CN105617362A - 一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其给药系统，其中，胰岛素与磷脂的质量比为1:3～1:100；壳聚糖与磷脂的质量比为1:5～1:50。本发明所述的自组装微粒载体，先由胰岛素与适量的磷脂材料在特定的环境中形成胰岛素磷脂复合物，再将胰岛素磷脂复合物的非水溶剂有机相，注入到壳聚糖的水相溶液中，在温和的搅拌条件下自组装形成胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体。本发明的胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体，无需加入交联剂，呈圆形或椭圆形，具有多层囊状结构，粒径分布在50～5000nm，药物包封率高达70％以上，在胃肠液环境中质量稳定性好，突释小，可突破酶屏障和膜屏障限制，用于制备胰岛素口服、粘膜、经皮等非注射给药系统。

Description

一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切地说是一种以脂质复合物为中间载体的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂和制备方法。

背景技术

随着生物技术的不断发展，蛋白多肽类药物的应用愈加广泛。胰岛素作为一种具有降血糖作用的蛋白多肽类药物，多年以来，临床上一直以注射的方式进行给药，长期频繁的注射给病人造成极大的不适与痛苦，因此，胰岛素的非注射方式给药一直受到广泛的关注。其中，以口服给药的方式对胰岛素进行给药，能够模拟体内胰岛素的代谢模式，因而成为胰岛素给药方式的研究热点。针对其口服给药所面临的主要问题，如半衰期很短、胃肠道稳定性差、难以通过胃肠道粘膜等等，不断涌现出脂质体、纳米粒、乳剂、微球等新型药物载体来实现胰岛素口服递送的目的。

近年来高分子材料以及新型药物给药系统的发展迅猛，可生物降解的壳聚糖纳米粒因其具有无毒、来源广泛、具有良好的生物相容性以及生物降解性而被广泛用作为生物药品的递送载体。经研究表明，壳聚糖表面荷有大量的正电荷，可以吸附到黏膜表面并迅速打开上皮细胞之间的紧密连接，以壳聚糖为载体材料包载蛋白多肽类药物制备的纳米粒，可促进该类药物的跨膜转运以及药物吸收，从而显著提高生物利用率。已有许多研究表明，胰岛素与壳聚糖形成的纳米粒能够成功地通过细胞旁路途径对胰岛素进行跨膜转运(K.Sonajeetal.Adv.Funct.Mater.20(2010)3695–3700)，提示胰岛素壳聚糖纳米粒作为口服递送载体，具有良好的发展前景。

但受胰岛素理化性质影响，胰岛素壳聚糖纳米粒存在明显缺陷，限制了其进一步发展。

1)在制备过程中蛋白多肽药物易发生变性、突释或泄露

胰岛素壳聚糖纳米粒形成机制是基于胰岛素的负电荷与壳聚糖的正电荷相作用，但由于胰岛素所带负电荷较弱，不能通过电荷引力作用直接与壳聚糖形成稳定的纳米粒或者其他制剂，已有的制备方法中必须加入交联剂，采用离子交联和化学交联等方法。其中，离子交联法需要添加三聚磷酸钠或海藻酸钠等作为交联剂，涉及多次洗涤、冻干等步骤，容易造成药物泄露，交联效率不高，所制得的胰岛素壳聚糖纳米粒于酸性条件下易解离，突释问题明显且不可预测(HammanJH.Chitosanbasedpolyelectrolytecomplexesaspotentialcarriermaterialsindrugdeliverysystems.MarDrugs.2010；8(4):1305-1322)。而通过化学交联法制备胰岛素-壳聚糖微球，则需要添加化学交联剂戊二醛等，交联剂毒性大、交联时间较长并且需要机械搅拌等条件，在制备过程中易导致蛋白质变性失活、微球尺寸不均一，经过复杂的工艺改进之后，药物包封率依然未能高于65％(GuYonghongetal.Preparationofuniform-sizedchitosanmicrospheresandapplicationascarriersforproteindrugs.ChineseJournalofBiotechnology,2006；22(1):150-155.)。

2)增加药物亲脂性会提高载药纳米粒的跨膜转运效率

尽管壳聚糖纳米粒可以吸附到黏膜表面并迅速打开上皮细胞之间的紧密连接，但因胰岛素为大分子的蛋白多肽类物质，亲脂性较差，包载胰岛素的壳聚糖纳米粒的跨膜转运效果会受到影响。针对以上问题，如果可以在增加胰岛素亲脂性的同时加上壳聚糖纳米粒的协助入胞作用，会增加载药纳米粒的跨膜转运效率。

针对如何提高胰岛素的亲脂性，有大量文献报道，如对胰岛素进行长链脂肪酸的酯化修饰，能够大大改善其脂溶性(S.R.Myersetal.Acylationofhumaninsulinwithpalmiticacidextendsthetimeactionofhumaninsulinindiabeticacid.Diabetes.1997,46:637-642)，然而，通过化学修饰的方法，会对蛋白多肽类药物的高级结构产生不可逆的影响，并不可避免地对其生物活性产生影响。而已有的研究表明通过制备胰岛素磷脂复合物，可以在不改变其生物活性的同时，增加胰岛素的脂溶性。

磷脂具有较强的荷负电性质，无需外加交联剂即可与壳聚糖通过自组装形成纳米粒，据此，有文献(F.Sonvicoetal.Formationofself-organizednanoparticlesbylecithin/chitosaninteraction,InternationalJournalofPhamacetics324(2006)67-73)通过溶剂注入法，将脂质材料的甲醇或者乙醇溶液注入至壳聚糖水溶液中，便得到了由磷脂和壳聚糖层层相互交联的自组装多层囊状结构的纳米粒。由于磷脂的亲脂性和粘膜渗透性较强，磷脂与壳聚糖形成的纳米粒具有更加出色的跨膜转运能力。同时，壳聚糖与磷脂相互交联形成的多层囊状结构，最外层为壳聚糖分子层，在一定程度上降低了磷脂分子层的流动性，使纳米粒的稳定性得到改善。

因此，利用磷脂和壳聚糖自组装纳米粒包载药物，受到国内外广泛的关注。但已有的文献研究同时亦表明，这种纳米粒对于脂溶性药物的包封率较高，对于水溶性药物的包封率则很低，主要原因是脂溶性药物易于进入多层囊状结构中，而亲水性药物则主要吸附在外层的壳聚糖分子外围。胰岛素不仅高度亲水，同时还是大分子药物，更是难以被包载进入磷脂壳聚糖的自组装纳米粒中，而且，胰岛素、磷脂和壳聚糖三者甚至都无法形成澄清透明的溶液，因此，迄今为止，尚未见胰岛素与磷脂及壳聚糖三者以任何形式组合制备纳米级或微米级释药载体的研究报道。

发明内容

本发明的核心内容，是将胰岛素与磷脂先形成药物/磷脂复合物，再将复合物溶于合适的有机溶剂中形成有机相，注入壳聚糖的水溶液中，通过电荷相互作用，在温和条件下自组装形成胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体。当磷脂与壳聚糖相互交联形成多层囊状结构的过程中，药物会随磷脂一起被包载进入多层囊中间，无需加入交联剂，即可获得包封率高、稳定性好、突释低的微粒载体，避免因交联反应导致的蛋白变性及药物泄露，有利于改善跨膜转运和生物吸收。

本发明所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，主要组成成分为壳聚糖、磷脂和胰岛素，其中，药物与磷脂的重量比为1:3－1:100，优选1:5－1:50；壳聚糖与磷脂的重量比为1:5－1:50，优选1:10－1:40。

本发明所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体，是由胰岛素与全部用量的磷脂先制成胰岛素磷脂复合物粉末，再将复合物粉末溶于非水溶剂中形成有机相，注入到壳聚糖的水相溶液中，搅拌条件下，通过电荷作用，自组装形成层层交联的多层囊结构的微粒。调节制备条件，可获得不同的粒径，范围在50－5000nm之间。

本发明所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体，还可是胰岛素与部分磷脂先制成胰岛素磷脂复合物粉末，再将复合物粉末及剩余量的游离磷脂，一同溶于非水溶剂中形成有机相，注入到壳聚糖的水相溶液中，搅拌条件下，通过电荷作用，自组装形成层层交联的多层囊结构的微粒。调节制备条件，可获得不同的粒径，范围在50－5000nm之间。

胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的自组装制备方法中，溶解胰岛素磷脂复合物的“非水溶剂”，可以是甲醇、乙醇、无水乙醇，还可是乙醚、二氯甲烷，还可是丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃。相互更换，可得到类似的结果。其中，优选无水乙醇和乙醚。

自组装制备方法中，壳聚糖的水相溶液，系用1％(v/v)醋酸或盐酸溶液溶解壳聚糖，制得含壳聚糖1％(w/v)的母液，再加水稀释至合适的浓度，并调节pH值至5左右，即得壳聚糖的水相溶液。其中所述的合适浓度，可以是0.05mg/ml，还可以是0.1mg/ml，还可是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml，还可是2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml。壳聚糖母液及稀释溶液的浓度及配制方法，可结合壳聚糖理化性质进行调整，并不影响本发明结果。

自组装制备方法中，自组装可在磁力搅拌条件下完成，磁力搅拌的转速和保持搅拌的时间可根据实验结果进行适当调整，并不影响本发明结果。

本发明所述的胰岛素磷脂复合物，是药物与磷脂在特定的非质子性溶剂中通过复合反应而制得。药物与磷脂的重量比为1:3－1:100，优选1:3－1:50，更优选1:5－1:20，进一步优选1:8－1:12。其制备方法，是将药物溶于含酸的低分子醇溶剂中，其中酸可选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸中的至少一种，低分子醇选自甲醇、乙醇和叔丁醇中的至少一种，优选三氯醋酸的甲醇溶液。而磷脂则溶于极性较低的有机溶剂中，具体可选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇乙酯、丙酮或乙醚中的至少一种，优选二氯甲烷。将药物溶液与磷脂溶液两者混合，旋转蒸发去除溶剂，即得复合物粉末。

胰岛素磷脂复合物的制备，还可将药物溶于含酸的DMSO或DMF中，酸可选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸中的至少一种，而磷脂溶于DMSO或DMF中，两者混合，经复合反应后，冷冻干燥去除溶剂，即得复合物粉末。

本发明所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装形成的微粒载体，通过磷脂与壳聚糖电荷相互作用发生层层交联，药物随磷脂被包载进入多层囊的中间位置，具有以下优点：

包封率高，在70－95％；

稳定性好，室温贮存6个月质量稳定；

抵御胃酸及消化道酶降解的能力强，人工胃液中4个小时和人工肠液中8个小时，胰岛素含量均无明显下降，而单纯的胰岛素溶液在人工胃液中60分钟即完全降解，胰岛素磷脂复合物在人工胃液中60分钟降解40％；

突释量由此提示，胰岛素形成复合物，可提可在人工胃液中的稳定性，而复合物为中间载体，再与壳聚糖形成自组装微粒系统，药物被较好的包载进入多层囊的纳米结构中，在胃肠液中的稳定性进一步显著提高。

突释效应低，人工胃液中1小时内突释率低于20％，人工肠液中1小时内的突释率低于10％，明显优于传统的胰岛素与壳聚糖通过交联剂形成的纳米粒。

本发明所述的任一项胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体混悬液，装入特装置后制成的喷雾剂，贮存3个月质量稳定，比格犬经鼻和舌下粘膜给药，10IU/kg，血糖下降幅度达40％。经雾化吸入给药，表现出类似的降糖效果。

本发明所述的任一项以胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体混悬液，加入赋形剂可制成供膜用的膜剂(赋形剂可选自PVC,HPMC,CMC,PVP,卡伯姆)，或用凝胶基质(丙烯酸树脂及其钠盐)制成巴布剂，用于家兔口粘膜和经皮给药，降糖效果明显。

本发明所述的任一项赋形剂，可加入支撑剂经冷冻干燥方法制成冻干粉针。

本发明所述的任一项胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体混悬液，可根据需要制成干粉，去除溶剂的方法可以采取喷雾干燥、旋转蒸发，还可通过冷冻干燥，对产品质量均无影响。

本发明所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的干粉，可加入稀释剂、崩解剂等常规赋形剂制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、干粉吸入剂。

本发明所述的任一项胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体混悬液，对腹腔注射链脲佐菌素所诱导的糖尿病模型大鼠，口服灌胃给药后，与初始血糖值相比，其血糖水平可以降低60％，提示其良好的生物吸收程度。

本发明所述的任一项胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体及其制剂组合物，可用于口服、粘膜给药、肺部吸入、经皮给药，通过非注射给药发挥胰岛素的抗糖尿病治疗效果。

附图说明

图1本发明制得的纳米级(800nm以下)胰岛素壳聚糖微粒透射电镜(TEM)照片。

图2本发明制得的纳米级(800nm以下)胰岛素壳聚糖微粒冷冻透射电镜(Cryo-TEM)照片。

图3本发明制得的微米级(800nm以上)胰岛素壳聚糖微粒透射电镜(TEM)照片。

图4本发明的胰岛素壳聚糖微粒系统的体外释放曲线图。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为累积释药百分率(％)。

图5本发明实施例所制得的胰岛素壳聚糖微粒系统的体内降糖曲线图。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为血糖降低百分率(％)。

具体实施方式

实施例

以下对本发明特征进行描述，但权利要求并不仅局限于实施例内容。

实施例1：胰岛素磷脂复合物系列

根据发明专利申请201180002259.4所述的方法，将胰岛素：磷脂的质量比例分别按1：3、1：5、1：10、1：20和1：50投料，按如下方法制备：

取处方量的胰岛素溶于含三氟醋酸的甲醇溶液中；处方量的大豆卵磷脂溶于二氯甲烷中，将上述2种溶液进行混合，形成澄清的溶液。将此溶液于30－50℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，进一步氮吹挥发尽残留溶剂，将其置于真空干燥箱中，干燥后刮取至密闭容器中，得到系列的胰岛素磷脂复合物的干燥粉末，标记为复合物A、B、C、D、E。

上述方法，三氟醋酸由冰醋酸代替，其余条件不变，得到复合物A^①、B^①、C^①、D^①、E^①。

上述方法，三氟醋酸由盐酸代替，其余条件不变，得到复合物A^②、B^②、C^②、D^②、E^②。

上述方法，二氯甲烷由醋酸乙酯代替，其余条件不变，得到复合物A^③、B^③、C^③、D^③、E^③。

上述方法，二氯甲烷由四氢呋喃代替，其余条件不变，得到复合物A^④、B^④、C^④、D^④、E^④。

上述方法，二氯甲烷由丙酮代替，其余条件不变，得到复合物A^⑤、B^⑤、C^⑤、D^⑤、E^⑤。

实施例2：胰岛素磷脂复合物系列

将胰岛素：磷脂的质量比例分别按1：3、1：5、1：10、1：20和1：50投料，按如下方法制备：

取处方量的胰岛素和溶于含冰醋酸的DMSO溶液中；处方量的大豆卵磷脂溶于DMSO中，将上述2种溶液进行混合，形成澄清的溶液。将此溶液进行冷冻干燥，得到系列的胰岛素磷脂复合物的干燥粉末，标记为复合物F、G、H、I、J。

实施例3：胰岛素磷脂复合物系列

取10mg胰岛素溶于含酸的甲醇溶液中；100mg的蛋黄卵磷脂溶于二氯甲烷中，将上述2种溶液进行混合，形成澄清的溶液。将此溶液于30－50℃条件下进行减压旋转蒸发至溶剂挥干，进一步氮吹挥发尽残留溶剂，将其置于真空干燥箱中，干燥后刮取至密闭容器中，得到系列的胰岛素磷脂复合物的干燥粉末，标记为复合物K。

上述方法，将合成磷脂取代蛋黄磷脂，其余条件不变，得复合物L。

实施例4：以胰岛素磷脂复合物为中间载体的壳聚糖纳米粒

量取1mL1％(w/v)醋酸水溶液，加入92mL纯净水，使用NaOH溶液将其pH值调节至5.3，得到水相。取实施例1中制得任一胰岛素磷脂复合物适量(使药物与壳聚糖的重量比为1：1)，溶于8mL无水乙醇中，得到醇相。于磁力搅拌条件下，将醇相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，得到载有胰岛素的脂质纳米粒。激光粒度测定仪测得的粒径为136－160nm。测得的包封率均在80％以上。

上述方法中，实施例1的胰岛素磷脂复合物由实施例2的任一胰岛素磷脂复合物代替，其作条件不变，得到的脂质纳米粒的粒径为130－170nm，测得的包封率均在80％以上。

上述方法中，实施例1的胰岛素磷脂复合物由实施例3的任一胰岛素磷脂复合物代替，其作条件不变，得到的脂质纳米粒的粒径为128－165nm，测得的包封率均在80％以上。

实施例5：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒

以1％(v/v)醋酸溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。取该母液1mL，加入91mL纯净水进行稀释，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于8mL无水乙醇中，得到醇相。于磁力搅拌条件下，将醇相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒。经激光粒度测定仪测定，4组纳米粒的平均粒径分别为143nm，165nm，184nm，以及201nm。测得的包封率分别均在85％以上。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

实施例6：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒

以1％(v/v)醋酸溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。取该母液1mL，加入91mL纯净水进行稀释，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于8mL无水乙醇中，得到醇相。于磁力搅拌条件下，将醇相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒。经激光粒度测定仪测定，F2’与F2、F3’与F3、F4’与F4组的纳米粒之间，平均粒径在140－200nm，测得的包封率均在80％以上。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

实施例7：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒

以1％(v/v)醋酸溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。取该母液1mL，加入95mL纯净水进行稀释，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于4mL无水乙醇中，得到醇相。于磁力搅拌条件下，将醇相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒。经激光粒度测定仪测定，4组纳米粒的平均粒径分别为116nm，183nm，230nm，以及532nm。测得的包封率分别为74％，76％，94％，以及73％。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

实施例8：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒

以0.1mol/L的盐酸水溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。取该母液1mL，加入91mL纯净水进行稀释，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于8mL无水乙醇中，得到醇相。于磁力搅拌条件下，将醇相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质纳米粒。经激光粒度测定仪测定，4组纳米粒的平均粒径分别为101nm，151nm，193nm，以及211nm。测得的包封率分别为73％，85％，80％，以及77％。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

实施例9：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质微粒

以1％(v/v)的醋酸水溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。按下表取该母液适量，加水稀释至100ml，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于4mL乙醚中，得到有机相。于磁力搅拌条件下，将有机相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，对乙醚进行常温挥发。之后，于37℃条件下进行真空旋蒸，挥尽有机溶剂，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质微粒溶液，平均粒径在930nm、1800nm、3050nm、4200nm。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

实施例10：以胰岛素磷脂复合物为中间载体，制备载有胰岛素的壳聚糖-脂质微粒

以1％(v/v)的醋酸水溶液对壳聚糖进行溶解，制得1％(w/v)的壳聚糖母液。取该母液适量，加水稀释至100ml，使用NaOH溶液将该稀释液的pH值调节至5.3，得到水相。按下表分别称取磷脂及实施例1中制得的胰岛素磷脂复合物C适量，溶于4mL二氯甲烷中，得到有机相。于磁力搅拌条件下，将有机相注入到水相中，继续保持搅拌1小时，对二氯甲烷进行常温挥发。之后，于37℃条件下进行真空旋蒸，挥尽有机溶剂，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质微粒溶液，得到载有胰岛素的壳聚糖-脂质微粒胶体溶液，平均粒径分别为800nm、1500nm、2600nm、3200nm。

将蛋黄磷脂或合成磷脂代替大豆磷脂，可得到类似的结果。

将实施例1－3的任一胰岛素磷脂复合物进行替换，可得到类似结果。

试验例

试验例1：自组装微粒中胰岛素包封率的测定

1)药物总量测定：

精密量取载药微粒混悬液2mL，置于10mL容量瓶中，加入0.1％三氟乙酸-甲醇溶液溶解定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取胰岛素对照品适量，以0.1％三氟乙酸-甲醇溶液溶解并稀释至浓度为20μg/mL的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各注入液相色谱仪进行分离分析，色谱柱为300SB-C8(4.6×250mm,5μm,Agilent)，流动相为0.1mol/L硫酸盐缓冲液-乙腈(73-27)，流速为1.0mL/min，检测波长为214nm，柱温为40℃，进样量为10μL。记录色谱图，根据峰面积按照外标法计算载药纳米粒中胰岛素的浓度以及总量，记为W_totalinsulin。

2)游离药物测定：

精密量取载药微粒混悬液2mL，置于经过预处理的4mL超滤离心管中，以4,500rpm的转速离心20分钟，可以将游离的溶液与纳米粒充分分离。取下层超滤液直接注入液相色谱仪进行分析，按照上述色谱方法测定超滤液中游离药物的浓度，并根据超滤液的体积计算所含药物的量，W_freeinsulin。

包封率计算公式： $\mathrm{EE}=\frac{W_{\mathrm{total\; insulin}}-W_{\mathrm{free\; insulin}}}{W_{\mathrm{total\; insulin}}}\×100\%$

(2)胰岛素磷脂复合物壳聚糖自组装微粒统的包封率测定结果

取实施例4～实施例9中所制备的载药微粒，根据上述方法测定并计算药物的包封率，结果如下表1所示。该结果表明，当脂质材料与壳聚糖的质量比为10:1～40:1时，制得的不同载药量的纳米粒的包封率均在70％以上，表明该载体对于胰岛素的包封效率较高，混悬液中的游离药物较少。

表1：处方F1～F12中纳米粒的包封率测定结果

处方编号	包封率	处方编号	包封率
				F1	87％	F7	94％
F2	94％	F8	73％
				F3	95％	F9	73％
F4	93％	F10	85％
				F5	74％	F11	80％
F6	76％	F12	77％

注：F13－F20，因粘度过大，包封率未进行测定，但样品外观显示为均匀的溶液，提示药物包封良好。

试验例2：自组装微粒系统的长期放置稳定性考察

将实施例4－实施例10制备的胰岛素磷脂复合物的壳聚糖自组装微粒系统的混悬液，2－8℃和室温25℃条件下放置6个月，外观性状及包封率稳定。

试验例3：自组装微粒系统的耐酸碱稳定性考察

取胰岛素水溶液及实施例4－实施例10制备的胰岛素磷脂复合物的壳聚糖自组装微粒系统混悬液约2ml，分别加入到含有胃蛋白酶和胰蛋白酶的人工胃液100ml中，37℃温孵2小时，取样过滤，取续滤液适量注入液相色谱仪，照前述HPLC依法测定；另取胰岛素以0.1％三氟乙酸-甲醇溶液溶解并稀释至浓度为20μg/mL的溶液，作为对照溶液，依法测定，计算胰岛素药物含量的剩余百分率。结果表明，胰岛素水溶液60分钟即完全降解，胰岛素磷脂复合物60分钟降解40％，而载有胰岛素磷脂复合物的壳聚糖微粒系统，4个小时药物含量无明显变化，质量稳定。

试验例4：降血糖试验

(1)试验药物

受试药物溶液1：按实施例1的复合物C为中间载体，实施例4中制备的载药纳米级混悬液(图中标记为纳米粒给药组)；

受试药物溶液2：F13的微米级混悬系统(图中标记为微粒给药组)

阳性对照溶液：0.1mg/ml胰岛素溶液(自制，过滤灭菌)；

空白对照溶液：不含胰岛素的空白壳聚糖-脂质纳米粒，根据实施例3中制备的载药纳米混悬液F3的组成，在制备胰岛素脂质复合物时，不加入胰岛素，以制备空白纳米粒混悬液。

(2)试验动物及糖尿病大鼠模型

取健康SD大鼠，体重200±20g，雄性。在适应性饲养1周之后，对其腹腔注射链脲佐菌素(60mg/kg)破坏胰岛功能，使其血糖升高。待血糖值稳定1周之后，对其断尾取血，使用强生稳豪型血糖仪测定血糖值，选取空腹血糖值大于16.7mmol/L的大鼠，作为造模成功的大鼠，取出备用。

(3)给药方式及剂量

取造模成功的糖尿病模型大鼠18只，随机分成3组，每组6只，按照下述给药方式和剂量进行给药，给药之前均禁食8小时，不禁水。

受试药物溶液：灌胃给药，30IU/kg；

阳性对照溶液：皮下注射给药，6IU/kg；

空白对照溶液：灌胃给药，2mL/只。

(4)血糖测定结果

分别于给药后第0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时断尾取血，使用强生稳豪型血糖仪测定血糖值并记录，计算每组血糖降低百分比的平均值，绘制单次给药之后的血糖降低曲线，如说明书附图图4所示。

试验结果表明，对腹腔注射链脲佐菌素所诱导的糖尿病模型大鼠进行口服灌胃给药，与初始血糖值相比，其血糖水平可以降低60％，显著优于空白对照溶液，提示其良好的生物吸收程度。与皮下注射相比，药效维持进间更长。

Claims (19)

1.一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，其特征在于，包含胰岛素、磷脂和壳聚糖，其中，胰岛素与磷脂的质量比为1:3～1:100，壳聚糖与磷脂的质量比为1:5～1:50，粒径分布在50～5000nm，包封率在70％以上。

2.根据权利要求1的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，其特征在于，所述的胰岛素与磷脂的质量比为1:5～1:50，壳聚糖与磷脂的质量比为1:10～1:40，粒径分布在100～600nm，包封率在70％以上。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的自组装微粒载体，其特征在于，所述的胰岛素选自天然胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素及各类中、长效胰岛素中的至少一种。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的自组装微粒载体，其特征在于，所述的磷脂材料选自天然磷脂、合成磷脂中的至少一种。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的自组装微粒载体，其特征在于，所述的壳聚糖选自高分子量壳聚糖、低分子量壳聚糖以及水溶性壳聚糖中至少一种。

6.制备权利要求1至5中任一项的自组装微粒载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)胰岛素磷脂复合物的制备

a.胰岛素溶于含酸的低分子醇溶剂中获得a溶液；

b.全部磷脂溶于有机溶剂中获得b溶液，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种；

c.将上述a溶液缓缓加入到b溶液中，在30－50℃条件下搅拌约30分钟，旋转蒸发挥除溶剂，干燥得复合物粉末；

(2)壳聚糖水相溶液的制备

取壳聚糖，用1％的醋酸或盐酸水溶液溶解，再用水稀释，制成含壳聚糖浓度为0.05mg/ml－5.0mg/ml的溶液，调节pH至4－6；

(3)胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的自组装

取胰岛素磷脂复合物粉末适量，溶解于非水溶剂中形成有机相，在磁力搅拌等温合条件下，快速注入到壳聚糖的水相溶液中，继续保持搅拌，旋转蒸发去除有机溶剂，得到类白色的悬状溶液。

7.权利要求1至5中任一项的自组装微粒载体的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)胰岛素磷脂复合物的制备

a.胰岛素溶于含酸的低分子醇溶剂中a溶液；

b.将磷脂分成A、B两部分，取A部分磷脂溶于有机溶剂中，用于制备磷脂复合物，B部分备用；

c.将上述a溶液缓缓加入到b的磷脂有机溶剂中，在30－50℃条件下搅拌约30分钟，旋转蒸发挥除溶剂，干燥得复合物粉末；

(2)壳聚糖水相溶液的制备

取壳聚糖，用1％的醋酸或盐酸溶液溶解，再用水稀释，制成含壳聚糖浓度为0.05mg/ml－5.0mg/ml的溶液，调节pH至4－6；

(3)胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的自组装

取胰岛素磷脂复合物适量，及B部分的游离磷脂，一同溶解于非水溶剂中形成有机相，在磁力搅拌等温合条件下，快速注入到壳聚糖的水相溶液中，继续保持搅拌，旋转蒸发去除有机溶剂，得到类白色的悬状溶液。

8.权利要求1至5中任一项的自组装微粒载体的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)胰岛素磷脂复合物的制备

a.胰岛素溶于含酸的DMSO中，其中的酸选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸中的至少一种；

b.将磷脂溶于DMSO中；

c.将上述a溶液缓缓加入到b溶液中，在30－50℃条件下搅拌约30分钟，冷冻干燥去除溶剂，得复合物粉末；

(2)壳聚糖水相溶液的制备

取壳聚糖，用1％的醋酸或盐酸溶液溶解，再用水稀释，制成含壳聚糖浓度为0.05mg/ml－5.0mg/ml的溶液，调节pH至4－6；

(3)胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的自组装

取胰岛素磷脂复合物适量，溶解于非水溶剂中形成有机相，在磁力搅拌等温合条件下，快速注入到壳聚糖的水相溶液中，继续保持搅拌，旋转蒸发去除有机溶剂，得到类白色的悬状溶液。

9.权利要求1至5中任一项的自组装微粒载体的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)胰岛素磷脂复合物的制备

a.胰岛素溶于含酸的DMSO中，其中的酸选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸中的至少一种；

b.将磷脂分成A、B两部分，取A部分磷脂溶于DMSO中，用于制备磷脂复合物，B部分备用；

c.将上述a溶液缓缓加入到b的DMSO溶液中，在30－50℃条件下搅拌约30分钟，冷冻干燥去除溶剂，得复合物粉末；

(2)壳聚糖水相溶液的制备

取壳聚糖，用1％的醋酸或盐酸溶液溶解，再用水稀释，制成含壳聚糖浓度为0.05mg/ml－5.0mg/ml的溶液，调节pH至4－6；

(3)胰岛素－磷脂－壳聚糖微粒载体的自组装

取胰岛素磷脂复合物适量，及B部分的游离磷脂，溶解于非水溶剂中形成有机相，在磁力搅拌等温合条件下，快速注入到壳聚糖的水相溶液中，继续保持搅拌，旋转蒸发去除有机溶剂，得到类白色的悬状溶液。

10.根据权利要求6或7中任一项的制备方法，其特征在于，所述的溶解胰岛素的含酸的低分子醇溶剂中，所述的酸选自冰醋酸、盐酸、三氯醋酸中的至少一种，所述的低分子醇可选自甲醇、乙醇或叔丁醇中的至少一种，优选三氯醋酸的甲醇溶液。

11.根据权利要求6或7中任一项的制备方法，其特征在于，溶解磷脂的有机溶剂中，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇乙酯、丙酮、乙醚中的至少一种，优选二氯甲烷。

12.根据权利要求6至9中任一项的制备方法，其特征在于，胰岛素与磷脂的质量比为1:3－1:50，优选1:5－1:20，更优选1:8－1:12。

13.根据权利要求6至9中任一项的制备方法，其特征在于，溶解胰岛素磷脂复合物或胰岛素磷脂复合物/磷脂的“非水溶剂”，选自甲醇、乙醇、无水乙醇、乙醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃中的至少一种，优选无水乙醇和乙醚。

14.权利要求1至5中任一项所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，可加入赋形剂直接制成混悬型的喷雾剂。

15.权利要求1至13中任一项所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，可加入常规的成膜材料或凝胶膏基质，制成膜剂或凝胶贴膏剂(巴布剂)。

16.权利要求1至13中任一项所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，可加入常规支撑剂，经冷冻干燥方法制成冻干粉。

17.权利要求1至13中任一项所述的以胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体，可通过喷雾干燥或旋转蒸发制成干粉。

18.权利要求16、17所述的干粉，可加入常规赋形剂制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、干粉吸入剂。

19.权利要求1－18中任一项所述的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其组合物，可通过口服、粘膜给药、肺部吸入、经皮给药，用于胰岛素的抗糖尿病治疗。