CN117180200B - 一种ros响应性脂质纳米递送系统及其制备方法和在靶向制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种ROS响应性脂质纳米递送系统及其制备方法和在靶向制剂中的应用。该脂质体包含聚合物和脂类物质，所述聚合物包含疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段和靶向片段。通过修饰HA和ROS响应敏感片段实现了药物的靶向和H2O2响应可控释放，所得脂质纳米递送系统的尺寸均一且由稳定的荧光标记，在药物靶向递送和可控释放领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物递送系统领域，具体涉及一种ROS响应性脂质纳米递送系统及其制备方法和在靶向制剂中的应用。
背景技术
纳米粒子载药系统在降低小分子药物的毒害作用、延长药物的体内循环时间、实现药物的控释和缓释、以及药物的靶向递送等方面具有明显的优势。金属、有机、无机聚合物纳米结构以及树枝状大分子、胶束和脂质体，经常被用于设计纳米粒子给药载体。纳米脂质体是一种双层脂质囊泡，结构灵活，可封装各种生物活性物质，这种由磷脂、多糖、蛋白质和多肽等天然聚合物制备的纳米脂质体是最有前景的制剂，其模拟天然脂质环境，具有更好的载药能力和生物相容性，并能减少网状内皮系统的吞噬，而且脂质体囊泡的发展也已经实现了针对疾病特异性定位、药物的控释和靶向给药。故而，纳米脂质体被认为是靶向药物传递中最具生物相容性的纳米载体之一，因为其能够克服细胞吸收障碍，提高所选包封剂位点的生物利用度和生物分布。
传统的给药系统往往伴随着全身副作用，主要是由于药物非特异性的生物分布和药物释放不可控造成的，所以智能可控药物递送系统应运而生。其以时间和空间控制的方式在目标部位有效释放药物，从而有效降低用药频率，同时能较长时间维持靶器官/组织的药物浓度，最终提高治疗效果。各种类型的刺激响应型生物材料逐渐被开发并广泛应用于可控给药。众多刺激因素都可以作为响应因子，包括与疾病病理特征相关的内源性诱因如pH值变化、激素水平、酶浓度、小生物分子、葡萄糖或氧化还原梯度等，亦或者温度、磁场、超声、光、电脉冲/高能辐射等外源性因子也可用于触发或增强疾病部位的药物释放。近年来智能响应脂质体也取得了许多进展包括使用低pH环境进行pH触发释放，在酶敏感脂质体中使用酶作为触发器和超声应答脂质体、磁响应脂质体、活性氧自由基响应脂质体等。此外，光作为刺激物在光敏脂质体中也得到了广泛的研究。针对靶点部位合理设计响应开关实现药物的可控释放是制备智能、可控和高效的药物递送系统的关键所在。其中，ROS响应性载体针对细胞内过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH)、单线态氧(1O2)、超氧化物等，具有响应速度快、灵敏度高的优势。H2O2作为ROS的代表，是活性氧分子中最常见、最稳定的一种形式，越来越多的研究表明其在细胞和器官生理中扮演着重要角色。
综上，提供一种具有H2O2响应性、携载药物且具有靶向性的脂质纳米递送系统有着较大的应用潜力。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种具有ROS响应释放性能的脂质体，包含聚合物和脂类物质，所述聚合物包含疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段和靶向片段；
所述疏水片段至少由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)及上述物质的改性活性酯中的一种或两种以上提供，优选由DSPE改性活性酯提供，更优选由DSPE-NH2提供，所述疏水片段还包括胆固醇、胆固醇-NBD作为膜稳定剂，优选地膜稳定剂为胆固醇-NBD；
所述ROS响应敏感片段由酮缩硫醇(TK)、聚硫化丙烯、硼酸酯和硫醚酯中的一种或两种以上提供，优选由TK提供；
所述连接片段由聚乙二醇(PEG)提供；
所述靶向片段由透明质酸(HA)提供；
所述脂类物质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等中的一种或多种。
根据本发明的实施方案，所述聚乙二醇的分子量不低于2000，优选为聚乙二醇2000。
根据本发明优选地实施方案，所述脂质体包含DOPE和聚合物，所述聚合物包含疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段和靶向片段；
所述疏水片段由DSPE-NH2提供，以胆固醇-NBD作为膜稳定剂；所述ROS响应敏感片段由TK提供，所述连接片段由PEG2000提供，所述靶向片段由HA提供。
根据本发明的实施方案，所述脂质体还被荧光分子标记，例如所述荧光分子选自NBD。
本发明还提供一种脂质体的制备方法，包括如下步骤：将包含疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段的原料和脂类物质混合反应，得到的产物与靶向片段的原料继续反应，得到所述脂质体；
优选地，所述脂质体具有上文所示的含义。
根据本发明的实施方案，所述疏水片段的原料包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基卵磷脂(DOPC)和二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)及上述物质的改性活性酯中的一种或两种以上，优选为DSPE改性活性酯，更优选为DSPE-NH2；
进一步地，所述疏水片段的原料还包括膜稳定剂原料，例如选自胆固醇、胆固醇-NBD中的一种或两种，优选为胆固醇-NBD。
根据本发明的实施方案，所述ROS响应敏感片段的原料选自酮缩硫醇(TK)、聚硫化丙烯、硼酸酯和硫醚酯中的一种或两种以上，优选为TK。
根据本发明的实施方案，所述连接片段的原料为聚乙二醇(PEG)，例如PEG-2000。
根据本发明的实施方案，所述疏水片段的脂质原料、ROS响应敏感片段的原料、连接片段的原料的质量比为(80-150):(20-60):(200-450)，例如(90-120):(30-50):(250-400)，示例性为115.5:39:310；
所述脂质原料指除膜稳定剂原料以外的疏水片段的原料。
根据本发明优选地实施方案，先将疏水片段的原料、ROS响应敏感片段的原料和聚乙二醇混合反应，再与脂类物质混合自组装；
例如，疏水片段的原料、ROS响应敏感片段的原料和聚乙二醇混合反应的产物、脂类物质和膜稳定剂原料的质量比为(5-30):(1-10):(1-10)，例如(10-25):(2-8):(2-8)，示例性为15.68:4:4；
还优选地，先将DSPE-NH2、TK和PEG2000反应，制备得到DSPE-TK-PEG-NH2；再将DOPE、胆固醇-NBD与DSPE-TK-PEG-NH2混合自组装；
例如，DSPE-TK-PEG-NH2与DOPE和胆固醇-NBD的质量比为15.68:4:4。
根据本发明的一种实施方案，所述制备方法包括：将包含疏水片段、ROS响应敏感片段和连接片段的原料混合反应，反应完成得到的聚合物与脂类物质和靶向片段的原料混合，反应，得到所述脂质体。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括荧光分子标记的过程，例如在所述产物与靶向片段的原料混合前、混合时或混合后，加入荧光分子标记；或者，加入荧光分子标记的脂类物质，优选加入胆固醇-NBD。
根据本发明的实施方案，与靶向片段的原料反应前，向其中加入NHS和EDC的混合物。
根据本发明优选地实施方案，所述脂质体的制备方法包括如下步骤：
先将DSPE-NH2、TK和PEG2000反应，制备得到DSPE-TK-PEG-NH2；再将DOPE、胆固醇-NBD与DSPE-TK-PEG-NH2混合自组装；而后向其中加入HA、NHS和EDC，反应得到所述脂质体。
本发明还提供上述脂质体作为药物载体的应用；优选地，所述药物选自SGLT2抑制剂，例如为EMPA(恩格列净)。
本发明还提供一种脂质纳米递送系统，以上述脂质体作为药物载体，所述药物被包封在所述脂质体载体中；优选地，所述药物选自SGLT2抑制剂，例如为EMPA(恩格列净)。
根据本发明的实施方案，所述脂质纳米递送系统的平均水合直径为80-300nm，例如100-200nm，示例性为120nm、150nm、157.59nm、180nm。
根据本发明的实施方案，所述脂质纳米递送系统具有球状形貌，优选为粒径均一的球状形貌。
根据本发明的实施方案，所述药物的载药量不低于4％，优选不低于5％，示例性为5.48％。
根据本发明的实施方案，所述药物的包封率不低于60％，优选不低于65％，还优选不低于70％，示例性为70.40％。
本发明还提供上述脂质纳米递送系统的制备方法，包括如下步骤：将上述脂质体与药物混合，得到所述脂质纳米递送系统；或者将药物加入所述脂质体的制备过程中，得到所述脂质纳米递送系统；
所述药物具有如上文所示的限定。
根据本发明的实施方案，所述药物与脂质体中疏水片段的原料、ROS响应敏感片段的原料和聚乙二醇混合反应的产物的质量比为(0.5-5):(5-30)，例如(1-3):(10-25)，示例性为2:15.68。
根据本发明的一种实施方案，所述制备方法包括如下步骤：
先将DSPE-NH2、TK和PEG2000反应，制备得到DSPE-TK-PEG-NH2；再将DOPE、胆固醇-NBD、EMPA与DSPE-TK-PEG-NH2混合自组装，得到EMPA@DSPE-TK-PEG；而后将EMPA@DSPE-TK-PEG和HA、NHS和EDC混合，反应得到所述脂质纳米递送系统，记为EMPA/NBD@DSPE-TK-HA。
本发明还提供上述脂质纳米递送系统在制备治疗靶向药物制剂中的应用。
有益效果
本发明提供了含有疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段和靶向片段的脂质体载体，通过修饰HA和ROS响应敏感片段(如TK)实现了药物的靶向和H2O2响应可控释放，所得脂质纳米递送系统的尺寸均一且由稳定的荧光标记，在药物靶向递送和可控释放领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为Lipo@EMPA@HA脂质纳米递送系统的制备示意图；
图2为DSPE-TK-PEG-NH2的合成路线图；
图3为FMOC-PEG2k-NH2(A)、FMOC-PEG2k-TK-COOH(B),FMOC-PEG2k-TK-DSPE(C)，DSPE-TK-PEG2k-NH2(D)的核磁共振氢谱图；
图4为FMOC-PEG2k-NH2(A)、FMOC-PEG2k-TK-COOH(B),FMOC-PEG2k-TK-DSPE(C)，DSPE-TK-PEG2k-NH2(D)的质谱图；
图5为Lipo@EMPA@HA脂质纳米递送系统的TEM照片；
图6为Lipo@EMPA@HA脂质纳米递送系统的荧光图谱；
图7为梯度浓度EMPA的HPLC检测结果和标准曲线图；
图8为Lipo@EMPA@HA在PBS和H2O2条件下对EMPA的累计释放率。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
脂质体纳米颗粒Lipo@EMPA@HA及其制备：
步骤①：将15.68mg DSPE-TK-PEG2k-NH2、4mg DOPE、4mg胆固醇-NBD超声分散于40mL无水乙醇中，得到混合溶液；2mg EMPA溶解于1mL无水乙醇缓慢加入上述混合溶液中搅拌过夜，减压除去有机溶液，重新分散于PBS或硫酸铵溶液中，将混合物通过带有100纳米过滤器的脂质体挤出机50次，之后使用去离子水透析得到EMPA@DSPE-TK-PEG。
步骤②：将66.07mg HA溶解在5ml乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2mM，pH 4.7)中，搅拌2小时(600rpm)，然后用NHS和EDC的混合物激活(NHS/EDC的摩尔比为0.25)。室温下，反应持续3小时，持续搅拌(600rpm)。随后，取400μL交联后的HA，加入步骤①EMPA@DSPE-TK-PEG，反应在室温下持续搅拌(600rpm)48小时得到EMPA/NBD@DSPE-TK-HA，即Lipo@EMPA@HA。
步骤③：将步骤②所得产物在乙酸-乙酸钠缓冲液(0.02mM，pH4.7)中透析24h，于第3、6、12h换透析液，以除去多余的杂质。
DSPE-TK-PEG2k-NH2由西安瑞禧生物材料有限公司提供，其合成路径如图2所示。图3和图4证明各中间体及产物DSPE-TK-PEG2k-NH2制备成功。
使用粒度仪检测脂质体纳米颗粒修饰前后Lipo@EMPA与Lipo@EMPA@HA的Zeta电势。透明质酸HA带有负电荷，修饰于纳米颗粒表面导致Zeta电势由-6.81eV降低至-14.66eV，证实HA修饰完成。
使用粒度仪测量了脂质体纳米颗粒Lipo@EMPA@HA的粒径和多分散系数，结果如表1所示。
表1脂质体纳米颗粒的的水合粒径、多分散系数与Zeta电位
利用透射电子显微镜对脂质体纳米颗粒Lipo@EMPA@HA的表面形貌，结果如图5所示，纳米粒呈粒径均一的球状，分散均匀。
图6显示，脂质体纳米颗粒Lipo@EMPA@HA的激发波长为452nm，峰值发射波长为522nm。
为了表征脂质体纳米颗粒Lipo@EMPA@HA对EMPA的负载情况以及在H2O2条件下的释药行为，采用高效液相色谱(HPLC)测定EMPA的标准曲线(图7)。取5mL的Lipo@EMPA@HA溶液加入0.1％曲拉通-100，高速离心使得EMPA全部释放完全，取上清液用分光光度计测量在EMPA最大吸收波长下的吸光度，对照EMPA的标准曲线，计算载药量和包封率。通过计算分析，得到该纳米颗粒对EMPA的包封率为70.4％(表2)。
表2
EMPA体外释放测定：
将5mL的Lipo@EMPA@HA分别分散在PBS(0.1M，pH＝7.4)和含H2O2(100mM)的PBS(pH＝5.5)条件下，在37℃下进行孵育，分别于不同时间点取出一定且相同体积的释放介质，同时补充等温等体积的释放介质，并检测其对EMPA的累积释放量。如图8所示的实验结果，在H2O2条件下，Lipo@EMPA@HA在8小时内的累积释放量约为65％。
可见，本发明提供了一种具有H2O2响应性且携载EMPA的纳米脂质体(Lipo@EMPA@HA)，并在其表面连接HA配体，其响应H2O2有助于实现EMPA的靶向治疗和可控释放。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种脂质纳米递送系统，其特征在于，以脂质体作为药物载体，药物被包封在所述脂质体中；所述药物为恩格列净；
所述脂质体包含聚合物和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOPE，所述聚合物包含疏水片段、ROS响应敏感片段、连接片段和靶向片段；
所述疏水片段为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE改性活性酯，即DSPE-NH2；所述疏水片段还包括胆固醇-NBD作为膜稳定剂；
所述ROS响应敏感片段由酮缩硫醇TK提供；
所述连接片段由聚乙二醇PEG2000提供；
所述靶向片段由透明质酸HA提供；
所述脂质体由下述方法制备得到：将DSPE-NH2、TK和PEG2000反应，制备得到DSPE-TK-PEG-NH2；再将DSPE-TK-PEG-NH2与DOPE、胆固醇-NBD、HA混合，反应，得到所述脂质体；
所述DSPE-NH2、TK和PEG2000的质量比为（80-150）:（20-60）:（200-450）；
所述DSPE-TK-PEG-NH2与DOPE和胆固醇-NBD的质量比为（5-30）:（1-10）:（1-10）。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米递送系统，其特征在于，所述DSPE-NH2、TK和PEG2000的质量比为（90-120）:（30-50）:（250-400）；
和/或，所述DSPE-TK-PEG-NH2与DOPE和胆固醇-NBD的质量比为（10-25）:（2-8）:（2-8）。
3.根据权利要求1或2所述的脂质纳米递送系统，其特征在于，所述DSPE-NH2、TK和PEG2000的质量比为115.5:39:310；
和/或，所述DSPE-TK-PEG-NH2与DOPE和膜稳定剂的质量比为15.68:4:4。
4.根据权利要求1所述的脂质纳米递送系统，其特征在于，所述脂质纳米递送系统的平均水合直径为80-300nm；
和/或，所述脂质纳米递送系统具有球状形貌；
和/或，所述药物的载药量不低于4%；
和/或，所述药物的包封率不低于60%。
5.根据权利要求1所述的脂质纳米递送系统，其特征在于，所述脂质纳米递送系统的平均水合直径为100-200nm；
和/或，所述药物的载药量不低于5%；
和/或，所述药物的包封率不低于70%。
6.权利要求1-5任一项所述的脂质纳米递送系统在制备治疗靶向药物制剂中的应用。
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