涤干燥，冻干得到纳米粒子粉末。
以上任一所述制备方法制备得到的装载有药物的纳米粒子。
优选地，所述药物为胰岛素。
以上所述装载有药物的纳米粒子在构建药物口服输运体系中的应用。
优选地，所述药物为胰岛素。
以上所述装载有药物的纳米粒子在制备治疗糖尿病的药物中的应用，所述药物在胰岛素。
优选地，所述药物为口服药物。
优选地，所述糖尿病为I型糖尿病
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）红外光谱结果显示，装载胰岛素的KGM-INS-ConA纳米粒子成功合成。
（2）粒径及透射电镜结果显示粒子的粒径约450 nm，大小均匀，形貌近似圆球形。
（3）热重分析和差示扫描量热分析结果表明粒子具有较好的热稳定性。
（4）粒子在低糖溶液中孔隙度小，结构较紧密，在高糖溶液中孔隙较大，结构较疏松，粒径较大，可响应葡萄糖浓度发生结构松紧变化。
（5）圆二色谱分析表明粒子可使胰岛素在制备和释放后保持二级结构的完整。
（6）研究使用STZ构建I型糖尿病大鼠模型，其空腹血糖高于13 mmol/L，且建模大鼠的进食量、饮水量远高于对照组，体重增长不明显，表明模型构建成功。体内研究表明，粒子输运的胰岛素可被小肠绒毛吸收，进入血液循环。一次性口服实验结果显示出粒子具有缓慢、较持续的降血糖作用。
本研究成功制备基于天然聚合物KGM、ConA、三偏磷酸钠构建的葡萄糖感应型胰岛素口服纳米粒子，该纳米粒子可响应葡萄糖浓度发生松紧的结构变化，调节胰岛素的释放，具有较好的葡萄糖感应性。利用该纳米粒子构建的输运体系能较好地维持胰岛素在体内的稳定性，且具有一定的黏膜穿透和肠吸收效果，可穿透小肠上皮进入血液循环。另外，该输运体系选用具有降血糖作用的KGM，将天然的医用材料与口服纳米输运系统结合在一起，在体内应用的效果较好，具有缓慢、较长时间的降糖作用，提高了胰岛素口服输运体系的控血糖疗效。该体系为I型糖尿病治疗、功能性胰岛素口服纳米输运体系的开发和应用提供了理论依据和实验基础。
附图说明
图1为纳米粒子合成及其葡萄糖感应机制示意图。
图2为KGM-INS-ConA纳米粒的葡萄糖感应性。
图3为KGM-INS-ConA纳米粒、KGM-INS纳米粒沉淀对比图。
图4为葡甘露聚糖、胰岛素、伴刀豆蛋白A、KGM-INS-ConA纳米粒、KGM-INS纳米粒的红外光谱图。
图5为胰岛素、KGM-INS-ConA纳米粒的热重分析图。
图6为胰岛素、KGM-INS-ConA纳米粒的差式扫描量热分析图。
图7为KGM-INS-ConA纳米粒在低糖、高糖溶液中的透射电镜图。
图8为胰岛素、ConA、KGM-INS-ConA纳米粒、KGM-INS纳米粒的圆二色光谱图。
图9为SD大鼠建模期间血糖、日进食量、日饮水量、体重监测。
图10为小肠绒毛吸收粒子荧光显微示意图。
图11为T1D大鼠分别注射胰岛素、口服胰岛素、口服KGM-INS-ConA纳米粒后血糖水平变化图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验动物：
SD大鼠，购于南方医科大学实验动物中心。
实验试剂：
葡甘露聚糖（KGM），伴刀豆蛋白A（ConA），三偏磷酸钠，葡萄糖，购于品锐生物公司；牛胰岛素购于西格玛公司，异硫氰酸荧光素标记胰岛素（FITC-Insulin）购于上海希施生物科技有限公司；链脲佐菌素STZ购于阿拉丁生化科技有限公司，戊巴比妥钠购于上海新亚药业有限公司。
实验仪器：
Sigma32184高速冷冻离心机，日本HITACHI 7650 透射电子显微镜，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，Nikon显微镜，英国Malvern ZEN3600，日本Olympus公司光学倒置显微镜，德国Bruker VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪，德国耐驰TG 209 F1 热重分析仪，DSC 214 Polyma 差示扫描量热仪，中国赛默飞世尔Cryotome FSE冰冻切片机。
实施例1 纳米粒子制备
一、实验操作
配制5 mg/ml的KGM溶液，取2 ml KGM溶液，加入1 mg胰岛素，充分混匀。
配制5mg/ml的ConA溶液，取1.88ml ConA溶液，加入100μL的KCl溶液（0.1 M），10μL的CaCl2溶液（0.01 mM），10μL的MnCl2溶液（0.01 mM），最终得到2ml的混合溶液，整个体系中ConA溶液、KCl溶液、CaCl2溶液、MnCl2溶液的摩尔浓度比为9.8×104: 1×104:1: 1。室温下匀速振荡6 h。
将已活化的ConA溶液2ml、交联剂三偏磷酸钠加入溶解有KGM、胰岛素的溶液中，使得交联剂三偏磷酸钠的终浓度为0.125 mg/ml，4℃下充分摇匀1 h。再将溶液置于120mlPBS溶液（pH 6.8）中磁力搅拌4 h，KGM 与ConA交联，形成装载胰岛素的纳米粒子。将溶液离心（5000 rpm）1 h，收集沉淀，洗涤干燥，冻干得到白色粉末。按照同样的方法制备出未加入ConA的KGM-INS纳米粒子。
二、实验结果
KGM在交联剂三偏磷酸钠的作用下发生交联反应，加入胰岛素后混匀得到KGM-INS纳米粒，在此基础上加入已活化的ConA溶液，ConA与KGM发生取代反应，发生特异性结合，在混匀过程中通过分子间作用力将胰岛素装载其中，形成KGM-INS-ConA纳米粒。
实施例2 粒子的葡萄糖感应性检测
一、实验操作
将实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子置于不同浓度葡萄糖溶液（0 mg/dl、100mg/dl、400 mg/dl）中进行体外释放。在0 h，4 h，8 h三个时间点离心观察粒子的溶解和释放情况，拍照观察。
二、实验结果
如图1显示，KGM-INS-ConA纳米粒在葡萄糖浓度升高或降低时，结构发生可逆的疏松或紧密的变化。
将KGM-INS-ConA 纳米粒子加入到不同浓度（0 mg/dl、100 mg/dl、400 mg/dl）的葡萄糖溶液中，观察发现不同浓度葡萄糖溶液中的粒子在0 h、4 h、8 h时溶解量都有不同程度的增加（如图2）。对比三种溶液中粒子的溶解情况，可见粒子的溶解量随着葡萄糖溶液浓度的升高而增加。推测KGM-INS-ConA 纳米粒具有一定的葡萄糖感应功能，能够根据不同的葡萄糖溶液浓度发生不同程度的溶解，能够响应葡萄糖浓度变化调节胰岛素的释放量。
实施例3 纳米粒沉淀对比
一、实验操作
将实施例1制备的制备KGM-INS-ConA纳米粒子和KGM-INS纳米粒子，离心（5000rpm）收集沉淀，观察
二、实验结果
KGM-INS-ConA纳米粒离心管中可见明显的白色沉淀，KGM-INS纳米粒离心管相同位置几乎没有白色沉淀（如图3）。可见，由于KGM与ConA进行特异性结合，形成装载胰岛素的KGM-INS-ConA纳米粒，未加入ConA，KGM无法与其结合，几乎无明显的纳米粒形成。这说明ConA与KGM交联可形成输运胰岛素的载体，ConA是制备装载胰岛素的纳米粒子的重要原料。
实施例4 红外光谱检测
一、实验操作
将原料与实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子、KGM-INS纳米粒子分别冷冻干燥，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2 μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理。在油压机上用10 MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，使用德国Bruker VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪测定。
二、实验结果
红外光谱可说明纳米粒子的结构组成和化学基团。KGM的红外光谱（如图4）显示在1026cm-1有吸收峰（-C-O-C伸缩振动），为多糖结构导致；胰岛素（Insulin）的特征酰胺峰在1239cm-1（-C-N拉伸）、1539cm-1（-N-H 弯曲振动）、1657cm-1（-C=O伸缩振动）；ConA红外光谱显示出相似的蛋白质特征峰。KGM-INS-ConA纳米粒、KGM-INS纳米粒的红外光谱显示出两者都具有多糖结构特征峰。KGM-INS纳米粒红外光谱中未出现Insulin、ConA的标志峰，KGM-INS-ConA纳米粒的红外光谱中显示了Insulin、ConA的酰胺峰，这说明两种纳米粒子都含有KGM，KGM-INS纳米粒没有装载胰岛素，在KGM-INS-ConA纳米粒中，由于KGM与ConA的交联，成功装载了胰岛素。可见ConA与KGM的特异性结合，对制备装载胰岛素的纳米粒具有重要的作用。
实施例5 热重和差示扫描量热分析
一、实验操作
将胰岛素、实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子冷冻干燥处理，使用德国耐驰TG209 F1 热重分析仪和DSC 214 Polyma 差示扫描量热仪，在N2氛围下，测量范围为30 ℃至900 ℃，升温速度为10 ℃/min。
二、实验结果
热重分析是在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，可以用来研究纳米体系的热稳定性。
如图5显示，从室温到100 ℃，胰岛素和KGM-INS-ConA 纳米粒的质量损失是由水分的蒸发造成的，粒子的失水比胰岛素少约4 %。在219℃ - 390℃之间，胰岛素和KGM-INS-ConA 纳米粒的质量损失明显加快，主要是氨基酸链之间共价键的断裂引起，KGM-INS-ConA纳米粒的质量损失明显少于胰岛素，约为20 %。且KGM-INS-ConA 纳米粒在390℃-500℃区间质量损失不明显。可推测纳米粒子的装载起到保护胰岛素的作用，KGM-INS-ConA 纳米粒热稳定性更好。纳米粒子在500 ℃ - 600 ℃的失重是由ConA的S-S，O-N，O-O等键的断裂造成，ConA在500 ℃后开始分解，这说明ConA使输运体系的结构更稳定。
差示扫描量热分析是一种在程序控温下，测量输入试样和参比物的功率差与温度的关系的热分析。胰岛素的扫描图（如图6）显示了69 ℃、219 ℃附近有吸热峰，219 ℃的峰表示胰岛素开始分解；KGM-INS-ConA 纳米粒的扫描图中，69 ℃处峰的峰值较小，219 ℃处没有吸热峰。这说明KGM-INS-ConA 纳米粒装载的胰岛素在219 ℃时几乎未被分解，体系的热稳定性更高。可以进一步推测所制备的KGM-INS-ConA 纳米粒对胰岛素起到一定的保护作用。
实施例6 透射电镜
一、实验操作
将实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子的悬液滴在覆有碳膜的铜网上，静置5min，用滤纸吸干多余水分，静置30 min，待其完全干透。使用HITACHI 7650透射电镜，电子加速电压为300 kV，分别于1×104倍、2 ×104倍的放大倍数下，观察粒子大小和形貌。分别观察在低糖和高糖溶液中粒子的大小、形貌。
二、实验结果
透射电子图像可用于了解纳米体系的大小和形态。如图7显示，KGM-INS-ConA纳米粒子大小均匀、呈不规则的圆球形，分散较均匀。粒子在低糖溶液中的平均粒径为300 -350 nm，整体结构致密，可推测KGM和ConA有效交联，形成包裹胰岛素的粒子；粒子在高糖溶液中的平均粒径为350 – 400 nm，与低糖中的粒子相比，粒径较大，且整体结构较松散，粒子表面孔隙增大。
这说明粒子在低糖溶液中较致密的结构有利于装载和保护胰岛素，在高糖溶液中，ConA优先与葡萄糖结合而使粒子结构松散，证明粒子具有一定的葡萄糖感应性，可通过结构的松紧变化调节胰岛素释放量。
实施例7 圆二色光谱分析
一、实验操作
圆二色光谱（CD）可测定蛋白质的二级结构。将实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子、KGM-INS纳米粒子的悬液在体外释放12 h，离心（5000 rpm）收集含有胰岛素的上清液，将其与胰岛素溶液、ConA溶液进行CD分析。CD光谱仪测量胰岛素的二级结构，扫描范围为190 nm - 260 nm。将生成的椭圆率值转化为摩尔椭圆率，使用方程[θ]λ = θλ ·M/C·L计算，θλ是波长λ下的椭圆率，M是平均分子量残留(g/mol),C是胰岛素浓度(g/ml)，L是光学路径长度(cm)。为了消除同样存在于溶液中的EPL带来的误差，记录下CD光谱后减去上清液的光谱。
二、实验结果
圆二色光谱（CD）可用于测量蛋白质的结构信息。如图8显示，胰岛素在222 nm 处的负峰、190 nm附近的正峰，表示其次级结构中典型的α-螺旋结构。ConA的CD谱图中可见198nm附近有负峰，220nm附近有正峰，说明ConA的次级结构主要为无规则卷曲。KGM-INS-ConA 纳米粒组的CD谱图显示出与胰岛素相似的峰，具有α-螺旋结构，这说明KGM-INS-ConA纳米粒子释放的胰岛素二级结构保持完整。KGM-INS 纳米粒组未出现与胰岛素相似的CD谱图， 推测KGM-INS 纳米粒未成功装载胰岛素或其二级结构被破坏。可见，KGM-INS-ConA纳米粒子能够装载胰岛素，且可保护输运的胰岛素的次级结构完整。
实施例8 体内研究
一、实验操作
（1）I型糖尿病大鼠模型构建
购买6周龄的SD大鼠，适应环境一周后，取3只大鼠做对照组，其余为实验组。大鼠禁食一夜后测量血糖。使用冰浴的柠檬酸缓冲液（pH 4.4）避光配制50 mg/ml 的STZ溶液。对实验组大鼠按50 mg/kg的剂量进行腹腔注射。
自建模当天起，每日测量大鼠体重、进食量、饮水量。在第3、6、9天分别禁食一夜后，使用罗氏活力型血糖仪监测大鼠的空腹血糖。第6、9天空腹血糖值都大于13 mmol/L，且进食量、饮水量远大于对照组，体重无明显增长的大鼠认定为T1D模型大鼠。将T1D成模大鼠按空腹血糖均值分组，保持每组大鼠的血糖均值无显著差异。
（2）小肠绒毛吸收粒子的荧光显微观察
取4只T1D模型大鼠，禁食一夜，不禁水。使用戊巴比妥钠（0.05 mg/kg）麻醉后，裸露腹部，结扎出5 cm回肠，使用生理盐水清洗。在对照组大鼠、实验组大鼠的结扎肠段中分别注入0.5 ml 游离FITC-胰岛素（FITC-Insulin），0.5 ml游离装载了FITC-Insulin的实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子。结扎肠段，孵育2 h后，处死大鼠，取出每个结扎的肠断，用PBS清洗后使用4 %多聚甲醛固定2 h，在30 %蔗糖溶液中浸泡一夜。样本埋藏并置于-20℃冷冻。使用冰冻切片机（Cryotome FSE，赛默飞世尔科技，中国）将冰冻肠段切出20 μm薄片，使用DAPI染色，再使用荧光显微镜观察。
（3）体内药效及生物利用度
给T1D大鼠断粮4 h，将大鼠分成3组，分别为胰岛素口服组、胰岛素注射组（5 IU/kg）、纳米粒子治疗组（实施例1制备的KGM-INS-ConA纳米粒子 50 IU/kg），每组鼠不少于3只。在第0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h抽取各组大鼠尾静脉血，使用罗氏血糖仪测血糖。同时，根据下列公式计算口服KGM-INS-ConA纳米粒子的绝对生物利用度（F）：
Figure 390477DEST_PATH_IMAGE001
AUCoa为口服KGM-INS-ConA纳米粒子后药时曲线下面积，Doa为口服KGM-INS-ConA纳米粒子剂量，AUC iv为静脉注射胰岛素后药时曲线下面积，Div为注射胰岛素剂量。
二、实验结果
使用雄性SD大鼠，腹腔注射STZ，剂量为50 mg/kg。注射STZ后第3天，大鼠禁食一夜后，实验组的血糖高于对照组。实验组大鼠中，血糖值在20 mmol/L以上，且第6、9天，高血糖趋势不变化，则为建模成功的T1D大鼠，成功率达90%（如图9A）。监测注射STZ前1天至注射STZ后第9天的大鼠日进食量、日饮水量、体重（如图9 B C D），实验组与对照组的体重、饮水、进食量在注射STZ前1天的数据无统计差异，注射前1天至注射当天的变化趋势也完全重合。至注射STZ当天起，体重、日饮水量、日进食量出现了差异，对照组大鼠体重不断增长，饮水与进食量无显著变化；实验组大鼠体重增长不明显，而饮水量激增约为注射前的6倍，进食量比对照组增加约30%。
通过结扎回肠段，使用药物孵育，可以观察小肠绒毛对输运体系的吸收情况。设置生理盐水组为对照组，在紫外光的激发下，如图10显示：对照组可见小肠的细胞核被染上蓝色，未观察到FITC-胰岛素的绿色荧光；KGM-INS-ConA 纳米粒组的冰冻切片显微图中可见细胞核的蓝色荧光和FITC-胰岛素的绿色荧光。这说明小肠吸收了少量的带有荧光标记的纳米粒子，可见KGM-INS-ConA 纳米粒成功包裹胰岛素，且在小肠绒毛上具有一定的渗透吸收效果。
如图11显示，阳性对照组（胰岛素注射组）大鼠在服药后1 h血糖骤降，降至初始血糖的20 %，之后血糖水平有轻微波动，4 h后血糖水平回升；阴性对照组（胰岛素口服组）大鼠在服药1 h后血糖稍有升高，2 h - 8 h血糖维持相对较高的水平，胰岛素口服组组不能降血糖；KGM-INS-ConA 纳米粒组大鼠服药后1 h 血糖下降，而后保持稳定，3 h - 6 h血糖再次平缓下降，达到降糖峰值，6 h后血糖浓度逐渐缓慢回升。可见，KGM-INS-ConA纳米粒具有缓慢、持续的降糖作用，服药后1 h可起作用，作用时间可达6 h。
根据公式F = (AUCT/DT)/(AUCiv/Div)×100%计算，得知KGM-INS-ConA纳米粒子的绝对生物利用度为5.2 %。（如表1）
表1 KGM-INS-ConA粒子的绝对生物利用度计算表：
Figure 441479DEST_PATH_IMAGE002
。

Claims (2)

1.一种装载有药物的纳米粒子在制备治疗糖尿病的药物口服输运体系中的应用，其特征在于，所述装载有药物的纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
S1.将药物加入葡甘露聚糖溶液，充分混匀得到混合溶液1，其中药物与葡甘露聚糖的质量比为1：10；
S2.向刀豆蛋白A溶液中加入KCl溶液、CaCl2溶液、MnCl2溶液，混合均匀得到混合溶液2，进行活化，其中，混合溶液2中刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度比为(1～0.96)×105：(1.02～0.98)×104：(1.02～0.98)：(1.02～0.98)；
S3.将步骤S2活化后的溶液、交联剂加入步骤S1得到的药物和葡甘露聚糖的混合溶液2，充分摇匀得到混合溶液3，其中，混合溶液3中交联剂的浓度为0.12～0.13mg/ml，混合溶液3中葡甘露聚糖与刀豆蛋白A的质量浓度比为1:1；
S4.将步骤S3得到的混合溶液3置于PBS溶液中，搅拌，使葡甘露聚糖和刀豆蛋白A交联，形成装载药物的纳米粒子，PBS溶液与混合溶液3的体积比为(29～31)：1；
S5.将步骤S4得到的溶液离心，收集沉淀，洗涤干燥，冻干得到纳米粒子粉末；
所述药物为胰岛素；
所述交联剂为三偏磷酸钠。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S2中，其中，混合溶液中2刀豆蛋白A、KCl、CaCl2和MnCl2的摩尔浓度比为9.8×104：1×104：1：1。
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