CN110123838A - 负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途。本发明提供了人多能干细胞外泌体以及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在以下方面的应用：作为制备预防妊娠纹、妊娠纹修复或妊娠纹治疗药物或化妆品的应用，作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用，作为制备治疗皮肤瘢痕、皮肤雀斑、祛痘、暗疮、痤疮等的药物或化妆品的应用。与现有技术相比，本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以起到更好的疾病治疗效果。

Description

负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途。
背景技术
外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括DNA、RNA、蛋白等进入效应细胞，有效调控机体细胞信号转导。研究表明，干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞，发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)与诱导人多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency)，即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。因而ESCs和iPSCs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。ESCs或iPSCs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体，也可以起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。
外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，外泌体作为药物的纳米载体得到了广泛的关注与研究。与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有丰富的生理功能，可以提高药物的传递效率，实现药物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。外泌体自身携带的蛋白、基因等物质具有细胞调控能力，可以对特定的疾病起到治疗作用。
目前，多种细胞外泌体构建的纳米药物递送系统已经用于疾病治疗的探索。Wood课题组最先利用未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)来源的外泌体负载siRNA治疗阿尔兹海默症。iDC分泌的外泌体表面缺乏T细胞激活蛋白(例如MHC-I，MHC-II，CD86)，具有免疫惰性。他们通过基因转染的方法，在外泌体表面蛋白Lamp2b上修饰乙酰胆碱受体识别多肽片段RVG，进而赋予iDC外泌体定位脑部神经细胞的能力；随后，利用电转的方法，将BACE-1的siRNA导入到iDC外泌体中，通过小鼠动物模型，验证了这些载药外泌体治疗阿尔兹海默症的潜力。然而，iDC细胞提取过程繁琐，细胞数量有限，成本高昂，难以产业化生产。同样，肿瘤细胞来源的外泌体也被用于药物递送系统的构建。虽然肿瘤细胞可以无限扩增，制备大量的外泌体，但是它们潜在的安全性风险限制其在临床的使用。最近，研究人员报道了利用牛奶来源外泌体构建的纳米药物递送系统。与细胞来源的外泌体相比，牛奶来源的外泌体提取简便、成本低，实现可以大规模制备满足临床需求。但是，由于牛奶外泌体中含有大量的非人源的基因与蛋白质等物质，其通过静脉全身注射的安全性仍有待进一步确认，而且该研究的重点主要集中于外泌体的药物载体功能，并没有充分发挥外泌体自身所携带的物质对疾病与损伤的治疗潜力。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：
提供人多能干细胞外泌体，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。
在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：
采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。
在本发明的一个实施方式中，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。
旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是：将一定容积的培养基于4℃400g离心10min，去除游离细胞，得到的上清移入另一管中，4℃15000g 20min，去除细胞碎片，获得的上清液倒入millipore超滤装置中，用PBS洗脱收集滤膜(100KD)上的浓缩液体，即再次加入PBS，经millipore超滤装置再次超滤，得到的浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100800g离心210分钟，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到Exosomes悬液，分装保存至-80℃。
在本发明的一个实施方式中，无血清培养体系选择市售的型号为TeSRTM-E8TM或mTeSR1或mTeSR2的培养基。
在本发明的一个实施方式中，收集外泌体后，通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定，结果符合外泌体特征：直径范围50-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构，其膜结构表面含有CD9，CD63等标志物。
本发明第二方面：
提供所述人多能干细胞外泌体的应用，包括以下用途中的一种或几种：
A、作为制备预防妊娠纹、妊娠纹修复或妊娠纹治疗药物或化妆品的应用；
B、作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用；
C、作为制备治疗皮肤瘢痕、皮肤雀斑、祛痘、暗疮、痤疮等的药物或化妆品的应用。
在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗妊娠纹。将人多能干细胞外泌体悬液涂抹在出现了妊娠纹的皮肤局部，观察外泌体对妊娠纹的修复作用，结果表明人多能干细胞外泌体对于妊娠纹修复或妊娠纹治疗具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体预防妊娠纹。将人多能干细胞外泌体悬液涂抹在孕妇腹部，观察外泌体对妊娠纹的预防作用，结果表明人多能干细胞外泌体对于预防妊娠纹具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体逆转皮肤衰老。以衰老动物为实验模型，静脉注射或口服或皮肤涂抹人多能干细胞外泌体的悬液，观察人多能干细胞外泌体对动物皮肤衰老的逆转效果，结果表明人多能干细胞外泌体对于抗皮肤衰老具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗皮肤瘢痕，将人多能干细胞外泌体悬液涂抹在瘢痕局部或瘢痕内注射，观察外泌体对瘢痕的去除作用，结果表明人多能干细胞外泌体治疗皮肤瘢痕具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗皮肤雀斑、祛痘。将人多能干细胞外泌体悬液涂抹在出现了雀斑或痘痘的皮肤局部，观察外泌体对治疗雀斑或祛痘的作用，结果表明人多能干细胞外泌体治疗雀斑或祛痘具有较好效果。
本发明第三方面：
提供基于所述人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂：以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射(如皮下注射、借助各种器械的皮下导入等)或喷雾等形式进行使用。
在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。
在本发明的一个实施方式中，含有人多能干细胞外泌体的添加剂，可以制备多种制剂，如滴剂、软膏剂、乳剂、膜剂、涂抹剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂及贴剂等等；以人多能干细胞外泌体作为添加剂，还可制备多种化妆品，如面膜、面霜、乳液、精华液、眼霜及原液等，用于皮肤美容抗衰老以及修复妊娠纹等。
本发明第四方面：
提供负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体，包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。
在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体为本发明第一方面所述外泌体。
在本发明的一个实施方式中，所述白藜芦醇的包裹浓度为20-100μg/mL。
本发明第五方面：
提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将一定剂量的白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。
在本发明的一个实施方式中，孵育的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度下孵育一定时间。随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；孵育温度的范围为4℃–50℃，优选为37℃；孵育时间范围为1h–48h，优选为4h；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中，冻融的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度的冰箱中进行冷冻。随后解冻，再冷冻，如此循环一定次数。最后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；冷冻温度范围为-10℃--200℃，优选为-80℃；循环次数为1–20次，优选为3次；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中，电转的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液和电转液混合，置于电转仪中，在一定条件下电转一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；电转液为KCl、K3PO4和OptiPrepTM细胞梯度离心液的混合溶液，其中KCl的浓度范围为1mM–1M，优选为25mM，K3PO4的浓度范围为0.01mM-1M，优选为1.15mM，OptiPrepTM细胞梯度离心液的体积分数范围为80％-0.1％，优选为21％；电转参数中电压的范围为10KV–0.1V，优选为400V，电容的范围为0.1–1000F，优选为150F；电转时间范围为0.1s–1min，优选为10s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中，超声的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液混合，利用针式超声仪在一定条件下对上述混合溶液超声一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；超声条件中，电压的范围为1KV–1V，优选为500V，频率的范围为1Hz–20KHz，优选为2KHz，循环次数的范围为1–100次，优选为6次，循环中超声输出时间为1s–60s，优选为5s，间隔时间的范围为1s–300s，优选为5s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中，通过常规的超滤、超速离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。
在本发明的一个实施方式中，通过高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)对人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的效率进行检测分析，最终获得人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的纳米药物递送体系。
本发明第六方面：
提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的应用，包括以下用途中的一种或几种：
A、作为制备预防妊娠纹、妊娠纹修复或妊娠纹治疗药物或化妆品的应用；
B、作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用；
C、作为制备治疗皮肤瘢痕、皮肤雀斑、祛痘、暗疮、痤疮等的药物或化妆品的应用。
在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗妊娠纹。将负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液涂抹在出现了妊娠纹的皮肤局部，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对妊娠纹的修复作用，结果表明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对于妊娠纹修复或妊娠纹治疗具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体预防妊娠纹。将负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液涂抹在孕妇腹部，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对妊娠纹的预防作用，结果表明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对于预防妊娠纹具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体逆转皮肤衰老。以衰老动物为实验模型，静脉注射或口服或皮肤涂抹负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的悬液，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对动物皮肤衰老的逆转效果，结果表明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对于抗皮肤衰老具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤瘢痕，将负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液涂抹在瘢痕局部或瘢痕内注射，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对瘢痕的去除作用，结果表明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤瘢痕具有较好效果。
在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤雀斑、祛痘。将负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液涂抹在出现了雀斑或痘痘的皮肤局部，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对治疗雀斑或祛痘的作用，结果表明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗雀斑或祛痘具有较好效果。
本发明第七方面：
提供基于所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射(如皮下注射、借助各种器械的皮下导入等)或喷雾等形式进行使用。
在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。
在本发明的一个实施方式中，含有负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的添加剂，可以制备多种制剂，如滴剂、软膏剂、乳剂、膜剂、涂抹剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂及贴剂等等；以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂，还可制备多种化妆品，如面膜、面霜、乳液、精华液、眼霜及原液等，用于皮肤美容抗衰老以及修复妊娠纹，用于祛痘及治疗雀斑等。
白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物，众多研究结果表明，白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护、保肝、神经系统保护、免疫调节、抗衰老等多种药理作用。也有研究结果确切表明白藜芦醇对于多种皮肤病具有一定的预防或治疗作用。白藜芦醇难溶于水，化学性质不稳定，易被氧化分解，口服后在体内迅速代谢，体内生物利用度低，制约了其广泛应用。脂质体及纳米乳等是白藜芦醇的剂型研究的热点。
外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移，清除衰老细胞等功能，且外泌体可通过粘膜屏障或皮肤屏障或血脑屏障直接进入组织细胞内。
本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为纳米载体既可以实现药物的有效递送，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的功能，起到更好的疾病治疗效果。在众多种类的干细胞中，多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)具有强大的增殖扩增能力，可以实现产业化生产以满足治疗需求。
本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以起到更好的疾病治疗效果。
附图说明
图1：人多能干细胞分泌的外泌体(ES-exo)粒径分布图。
图2：外泌体标志物鉴定。
图3：Res的HPLC标准定量曲线。
图4：ESC-Exos包裹Res的HPLC检测结果。
图5：ESC-Exos-Res对衰老皮肤结构的改善作用。
A为衰老小鼠皮肤切片HE染色(对照组)，B为经涂抹ESC-Exos-Res处理12W后的小鼠皮肤切片HE染色(实验组)，可见角质层明显比对照组薄，真皮层明显比对照组厚。
图6：ESC-Exos-Res可促进受损皮肤组织血管新生。
CD31免疫组织化学染色结果：A为对照组；B为经ESC-Exos-Res治疗4周后，显示新生微血管明显增多。
图7：ESC-Exos-Res可促进受损皮肤组织的胶原合成。
Masson染色结果：A为对照组，B为ESC-Exos-Res治疗4周后，显示胶原合成增加。
图8：小鼠皮肤组织学染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
人胚胎干细胞(ESCs)的培养和外泌体的提取与鉴定
在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将ESCs移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO2，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液ES-exo，分装保存至-80℃。
ES-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。
ES-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图1。
通过western blot检测ES-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。见图2。
实施例2
人诱导人多能干细胞(iPSCs)的培养和外泌体的提取与鉴定
在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将iPSC移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO2，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求以PBS定容至一定体积，得到外泌体悬液iPS-exo，分装保存至-80℃。
iPS-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。
iPS-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。
通过western blot检测iPS-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。
实施例3
人ESC来源外泌体(ESC-Exos)通过共孵育法包裹白藜芦醇(Res)
ESC-Exos溶液来自实施例1。
Res的定量标准曲线测定：准确称取1mg的Res粉末溶解于1mL的甲醇中，随后将该溶液用甲醇进行稀释，配置成50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL的Res的甲醇标准溶液，HPLC进样。色谱条件如下：
色谱柱：Zorbax Extend C-18，150*4.6μm，5–micro
流动相：甲醇：水＝95:5
流速：1mL/min
柱温：室温
检测波长：305nm
获得相应的实验结果后，将色谱峰的峰面积(PA)作为Res浓度(C，μg/mL)的函数作图(如附图3)，得到如下该色谱分离条件下Res的定量标准曲线：
PA＝38.42C+71.12，R2＝0.9991
白藜芦醇的包裹：配制1mg/mL的白藜芦醇(Res)的生理盐水溶液(pH＝4.0)，随后用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液pH至6左右。取ESC-Exos溶液100μL(浓度1.0*1012/mL)，向其中加入1mL的Res溶液。37℃孵育1h后，用5mL的生理盐水超滤洗涤溶液两次，留取200μL液体，得到负载Res的ESC-Exos溶液。随后，取50μL该溶液，利用200μL的乙腈进行稀释，12000rad/min下离心，除去蛋白沉淀，上清液在标准曲线的测定条件下，进行HPLC检测。检测结果附图4所示，Res的包裹浓度为35μg/mL。
实施例4：
人多能干细胞外泌体及载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)使衰老皮肤年轻化的研究
取6-8周龄的C57BL/6小鼠，于背部皮肤连续注射D-半乳糖(120mg/kg/d)6-8周诱导建立小鼠衰老模型。通过背部皮肤涂抹方式分别给予ESC-Exos和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)进行治疗。通过HE染色、masson染色、Van Gieson染色及免疫组织化学染色等方法观察老鼠皮肤结构的变化。结果如图5所示，发现衰老小鼠的真皮厚度变薄、真皮胶原纤维合成减少和弹性纤维变性，皮肤毛细血管数量明显减少，而经ESC-Exos和ESC-Exos-Res干预的小鼠皮肤结构明显改善，且以ESC-Exos-Res干预的效果最佳，说明负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在逆转皮肤衰老而使衰老皮肤年轻化方面功能更强大。
实施例5
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)修复妊娠纹
选择SD大鼠，利用皮肤扩张器模拟制备妊娠纹模型，妊娠纹样改变形成后一周开始在妊娠纹皮肤表面涂抹负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液，对照组涂抹生理盐水，每隔三天涂抹一次，分别于治疗前与治疗后每隔二周通过皮肤扫描仪和皮肤弹性检测仪对受损皮肤进行检测评估ESC-Exos及ESC-Exos-Res对妊娠纹的修复效果，一直观察12周；通过CD31免疫组织化学染色观察ESC-Exos及ESC-Exos-Res对妊娠纹样改变的皮肤组织血管新生的影响；通过Masson染色观察ESC-Exos及ESC-Exos-Res对妊娠纹样改变的皮肤组织胶原合成的影响。实验结果显示，经ESC-Exos及ESC-Exos-Res治疗的皮肤松弛度有明显改善，且以ESC-Exos-Res的改善效果最显著(P<0.05)，总弹性指数和塑形恢复指数均呈上升趋势，见附表1；ESC-Exos及ESC-Exos-Res干预的妊娠纹样改变的皮肤组织的CD31表达阳性细胞明显增多，而ESC-Exos-Res干预的CD31表达阳性细胞增多更明显，说明ESC-Exos及ESC-Exos-Res均可促进受损皮肤组织血管新生且以ESC-Exos-Res的作用最显著(见图6)。Masson染色结果显示，妊娠纹样改变的皮肤组织的胶原纤维明显变细疏松，而经ESC-Exos及ESC-Exos-Res干预的妊娠纹样改变的皮肤组织胶原纤维变密且增粗，且以ESC-Exos-Res干预的改变最明显(见图7)。具体数据如表1所示。以上实验结果表明，ESC-Exos及ESC-Exos-Res对妊娠纹样皮肤结构改变均具有明显的修复作用，且ESC-Exos-Res的作用更显著。
表1妊娠纹样皮肤质地参数变化 (均数±标准差)
实施例6
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)预防妊娠纹
选择SD大鼠，利用皮肤扩张器模拟制备妊娠纹模型，实验分三组进行，一组在皮肤扩张的同时涂抹人多能干细胞外泌体悬液，一组在皮肤扩张的同时涂抹负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体悬液，对照组涂抹生理盐水，每隔三天涂抹一次，一直观察到12周，皮肤取材，通过病理检测评估ESC-Exos及ESC-Exos-Res对妊娠纹发生的预防效果。病理检察结果显示，涂抹生理盐水的对照组皮肤真皮层明显变薄，胶原纤维明显变细疏松，而经ESC-Exos或ESC-Exos-Res干预的皮肤组织胶原纤维变密且增粗，经统计软件分析，ESC-Exos或ESC-Exos-Res干预的皮肤组织胶原纤维的面积明显大于对照组(P<0.05)。实验结果表明，ESC-Exos及ESC-Exos-Res具有预防妊娠纹发生发展的作用。
实施例7
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)防治皮肤瘢痕
选择7～8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、皮肤瘢痕模型组、ESC-Exos治疗组及ESC-Exos-Res治疗组，每组10只。瘢痕模型组、ESC-Exos治疗组及ESC-Exos-Res治疗组小鼠经背部皮下注射1ml浓度为1mg/ml的博来霉素(PBS溶解)，3小时后ESC-Exos治疗组及ESC-Exos-Res治疗组分别背部皮肤涂抹ESC-Exos 2×1010个和ESC-Exos-Res 2×1010个，模型组给予相同剂量的PBS，对照组于相同时间点分别皮下注射相同剂量PBS，各组均连续处理4周后处死，取皮肤组织经4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，用于病理组织学观察及免疫组织化学检测。
HE及Masson's Trichome染色显示：对照组皮肤组织结构完整，呈红染波纹状，胶原纤维较细，密集排列，纤维间和纤维周围可见部分成纤维细胞，无炎性细胞浸润；模型组表皮层上皮增厚明显，真皮层胶原沉积增加，胶原束增粗，排列不规则，脂肪层由结缔组织取代，并可见大量炎性细胞浸润；ESC-Exos治疗组及ESC-Exos-Res治疗组胶原排列与正常皮肤组织相似，部分脂肪层为结缔组织取代，可见少量炎性细胞(图8)。为评价各组纤维化的程度，对真皮厚度进行测量，结果显示模型组的真皮厚度(430.5±36.4μm)，显著高于ESC-Exos治疗组(291.1±16.8μm，P<0.05)和ESC-Exos-Res治疗组(280.1±13.5μm，P<0.05)。结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均可防治瘢痕形成，且ESC-Exos-Res对瘢痕改善效果更突出。
实施例8
人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)用于皮肤美容
将ESC-Exos或ESC-Exos--Res制备成精华液、面霜、面膜、乳液、眼霜等，用于皮肤保养、去除皱纹、祛斑、祛痘、修复瘢痕等。ESC-Exos可促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，产生丰富的胶原，发挥增加皮肤弹性、去皱、修复瘢痕和防止衰老等功效；ESC-Exos可防治色素细胞衰老，发挥祛斑及调节色素分泌失调等功效；ESC-Exos可抗炎及调节免疫，发挥祛痘及治疗痤疮等功效。ESC-Exos—Res将ESC-Exos与白藜芦醇的生物效应协同发挥，将进一步加强上述各种功效。
(1)选择30例痤疮志愿者患者，分成三组，进行治疗之前将面部清洁，热毛巾擦拭，A组使用阿达帕林凝胶治疗，每晚将阿达帕林凝胶涂抹在患处，连续使用4周；B组使用ESC-Exos治疗，每晚将ESC-Exos(2×1010个)涂抹在患处，连续使用4周；C组使用ESC-Exos治疗，每晚将ESC-Exos-Res(2×1010个)涂抹在患处，连续使用4周；按照皮肤痤疮治疗前后的有效率判定治疗效果，连续进行4周观察。
按照皮肤的损伤程度在治疗前后的变化来作为判定效的标准。前后皮损的减少率＝(治疗前皮疹数量-治疗后皮疹数量)/治疗前皮疹数×100％。痊愈:皮损减少率≥90％；显效:皮损减少率70％-89％；好转:皮损减少率是30％-69％；无效:皮损减少率≤30％。观察结果显示A、B、C三组的有效率分别是60.31％、81.24％、94.32％。表明应用ESC-Exos和ESC-Exos-Res治疗痤疮均有效果。
(2)选择30例雀斑志愿者患者，分成三组，进行治疗之前将面部清洁，热毛巾擦拭，A组使用三维肽素治疗，每晚将三维肽素涂抹在患处，连续使用3个月；B组使用ESC-Exos治疗，每晚将ESC-Exos(2×1010个)涂抹在患处，连续使用3个月；C组使用ESC-Exos治疗，每晚将ESC-Exos-Res(2×1010个)涂抹在患处，连续使用3个月；3个月后观察患处色素沉着的变化。结果显示A、B、C三组的有效率分别是30.11％、91.28％、95.37％。结果表明应用ESC-Exos和ESC-Exos-Res治疗雀斑均有明显效果。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人多能干细胞外泌体，其特征在于，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体，
所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：
采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述人多能干细胞外泌体，其特征在于，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。
3.负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体，其特征在于，包括如权利要求1所述人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。
4.根据权利要求3所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体，其特征在于，所述白藜芦醇的包裹浓度为5-100μg/mL。
5.如权利要求3所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。
6.根据权利要求3或5所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，通过超滤、离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。
7.如权利要求1所述人多能干细胞外泌体的应用，其特征在于，包括以下用途中的一种或几种：
A、作为制备预防妊娠纹、妊娠纹修复或妊娠纹治疗药物或化妆品的应用；
B、作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用；
C、作为制备治疗皮肤瘢痕、皮肤雀斑、祛痘、暗疮、痤疮等的药物或化妆品的应用。
8.基于权利要求1所述人多能干细胞外泌体的制剂，其特征在于，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由所述人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
9.如权利要求3所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的应用，其特征在于，包括以下用途中的一种或几种：
A、作为制备预防妊娠纹、妊娠纹修复或妊娠纹治疗药物或化妆品的应用；
B、作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用；
C、作为制备治疗皮肤瘢痕、皮肤雀斑、祛痘、暗疮、痤疮等的药物或化妆品的应用。
10.基于权利要求3所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制剂，其特征在于，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
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