CN101874781B - 疏水改性葡聚糖修饰的长循环脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物制剂领域。具体涉及一种疏水改性葡聚糖修饰的长循环脂质体及其制备方法和应用。该脂质体由磷脂、胆固醇、疏水改性葡聚糖组成。其特征在于疏水改性葡聚糖的疏水链段部分由于熵的驱动进入脂质体的疏水层,增强脂质体内部结构的稳定性;亲水链段部分位于脂质体亲水外层,能发挥立体稳定作用和体内长循环作用。疏水改性葡聚糖可以通过油胺与羧甲基葡聚糖反应制得。该脂质体适合用作多种药物、营养物质、香料、染料的载体,其包封率高,粒径均匀,稳定性好,且可以冻干保存,再次分散性好。本发明与现有PEG修饰的长循环脂质体比较,具有成本低、进一步靶向功能修饰更方便的优点。
Description
技术领域
本发明属药物制剂领域,具体涉及疏水改性葡聚糖修饰的长循环脂质体及其制备方法。
背景技术
脂质体是靶向给药系统的一种新剂型,它是由脂质双分子层构成的内部为水相的封闭囊泡。脂质体作为一种智能给药载体,具有靶向性,生物相容性,提高药物稳定性以及降低毒副作用等显著优点,因而得到人们越来越多的关注。普通脂质体虽然能够改善药物的疗效,但是进入体内后很快被体内网状内皮系统吞噬,主要靶向在肝、脾、骨髓等网状内皮系统器官中,药物在体内滞留时间短,且在体内易受蛋白、酶等的作用而发生渗漏,影响疗效,使毒性增大。
近年来,长循环脂质体成为国内外的研究热点。长循环脂质体是靶向制剂的一种,它具有长效、降低毒性及稳定包封药物等优点,用脂质体包封后提高了药物的靶向性,降低了毒性。长循环脂质体是一种表面修饰了天然或合成亲水性聚合物的新型脂质体,这些聚合物形成的立体柔性亲水表面,增加了脂质体的亲水性和空间位阻,防止生物分子、细胞与脂质体相互作用,使脂质体不易被血液中的调理素识别,从而可以降低体内网状内皮系统对脂质体的吞噬,增加其在体内环境中的稳定性,使其具有更长的体内循环时间,更高的血药浓度,因此可以更好的发挥疗效,降低毒性。长循环脂质体中,研究最多的就是聚乙二醇(PEG)修饰脂质体{Advanced Drug Delivery Reviews,1997,24,235-242}。表面修饰PEG的脂质体在静脉注射后具有“隐形”的特点,即可以逃避血浆中的调理素的调理,从而减少巨噬细胞对药物的吞噬,阻碍血液蛋白质成分及磷脂的结合,延长药物在体内的循环时间{Clinical andExperimental Pharmacology and Physiology,2006,33,557-562}。由于PEG分子链上仅包含少量的活性基团,导致功能化修饰较困难,造成PEG修饰脂质体在实际生产应用中存在成本较高等局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的疏水改性葡聚糖修饰脂质体及其制备方法,其包封率高,稳定性好,成本较低,显著提高脂质体在体内循环时间,从而更好的发挥药效,且更方便进一步修饰靶向功能基团。该脂质体适合用作多种药物、营养物质、香料、染料的载体。
在制备脂质体的过程中,本发明在传统的脂质体的基础上(主要是磷脂和胆固醇)中,另加入疏水改性葡聚糖来制备疏水改性葡聚糖修饰脂质体。
本发明的技术方案是:所述的脂质体包括磷脂和胆固醇,采用疏水改性葡聚糖为修饰剂修饰脂质体,所述的疏水改性葡聚糖为疏水油胺修饰的羧甲基葡聚糖,葡聚糖的分子量为1000~100000。
葡聚糖羧甲基化的程度为0.2~1.0,油胺和羧甲基葡聚糖的取代度为优选为0.3~0.5。
疏水改性葡聚糖与脂质体的修饰连接是由于熵的驱动疏水改性葡聚糖的疏水链段部分的进入脂质体的疏水层,亲水链段部分位于脂质体亲水外层而成。
磷脂包括天然大豆卵磷脂或者蛋黄卵磷脂。
本发明运用合成的疏水改性葡聚糖对脂质体进行修饰:一方面,疏水改性葡聚糖的疏水链段部分由于熵的驱动进入脂质体的疏水层,能增强脂质体内部结构的稳定性,可以解决传统脂质体粒径较大,稳定性差,易泄露,易聚集等问题;另一方面,葡聚糖亲水链段部分位于脂质体亲水外层,可阻止血液中调理素的识别和血浆蛋白的吸附,减少脂质体被网状内皮系统的吞噬,从而使脂质体的清除速度减慢,在血液中停留时间延长,有利于其进入肿瘤组织,能发挥立体稳定作用和体内长循环作用,可以解决药物在体内暴释和药物毒性大等问题;第三方面,改性葡聚糖的合成方法简单可行,成本低,且羧甲基葡聚糖上有游离羧基,更方便修饰靶向功能基团,可以解决脂质体药物成本昂贵,药效低等问题。
本发明脂质体的制备包含下列步骤:
(1)制备含有疏水改性葡聚糖修饰的脂质体:将磷脂,胆固醇,疏水改性葡聚糖溶于有机混合溶剂中,在高于相转移温度20℃以内的条件下恒温水浴旋蒸除去有机混合溶剂,直至干燥脂质膜均匀沉积在瓶壁上;然后,将其水化超声即得到泛蓝色乳光的脂质体悬浮液;
(2)均化脂质体:通过把脂质体悬浮液经相应孔径的微孔膜过滤来达到。
本发明中胆固醇与磷脂的摩尔比为0.28~1;疏水改性葡聚糖与磷脂的质量比为0.075~0.375。
有机混合溶剂选自氯仿与甲醇,它们的体积比为1~3。
本发明的脂质体可以进一步冷冻干燥成脂质体冻干制剂,再分散时其粒径分布和包封率基本不变。
本发明的疏水改性葡聚糖的制备,包括以下步骤:(1)合成羧甲基葡聚糖:以葡聚糖为原料,在含有溴乙酸的NaOH溶液中反应,即能得到白色絮状的羧甲基葡聚糖;(2)合成疏水改性葡聚糖:将羧甲基葡聚糖,溶解于含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液中活化羧基,然后与油胺的氨基端结合,得到疏水改性葡聚糖。
本发明中空白脂质体的制备采用薄膜分散法,脂质体的粒度及均匀度,通过把空白脂质体悬浮液经相应孔径的微孔膜过滤来达到。
本发明的第一步,是合成疏水改性葡聚糖,其成本较低,方法简单,具体通过以下步骤来完成:(1)合成羧甲基葡聚糖(CMD):将葡聚糖溶解于含有溴乙酸的NaOH溶液中,在室温下搅拌反应24h,分别用水,0.1mol/L的HCl,水各透析24h,然后将溶液冷冻干燥,得到白色絮状的羧甲基葡聚糖;(2)合成疏水油胺修饰葡聚糖:将羧甲基化葡聚糖,溶解于含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的水溶液中,室温下搅拌活化2-3h。另将油胺溶解于四氢呋喃中,滴加到EDC/NHS的水溶液中,调成均相反应。然后用Na2CO3调节反应pH值为9左右,室温搅拌反应24h。
待反应完毕后,在37℃下旋蒸除去四氢呋喃,用水透析24h。取出透析袋内液体,用环己烷萃取,彻底除去残余的油胺。冷冻干燥后,得到白色固体。
本发明的疏水改性葡聚糖中,葡聚糖羧甲基化的程度为0.2~1.0,油胺和羧甲基葡聚糖的取代度为优选为0.3~0.5,更优选为0.42。红外(IR)谱图中1630cm-1的吸收峰为疏水改性葡聚糖分子中的酰胺键C=O的伸缩振动吸收峰(见图1),核磁(1H NMR)谱图中7.8ppm处的质子特征峰为疏水改性葡聚糖疏水改性葡聚糖分子中酰胺键中N-H表现的化学位移(见图2),成功说明了羧基化葡聚糖和油胺已经发生了反应。
本发明的脂质体对阿霉素等多种物质的有效负载。针对不同的物质,采用不同的负载方法。
本发明脂质体对各种物质的负载方法的如下:
针对多种药物、营养物质、香料等,一般都可以直接用薄膜法进行负载。具体步骤与空白脂质体的制备类似。
在本发明的应用过程中药物与本发明的脂质体的摩尔比优选为0.1~0.5,更优选为0.1;
针对阿霉素、拓扑替康等带氨基的水溶性药物还可以通过硫酸铵梯度法进行负载,具体通过以下步骤来完成:
(1)制备含有疏水改性葡聚糖的脂质体:准确称取一定量的卵磷脂,胆固醇,疏水油胺修饰葡聚糖溶于氯仿和甲醇的有机混合溶剂中,移到50mL的圆底烧瓶中,在T>TC(相转移温度)的恒温水浴中旋蒸1h除去有机溶剂,直至干燥脂质膜均匀沉积在瓶壁上。然后,用250mM的(NH4)2SO4溶液水化,超声约2h,即得到泛蓝色乳光的悬浮液。再分别用孔径为0.45μm、0.2μm的滤膜过滤两次。
(2)制备载盐酸阿霉素的脂质体:取脂质体液在45℃下,PBS(pH 7.4,50mM)中透析24小时,除去外水相未包封的(NH4)2SO4。取出透析液于一定量的容量瓶中,称量一定量的阿霉素溶于去离子水中,加入容量瓶里,用PBS定容,45℃孵化1h,即得到疏水改性葡聚糖修饰的阿霉素脂质体悬浮液。
利用本发明获得的疏水改性葡聚糖脂质体,具有很好的分散性,用激光粒度分析仪测定平均粒径大约在50~200nm左右,多分散系数为0.1~0.3。对多种药物的包封率可高达95%以上。
所制备的脂质体制剂可以在水溶液中长期保存,稳定性好,还可以经过冷冻干燥后得到粉末进行保存,这种粉末可以重新分散到水溶液中并且保持原有的粒径和粒径分布(图3)。通过原子力显微镜表征脂质体为囊泡结构,形貌均一,分散均匀(图4)。
利用本发明获得的疏水改性葡聚糖脂质体,具有很好的稳定性,不会被特异性吸附,具备潜在的长循环性质。本发明中通过表面等离子体激元共振仪(SPR)分别研究空白脂质体、疏水改性葡聚糖脂质体与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用,结果如图5所示。由于葡聚糖的立体位阻效应,疏水改性葡聚糖脂质体与BSA的吸附量远少于空白脂质体,这充分说明了经过改性葡聚糖修饰的脂质体具有潜在的长循环作用。
此外,载药的疏水改性葡聚糖修饰的脂质体还具有体外缓释性质。通过对阿霉素溶液、阿霉素脂质体和疏水改性葡聚糖修饰的阿霉素脂质体进行比较,结果如图6和7所示。图6为上述三种脂质体在模拟生理环境pH为7.4的磷酸盐(PBS)溶液中的体外缓释行为,图7为上述三种脂质体在模拟细胞溶酶体环境pH为5.0的醋酸盐(HAc-NaAc)缓冲溶液中的体外缓释行为。研究发现经过改性葡聚糖修饰的阿霉素脂质体具有明显的体外缓释效果。
由于本发明改性葡聚糖上有游离的羧基,可以很方便地与靶向基团反应,进一步提高脂质体的主动靶向功能。
综上所述,本发明制备的疏水改性葡聚糖修饰的脂质体,由于疏水改性葡聚糖的疏水链段部分由于熵的驱动进入脂质体的疏水层,增强脂质体内部结构的稳定性;亲水链段部分位于脂质体亲水外层,能发挥立体稳定作用和体内长循环作用。本发明的脂质体相对PEG修饰脂质体,原料易得,来源丰富、价廉,具有稳定、无毒、无免疫抗原性、水溶性好、优良的生物相容性和可生物降解性、良好的细胞黏附性等优点,还可以提供多种给药途径如静脉注射、口服结肠靶向给药、鼻粘膜、眼部、皮肤表面等。且本发明的脂质体还具有成本较低,稳定性好,能显著提高了脂质体在体内的循环时间,且能更方便进一步靶向功能修饰的特点。
附图说明
图1.本发明的疏水改性葡聚糖的IR表征。
图2.本发明的疏水改性葡聚糖的1H NMR表征。
图3.载阿霉素的疏水改性葡聚糖脂质体冻干后再分散在水中以及在水溶液中存放3个月后的粒径和粒径分布。
图4.疏水改性葡聚糖修饰脂质体的原子力显微镜照片。
图5.SPR分析传统脂质体和疏水改性葡聚糖脂质体与BSA之间的相互作用。
图6.载阿霉素的疏水改性葡聚糖脂质体在PBS缓冲溶液中的体外缓释。
图7.载阿霉素的疏水改性葡聚糖脂质体在HAc-NaAc缓冲溶液中的体外缓释。
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1.
疏水改性葡聚糖修饰脂质体
准确称量大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂40mg,胆固醇15mg,溶于2mL的氯仿溶剂中。称量6mg的疏水改性葡聚糖溶于1mL的甲醇溶剂中,将两者混合于50mL的圆底烧瓶旋转蒸发除去有机溶剂,直至干燥脂质膜均匀沉积在瓶壁上。再用去离子水(或者PBS、硫酸铵溶液)水化,在37℃上超声2h,即得到泛蓝色乳光的悬浮液。再分别用0.45μm,0.2μm滤膜过滤两次,得到稳定的疏水改性葡聚糖修饰脂质体悬浮液。
上述脂质体液平均粒径为105nm,多分散系数为0.15。
实施例2.
疏水改性葡聚糖修饰脂质体对布洛芬等多种物质的负载
首先准确称量大豆卵磷脂或者蛋黄卵磷脂40mg,胆固醇15mg,溶于2mL的氯仿中;称量6mg的疏水改性葡聚糖溶于0.5mL的甲醇中;称量一定量的布洛芬溶于0.5mL的甲醇中,将三者混合于50mL的圆底烧瓶旋转蒸发除去有机溶剂,直至干燥脂质膜均匀沉积在瓶壁上。然后水化,在37℃上超声2h,即得到载布洛芬的脂质体悬浮液。
采用同上述包载布洛芬的方法包封其他各种物质,具体结果如表1所示。
表1疏水改性葡聚糖脂质体对布洛芬等多种物质的负载
实施例3.
采用硫酸铵梯度法制备载阿霉素的疏水改性葡聚糖脂质体
载阿霉素的改性葡聚糖脂质体,首先同例1制得疏水改性葡聚糖修饰的脂质体,其中水化时是用250mM的(NH4)2SO4溶液,取脂质体液在45℃下,PBS(pH7.4,50mM)中透析24小时,除去外水相未包封的(NH4)2SO4。取出透析液于容量瓶中,称量不同量的阿霉素溶于去离子水中,加入容量瓶里,用PBS定容到所需量,45℃孵化1h,即得到疏水改性葡聚糖修饰的阿霉素脂质体液。
上述载阿霉素改性葡聚糖修饰脂质体的平均粒径约为100-150nm,包封率高达95%以上,最大载药量可达56%。
采用上述方法对含有不同量的阿霉素进行负载,具体结果如表2所示。
表2载不同量的阿霉素脂质体的粒径和包封率
实施例4.
采用硫酸铵梯度法制备疏水改性葡聚糖修饰脂质体对拓扑替康盐酸盐的负载
疏水改性葡聚糖修饰脂质体对拓扑替康盐酸盐的负载,与载阿霉素的方法一致,也是用硫酸铵梯度法。其平均粒径为119nm,包封率为80%。
Claims (7)
1.一种长循环脂质体,所述的脂质体包括磷脂和胆固醇,其特征在于,采用疏水改性葡聚糖为修饰剂修饰脂质体,所述的疏水改性葡聚糖为疏水油胺修饰的羧甲基葡聚糖,葡聚糖的分子量为1000~100000;葡聚糖羧甲基化的程度为0.2~1.0,油胺和羧甲基葡聚糖的取代度为0.3~0.5;磷脂包括天然大豆卵磷脂或者蛋黄卵磷脂;胆固醇与磷脂的摩尔比为0.28~1;疏水改性葡聚糖与磷脂的质量比为0.075~0.375;疏水改性葡聚糖的制备,其特征在于,包括以下步骤:(1)合成羧甲基葡聚糖:以葡聚糖为原料,在含有溴乙酸的NaOH溶液中反应,即能得到白色絮状的羧甲基葡聚糖;(2)合成疏水改性葡聚糖:将羧甲基葡聚糖,溶解于含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液中活化羧基,然后与油胺的氨基端结合,得到疏水改性葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种长循环脂质体,其特征在于,疏水改性葡聚糖与脂质体的修饰连接是由于熵的驱动疏水改性葡聚糖的疏水链段部分的进入脂质体的疏水层,亲水链段部分位于脂质体亲水外层而成。
3.根据权利要求1所述的一种长循环脂质体,进一步冷冻干燥成脂质体冻干制剂。
4.一种制备权利要求1所述的脂质体的方法,其特征在于,包含下列步骤:
(1)制备含有疏水改性葡聚糖修饰的脂质体:将磷脂、胆固醇和疏水改性葡聚糖溶于有机混合溶剂中,在高于相转移温度20℃以内的条件下恒温水浴旋蒸除去有机混合溶剂,直至干燥脂质膜均匀沉积在瓶壁上;然后,将其水化超声即得到泛蓝色乳光的脂质体悬浮液;
(2)均化脂质体:通过把脂质体悬浮液经相应孔径的微孔膜过滤来达到。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,有机混合溶剂选自氯仿与甲醇,它们的体积比为1~3。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于脂质体制剂平均粒径为50-200nm。
7.根据权利要求4所述的方法,进一步冷冻干燥成脂质体冻干制剂。
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