CN101690820B - 载有铂类药物的纳米微球和其被天然高分子包裹的水凝胶及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，它的表面是带电荷的明胶分子，内部是明胶分子和聚丙烯酸分子通过静电作用形成的不带电的聚电解质，铂类药物通过Pt(II)与体系中的羧基形成化学配位作用结合在纳米微球上，其中，铂类药物占复合纳米微球质量的5-45％，明胶含量为复合纳米微球质量的45％-70％，聚丙烯酸含量为复合纳米微球质量的10％-25％。纳米微球的平均粒径为50-200纳米。上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球可以制成天然高分子水凝胶，水凝胶不仅拥有良好的生物相容性，可在外科手术过程中将其植入体内并贴敷在肿瘤部位，而且因其高载药量，双重缓释速度缓慢的特点，可以大幅度提高铂类药物的给药剂量而不增加药物的系统毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及铂类药物的负载，具体涉及包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球及其被天然高分子包裹的水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，铂类药物在恶性肿瘤的治疗上有着重要的应用价值，治疗机理主要是依靠铂类化疗药物对细胞的细胞毒作用。目前临床上主要应用的铂类药物有传统铂制剂顺铂(顺氯氨铂)，替代顺铂的产品卡铂(又称碳铂)以及奥沙利铂(又称草酸铂)。铂类药物属细胞周期非特异性药物，作用于细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜，有较强的广谱抗癌作用，为泌尿生殖系统肿瘤、消化道肿瘤、癌性胸腔积液等的一线药物，被临床广泛应用，成为当前最常用的抗癌药物之一。在临床应用中，铂类药物通常以静脉注射的方式给药，但是它们具有肾毒性、骨髓抑制及严重的消化道反应，如频繁的恶心，呕吐等。这些毒副作用使得铂类药物在给药剂量上受到极大限制。研究证明，顺铂在组织中浓度高低与其抗癌作用及毒副作用一致。因此，寻找生物相容并且可生物降解的铂类药物载体，在减少正常组织毒副作用的同时又不降低甚至提高肿瘤部位的药物浓度已经引起了人们广泛的关注。
随着纳米技术的发展和对各种可生物降解高分子材料的深入研究，使得基于高分子纳米微粒的药物输送体系成为研究铂类药物的重点之一。目前的研究表明，纳米药物载体的尺寸及表面性质等对其体内分布和药物输送状况均有显著的影响。因此，高分子纳米粒子药物载体除了具备传统药物输送体系所具有的诸如提高药物溶解度、增加药物稳定性以及缓释等优点外，还可以较大幅度地改变药物的组织分布和代谢，提高药效并降低药物的系统毒副作用，对临床应用具有重大的应用价值。
由于肿瘤部位的血管系统具有比正常部位更高的通透性(EPR)效应，高分子纳米药物载体可以充分利用这种效应，在肿瘤等病变部位富集，达到“被动靶向”药物输送的效果。但是，这种基于EPR效应的静脉内注射的给药方式虽然在一定程度上增强了抗肿瘤效果，却仍然不能大幅度的提高药物到达肿瘤内的浓度。因为纳米微粒进入体内后，很容易被网状内皮系统的吞噬细胞吞噬从而从血液中排除以及在肝脏，脾脏等单核噬菌系统的器官富集，使得进入病灶部位的纳米微粒浓度大大降低。为了解决上述药物分布的问题，局部化疗的概念在临床应用的观点上应运而生，例如使载药纳米微粒通过瘤内注射的给药方式进入体内，这种给药方式不仅有效的提高了肿瘤内的药物浓度，并且延长了药物在肿瘤内的存留时间，从而提高了药物的抗肿瘤效果，大幅度的降低了药物的系统毒副作用。
然而，在对于卵巢、胃、肠癌这类具有腹膜内癌扩散特征的恶性肿瘤的临床治疗中，由于肿瘤在腹腔内的转移和浸润作用，使得它们具有尺寸小，分布广和数量多的特点。此外，一些肿瘤入侵的区域只能在微观尺度下才能观察到，宏观上并不能看到。这就给临床上的手术切除治疗和局部化疗带来了极大的困难。因此，肿瘤内注射给药就成为无的放矢，不能有效地抑制所有的肿瘤细胞和防止肿瘤细胞的浸润和转移。而本发明中采用了无毒性，可生物降解的天然高分子水凝胶作为纳米粒子的载体，它可以在模具中成为任意的形状，在临床手术治疗中贴附在肿瘤部位和任何肿瘤可能已经浸润和转移的区域。一段时间内，高分子水凝胶会逐渐将载药纳米微粒释放出来，这样，通过高分子水凝胶和纳米微粒的双重缓释作用，使得药物在病灶部位的浓度增加，作用时间延长，进而达到了有效治疗的效果。
明胶是由动物皮、骨、腱和韧带组织中的胶原蛋白部分水解得到的，是蛋白质片断的混合物，由18种氨基酸组成。明胶由于其低的抗原性，良好的生物相容性和可生物降解性，广泛应用于医药领域。明胶分为两种类型，A型和B型。A型明胶是胶原蛋白经过酸化处理得到的，等电点大约为7-9。而B型明胶是在高pH条件下，胶原蛋白经过碱性水解得到的。由于此过程中蛋白质中氨基化合物丢失，最终成为一种低等电点(约为pH5)的明胶。在明胶分子上含有大量的官能基团，如氨基，羧基等，可以用来交联或形成其他衍生物，例如可以通过明胶分子上的氨基与聚丙烯酸分子上的羧基通过静电络合作用形成疏水区域，从而形成核壳结构的纳米微粒。此外，当明胶在水中的浓度高于0.5g/dL时，随着温度降低到明胶凝胶的熔点以下，明胶分子间会部分复性成为胶原蛋白的三螺旋结构，在溶液中形成无限的分子网络结构进而形成明胶水凝胶。
现有的铂类药物输送体系主要有脂质体，高分子纳米微粒，微球等作为载体，给药方式通常为静脉注射，腹腔内注射和局部瘤内注射。据文献报道，当顺铂加入到富含羧基的高分子纳米微粒溶液中时，顺铂上的两个氯配体会被纳米微粒上的羧酸盐所替换，从而将顺铂通过比较强的化学配位作用包覆在纳米微粒中。当纳米微粒进入体内后，由于体内环境中氯离子浓度相对较高，氯配体会重新取代羧基结合到铂原子上，实现了纳米微粒对顺铂药物的释放。其它铂类药物也可通过这一过程实现纳米微粒对其的包覆与释放。利用这一原理，Kataoka等人详细地研究了铂类药物在富含羧基的纳米微粒上的负载情况，取得了一定的成效。本发明中我们利用明胶-聚丙烯酸复合纳米微球中聚丙烯酸和明胶分子上的羧基与铂类药物中的Pt(II)的配位作用，实现了纳米微球对铂类药物的包覆。用负载铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球作为剂型，以及采用天然高分子水凝胶作为此种载药纳米微粒的载体植入体内并贴敷在肿瘤部位的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载有铂类药物纳米微球以及可贴敷于肿瘤部位的并可生物降解的包裹有铂类药物纳米微球的天然高分子水凝胶及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，它的表面是带电荷的明胶分子，内部是明胶分子和聚丙烯酸分子通过静电作用形成的不带电的聚电解质，铂类药物通过Pt(II)与体系中的羧基形成化学配位作用结合在纳米微球上，其中，铂类药物占复合纳米微球质量的5-45％，明胶的数均分子量在20000-100000范围内，含量为复合纳米微球质量的45％-70％，聚丙烯酸数均分子量范围为500-20000，含量为复合纳米微球质量的10％-25％。纳米微球的平均粒径为50-200纳米。
上述的纳米微球可以是经戊二醛或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)交联剂交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，交联后的纳米微球更加稳定。
上述的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，所述的铂类药物可以是顺铂、卡铂、奥沙利铂。
一种制备上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的方法，它包括如下步骤：
步骤1.在60-90℃搅拌下，在蒸馏水中加入明胶和丙烯酸，明胶与丙烯酸的质量比为2.5∶1～5∶1，体系中反应物的总浓度为10-30mg/ml，搅拌至完全溶解；
步骤2.溶解完全后，加入引发剂在60-90℃搅拌下反应1-4小时，引发剂可以是过硫酸钾，引发剂过硫酸钾的浓度为0.6-3mg/ml，反应完成后形成水相纳米微粒分散液；
步骤3.将步骤2所得的水分散液用蒸馏水稀释3-10倍，稀释后加入铂类药物，铂类药物与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.1∶1-1.5∶1，在30-40℃搅拌下反应12-72小时后即得到载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球。
一种制备上述交联剂交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的方法，它由下列步骤组成：
步骤1.在60-90℃搅拌下，在蒸馏水中加入明胶和丙烯酸，明胶与丙烯酸的质量比为2.5∶1～5∶1，体系中反应物的总浓度为10-30mg/ml，搅拌至完全溶解；
步骤2.溶解完全后，加入引发剂在60-90℃搅拌下反应1-4小时，引发剂可以是过硫酸钾，引发剂过硫酸钾的浓度为0.6-3mg/ml，反应完成后形成水相纳米微粒分散液；
步骤3.将步骤2所得的水相纳米微粒分散液过滤后加入25％戊二醛溶液，加入的戊二醛交联剂中的醛基与纳米微球中氨基的物质的量之比为0.2∶1-5∶1；或者先后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)作为交联剂，加入的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.5∶1-5∶1，加入的2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)中的氨基与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.5∶1-5∶1，在20-40℃下反应2-12小时，反应完成后将水分散液放在透析袋(Cut-off分子量为12000)中，然后将透析袋完全浸入1000ml蒸馏水中，每隔4小时换新鲜的蒸馏水，透析8-48h后将透析袋内的溶液倾出，透析掉未反应的交联剂；
步骤4.将上述透析后的水分散液用蒸馏水稀释3-10倍，稀释后加入铂类药物，铂类药物与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.1∶1-1.5∶1，在30-40℃搅拌下反应12-72小时后即得到交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球。在该条件下交联得到的纳米微球更加稳定，耐碱，耐盐性能更好。
本发明的载药纳米微球的大小可以通过调节明胶与丙烯酸的投料比、引发剂过硫酸钾的浓度、体系反应物的总浓度和反应时间的长短来调节。
本发明的制备方法制得的载有铂类药物的纳米微球粒径均一，分散性好，而且包封率和载药量高。
一种包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶，它是天然高分子水凝胶包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，其中载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球与天然高分子水凝胶的质量比为1∶3-1∶150，所述的天然高分子水凝胶可以是明胶、胶原、海藻酸或琼脂的水凝胶。
上述的包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶，可以承载在盘状的可生物降解高分子薄膜中。
一种制备上述的包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶的方法，它包括下列步骤：
(1)将上述天然高分子明胶、胶原、海藻酸或琼脂的粉末溶于蒸馏水中，使高分子的质量分数为2-90％；
(2)充分溶解后，在35-60℃下，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂交联上述溶液中的高分子，其中高分子中的羧基与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1∶0.5-1∶10，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量之比为1∶0.2-1∶1，反应时间为0.5-10小时；
(3)将步骤2所得的高分子溶液放在透析袋(Cut-off分子量为12000)中，然后将透析袋完全浸入1000ml蒸馏水中，每隔4小时换新鲜的蒸馏水，透析8-24h后将透析袋内的溶液倾出，去掉未反应的交联剂；
(4)将浓度为6mg/ml载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与上述天然高分子溶液混合并搅拌均匀，其中载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球与天然高分子水凝胶的质量比为1∶3-1∶150；
(5)将上述搅拌后的溶液在温度为4-25℃的条件下放置0.5-2小时，得到包裹铂类药物高分子纳米微球的天然高分子水凝胶。
上述的制备载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶的方法，步骤5所述的过程可以发生在可生物降解高分子薄膜的盘状模具中。如此所得的由高分子薄膜承载的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶的机械强度更高，更便于携带与操作。同时，可以将铂类药物水凝胶类似膏药贴附在肿瘤部位并固定，这样，纳米微球就可以定向的释放到肿瘤部位中，提高了药物的利用率。
上述可生物降解高分子薄膜模具，其材料是聚乙交酯丙交酯共聚物、聚丙交酯或羟丙基甲基纤维素。
本发明中铂类药物的用量为：铂类药物与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.1∶1-1.5∶1。该用量能够很好的实现铂类药物的包埋，载药量大，载药效率高，可达80％以上。
本发明中高分子水凝胶的交联所选用的交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺。选用该交联剂是因为相比于其他的交联剂，它们具有更好的生物相容性和低毒性。
本发明中制得的包裹载有铂类药物的高分子复合纳米微球的天然高分子水凝胶对铂类药物具有双重缓释作用，即水凝胶会缓慢释放出载药纳米微球，载药高分子微球再将铂类药物缓释出来。体外释放时间为10-20天，作为药物，它具有良好的缓释效果，大大提高了药效。
本发明中制得的包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶不仅拥有良好的生物相容性，可在外科手术过程中将其植入体内并贴敷在肿瘤部位，而且因其高载药量，双重缓释速度缓慢的特点，可以大幅度提高铂类药物的给药剂量而不增加药物的系统毒副作用。此外，本发明对于卵巢、胃、肠癌这类具有腹膜内癌扩散特征的恶性肿瘤的临床治疗有着非常好的应用前景。
本发明制备的包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶药物具有与铂类药物自由药相当的体外抗肿瘤活性，而且体内抗肿瘤效果也明显得到了增强。
本发明以天然高分子水凝胶为载体，实现了对铂类药物纳米微球的包埋。此方法简单有效，原料易得，成本较低。
附图说明
图1为负载铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的模型图；1为聚合物网络；2为铂类药物分子。
图2为包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的体外释放曲线；
图3为包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶对人肠癌细胞LOVO体外细胞毒性实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后将水分散液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，除去体系中未反应的单体和小分子无机盐。取透析后的溶液2ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂，得到载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球55毫克，其中，顺铂占复合纳米微球质量的16％，明胶的含量为复合纳米微球质量的68％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的16％。微球粒径约为120nm。
实施例2：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为2万的B型明胶2.5克，以及1克丙烯酸溶于350ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至60℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.2克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应1小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后将水分散液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，除去体系中未反应的单体和小分子无机盐。取透析后的溶液3ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入4毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，30℃搅拌12小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂，得到载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球30毫克，其中，顺铂占复合纳米微球质量的5％，明胶的含量为复合纳米微球质量的70％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的25％。微球粒径约为50nm。
实施例3：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为10万的A型明胶5克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至90℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.6克过硫酸钾作为引发剂。90℃条件下反应4小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后将水分散液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，除去体系中未反应的单体和小分子无机盐。取透析后的溶液1ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入40毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，40℃搅拌72小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂，得到载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球50毫克，其中，顺铂占复合纳米微球质量的45％，明胶的含量为复合纳米微球质量的45％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的10％。，微球粒径约为200nm。
实施例4：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中加入0.8ml25％戊二醛溶液进行交联，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液2ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。其中，顺铂占复合纳米微球质量的16％，明胶的含量为复合纳米微球质量的68％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的16％。。
实施例5：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为2万的B型明胶2.5克，以及1克丙烯酸溶于350ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至60℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.2克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应1小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中加入100μl25％戊二醛溶液进行交联，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液3ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入4毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，30℃搅拌12小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。其中，顺铂占复合纳米微球质量的5％，明胶的含量为复合纳米微球质量的70％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的25％。。
实施例6：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为10万的A型明胶5克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至90℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.6克过硫酸钾作为引发剂。90℃条件下反应4小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中加入5ml25％戊二醛溶液进行交联，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液1ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入40毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，40℃搅拌72小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。其中，顺铂占复合纳米微球质量的45％，明胶的含量为复合纳米微球质量的45％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的10％。
实施例7：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入1.7克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和660μl2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应2小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液2ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。其中，顺铂占复合纳米微球质量的16％，明胶的含量为复合纳米微球质量的68％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的16％。
实施例8：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入17克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和6.6ml2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液2ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。其中，顺铂占复合纳米微球质量的16％，明胶的含量为复合纳米微球质量的68％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的16％。
实施例9：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入2克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1ml 2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液1ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入20毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。
上述体系中聚丙烯酸的分子量为3000，透射电镜观察顺铂纳米微球为较为规则的球形结构，平均粒径在130纳米左右，在pH＝7.4的PBS溶液中能长时间保存。在上述条件下用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法测得该载药体系的载药量为41.7％，载药效率高于70％。
实施例10：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入2克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1ml2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液1.5ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。
上述体系中聚丙烯酸的分子量为3000，透射电镜观察顺铂纳米微球为较为规则的球形结构，平均粒径在150纳米左右，在pH＝7.4的PBS溶液中能长时间保存。在上述条件下用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法测得该载药体系的载药量为21.9％，载药效率高于80％。
实施例11：载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入2克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1ml2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液3ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入10毫克的顺铂(顺式二氨基二氯络铂)，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的顺铂。
上述体系中聚丙烯酸的分子量为3000，透射电镜观察顺铂纳米微球为较为规则的球形结构，平均粒径在160纳米左右，在pH＝7.4的PBS溶液中能长时间保存。在上述条件下用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法测得该载药体系的载药量为13.9％，载药效率高于80％。
实施例12：载有卡铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入2克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1ml2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液3ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入12毫克的卡铂，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的卡铂。其中，卡铂占复合纳米微球质量的14％，明胶的含量为复合纳米微球质量的69％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的17％。
实施例13：载有奥沙利铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备
在500ml搅拌式反应器中，数均分子量为5万的B型明胶4克，以及1克丙烯酸溶于200ml蒸馏水中。搅拌条件下，升温至80℃。当明胶完全溶解后，向反应器中加入0.3克过硫酸钾作为引发剂。80℃条件下反应2小时，得到水相纳米微粒分散液。停止反应，将体系温度降至室温过滤，过滤后向所得的水分散液中先后加入2克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1ml2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联，室温下搅拌反应12小时，反应后将所得溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时以除去体系中未反应的单体和交联剂。取透析后的溶液3ml，用蒸馏水稀释至10ml后再向溶液中加入13毫克的奥沙利铂，37℃搅拌反应48小时，取出后在中性水中反复超滤，以除去游离的奥沙利铂。其中，奥沙利铂占复合纳米微球质量的14％，明胶的含量为复合纳米微球质量的69％，聚丙烯酸的含量为复合纳米微球质量的17％。
实施例14：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将200毫克数均分子量为2万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液，搅拌并混合均匀。在温度为4℃的条件下放置0.5小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例15：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将9克数均分子量为10万的A型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液，搅拌并混合均匀。在温度为25℃的条件下放置2小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例16：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液，搅拌并混合均匀。在温度为8℃的条件下放置1小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例17：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入60毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和7毫克N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，在35℃下反应0.5小时。将交联后的明胶溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析8小时，去除掉未反应的交联剂；透析后将10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与所得的明胶溶液混合并搅拌均匀。在温度为8℃下放置1小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例18：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入1.1克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和690毫克N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，在60℃下反应10小时。将交联后的明胶溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析48小时，去除掉未反应的交联剂；透析后将10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与所得的明胶溶液混合并搅拌均匀。在温度为8℃下放置1小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例19：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入200毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100毫克N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，在40℃下反应8小时。将交联后的明胶溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，去除掉未反应的交联剂；透析后将10ml上述实施例10载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与所得的明胶溶液混合并搅拌均匀。在温度为8℃下放置1小时，即得到包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例20：包裹载有卡铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入200毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100毫克N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，在40℃下反应8小时。将交联后的明胶溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，去除掉未反应的交联剂；透析后将10ml上述实施例12载有卡铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与所得的明胶溶液混合并搅拌均匀。在温度为8℃下放置1小时，即得到包裹载有卡铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例21：包裹载有奥沙利铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将600毫克数均分子量为5万的B型明胶加入到10ml蒸馏水中，在40℃搅拌下充分溶解，然后加入200毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100毫克N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，在40℃下反应8小时。将交联后的明胶溶液装入透析袋(Cut-off分子量为12000)中透析24小时，去除掉未反应的交联剂；透析后将10ml上述实施例13载有奥沙利铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与所得的明胶溶液混合并搅拌均匀。取一定体积的混合后的溶液在温度为8℃下放置1小时，即得到包裹载有奥沙利铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶。
实施例22：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的胶原水凝胶的制备
将1克数均分子量为30万的I型胶原加入到10ml蒸馏水中，在60℃搅拌下充分溶解，然后加入10ml上述实施例10载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液，搅拌并混合均匀。取一定体积的混合后的溶液在温度为8℃的条件下放置1小时，即得到包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的胶原蛋白水凝胶。
实施例23：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的海藻酸水凝胶的制备
将1克数均分子量为17万的海藻酸钠粉末加入到10ml蒸馏水中，在室温下搅拌充分溶解，然后加入上述实施例10载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液10ml，搅拌并混合均匀。取一定体积的混合后的溶液用酸性缓冲溶液将体系pH值调至3.5左右，即得到包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的海藻酸水凝胶。
实施例24：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的琼脂水凝胶的制备
将300毫克琼脂粉末加入到10ml蒸馏水中，在90℃搅拌下充分溶解，然后加入10ml上述实施例10载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液，搅拌并混合均匀。取一定体积的混合后的溶液在室温下放置1小时，即得到包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的琼脂水凝胶。
实施例25：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将聚乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)溶于1，4-二氧六环溶剂中，配置成质量百分浓度为10％的溶液，充分溶解后将其滴入到模具中成膜。自然干燥48h，真空干燥24h后，将所成的薄膜从模具中取出。所成的膜的形状为盘状的PLGA薄膜。将一定体积的上述实施例10中天然高分子溶液与铂类药物纳米微球溶液的混合溶液滴入到上述盘状的PLGA薄膜中，8℃放置1小时。所得的承载在盘状PLGA高分子薄膜中的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的高分子水凝胶机械强度更高，更便于携带与操作。同时，可以将水凝胶贴附在肿瘤部位并固定，这样，纳米微球就可以定向的释放到肿瘤部位中，提高了药物的利用率。
实施例26：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将聚丙交酯(PLA)溶于1，4-二氧六环溶剂中，配置成质量百分浓度为10％的溶液，充分溶解后将其滴入到模具中成膜。自然干燥48h，真空干燥24h后，将所成的薄膜从模具中取出。所成的膜的形状为盘状的PLA薄膜。将一定体积的上述实施例10中天然高分子溶液与铂类药物纳米微球溶液的混合溶液滴入到上述盘状的PLA薄膜中，8℃放置1小时。所得的承载在盘状PLA高分子薄膜中的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的高分子水凝胶机械强度更高，更便于携带与操作。同时，可以将水凝胶贴附在肿瘤部位并固定，这样，纳米微球就可以定向的释放到肿瘤部位中，提高了药物的利用率。
实施例27：包裹载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的制备
将羟丙基甲基纤维素(HPMC)溶于75％乙醇中，配置成质量百分浓度为10％的溶液，充分溶解后将其滴入到模具中成膜。自然干燥48h，真空干燥24h后，将所成的薄膜从模具中取出。所成的膜的形状为盘状的HPMC薄膜。将一定体积的上述实施例10中天然高分子溶液与铂类药物纳米微球溶液的混合溶液滴入到上述盘状的HPMC薄膜中，8℃放置1小时。所得的承载在盘状HPMC高分子薄膜中的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的高分子水凝胶机械强度更高，更便于携带与操作。同时，可以将水凝胶贴附在肿瘤部位并固定，这样，纳米微球就可以定向的释放到肿瘤部位中，提高了药物的利用率。
实施例28：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的体外释放
将实施例17中制得的包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶(所含顺铂的量为1毫克)放在透析袋(Cut-off分子量为12000)中，然后将透析袋完全浸入10ml 0.01mol/LPBS中，在37℃搅拌下进行释放实验。每隔一定时间取出5ml释放介质，用ICP-MS的方法测定样品中铂的含量。并根据含量计算释放百分率，结果如图2所示，可以看出负载于其中的药物表现出持续稳定的释放特性。
实施例29：包裹载有顺铂的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的明胶水凝胶的体外细胞毒性实验
细胞株为人肠癌细胞LOVO。通过MTT法测定了实施例17中制备的顺铂水凝胶对LOVO细胞的体外杀伤效果(如图3所示)，时间为48小时。从图3中可以看到在48小时作用时间下，顺铂水凝胶在较高的药物浓度下就具有与顺铂自由药相当的体外杀伤力。
由此可见，采用本发明所公开的方法，可以将铂类药物通过贴附病理靶向到肿瘤部位，大大地提高了肿瘤部位的药物浓度，由于铂类药物水凝胶的双重缓释作用，可以增加铂类药物的给药剂量并且很好地降低了系统毒副作用。进一步提高了抗肿瘤效率。
Claims (10)
1.一种载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，其特征是：它的表面是带电荷的明胶分子，内部是明胶分子和聚丙烯酸分子通过静电作用形成的不带电的聚电解质，铂类药物通过Pt(II)与体系中的羧基形成化学配位作用结合在纳米微球上，其中，铂类药物占复合纳米微球质量的5-45％，明胶的数均分子量在20000-100000范围内，含量为复合纳米微球质量的45％-70％，聚丙烯酸数均分子量范围为500-20000，含量为复合纳米微球质量的10％-25％，纳米微球的平均粒径为50-200纳米，明胶-聚丙烯酸复合纳米微球由下述方法制备：在60-90℃搅拌下，在蒸馏水中加入明胶和丙烯酸，明胶与丙烯酸的质量比为2.5∶1～5∶1，体系中反应物的总浓度为10-30mg/ml，搅拌至完全溶解；然后，加入引发剂在60-90℃搅拌下反应1-4小时，反应完成后形成水相纳米微粒分散液。
2.根据权利要求1所述的纳米微球，其特征是：所述的纳米微球是经戊二醛或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)交联剂交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球。
3.根据权利要求1所述的纳米微球，其特征是：所述的铂类药物是顺铂、卡铂或奥沙利铂。
4.一种制备权利要求1所述的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1.在60-90℃搅拌下，在蒸馏水中加入明胶和丙烯酸，明胶与丙烯酸的质量比为2.5∶1～5∶1，体系中反应物的总浓度为10-30mg/ml，搅拌至完全溶解；
步骤2.溶解完全后，加入引发剂在60-90℃搅拌下反应1-4小时，引发剂是过硫酸钾，引发剂过硫酸钾的浓度为0.6-3mg/ml，反应完成后形成水相纳米微粒分散液；
步骤3.将步骤2所得的水分散液用蒸馏水稀释3-10倍稀释后加入铂类药物，铂类药物与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.1∶1-1.5∶1，在30-40℃搅拌下反应12-72小时后即得到载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球。
5.一种制备权利要求2所述交联剂交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的方法，其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.在60-90℃搅拌下，在蒸馏水中加入明胶和丙烯酸，明胶与丙烯酸的质量比为2.5∶1～5∶1，体系中反应物的总浓度为10-30mg/ml，搅拌至完全溶解；
步骤2.溶解完全后，加入引发剂在60-90℃搅拌下反应1-4小时，引发剂是过硫酸钾，引发剂过硫酸钾的浓度为0.6-3mg/ml，反应完成后形成水相纳米微粒分散液；
步骤3.将步骤2所得的水相纳米微粒分散液过滤后加入25％戊二醛溶液，加入的戊二醛交联剂中的醛基与纳米微球中氨基的物质的量之比为0.2∶1-5∶1；或者先后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2′-(乙烯二氧)双(乙胺)作为交联剂，加入的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.5∶1-5∶1，加入的2，2′(乙烯二氧)双(乙胺)中的氨基与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.5∶1-5∶1，在20-40℃下反应2-12小时，反应完成后将水分散液放在透析袋中，然后将透析袋完全浸入1000ml蒸馏水中，每隔4小时换新鲜的蒸馏水，透析8-48h后将透析袋内的溶液倾出，透析掉未反应的交联剂；
步骤4.将上述透析后的水分散液用蒸馏水稀释3-10倍稀释后加入铂类药物，铂类药物与纳米微球中羧基的物质的量之比为0.1∶1-1.5∶1，在30-40℃搅拌下反应12-72小时后即得到交联的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球。
6.一种包裹有权利要求1或2所述的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶，其特征是：它是天然高分子水凝胶包裹有权利要求1或2所述的载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球，其中载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球与天然高分子水凝胶的质量比为1∶3～1∶150，所述的天然高分子水凝胶是明胶、胶原、海藻酸或琼脂的水凝胶。
7.根据权利要求6所述的包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶，其特征是：它承载在盘状的可生物降解高分子薄膜中。
8.一种制备上述的包裹有上述载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶的方法，其特征是：它包括下列步骤：
(1)将上述天然高分子明胶、胶原、海藻酸或琼脂的粉末溶于蒸馏水中，使高分子的质量分数为2-90％；
(2)充分溶解后，在35-60℃下用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂交联上述溶液中的高分子，其中高分子中的羧基与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量之比为1∶0.5-1∶10，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量之比为1∶0.2-1∶1，反应时间为0.5-10小时；
(3)将步骤2所得的高分子溶液透析8-48小时，去掉未反应的交联剂；
(4)将载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的溶液与上述天然高分子溶液混合并搅拌均匀，其中载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球与天然高分子水凝胶的质量比为1∶3-1∶150；
(5)将上述搅拌后的溶液在温度为4-25℃的条件下放置0.5-2小时，得到包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶。
9.根据权利要求8所述的制备包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶的方法，其特征是：步骤5所述的过程发生在可生物降解高分子薄膜的盘状模具中，制得权利要求7所述的承载在盘状的可生物降解高分子薄膜中的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶。
10.权利要求6或7所述的包裹有载有铂类药物的明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的天然高分子水凝胶在制备抗肿瘤药物中的应用。
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