CN111184873A - 一种ros响应性重组高密度脂蛋白纳米载体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体及制备方法；其中：一种具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其包括，脂类、自主设计合成的聚合物和apoE模拟肽；所述自主设计合成的聚合物包括疏水片段、ROS响应敏感片段、靶向片段、连接片段结合构成。本发明提供了一种ROS响应性的重组高密度脂蛋白，由于应用了ROS敏感性片段TK，有效的保证了重组高密度脂蛋白在借助ANG到达AD患者脑部后消耗ROS断裂TK片段，暴露apoE模拟肽，结合Aβ后进入神经细胞内进行胞内代谢，在此过程中并发挥抑制Aβ单体聚集和促进Aβ寡聚体解聚的作用。

Description

一种ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体及制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体及制备方法。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆和认知障碍为主要表现，其病理特征是以Aβ淀粉样蛋白为主要成分的老年斑和由过度磷酸化tau蛋白构成的神经纤维缠结。研究发现AD发展早期产生大量活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)，ROS易氧化进攻蛋白质、脂质、DNA，进一步促进Aβ聚集从而引起神经毒性。目前，治疗阿尔茨海默症纳米载体普遍存在脑靶向效率低，毒副作用强等问题，故而设计一种能穿越血脑屏障，靶向至脑部，在不影响脑部正常生理功能的前提下发挥治疗作用的载体至关重要。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性的重组高密度脂蛋白，由ANG介导穿越血脑屏障向中枢输送纳米载体，在氧化应激环境下消耗ROS断裂TK，暴露出apoE模拟肽，与Aβ结合的基础上，促进Aβ寡聚体解聚成低毒性的Aβ单体，并以复合物的形式在apoE模拟肽的介导下进入神经细胞进行胞内代谢，恢复Aβ生成与代谢的平衡，从而减轻患者脑部神经元损伤引起的认知障碍。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体及制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其包括，脂类、自主设计合成的聚合物和apoE模拟肽；所述自主设计合成的聚合物包括疏水片段、ROS响应敏感片段、靶向片段、连接片段结合构成。
作为本发明所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的优选方案，其中：所述脂类为磷脂；所述ROS响应敏感片段包括硫醇缩酮、聚硫化丙烯、硼酸酯、硫醚酯、碲化物中的一种或几种；所述连接片段包括PEG3400和/或mPEG2000中的一种或几种；所述疏水片段包括DMPC、DPPC、DSPE、DOPC或DEPC中的一种或几种；所述靶向片段包括ANG、RVG29、OX26、TGN中的一种或几种，其具有携带高密度脂蛋白穿越BBB入脑的能力。
作为本发明所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的优选方案，其中：所述磷脂包括豆磷脂，蛋黄磷脂，DMPC、DPPC或者DSPE中的一种或几种。
作为本发明所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的优选方案，其中：所述自主设计合成的聚合物包括DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG中的一种或几种。
作为本发明所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的优选方案，其中：所述重组高密度脂蛋白纳米载体的内部包含的具有治疗阿尔茨海默症功效的药物。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种制备具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其包括，制备自主设计合成的聚合物；将脂类、所述自主设计合成的聚合物、apoE模拟肽和治疗阿尔茨海默症的药物混合溶解于甲醇与二氯甲烷混合溶剂中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；向缓冲液中加入表面活性剂，混合均匀后得到水合介质，将所述水合介质加入所述脂质薄膜中，超声粉碎后过滤，得到重组高密度脂蛋白。
作为本发明所述的制备具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其中：按质量比计，所述脂类、所述自主设计合成的聚合物、所述apoE模拟肽与所述药物的比例为(50～70)：(5～8)：(1～4)：(1～4)；所述甲醇与二氯甲烷混合溶剂中甲醇与二氯甲烷的比例为3:1。
作为本发明所述的制备具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其中：所述缓冲液包括PBS 7.4、Tris-HCl 8.0、HEPES缓冲液中的一种或几种。
作为本发明所述的制备具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其中：所述药物可为姜黄素、α-倒捻子素、白藜芦醇或银杏酮酯中的一种或几种。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种ROS响应性的重组高密度脂蛋白，由于应用了ROS敏感性片段TK，有效的保证了重组高密度脂蛋白在借助ANG到达AD患者脑部后消耗ROS断裂TK片段，暴露apoE模拟肽，结合Aβ后进入神经细胞内进行胞内代谢，在此过程中并发挥抑制Aβ单体聚集和促进Aβ寡聚体解聚的作用。本发明利用ROS断裂TK片段，消耗的ROS可一定程度上降低脑部氧化应激的状态，并且暴露的apoE模拟肽发挥Aβ清除作用，提高治疗AD的功效，是一种发展潜力巨大的ROS敏感性重组高密度脂蛋白纳米药物载体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1合成的DSPE-TK-mPEG2000的氢谱图；
图2为实施例1合成的DSPE-TK-PEG3400-ANG的氢谱图；
图3为实施例1制得的rHDL的ROS响应性；
图4为实施例1制得的rHDL与Aβ结合情况；
图5为实施例1制得的rHDL促进Aβ寡聚体解聚；
图6为实施例1制得的rHDL靶向入脑的能力对比。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
DESP-TK-mPEG2000的制备方法：
称取277mg HOOC-TK-COOH(1.1mmol)，211mg EDCI(1.1mmol)和24.4mg DMAP(0.2mmol)溶于10mL DMF中活化TK的羧基，称取2g mPEG2000-NH2(1mmol)，溶于10mL DMF中，逐滴缓慢加入已活化的TK溶液中，30℃搅拌反应48h，透析袋(MW1000)透析24h除去未反应的成分，冻干得到HOOC-TK-mPEG2000。称取1.1gHOOC-TK-mPEG2000(0.5mmol)，115mg EDCI(0.6mmol)和13mg DMAP(0.1mmol)溶解在20mL DMF中继续活化TK另一端羧基，称取447mgDSPE-NH2(0.6mmol)溶于10mL DMF，逐滴缓慢加入已活化的TK-mPEG2000溶液中30℃反应48h，透析袋(MW1000)透析24h除去未反应的成分，反向透析(MW3500)24h除去mPEG2000-TK-mPEG2000，冻干即得DSPE-TK-mPEG2000。采用核磁(1H-NMR)进行产物结构鉴定。产物的氢谱图见图1，4.18ppm为酰胺氢特征性化学位移值，结合11.73ppm羟基氢的消失，可以证明合成的产物为DSPE-TK-mPEG2000。
DSPE-TK-PEG3400-ANG的制备方法：
称取1.5g Mal-PEG3400-NHS溶于10mL三氯甲烷中，加入NH2-TK-NH2(2eq.)和适量三乙胺，室温下反应24h后，减压浓缩反应液，倒入大量冰乙醚中沉淀，过滤收集产物，真空干燥即得Mal-PEG3400-TK-NH2。称取1.0gMal-PEG3400-TK-NH2溶于5mL三氯甲烷中，加入DSPE-NHS(1.1eq.)和适量三乙胺，室温下反应24h后，减压浓缩反应液，倒入大量冰乙醚中沉淀，过滤收集产物，真空干燥即得Mal-PEG3400-TK-DSPE。称取0.5gMal-PEG3400-TK-DSPE溶于0.1MpH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入ANG多肽(1.1eq.)，室温下搅拌反应24h，然后将反应液转移至透析袋(截留分子量3500)于去离子水中透析纯化24h，取透析液冷冻干燥即得产物DSPE-TK-PEG3400-ANG。采用核磁(1H-NMR)进行产物结构鉴定。产物的氢谱图见图2，3.48ppm为PEG3400的特征峰，7.52ppm为ANG中苯丙氨酸和酪氨酸苯环的特征峰，1.62ppm，2.65ppm和2.93ppm属于TK的特征峰，5.13ppm和4.25ppm是DSPE的特征峰，可以证明DSPE-TK-PEG3400-ANG成功合成。
在制备DSPE-TK-mPEG2000的前期摸索中，还尝试过将第一步反应中控制HOOC-TK-COOH与EDCI和DMAP的反应摩尔比为1:2:0.2等多种情况，发现1:2:0.2时没能完全的保证仅一端羧基被活化，本发明中需要尽可能避免两端羧基活化生成mPEG2000-TK-mPEG2000才能提高DSPE-TK-mPEG2000收率，通过优选，发现1.1:1.1:0.2时的羧基被活化情况最合适。
在制备DSPE-TK-PEG3400-ANG的摸索中，还尝试过选用NHS-PEG3400-NHS，一端连接NH2-TK-NH2，一端连接ANG，但发现ANG的接枝率极低，可能是因为ANG上的-NH2未暴露在外侧。选用Mal-PEG3400-NHS进行合成，Mal与ANG的-SH反应，经核磁鉴定DSPE-TK-PEG3400-ANG成功合成，且效率较高、收率提高。
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将豆磷脂、DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟肽(RLASHLRKLRKRLLREEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDM)和姜黄素(质量比为60：10：1：2.5：10)混合溶解于有机溶剂(甲醇与二氯甲烷体积比为8:2的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；
b)往15mL pH8.0 Tris-HCL缓冲液中加入60mg表面活性剂泊洛沙姆，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜中，形成脂质混悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，即得重组高密度脂蛋白rHDL；rHDL的平均粒径101.23nm，Zeta电位<-15mV。
实施例2
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白ANG接枝率：
①采用BCA法测定rHDL表面ANG浓度：精密称取DSPE-TK-PEG3400-ANG 2mg，加入2mLPBS7.4溶液，依次稀释为0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL的溶液，按说明加入BCA试剂后测定在450nm处的吸光度，绘制OD450nm-浓度标准曲线。制得的rHDL超滤离心下层得到游离的DSPE-TK-PEG3400-ANG，浓缩后经BCA试剂检测得出游离的DSPE-TK-PEG3400-ANG的浓度，计算得出rHDL中DSPE-TK-PEG3400-ANG的浓度Q(mg/mL)。
②取1mL rHDL置于已恒重后的EP管中，冻干后继续放于80℃烘箱中恒重，计算得出rHDL的质量W(mg/mL)，同时测定rHDL粒径(X，nm)。
③计算：
a.根据平均粒径计算每毫升载体中rHDL中的平均数目：N＝6×W×10-3/[π×(X×10-7)3×ρ]，根据文献查得ρ＝1.1g/cm3。
b.每毫升rHDL中DSPE-TK-PEG3400-ANG的数目：M＝Q×10-3/MW×6.02×1023，MW＝6848。
c.计算每个rHDL上连接DSPE-TK-PEG3400-ANG的数目：P＝M/N。
固定其他因素不变，以粒径和ANG的连接效率为考察指标，依次考察豆磷脂浓度(2mg/mL，6mg/mL和10mg/mL)，DSPE-TK-mPEG2000浓度(0.5mg/mL，1mg/mL和1.5mg/mL)，DSPE-TK-PEG3400-ANG(0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.3mg/mL)浓度对粒径和ANG连接效率的影响，筛选出最优处方。结果见下表，
当豆磷脂浓度为6mg/mL，DSPE-TK-mPEG2000浓度为1mg/mL，DSPE-TK-PEG3400-ANG浓度为100μg/mL，即豆磷脂、DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟肽与药物的质量比为60：10：1：2.5：10，rHDL粒径为97.12nm，表面接有ANG 349个，粒径大小合适，连接效率适中。
表1
Figure BDA0002370183300000061
表2
Figure BDA0002370183300000062
表3
Figure BDA0002370183300000071
实施例3
DESP-TK-mPEG2000与DSPE-TK-PEG3400-ANG的制备同实施例1。
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将豆磷脂、DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟肽(RLASHLRKLRKRLLREEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDM)和姜黄素混合溶解于有机溶剂(甲醇与二氯甲烷体积比为9:1的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；
b)往15mL pH8.0 Tris-HCL缓冲液中加入60mg表面活性剂胆酸钠，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜中，形成脂质混悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，即得rHDL；rHDL的平均粒径98.53nm，Zeta电位<-18.45mV。
rHDL的ROS响应性测试：
实施例1制得的rHDL分别与100μM H2O2溶液和10mM PBS溶液混合，0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h取样100μL，按照过氧化氢检测试剂盒测定体系中剩余的H2O2。图3和下表显示rHDL能清除体系中的H2O2，12h清除效率达80％左右。
表4
Figure BDA0002370183300000072
Figure BDA0002370183300000081
实施例4
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将蛋黄磷脂、DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟(AQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH)和姜黄素(质量比为60：10：1：2.5：10)混合溶解于有机溶剂(甲醇与二氯甲烷体积比为8:2的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；
b)往15mL pH8.0 Tris-HCL缓冲液中加入60mg表面活性剂胆酸钠，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜中，形成脂质混悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，即得rHDL；rHDL的平均粒径103.65nm，Zeta电位<-17.45mV
ELISA测试rHDL与Aβ结合：
使用pH9.6碳酸盐包被缓冲液将Aβ1-42稀释至25μg/mL，加入200μL至酶标板孔中，置于4℃冰箱过夜。次日，弃去Aβ1-42溶液，洗涤液洗涤2-3次，加入5％BSA封闭液200μL，37℃摇床中孵育3h，弃去板内BSA溶液，洗涤2-3次，加入5μg/mL，50μg/mL，250μg/mL apoE模拟肽修饰的rHDL溶液200μL，于37℃孵育0.5h、1h、2h，吸弃载体，洗涤2～3次，于各反应孔中，加入酶标抗体100μL，用封板膜封板后置于37℃孵育1h，弃去封板膜和液体，洗涤5次，拍干。再于各反应孔中加入显色剂A和B各50μL，混匀，37℃避光显色15min。于各反应孔中加入终止液50μL。15min内于450nm处测量各孔OD值，同时设板底不包被Aβ1-42为阴性对照组。根据公式RW＝[(OD样品-OD对照)/OD对照]×100％计算相对结合量(RW)。实施例4制得的rHDL与Aβ的相对结合量见图4和下表，可以看出，随着apoE模拟肽浓度和孵育时间的增加，rHDL与Aβ的相对结合量增加。
表5
Figure BDA0002370183300000082
Figure BDA0002370183300000091
实施例5
ROS响应性rHDL促进Aβ寡聚体解聚性能测试：
按实施例1步骤制备0μg/mL，5μg/mL，50μg/mL，250μg/mL apoE模拟肽修饰的rHDL，分别取1.0mL上述溶液，加入Aβ1-42寡聚体溶液50μL，同时取PBS 7.4溶液，加入50μL Aβ1-42寡聚体溶液作为对照组，置于37℃摇床孵育，分别于0h，12h，24h，48h，72h，120h取样80μL，加入ThT溶液320mL，于激发波长400nm处，测量发射波长480nm处的荧光强度。
rHDL促进Aβ寡聚体解聚的结果见图5，如图所示，与Aβ组相比，apoE模拟肽修饰的rHDL组的荧光强度有不同程度的下降，且下降的趋势与apoE模拟肽浓度呈正相关，表明apoE模拟肽修饰的rHDL能促使高毒性的Aβ寡聚体解聚为低毒性的单体。
实施例6
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法同实施例1.
rHDL降低神经细胞氧化应激性能测试：
小鼠海马神经元细胞(HT22)的培养：采用含10％胎牛血清，1％双抗的DMEM培养基，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞置于96孔板培养24h，密度约为1×104个/孔，给予100μM H2O2，2h后加入100μL无血清的DMEM稀释的rHDL，每4h更新一次H2O2，同时设置不施加任何处理和仅用H2O2处理的作为对照组，12h后，使用CCK8试剂盒测定各组别细胞的存活率。见下表，rHDL处理HT22细胞12h后的存活率从78.50％上升至96.26％，说明rHDL可缓解H2O2造成的细胞损伤。
表6
Figure BDA0002370183300000092
Figure BDA0002370183300000101
实施例7
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法：
a)将豆磷脂、DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟肽(RLASHLRKLRKRLLREEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDM)和白藜芦醇(质量比60：10：1：2.5：10)混合溶解于有机溶剂(甲醇与二氯甲烷体积比为9:1的混合溶剂)中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；
b)往15mL pH8.0 Tris-HCL缓冲液中加入60mg表面活性剂胆酸钠，混合均匀后得到水合介质，将水合介质加入到步骤a)得到的脂质薄膜中，形成脂质混悬液，将脂质悬液转移至超声波细胞粉碎仪，超声后采用0.22μm微孔滤膜过滤，即得rHDL；rHDL的平均粒径103.07nm，Zeta电位<-12.63mV。
对比例1
靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白的制备方法，除了不加入DSPE-TK-PEG3400-ANG，其余步骤与实施例1相同。产物的平均粒径98.54nm，Zeta电位<-12.63mV
脑靶向性能测试：
12只雌性昆明小鼠随机分为2组，每组6只，分别尾静脉注射花青素Cy5.5荧光标记的实施例1制得的rHDL和对比例rHDL，于注射后的0.5h、1h、2h、4h、12h和24h后对小鼠注射5％的水合氯醛0.2mL，麻醉小鼠，然后放入小动物活体成像仪下观察并拍照，拍照后处死小鼠，取出脑部，组织匀浆后甲醇提取Cy5.5，使用荧光分光光度计测量(激发波长673nm，滤光片693nm)。
测试结果如图6所示，从0.5h到24h对比例rHDL组小鼠脑部仅有微弱的荧光，4h荧光基本消失，表明其小鼠体内循环时间较短，脑靶向性较差。对比之下，实施例1制得的rHDL组则呈现出良好的脑靶向性，其在小鼠脑部从0.5h到4h均呈现高强度荧光分布，且随着时间的延长脑部荧光逐步增强，12h出现明显的荧光衰减。结合下表表明实施例1制得的rHDL在修饰了ANG后，对于脑部具有高选择性、高强度的靶向驻留作用。
表7
Figure BDA0002370183300000111
apoE，由299个氨基酸组成，现代科学对其结构研究已十分透彻，位于N端的RLASHLRKLRKRLLREEQAQQIRLQAEAFQA序列是与低密度脂蛋白受体(LDLR)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)结合的关键结构，C端的RLKSWFEPLVEDM序列是与Aβ结合的关键结构，截取上述两个功能性片段连结组成apoE模拟肽，模拟完整apoE与Aβ结合后发挥解聚功能，并介导入胞发挥治疗作用。
ANG，来源于抑肽酶(aprotinin)的Kunitz区，是一种类似于低密度脂蛋白受体相关蛋白的新型多肽，序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，和乳铁蛋白与转铁蛋白相比，ANG无内源性，不存在与内源性配体竞争导致外源性导向效率偏低的问题，ANG穿越血脑屏障效率比乳铁蛋白，转铁蛋白高数十倍。酮缩硫醇(thioketal，TK)，是包含巯基官能团的一类芳香化合物，在ROS环境下化学键断裂，生成酮和硫醇。
本课题基于仿生学的原理设计一种ROS响应性的重组高密度脂蛋白，选用磷脂、DSPE-TK-mPEG2000和DSPE-TK-PEG3400-ANG构成基本骨架，同时修饰apoE模拟肽构成具有长循环特征的纳米载体。PEG3400的长度大于PEG2000，ANG稍“伸出”于脂质体表面，与LRP1结合介导穿越血脑屏障后，脑部高浓度的ROS氧化断裂TK片段脱去PEG2000与PEG3400-ANG，暴露apoE模拟肽，模拟肽与Aβ结合发挥抑制聚集和促进解聚的作用，并介导Aβ进入神经细胞内进行代谢，阻止老年斑的形成，另外，由于氧化断裂TK片段过程中消耗一部分ROS，可一定程度上降低脑部脑部氧化应激水平，暴露的apoE模拟肽加速Aβ代谢清除，协同治疗AD，减轻神经损伤引起的认知障碍。
本发明的重组高密度脂蛋白主要组成成分有磷脂、自主设计合成的DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG、apoE模拟肽和内部包含的具有治疗阿尔茨海默症功效的药物，形成高密度脂蛋白结构。本发明制备的高密度脂蛋白表面的ANG，可介导穿越血脑屏障，遇ROS断裂TK，暴露出的apoE模拟肽可与Aβ特异性结合，促进寡聚体解聚的同时，携带Aβ进入神经细胞内进行胞内代谢清除,恢复Aβ的生成与代谢的平衡。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其特征在于：包括，
脂类、自主设计合成的聚合物和apoE模拟肽；
所述自主设计合成的聚合物包括疏水片段、ROS响应敏感片段、靶向片段、连接片段结合构成。
2.如权利要求1所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其特征在于：所述脂类为磷脂；所述ROS响应敏感片段包括硫醇缩酮、聚硫化丙烯、硼酸酯、硫醚酯、碲化物中的一种或几种；所述连接片段包括PEG3400和/或mPEG2000中的一种或几种；所述疏水片段包括DMPC、DPPC、DSPE、DOPC或DEPC中的一种或几种；所述靶向片段包括ANG、RVG29、OX26、TGN中的一种或几种，其具有携带高密度脂蛋白穿越BBB入脑的能力。
3.如权利要求2所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其特征在于：所述磷脂包括豆磷脂，蛋黄磷脂，DMPC、DPPC或者DSPE中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其特征在于：所述自主设计合成的聚合物包括DSPE-TK-mPEG2000、DSPE-TK-PEG3400-ANG中的一种或几种。
5.如权利要求1～4任一所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体，其特征在于：所述重组高密度脂蛋白载体的内部包含的具有治疗阿尔茨海默症功效的药物。
6.一种制备权利要求1～5任一所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其特征在于：包括，
制备自主设计合成的聚合物；
将脂类、所述自主设计合成的聚合物、apoE模拟肽和治疗阿尔茨海默症的药物混合溶解于甲醇与二氯甲烷混合溶剂中，然后减压蒸发除去混合溶剂，得到脂质薄膜；
向缓冲液中加入表面活性剂，混合均匀后得到水合介质，将所述水合介质加入所述脂质薄膜中，超声粉碎后过滤，得到重组高密度脂蛋白。
7.如权利要求6所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其特征在于：按质量比计，所述脂类、所述自主设计合成的聚合物、所述apoE模拟肽与所述药物的比例为(50～70)：(5～8)：(1～4)：(1～4)；所述甲醇与二氯甲烷混合溶剂中甲醇与二氯甲烷的比例为3:1。
8.如权利要求6或7所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其特征在于：所述缓冲液包括PBS 7.4、Tris-HCl8.0、HEPES缓冲液中的一种或几种。
9.如权利要求8所述的具有靶向治疗阿尔茨海默症的ROS响应性重组高密度脂蛋白纳米载体的方法，其特征在于：所述药物可为姜黄素、α-倒捻子素、白藜芦醇或银杏酮酯中的一种或几种。
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