CN115337412A - 一种基于软模板的中空载药纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于软模板的中空载药纳米材料及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。在本发明中，以DMDES软模板作为媒介，将两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP‑9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到ROS和MMP‑9双响应性的中空纳米材料，以及在中空结构中包载有药物姜黄素，具有良好的体外相容性、安全性和较强的超声成像能力，实现对急性心肌梗死小鼠超声造影成像，对AMI具有良好的靶向性和靶向释放药物的能力，并在心肌梗死部位释放姜黄素，对心肌梗死细胞有一定的干预作用，实现对急性心肌梗死的诊疗一体化。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于软模板的中空载药纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
心肌梗死(myocardial infarction,MI)是世界范围内发病率和死亡率较高的疾病之一，仅在美国每年发生心肌梗死事件大约80.5万起，在我国的发病率也逐年上升，目前已成为我国心脏病住院和死亡的主要原因。急性心肌梗死(acute myocardialinfaraction，AMI)是由冠状动脉阻塞引起的心肌缺血缺氧或心肌坏死的心脏病，由于心肌细胞不可逆坏死，梗死损伤进一步激活心肌成纤维细胞，形成不可收缩的瘢痕组织，所以AMI患者的死亡率较高，预后较差。
目前，AMI的主要治疗方法是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronaryintervention,PCI)和溶栓治疗，两者的治疗效果与治疗时效密切相关。根据文献报道，AMI患者在90min内接受PCI手术将具有显著的治疗效果，因此，患者得到尽早的诊断和治疗是临床治疗AMI的关键。近几十年来，AMI的临床诊断依赖于血清中肌钙蛋白I的高灵敏度检测。但是，这种方法需将肌钙蛋白I从梗死部位释放到外周血中才能被检测到，延迟了AMI患者的临床诊断。
超声成像(ultrasonic imaging US)作为一种便捷、无创的临床诊断方法，与X射线成像、磁共振成像等其他成像诊断方法相比，US能够实现实时和快速的检测并保护患者免受辐射和磁场的影响。因此，临床上常采用超声影像辅助诊断多种心脏疾病。但目前的超声成像只能反映患者心脏结构和血流的变化，不能直接反映心肌坏死和微血管阻塞情况。所以，临床上目前尚无AMI的超声影像学诊断方法报道。已商业化的增强超声成像的造影剂，如六氟化硫脂质纳米颗粒，由于缺乏靶向手段，无法靶向心肌梗死部位。同时，尚未有兼具靶向诊断和早期辅助治疗的商用超声造影剂，帮助AMI患者的早期诊断和辅助治疗。
因此，迫切需要开发一种早期诊断和治疗AMI的超声造影剂，对AMI患者进行早于肌钙蛋白指标的确诊和早期辅助治疗，改善AMI患者的临床预后。
发明内容
活性氧(reactive oxygen species，ROS)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)被发现在AMI发生中含量表达明显升高，可以作为AMI发生进程中的潜在生物标志物。所以，可以开发基于ROS和MMP-9响应的造影剂材料，实现AMI的靶向成像和治疗。然而，ROS和MMP-9的表达在肿瘤、炎症等其它疾病中也存在显著提升。所以，单独的指标对于靶向AMI疾病发生特异性较差。需联合两种指标才能获得较好的靶向特异性。事实上，ROS的响应性底物为疏水性化合物，MMP-9的响应性底物为亲水性化合物，联合这两种底物于同一材料上较为困难。因此，现有技术中尚没有公开ROS和MMP-9双靶向急性心肌梗死的超声造影材料，也没有公开可以同时释放药物进行急性心肌梗死早期治疗的超声造影材料。针对现有技术中存在的缺陷，本发明构建了一种疏水性的软模版，可以分散于水中，与ROS响应的底物相溶，并可使ROS响应性底物和MMP-9响应性底物在软模版表面聚合，在洗去软模版之后获得中空纳米结构的材料，实现良好的超声成像效果。
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种基于软模板的中空载药纳米材料，以DMDES软模板作为媒介，克服了因ROS的响应性底物为疏水性化合物，MMP-9的响应性底物为亲水性化合物，难以实现将两者结合在同一种材料上的困难，将两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料，在中空纳米材料的中空结构中包载有药物姜黄素，得到中空载药纳米材料，具有良好的体外相容性、安全性和较强的超声成像能力，实现对急性心肌梗死小鼠超声造影成像，对AMI具有良好的靶向性和靶向释放药物的能力，并在心肌梗死部位释放姜黄素，对心肌梗死细胞有一定的干预作用，实现对急性心肌梗死的诊疗一体化。
本发明的另一目的是提供一种上述基于软模板的中空载药纳米材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述基于软模板的中空载药纳米材料作为超声造影材料的应用。
本发明的技术方案如下：
一种基于软模板的中空载药纳米材料，它包括中空纳米材料以及在中空纳米材料的中空结构中包载的姜黄素，其中，中空纳米材料由两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到的ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料。
在本发明中，MMP-9响应性底物的制备方法如下：将氨基酸序列为YPLGLAGR的多肽与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸进行反应，得到两侧末端具有双丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物。其中，MMP-9响应性底物的结构式简写如下：
在本发明中，ROS响应性硫醇缩酮底物的制备方法如下：在氮气保护下，将化合物PDSE、三乙胺和丙烯酰氯在-10～10℃的条件下进行反应，得到ROS响应性硫醇缩酮底物。具体合成路线如下：
本发明以DMDES软模板作为媒介，将两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料，具有良好的中空形貌，粒径约200nm，粒径分布均匀。
其中，DMDES软模板的制备方法如下：将NH3·H2O水溶液、十二烷基磺酸钠、去离子水和DMDES混合均匀后，进行透析处理，再向透析处理后的混合溶液中加入3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷，在20～40℃的条件下进行搅拌反应，得到DMDES软模板。
在DMDES软模板为媒介，将MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应，离心、洗涤去除DMDES软模板，得到中空纳米材料，合成路线如下：
在上述所得中空纳米材料的中空结构中包载有药物姜黄素，制备中空载药纳米材料，具有良好的体外相容性、安全性，具有一定对损伤心肌细胞干预功能，良好的体外超声造影效果，以及体外OGD模型诱导的缺血缺氧心肌细胞的响应性。
本发明提供的中空载药纳米材料，具有较强的超声成像能力，实现对急性心肌梗死小鼠超声造影成像，对AMI具有良好的靶向性和靶向释放药物的能力，并在心肌梗死部位释放姜黄素，对心肌梗死细胞有一定的干预作用，实现对急性心肌梗死的诊疗一体化。
为了更好的理解本发明的内容，出现了一些缩略词，其对应的中文解释如下：中空纳米材料(PHNs)、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)、DMDES(二甲基二乙氧基硅烷)、化合物SDS(十二烷基磺酸钠)、化合物TEMED(四甲基乙二胺)、化合物MPS【3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷】、KPS(过硫酸铵)、化合物PDSE【2,2’-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)】。
本发明还提供了上述基于软模板的中空载药纳米材料的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)MMP-9响应性底物的制备：将氨基酸序列为YPLGLAGR的多肽与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸进行反应，得到两侧末端具有双丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物；
(2)ROS响应性硫醇缩酮底物的制备：在氮气保护下，将化合物PDSE、三乙胺和丙烯酰氯在-10～10℃的条件下进行反应，得到ROS响应性硫醇缩酮底物；
(3)DMDES软模板的制备：将NH3·H2O水溶液、十二烷基磺酸钠、去离子水和DMDES混合均匀后，进行透析处理，再向透析处理后的混合溶液中加入3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷，在20～40℃的条件下进行搅拌反应，得到DMDES软模板；
(4)中空纳米材料的制备：在氮气保护下，将步骤(1)中制备的MMP-9响应性底物、步骤(2)中制备的ROS响应性硫醇缩酮底物、碳酸氢钠和去离子水混合均匀，向所得混合溶液中加入步骤(3)中制备的DMDES软模板，搅拌混合均匀后，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，在50～70℃的条件下进行搅拌反应，待反应结束后，离心、洗涤去除DMDES软模板，得到中空纳米材料；
(5)中空载药纳米材料的制备：将步骤(4)中制备的中空纳米材料分散于含姜黄素的乙醇溶液中，在室温条件下进行孵育，得到中空结构中包载有姜黄素的中空载药纳米材料。
对于本发明而言，在步骤(2)中，ROS响应性硫醇缩酮底物的制备过程中，反应温度为-10～10℃，可以但不局限于-10℃、-5℃、0℃、5℃或10℃，优选地，反应温度为0℃。
在一种优选方案中，化合物PDSE与三乙胺的摩尔比为1:4～8，可以但不局限于1:4、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7或1:8，为了获得更好的效果，化合物PDSE与三乙胺的摩尔比为1:6。
在一种优选方案中，化合物PDSE与丙烯酰氯的摩尔比为1:2～5，可以但不局限于1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4或1:5，为了获得更好的效果，化合物PDSE与丙烯酰氯的摩尔比为1:3。
对于本发明而言，在步骤(3)中，以NH3·H2O作为催化剂，在DMDES软模板的制备过程中，十二烷基磺酸钠与DMDES的质量体积比为25～35mg/ml，可以但不局限于25mg/ml、27mg/ml、30mg/ml、32mg/ml或35mg/ml，为了获得更好的效果，十二烷基磺酸钠与DMDES的质量体积比为30mg/ml。
在一种优选方案中，DMDES与3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷的体积比为8～15:1，可以但不局限于8:1、9:1、10:1、11:1、12:1或15:1、为了获得更好的效果，DMDES与3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷的体积比为10:1。
对于本发明而言，在步骤(4)中，在中空纳米材料的制备过程中，反应温度为50～70℃，可以但不局限于50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，为了获得更好的效果，反应温度为60℃。
进一步地，反应时间为4～10小时，优选地，反应时间为为6小时。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，MMP-9响应性底物与ROS响应性硫醇缩酮底物的质量比为0.8～1.2:1，可以但不局限于0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1或1.2:1，为了获得更好的效果，MMP-9响应性底物与ROS响应性硫醇缩酮底物的质量比为1:1。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，MMP-9响应性底物与碳酸氢钠的质量比为2～6:1，可以但不局限于2:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1或6:1，为了获得更好的效果，MMP-9响应性底物与碳酸氢钠的质量比为4:1。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，MMP-9响应性底物与过硫酸铵的质量比为0.8～1.2:1，可以但不局限于0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1或1.2:1，为了获得更好的效果，MMP-9响应性底物与过硫酸铵的质量比为1:1。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，MMP-9响应性底物与四甲基乙二胺的质量体积比为0.8～1.2:1mg/ml，可以但不局限于0.8:1mg/ml、0.9:1mg/ml、1:1mg/ml、1.1:1mg/ml或1.2:1mg/ml，为了获得更好的效果，MMP-9响应性底物与四甲基乙二胺的质量体积比为1:1mg/ml。
本发明制备的中空纳米材料，为中空核壳结构，具有良好的中空形貌，粒径约200nm，粒径分布均匀，空腔的平均直径约为80nm。
本发明提供的中空载药纳米材料，可以作为超声造影材料，具有较强的超声成像能力，实现对急性心肌梗死小鼠超声造影成像，对AMI具有良好的靶向性和靶向释放药物的能力，并在心肌梗死部位释放姜黄素，对心肌梗死细胞有一定的干预作用，实现对急性心肌梗死的诊疗一体化。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明以DMDES软模板作为媒介，克服了因ROS的响应性底物为疏水性化合物，MMP-9的响应性底物为亲水性化合物，难以实现将两者结合在同一种材料上的困难，将两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料，具有良好的中空形貌，粒径约200nm，粒径分布均匀。
(2)在ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料中包载有药物姜黄素，制备中空载药纳米材料，具有良好的体外相容性、安全性，具有一定对损伤心肌细胞干预功能，良好的体外超声造影效果，以及体外OGD模型诱导的缺血缺氧心肌细胞的响应性。
(3)本发明提供的中空载药纳米材料，具有较强的超声成像能力，实现对急性心肌梗死小鼠超声造影成像，对AMI具有良好的靶向性和靶向释放药物的能力，并在心肌梗死部位释放姜黄素，对心肌梗死细胞有一定的干预作用，实现对急性心肌梗死的诊疗一体化。
附图说明
图1是本发明中基于软模板的中空载药纳米材料的合成过程示意图。
图2是中空载药纳米材料的表征图谱；其中，图2中A为SEM图谱；图2中B为TEM图谱；在图2中A和B之间的图为图2中A的局部放大图；图2中C为红外光谱；，图2中D为XPS图谱；图2中E为氮气吸附实验的结构表征图；
图3是中空载药纳米材料的体内外安全性图谱；其中，图3中A为CCK8考察中空载药纳米材料的毒性图谱；图3中B为流式细胞技术考察中空载药纳米材料的毒性图谱；图3中C为中空载药纳米材料在小鼠体内的分布和代谢考察；图3中D为中空载药纳米材料注射小鼠30天内小鼠的体重变化；图3中E为中空载药纳米材料注射30天后小鼠的肝肾功能变化情况；
图4是中空载药纳米材料的体内外成像性图谱；其中，图4中A体外成像；图4中B体内成像；
图5是单一MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物的体内外成像性图谱；
图6是中空载药纳米材料的体内外治疗性图谱；其中，图6中A为中空载药纳米材料在双氧水和MMP-9蛋白酶溶液中的药物释放实验；图6中B为中空载药纳米材料和非载药中空纳米材料对体外AMI心肌细胞模型的治疗效果实验；图6中C为中空载药纳米材料和非载药中空纳米材料的CCK8和细胞凋亡实验；图6中D为中空载药纳米材料和非载药中空纳米材料对AMI心肌细胞模型中caspase-3蛋白表达的影响；图6中E为中空载药纳米材料和非载药中空纳米材料对AMI模型小鼠心肌组织的染色和各项指标组化表达的影响；
图7是对比例1中制备纳米材料的表征图谱；图2中A为SEM图谱，左侧为右侧的局部放大图；图2中B为TEM图谱，右侧为左侧的局部放大图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下实施例所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和不中也应视为本发明的保护范围。
一、材料
1、实验样本
KM昆明小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司
裸小鼠卡文斯实验动物技术有限公司
2、实验试剂
3、实验仪器
二、实验方法
1、中空载药纳米材料的表征
傅里叶变换-红外分光光度法(FT-IR)对中空载药纳米材料进行分析和鉴定。利用X射线光电子能谱(XPS)、能量色散X射线光谱(EDX)测定中空载药纳米材料的元素含量。通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)了解中空载药纳米材料的形貌结构。采用动态光散射法(DLS)测定粒径分布。采用BET法测定中空载药纳米材料的比表面积和孔径分布。
2、中空载药纳米材料的体外安全性
细胞培养：H9c2细胞来源于胚胎大鼠心脏。使用含5％胎牛血清、1％青霉素/链霉素混合液的DMEM高糖培养基培养，每24h更换一次培养基，培养条件为37℃，5％CO2和21％O2。
细胞毒性检测(CCK8试剂盒)：在96孔板中接种H9c2心肌细胞(～105/孔)，每组设6个复孔，每孔100μL相应培养基，24h后进行处理。实验分为空白组、对照组、处理组，各组细胞经相应处理后，用移液器向各孔加入10μL CCK-8试剂。将孔板放入相应培养条件下，1h后使用酶标仪测量450nm波长处的吸光度(A)。
细胞活力(％)＝[(As–Ab)/(Ac–Ab)]×100％
As：实验孔(含有细胞和材料、有CCK-8)的吸光度；
Ac：对照孔(含有细胞而不含材料、有CCK-8)的吸光度；
Ab：空白孔(不含有细胞和材料、有CCK-8)的吸光度。
细胞凋亡检测(Annexin V-FITC/PI试剂盒)：在6孔板中接种H9c2心肌细胞，待细胞生长达到60％-80％后进行处理。实验分为两组：1)实验组：不同浓度的中空载药纳米材料；2)对照组。各组经过处理后弃去培养基，用不含EDTA的胰酶消化1min，终止消化后1000rpm，4℃离心5min，弃上清。加入1mL预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，洗涤3次。细胞重悬于500μL Binding Buffer，依次加入10μL Annexin V-FITC和10μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15min，在1h内用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
3、中空载药纳米材料的体外成像
于2mL离心管内配置1.5mL造影剂浓度分别为0.1、0.4、0.8mg/mL的PBS和PBS+10％FBS分散液。分散液混匀后添加琼脂糖溶液(0.4％,m/v,0.4mL)密封离心管，待冷凝后在4℃冰箱保存待用。在超声探头的作用下，研究超声波强度和不同浓度材料的关系。同时采集每个样本超声图像进行分析，采用ImageJ ROI进行定量分析。
4、中空载药纳米材料的体内安全性实验
小鼠的一般行为实验：实验选取8周龄健康的成年昆明(KM)雄性小鼠作为实验对象，实验前留置1周以适应环境。每组3只KM鼠，正常饲养，观察小鼠的行为有无异常，有无死亡情况，记录30天内小鼠的体重变化。实验分组如下：
对照组：生理盐水(200μL)尾静脉注射小鼠；
实验组1：非载药中空纳米材料(200μL,20mg/kg)尾静脉注射小鼠；
实验组2：中空载药纳米材料(200μL,20mg/kg)尾静脉注射小鼠；
小鼠的肝肾功能指标：小鼠尾静脉注射1个月后，小鼠进行眼眶动脉取血，将血液分为两份，一份滴入含抗凝血剂肝素的离心管中，4℃下3000rpm的转速离心5min，重复2次，将上清分离至离心管中，-80℃冻存待用。融化后按试剂盒说明检测肝肾功能生化指标谷草转氨酶(AST/GOT)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)、尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)。
另一份制备血涂片：取新鲜血液1滴，置于载玻片的一端1cm处，左手持载玻片，右手持推片从血滴前方后移接触血滴，使血滴沿推片边缘展开，将推好的血涂片在空中晃动，使其迅速干燥。待血片干燥后，滴数滴瑞特染液(配方：瑞特染料0.1g溶于60mL甲醇中)在血片上，使血片全部被染液淹盖。约1min后，滴加相当于染液1.5倍的缓冲液或蒸馏水，洗净多余染液。制成血涂片后，在明场显微镜下观察血细胞的形态。实验分组同小鼠的一般行为实验。
小鼠的组织病理切片：小鼠尾静脉注射PHNs溶液1个月后，脊椎脱臼法处死小鼠后，取小鼠主要器官心、肝、脾、肺、肾、肠，在4％多聚甲醛固定，将器官脱水后石蜡包埋并切片，对制作好的切片进行H&E染色，在奥林巴斯光学显微镜下观察各组织结构和形态。实验分组同小鼠的一般行为实验。
5、中空载药纳米材料的体内超声
实验前，将冻干的中空载药纳米材料淡蓝色粉末用超声波分散在生理盐水中，饲喂10周龄卡文斯裸鼠1周以适应环境实验。将处理组小鼠用水合氯醛麻醉后，用超声探头在裸鼠心脏部位超声诊断待其超声信号消失后，继续尾静脉注射材料。每组截取3张超声图片进行分析，定量分析软件采用ImageJ ROI。实验分组：1)正常鼠注射生理盐水组；2)正常鼠的中空载药纳米材料溶液(20mg/kg)尾静脉注射组；3)造模鼠的中空载药纳米材料溶液(20mg/kg)尾静脉注射组。
6、中空载药纳米材料的体内治疗效果评价
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：实验选取健康KM小鼠作为实验对象，实验前饲养1周以适应环境。将处理组小鼠用水合氯醛麻醉后直接取心脏，用生理盐水冲洗后直接冻于-20℃30min后，用刀片从心脏顶端到结扎处切片，用20mg/ml TTC孵育30min后用多聚甲醛固定，最后用显微镜观察拍照。实验分组：1)正常小鼠注射生理盐水组；2)造模鼠注射生理盐水尾静脉3)造模小鼠连续7天造影剂溶液(20mg/kg)尾静脉注射。
Massion染色：实验选取健康KM小鼠作为实验对象，实验前饲养1周以适应环境。将处理组小鼠脊椎脱臼法处死，取心脏进行石蜡包埋，脱水后切片。将切好的片子进行Massion染色，观察心肌细胞的形态和纤维化情况。实验分组：1)正常小鼠注射生理盐水组；2)造模鼠注射生理盐水尾静脉3)造模鼠连续7天造影剂溶液(20mg/kg)尾静脉注射。
免疫组化：将切好的片子烘干2h后脱蜡，3％H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶活性。微波修复后物理冷却，5％BSA室温封闭。将MMP-9、a-SMA、VwF、CD31抗体按比例稀释孵育后与二抗结合。最后DAB显色，加苏木素复染，脱水，中性树胶封片后晾干保存。在奥林巴斯光学显微镜下观察各蛋白的表达情况以评估炎症、细胞凋亡和血管生成。
实施例1
1、基于软模板的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的合成
1.1、MMP-9响应性底物的制备
MMP-9响应性多肽(氨基酸序列为YPLGLAGR)由合肥森纳生物技术有限公司合成。具体制备方法如下：将氨基酸序列为YPLGLAGR的多肽的多肽序列中的酪氨酸(Tyr)和精氨酸(Arg)残基与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸进行反应，得到两侧末端具有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物。纯化后，冷冻干燥为白色粉末状，置于-20℃冰箱保存备用。
其中，MMP-9响应性底物的结构式简写如下：
1.2、ROS响应性硫醇缩酮底物的制备
在50mL烧瓶中，将化合物PDSE【2,2’-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙-1-胺)】(0.3g,1.6mmol,1eq)溶于含有三乙胺(0.9g,9.6mmol,6eq)的二氧六环溶剂(30mL)中。在0℃和N2保护下，向所得混合溶液中慢慢滴加丙烯酰氯(0.4g,4.8mmol,3eq)进行搅拌反应，反应1.5h后，薄层色谱法(TLC)监测，乙酸乙酯萃取后通过跑大板纯化，最后旋干，称重，得到ROS响应性硫醇缩酮底物，合成产率为60％。
合成路线如下：
产物结构通过核磁共振氢谱进行验证。氘代DMSO溶剂中核磁氢谱如下:1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ8.29(d,J＝7.6Hz,2H),6.27-6.12(m,2H),6.07(dd,J＝17.3,4.6Hz,2H),5.66-5.53(m,2H),3.30(p,J＝6.3Hz,5H),2.67(q,J＝6.7Hz,4H),1.65-1.50(m,6H)。与硫缩酮交联剂标准氢谱图一致。
1.3、DMDES软模板的制备
碱催化水解缩合法制备单分散、胶体稳定的二甲基二乙氧基硅烷(DMDES)乳液模板。合成方法如下：在50mL离心管内，将NH3·H2O水溶液和12mg SDS(十二烷基磺酸钠)加入至去离子水中，形成NH3浓度为2％v/v的20mL混合溶液，向所得混合溶液中慢慢滴加400μL的DMDES，手动剧烈震荡1min，形成DMDES浓度为2％v/v的混合溶液，静置16h。将透析袋(分子量小于3500Da)剪成适当长度，在体积浓度为2％NaHCO3和1mmol/L EDTA中煮沸10min，然后将混合溶液透析24h，每2-4h更换一次透析液，去除多余的NH3·H2O和杂质。透析处理后的混合溶液中加入40μL的3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷(MPS，10％v/v)，在25℃下搅拌24h，得到DMDES软模板，置于4℃冰箱中备用。
1.4、中空纳米材料(PHNs)的制备
MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到的ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料。合成方法如下：在50mL烧瓶中，N2保护下，将10mg MMP-9响应性底物、10mg ROS响应性硫醇缩酮底物和2.5mg碳酸氢钠溶于15g去离子水中混合均匀，向所得混合溶液中加入5mL DMDES乳滴软模板，充分混匀。机械搅拌(600rpm)15min后，加入10mg KPS(过硫酸铵)(溶解在500μL去离子水中)和10μL TEMED(四甲基乙二胺)，在N2保护下，60℃持续搅拌6h。然后将反应物冷却至室温，得到的乳白色浑浊悬液，在高速离心机下离心10min(8500g)，将上清弃掉，沉淀物用乙醇超声洗涤3次，每次10min，去除DMDES软模板，最后在烘箱内60℃干燥，得到中空纳米材料(PHNs)，4℃冰箱保存。合成路线如下：
1.5、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的制备
中空纳米材料(PHNs)通过相互作用吸附、包封疏水性药物姜黄素(CUR)的方法如下：将10mg中空纳米材料(PHNs)分散于2mL的含有姜黄素的乙醇溶液(10mg/mL)中，然后在室温下孵育24h，使得在中空纳米材料(PHNs)的中空结构中包载有药物姜黄素。孵育完成后，将所得反应液离心(8500g,10min)，用50％乙醇进行洗涤，去除未负载的CUR，与此同时，收集CUR上清液，在435nm波长下通过紫外-可见分光光度仪测量上清液中的CUR含量。根据建立的标准曲线，计算包载CUR的含量，最后将PHNs@CUR冷冻干燥，在-20℃冰箱中避光保存。
2、结果与分析
2.1、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的表征
利用扫描电子显微镜(SEM)对所获得的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)进行微观形貌的表征。SEM显示中空载药纳米材料(PHNs@CUR)为单分散的球形结构，通过对多组图片中球形纳米材料的测量可知平均粒径为200nm，粒径均一且表面光滑(图2A)。利用透射电子显微镜(TEM)进一步进行表征发现中空载药纳米材料(PHNs@CUR)为明显的中空核壳结构，分散性良好，且空腔的平均直径为80nm，粒径均一(图2B)。
图2中C为红外光谱，其中，a为软模板中DMDES乳滴的红外光谱，b为MMP-9响应性底物的红外光谱，c为ROS响应性硫醇缩酮底物的红外光谱，d为中空载药纳米材料的红外光谱；通过红外光谱对中空载药纳米材料(PHNs@CUR)进行分析发现，相较于反应底物和软模板的红外谱图，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)谱图中的3062cm-1、1620cm-1峰(分别代表＝C-H伸缩振动和C＝C伸缩振动)消失，说明MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物中的双键均键合完全。3300cm-1为N-H伸缩振动以及1620cm-1处酰胺的C＝O伸缩振动是MMP-9响应性底物的特征吸收峰；而649cm-1的C-S伸缩振动和1365、1385cm-1处的-C(CH3)2伸缩振动是ROS响应性硫醇缩酮底物的特征吸收峰，综上可见，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)为MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物的双键自由基聚合产物(图2C)。通过X射线光电子能谱分析图(XPS)进一步探究中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的元素组成。发现其主要含有C、N、O、Si、S几种元素，其中N1s和S2p峰，表明氨基和C-S键存在(图2D)。
通过氮吸附进一步表征中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的物理特性。可见在P/P0 -1小于0.1时，曲线微凸向上，随着P/P0 -1的逐渐增大，吸附质发生毛细管凝聚并且等温线上升，并观察到一定的滞后现象，这是由于中空载药纳米材料(PHNs@CUR)具有中空介孔结构；采用了BJH方法计算介孔孔径得到造影剂的平均孔径在20nm左右；由BET等温方程计算出造影剂的比表面积99.89m2g-1。表明造影剂是具有一定较比表面积的中空介孔材料(图2E)。
2.2、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的体内外安全性
首先采用CCK-8法来评价细胞毒性。不同浓度的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)与H9c2心肌细胞共孵育6h、12h、24h、48h后，样品浓度为80μg/mL时H9C2细胞仍有较高的存活率。实验组与空白对照组相比，差异无统计学意义，说明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对H9C2细胞毒性低(图3A)。通过Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率进一步评价中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的安全性。不同浓度的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)(10、50、100μg/mL)与H9c2细胞共孵育12h后的细胞凋亡率分别是9.9％、12.3％、9.6％，与对照组(9.3％)较为接近，进一步说明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对H9c2细胞毒性较低(图3B)。
通过活体成像实验研究中空载药纳米材料(PHNs@CUR)在体内的分布情况。结果显示，尾静脉注射中空载药纳米材料2h、6h后其主要分布在肝脏和肠道内，经过24h基本被代谢干净(图3C)。表明，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)主要被代谢器官摄取(肝、肠、肾)，经过肝肠系统代谢并排出体外。通过观察8～10周龄的雄性小鼠给药后死亡率和体重变化是最直观的毒性实验。给药后30天内小鼠的活动、饮食及大小便情况均无明显异常变化(图3D)。肝肾功能指标是评价中空载药纳米材料(PHNs@CUR)体内毒性的关键。可以特异性反映肝细胞损伤有谷草转氨酶(AST/GOT)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)；特异性反映肾功能状态的有尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)等指标在注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)一个月后实验组与对照组均无显著性差异，表明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)在小鼠的体内安全性良好(图3E)。
2.3、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的体内外成像性
在体外超声成像分析中，不同浓度(0-1mg/mL)的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)被分散于PBS和血清两种介质中。结果显示，在两种介质中各浓度点均表现出明显的超声信号效果，超声造影增强显著且浓度越高超声造影效果越强(图4A)。
在体内继续评价中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对于AMI的造影增强效果。通过结扎冠状动脉左前降支来构建AMI模型，并通过测定造模前后的心电图检测造模是否成功。若造模后可见ST段明显抬高，说明AMI模型造模成功。将造模和未造模的小鼠均尾静脉注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)，通过超声探头观察心腔内造影效果。注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)前的心腔如图所示为黑色空腔，注射后则为灰色的超声造影图像。结果显示，AMI造模裸鼠的心腔在注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)后出现信号增强，且相较于未造模小鼠强度明显(图4B)。说明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)可以在心腔内对AMI进行早期确诊。从结果可得，浓度为0.8μM/mL的浓度时得到的超声成像效果最好。
图5是单一MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物的体内外成像性图谱。由图5可知，当浓度为0.8μM/mL的浓度时，单一的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物几乎没有造影增强效果。由此可知，本发明以DMDES软模板作为媒介，将两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料，相对于单一的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物，取得了出人意料的超声造影效果。
2.4、中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的体内外治疗性
为了验证姜黄素在体外的释放性能。中空载药纳米材料(PHNs@CUR)被放入了双氧水和富含MMP-9蛋白酶的溶液中。结果显示，经过不同浓度的双氧水反应20-40h姜黄素的释放会达到峰值，最大释放率超过80％。经过不同浓度的MMP-9蛋白酶反应12h后姜黄素的释放效率也能达到峰值。说明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)可以实现ROS和MMP-9响应的药物释放(图6A)。
进一步，构建了体外诱导心肌缺血的细胞模型(OGD)。OGD模型H9c2细胞在不同浓度的中空载药纳米材料(PHNs@CUR)处理下，明显抑制了细胞活力的下降，表明造影剂对OGD模型的H9c2细胞有一定的治疗作用(图6B)。通过Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测心肌细胞的凋亡率，我们探究了中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对OGD模型H9c2细胞凋亡的作用。结果显示与对照组相比，OGD刺激后存活细胞比例明显减少，早期凋亡细胞比例明显增多。中空载药纳米材料(PHNs@CUR)可以剂量(5-20μg/ml)依赖性地抑制OGD模型诱导的H9c2细胞凋亡(图6C)。通过Western blot实验检测心肌细胞内Caspase-3的含量，从分子水平探究中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对OGD模型H9c2细胞保护作用，结果显示与OGD模型H9c2细胞内Caspase-3表达相比，给中空载药纳米材料(PHNs@CUR)后的OGD模型H9c2细胞内的Caspase-3表达量减少，表明中空载药纳米材料(PHNs@CUR)可以抑制OGD模型诱导的H9c2细胞内凋亡因子的表达(图6D)。
同时，利用小鼠动物模型评价中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的体内治疗效果。具体通过小鼠心肌梗死后用2,3,5-三苯基四唑氯(TTC)来评价中空载药纳米材料(PHNs@CUR)对心脏的治疗效果。图6E为正常小鼠(左)、注射非载药中空纳米材料(PHNs)的AMI小鼠(中)、注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的AMI小鼠(右)心脏切片TTC染色图片。TTC通常是无色的，但在活细胞中被脱氢酶还原后变为红色，因此，正常心肌细胞为红色，梗死心肌细胞为白色，判断心肌梗死面积大小。可见与注射非载药中空纳米材料(PHNs)的AMI小鼠相比，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)能减少心肌梗死面积。
通过Masson染色来显示组织中的纤维和炎症因子。结果显示，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)给药组心肌梗死面积较AMI组明显减小。炎症和纤维化是不可分割的。采用a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、血管性血友病因子(vWF)、血小板内皮细胞黏附分子(CD31)以及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的免疫组化分析心肌梗死后缺血心肌的纤维化和炎症情况。心肌纤维化中α-SMA的表达随器官纤维化的加重而增加。VWF是一种主要由血管内皮细胞产生的聚合糖蛋白，是评估出血和血栓形成状态的危险因素。CD31是血管的标志，当血管渗漏时，其表达升高。心肌梗死时，α-SMA、VwF、CD31表达水平升高。MMPs是锌内肽酶家族的成员，在AMI早期常被ROS激活，导致ECM成分降解，进行性梗死扩张，左心室壁变薄。因此，MMP-9表达水平是AMI严重程度和恢复的间接指标。图5E所示，在梗死心肌中，α-SMA、VwF、CD31、MMP-9表达增加，注射非载药中空纳米材料(PHNs)后并未下降；而注射中空载药纳米材料(PHNs@CUR)的靶向造影剂后，表达水平均下降。综上所述，中空载药纳米材料(PHNs@CUR)作为造影剂对缺血缺氧后的心肌细胞具有一定的保护作用。
对比例1
1、不基于软模板的纳米材料的合成
1.1、MMP-9响应性底物的制备(参照实施例1)
1.2、ROS响应性硫醇缩酮底物的制备(参照实施例2)
1.3、不基于软模板的纳米材料的制备
合成方法如下：在50mL烧瓶中，N2保护下，将10mg MMP-9响应性底物、10mg ROS响应性硫醇缩酮底物和2.5mg碳酸氢钠溶于15g去离子水中混合均匀，充分混匀。机械搅拌(600rpm)15min后，加入10mg KPS(过硫酸铵)(溶解在500μL去离子水中)和10μL TEMED(四甲基乙二胺)，在N2保护下，60℃持续搅拌6h。然后将反应物冷却至室温，得到的乳白色浑浊悬液，在高速离心机下离心10min(8500g)，将上清弃掉，所得沉淀物在烘箱内60℃干燥，不基于软模板的纳米材料，4℃冰箱保存。
2、结果与分析
2.1、不基于软模板的纳米材料的的表征
利用扫描电子显微镜(SEM)对所获得的不基于软模板的纳米材料进行微观形貌的表征。SEM显示纳米材料呈现交联状态，不能形成单分散的球体结构(图7A)。利用透射电子显微镜(TEM)进一步进行表征发现纳米材料没有明显的中空核壳结构，且分散性差，粒径不均一(图7B)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基于软模板的中空载药纳米材料，其特征在于，它包括中空纳米材料以及在所述中空纳米材料的中空结构中包载的姜黄素，所述中空纳米材料由两侧末端修饰有丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物和ROS响应性硫醇缩酮底物在DMDES软模板上进行沉淀聚合反应得到的ROS和MMP-9双响应性的中空纳米材料。
2.根据权利要求1所述的基于软模板的中空载药纳米材料，其特征在于，所述MMP-9响应性底物的制备方法如下：将氨基酸序列为YPLGLAGR的多肽与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸进行反应，得到两侧末端具有双丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物。
3.根据权利要求1所述的基于软模板的中空载药纳米材料，其特征在于，所述ROS响应性硫醇缩酮底物的制备方法如下：在氮气保护下，将化合物PDSE、三乙胺和丙烯酰氯在-10～10℃的条件下进行反应，得到ROS响应性硫醇缩酮底物。
4.根据权利要求1所述的基于软模板的中空载药纳米材料，其特征在于，所述DMDES软模板的制备方法如下：将NH3·H2O、十二烷基磺酸钠、去离子水和DMDES混合均匀后，进行透析处理，再向透析处理后的混合溶液中加入3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷，在20～40℃的条件下进行搅拌反应，得到DMDES软模板。
5.权利要求1所述的基于软模板的中空载药超声纳米的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)MMP-9响应性底物的制备：将氨基酸序列为YPLGLAGR的多肽与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸进行反应，得到两侧末端具有双丙烯酸官能团的MMP-9响应性底物；
(2)ROS响应性硫醇缩酮底物的制备：在氮气保护下，将化合物PDSE、三乙胺和丙烯酰氯在-10～10℃的条件下进行反应，得到ROS响应性硫醇缩酮底物；
(3)DMDES软模板的制备：将NH3·H2O水溶液、十二烷基磺酸钠、去离子水和DMDES混合均匀后，进行透析处理，再向透析处理后的混合溶液中加入3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷，在20～40℃的条件下进行搅拌反应，得到DMDES软模板；
(4)中空纳米材料的制备：在氮气保护下，将步骤(1)中制备的MMP-9响应性底物、步骤(2)中制备的ROS响应性硫醇缩酮底物、碳酸氢钠和去离子水混合均匀，向所得混合溶液中加入步骤(3)中制备的DMDES软模板，搅拌混合均匀后，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，在50～70℃的条件下进行搅拌反应，待反应结束后，离心、洗涤去除DMDES软模板，得到中空纳米材料；
(5)中空载药纳米材料的制备：将步骤(4)中制备的中空纳米材料分散于含姜黄素的乙醇溶液中，在室温条件下进行孵育，得到中空结构中包载有姜黄素的中空载药纳米材料。
6.根据权利要求5所述的基于软模板的中空载药超声纳米的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，反应温度为0℃；所述化合物PDSE与三乙胺的摩尔比为1:4～8，优选为1:6；所述化合物PDSE与丙烯酰氯的摩尔比为1:2～5，优选为1:3。
7.根据权利要求5所述的基于软模板的中空载药超声纳米的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述十二烷基磺酸钠与DMDES的质量体积比为25～35mg/ml，优选为30mg/ml；所述DMDES与3-(甲基丙烯酰氯)丙基三甲氧基硅烷的体积比为8～15:1，优选为10:1。
8.根据权利要求5所述的基于软模板的中空载药超声纳米的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，反应温度为60℃；反应时间为4～10小时，优选为6小时；所述中空纳米材料平均粒径200nm；空腔的平均直径为80nm。
9.根据权利要求5所述的基于软模板的中空载药超声纳米的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述MMP-9响应性底物与ROS响应性硫醇缩酮底物的质量比为0.8～1.2:1，优选为1:1；所述MMP-9响应性底物与碳酸氢钠的质量比为2～6:1，优选为4:1；所述MMP-9响应性底物与过硫酸铵的质量比为0.8～1.2:1，优选为1:1；所述MMP-9响应性底物与四甲基乙二胺的质量体积比为0.8～1.2:1mg/ml，优选为1:1mg/ml。
10.权利要求1所述的基于软模板的中空载药纳米材料作为超声造影材料的应用。
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