CN110123795A - 负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗皮肤病用药物上的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人多能干细胞外泌体、负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法,和在制备治疗皮肤病用药物上的用途。与现有技术相比,本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体,可大大提高白藜芦醇的生物学效应,再结合人多能干细胞外泌体自身的功能,可以大大提高其在治疗白癜风、银屑病、牛皮癣、硬皮病等难治性皮肤疾病方面的效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域,尤其是涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗皮肤病用药物上的用途。
背景技术
外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡,其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括DNA、RNA、蛋白等进入效应细胞,有效调控机体细胞信号转导。研究表明,干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质,生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞,发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)与诱导人多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency),即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞,具有发育成多种组织的能力,参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency),即只能分化成为有限的几种细胞。因而ESCs和iPSCs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。ESCs或iPSCs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等,表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体,可以抑制细胞衰老过程,改变靶细胞表观遗传特征,使效应细胞逆转至低分化状态,从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体,也可以起到与组织干细胞类似的作用,如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。
外泌体是细胞分泌的天然纳米载体,外泌体作为药物的纳米载体得到了广泛的关注与研究。与人工合成的纳米载体相比,外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞,避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质,具有丰富的生理功能,可以提高药物的传递效率,实现药物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。外泌体自身携带的蛋白、基因等物质具有细胞调控能力,可以对特定的疾病起到治疗作用。
目前,多种细胞外泌体构建的纳米药物递送系统已经用于疾病治疗的探索。Wood课题组最先利用未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)来源的外泌体负载siRNA治疗阿尔兹海默症。iDC分泌的外泌体表面缺乏T细胞激活蛋白(例如MHC-I,MHC-II,CD86),具有免疫惰性。他们通过基因转染的方法,在外泌体表面蛋白Lamp2b上修饰乙酰胆碱受体识别多肽片段RVG,进而赋予iDC外泌体定位脑部神经细胞的能力;随后,利用电转的方法,将BACE-1的siRNA导入到iDC外泌体中,通过小鼠动物模型,验证了这些载药外泌体治疗阿尔兹海默症的潜力。然而,iDC细胞提取过程繁琐,细胞数量有限,成本高昂,难以产业化生产。同样,肿瘤细胞来源的外泌体也被用于药物递送系统的构建。虽然肿瘤细胞可以无限扩增,制备大量的外泌体,但是它们潜在的安全性风险限制其在临床的使用。最近,研究人员报道了利用牛奶来源外泌体构建的纳米药物递送系统。与细胞来源的外泌体相比,牛奶来源的外泌体提取简便、成本低,实现可以大规模制备满足临床需求。但是,由于牛奶外泌体中含有大量的非人源的基因与蛋白质等物质,其通过静脉全身注射的安全性仍有待进一步确认,而且该研究的重点主要集中于外泌体的药物载体功能,并没有充分发挥外泌体自身所携带的物质对疾病与损伤的治疗潜力。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其在制备治疗皮肤病用药物上的用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明第一方面:
提供人多能干细胞外泌体,所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。
在本发明的一个实施方式中,所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的:
采用无饲养层培养方法,在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs,收集培养基,收集纯化培养基中的外泌体,即为人多能干细胞外泌体。
在本发明的一个实施方式中,采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。
旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是:将一定容积的培养基于4℃400g离心10min,去除游离细胞,得到的上清移入另一管中,4℃15000g 20min,去除细胞碎片,获得的上清液倒入millipore超滤装置中,用PBS洗脱收集滤膜(100KD)上的浓缩液体,即再次加入PBS,经millipore超滤装置再次超滤,得到的浓缩液转移至30%蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3),4℃100800g离心210分钟,收集底部蔗糖/重水密度垫,加入两倍体积PBS,转移至可截留100KD分子的超滤细心管中,4℃3500g离心15min;PBS洗涤3次,最终按后续实验要求定容至一定体积,得到Exosomes悬液,分装保存至-80℃。
在本发明的一个实施方式中,无血清培养体系选择市售的型号为TeSRTM-E8TM或mTeSR1或mTeSR2的培养基。
在本发明的一个实施方式中,收集外泌体后,通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定,结果符合外泌体特征:直径范围50-150nm,透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构,其膜结构表面含有CD9,CD63等标志物。
本发明第二方面:
提供所述人多能干细胞外泌体的应用,作为制备皮肤病用药物的应用,所述皮肤病包括色素障碍性皮肤病、鳞屑性皮肤病、结节或斑块类皮肤病,所述色素障碍性皮肤病包括白斑、白癜风、色素沉着异常等,所述鳞屑性皮肤病包括银屑病、牛皮癣等,所述结节或斑块类皮肤病包括炎症性疾病、代谢性疾病、血管性疾病、皮肤及皮下组织新生物等。
在本发明的一个实施方式中,应用人多能干细胞外泌体治疗白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿、皮肤假性淋巴瘤、硬皮病、皮肤肥大细胞增生症、牛皮癣、特应性皮炎、扁平苔藓等皮肤疾病,结果表明人多能干细胞外泌体治疗白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿、皮肤假性淋巴瘤、硬皮病、皮肤肥大细胞增生症、牛皮癣、特应性皮炎、扁平苔藓等皮肤疾病具有较好的效果。
本发明第三方面:
提供基于所述人多能干细胞外泌体的制剂,所述制剂选择以下形式中的任一种:
A、悬浮剂:将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中,以悬浮剂的形式存在;
B、缓释外泌体的复合物:由人多能干细胞外泌体与载体结合形成缓释外泌体的复合物,所述载体包括各种水凝胶、生物膜、纳米结构的生物材料;
C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂:以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
在本发明的一个实施方式中,悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射,或直接在组织损伤部位注射或喷雾等形式进行使用。
在本发明的一个实施方式中,所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。
在本发明的一个实施方式中,含有人多能干细胞外泌体的添加剂,可以制备多种制剂,如滴剂、软膏剂、乳剂、膜剂、涂抹剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂及贴剂等等;以人多能干细胞外泌体作为添加剂,还可制备多种药用品,用于白癜风、银屑病等疑难皮肤疾病的治疗。
本发明第四方面:
提供负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体,包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。
在本发明的一个实施方式中,所述人多能干细胞外泌体为本发明第一方面所述外泌体。
在本发明的一个实施方式中,所述白藜芦醇的包裹浓度为20-100μg/mL。
本发明第五方面:
提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法,通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将一定剂量的白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。
在本发明的一个实施方式中,孵育的处理技术主要按以下方法进行:将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合,置于一定温度下孵育一定时间。随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中,利用生物相容性介质超滤洗涤三次,得到载药的外泌体。本方法中,外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL,优选为1×1010/mL;孵育温度的范围为4℃–50℃,优选为37℃;孵育时间范围为1h–48h,优选为4h;超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa,优选为100KDa;生物相容性介质为生理盐水,生理缓冲液,细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中,冻融的处理技术主要按以下方法进行:将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合,置于一定温度的冰箱中进行冷冻。随后解冻,再冷冻,如此循环一定次数。最后,将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中,利用生物相容性介质超滤洗涤三次,得到载药的外泌体。本方法中,外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL,优选为1×1010/mL;冷冻温度范围为-10℃--200℃,,优选为-80℃;循环次数为1–20次,优选为3次;超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa,优选为100KDa;生物相容性介质为生理盐水,生理缓冲液,细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中,电转的处理技术主要按以下方法进行:将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液和电转液混合,置于电转仪中,在一定条件下电转一定时间。随后,将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中,利用生物相容性介质超滤洗涤三次,得到载药的外泌体。本方法中,外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL,优选为1×1010/mL;电转液为KCl、K3PO4和OptiPrepTM细胞梯度离心液的混合溶液,其中KCl的浓度范围为1mM–1M,优选为25mM,K3PO4的浓度范围为0.01mM-1M,优选为1.15mM,OptiPrepTM细胞梯度离心液的体积分数范围为80%-0.1%,优选为21%;电转参数中电压的范围为10KV–0.1V,优选为400V,电容的范围为0.1–1000F,优选为150F;电转时间范围为0.1s–1min,优选为10s;超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa,优选为100KDa;生物相容性介质为生理盐水,生理缓冲液,细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中,超声的处理技术主要按以下方法进行:将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液混合,利用针式超声仪在一定条件下对上述混合溶液超声一定时间。随后,将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中,利用生物相容性介质超滤洗涤三次,得到载药的外泌体。本方法中,外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL,优选为1×1010/mL;超声条件中,电压的范围为1KV–1V,优选为500V,频率的范围为1Hz–20KHz,优选为2KHz,循环次数的范围为1–100次,优选为6次,循环中超声输出时间为1s–60s,优选为5s,间隔时间的范围为1s–300s,优选为5s;超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa,优选为100KDa;生物相容性介质为生理盐水,生理缓冲液,细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中,通过常规的超滤、超速离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。
在本发明的一个实施方式中,通过高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography,HPLC)对人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的效率进行检测分析,最终获得人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的纳米药物递送体系。
本发明第六方面:
提供负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为制备皮肤病用药物的应用,所述皮肤病包括色素障碍性皮肤病、鳞屑性皮肤病、结节或斑块类皮肤病,所述色素障碍性皮肤病包括白斑、白癜风、色素沉着异常等,所述鳞屑性皮肤病包括银屑病、牛皮癣等,所述结节或斑块类皮肤病包括炎症性疾病、代谢性疾病、血管性疾病、皮肤及皮下组织新生物等。
在本发明的一个实施方式中,应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿、皮肤假性淋巴瘤、皮肤肥大细胞增生症、牛皮癣、特应性皮炎、硬皮病、扁平苔藓等皮肤疾病,显现出明显的效果。
人多能干细胞外泌体与白藜芦醇双重功能的发挥,可以大大提高对白色素障碍性皮肤病(如白斑、白癜风、色素沉着异常等)、鳞屑性皮肤病(如银屑病、牛皮癣等)、结节或斑块类皮肤病(如炎症性疾病、代谢性疾病、血管性疾病、皮肤及皮下组织新生物等)等皮肤疾病的治疗效果,具有很好的转化应用前景。
本发明第七方面:
提供基于所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制剂,所述制剂选择以下形式中的任一种:
A、悬浮剂:将所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中,以悬浮剂的形式存在;
B、缓释外泌体的复合物:由所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体与载体结合形成缓释外泌体的复合物,所述载体包括各种水凝胶、生物膜、纳米结构的生物材料;
C、以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂:以所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
在本发明的一个实施方式中,悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射,或直接在组织损伤部位注射或喷雾等形式进行使用。
在本发明的一个实施方式中,所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。
在本发明的一个实施方式中,含有负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的添加剂,可以制备多种制剂,如滴剂、软膏剂、乳剂、膜剂、涂抹剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂及贴剂等等;以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂,还可制备多种药用品,用于白癜风、银屑病等疑难皮肤疾病的治疗。
白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物,众多研究结果表明,白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护、保肝、神经系统保护、免疫调节、抗衰老等多种药理作用。也有研究结果确切表明白藜芦醇对于多种皮肤病具有一定的预防或治疗作用。白藜芦醇难溶于水,化学性质不稳定,易被氧化分解,口服后在体内迅速代谢,体内生物利用度低,制约了其广泛应用。脂质体及纳米乳等是白藜芦醇的剂型研究的热点。
外泌体是细胞分泌的天然纳米载体,与人工合成的纳米载体相比,外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞,避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移,清除衰老细胞等功能,且外泌体可通过粘膜屏障或皮肤屏障或血脑屏障直接进入组织细胞内。
利用干细胞外泌体作为纳米载体既可以实现药物的有效递送,同时又可以充分发挥干细胞外泌体的功能,起到更好的疾病治疗效果。在众多种类的干细胞中,多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)具有强大的增殖扩增能力,可以实现产业化生产以满足治疗需求。
本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体,可大大提高白藜芦醇的生物学效应,再结合人多能干细胞外泌体自身的功能,可以大大提高其在治疗白癜风、银屑病、牛皮癣、硬皮病等难治性皮肤疾病方面的效果。
附图说明
图1:人多能干细胞分泌的外泌体(ESC-Exos)粒径分布图。
图2:外泌体标志物鉴定。
图3:Res的HPLC标准定量曲线。
图4:ESC-Exos包裹Res的HPLC检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1:
人胚胎干细胞(ESCs)的培养和外泌体的提取与鉴定
在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA),将ESCs移入该培养皿,加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada),在温箱内(37℃,5%CO2,饱和湿度)培养,收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟,去除细胞碎片;采用100KD分子量的超滤管,离心(3500g,15min)截留浓缩上清中的外泌体,得到外泌体浓缩液;将浓缩液转移至30%蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3),4℃100000g离心210分钟,收集底部5ml蔗糖/重水密度垫,加入PBS稀释,转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中,4℃3500g离心15min;PBS洗涤3次,最终按后续实验要求定容至一定体积,得到外泌体悬液ESC-Exos,分装保存至-80℃。
ESC-Exos的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上,将20μL样本滴加到铜网上,室温静置3分钟后,在铜网一侧用滤纸将液体吸去,滴加3%磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温,5分钟)。用滤纸吸去负染液,将铜网转移至透射电子显微镜下,观察外泌体形态。
ESC-Exos的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测,按照操作说明书调节仪器各项参数:将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方,调节Stretch至43cm,向加样孔内加入40μL PBS,使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS,加入40μL 1:100稀释的CPC100标准品(粒径70nm),测量粒子数和浓度,通过软件得到标准曲线。吸去标准品,PBS洗3次,加入40μL 1:1000稀释的待测样品,测定粒子数和浓度,重复测量3次。通过软件进行数据分析,得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm,见图1。
通过western blot检测ESC-Exos特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤:外泌体总蛋白提取,通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度,制胶配制10%的分离胶,电泳,转膜,封闭及抗体孵育,化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。见图2。
实施例2
人诱导人多能干细胞(iPSCs)的培养和外泌体的提取与鉴定
在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA),将iPSC移入该培养皿,加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada),在温箱内(37℃,5%CO2,饱和湿度)培养,收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟,去除细胞碎片;采用100KD分子量的超滤管,离心(3500g,15min)截留浓缩上清中的外泌体,得到外泌体浓缩液;将浓缩液转移至30%蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3),4℃100000g离心210分钟,收集底部5ml蔗糖/重水密度垫,加入PBS稀释,转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中,4℃3500g离心15min;PBS洗涤3次,最终按后续实验要求以PBS定容至一定体积,得到外泌体悬液iPS-exo,分装保存至-80℃。
iPS-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上,将20μL样本滴加到铜网上,室温静置3分钟后,在铜网一侧用滤纸将液体吸去,滴加3%磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温,5分钟)。用滤纸吸去负染液,将铜网转移至透射电子显微镜下,观察外泌体形态。
iPS-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测,按照操作说明书调节仪器各项参数:将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方,调节Stretch至43cm,向加样孔内加入40μL PBS,使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS,加入40μL 1:100稀释的CPC100标准品(粒径70nm),测量粒子数和浓度,通过软件得到标准曲线。吸去标准品,PBS洗3次,加入40μL 1:1000稀释的待测样品,测定粒子数和浓度,重复测量3次。通过软件进行数据分析,得出分析报告。
通过western blot检测iPS-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤:外泌体总蛋白提取,通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度,制胶配制10%的分离胶,电泳,转膜,封闭及抗体孵育,化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。
实施例3
人ESC来源外泌体(ESC-Exos)通过共孵育法包裹白藜芦醇(Res)
ESC-Exos溶液来自实施例1。
Res的定量标准曲线测定:准确称取1mg的Res粉末溶解于1mL的甲醇中,随后将该溶液用甲醇进行稀释,配置成50μg/mL,20μg/mL,10μg/mL的Res的甲醇标准溶液,HPLC进样。色谱条件如下:
色谱柱:Zorbax Extend C-18,150*4.6μm,5–micro
流动相:甲醇:水=95:5
流速:1mL/min
柱温:室温
检测波长:305nm
获得相应的实验结果后,将色谱峰的峰面积(PA)作为Res浓度(C,μg/mL)的函数作图(如附图3),得到如下该色谱分离条件下Res的定量标准曲线:
PA=38.42C+71.12,R2=0.9991
白藜芦醇的包裹:配制1mg/mL的白藜芦醇(Res)的生理盐水溶液(pH=4.0),随后用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液pH至6左右。取ESC-Exos溶液100μL(浓度1.0*1012/mL),向其中加入1mL的Res溶液。37℃孵育1h后,用5mL的生理盐水超滤洗涤溶液两次,留取200μL液体,得到负载Res的ESC-Exos溶液。随后,取50μL该溶液,利用200μL的乙腈进行稀释,12000rad/min下离心,除去蛋白沉淀,上清液在标准曲线的测定条件下,进行HPLC检测。检测结果附图4所示,Res的包裹浓度为5μg/mL。
实施例4
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗白癜风
白癜风是一种常见的皮肤黏膜色素脱失性疾病,好发于暴露及摩擦部位,影响患者的美观和人际交往,给患者带来较大的心理障碍。ESC-Exos具有调节免疫功能,促进细胞增殖迁移等功能,ESC-Exos-Res能更进一步加强这些功能,且外泌体易于通过皮肤屏障和粘膜屏障,能携载白藜芦醇进入组织细胞。
招募40例免疫失调白癜风患者随机分成3个实验组和对照组,每组各10例。实验组分别给予口服ESC-Exos-Res、ESC-Exos、Res,每天口服ESC-Exos-Res或ESC-Exos 2×1011个或0.25克Res,同时每天晚上于患处涂抹ESC-Exos-Res或ESC-Exos 2×1010个或Res悬液。对照组给予口服白癜风胶囊和涂抹0.1%他克莫司。3个月后通过观察皮损面积的变化和外周血液中T细胞亚群的变化来评价各组的疗效。观察结果显示,ESC-Exos-Res实验组总有效率为90%,对照组总有效率为50%,两组之间相比P<0.05,表明两组疗效有明显差异,ESC-Exos-Res实验组的疗效明显优于对照组,而且实验组治疗患者未见明显副作用;ESC-Exos实验组总有效率为78%,对照组总有效率为50%,两组之间相比P<0.05,表明两组疗效有明显差异,ESC-Exos实验组的疗效明显优于对照组,而且实验组治疗患者未见明显副作用;Res实验组总有效率为66%,对照组总有效率为50%,两组之间相比无统计学意义,表明两组疗效无明显差异。检测各实验组治疗前后外周血中T细胞亚群变化结果显示,治疗前CD3+的淋巴细胞数值与治疗后相比,P>0.05无统计学意义,表明治疗前后CD3+淋巴细胞水平无差异;治疗后ESC-Exos-Res、ESC-Exos实验组CD4+的淋巴细胞比值较治疗前明显升高,P<0.01有统计学意义,治疗后CD8+的比值较治疗前下降,P<0.01有统计学意义;治疗后CD4+/CD8+较治疗前升高,P<0.01有统计学意义。结果表明,ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗白癜风临床疗效确切,副作用少,且ESC-Exos-Res的疗效最佳。而单独使用白藜芦醇的疗效欠佳。ESC-Exos-Res和ESC-Exos对免疫失调白癜风患者免疫系统具有调节作用。
实施例5
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗硬皮病
招募40例局限性硬皮病患者采取随机的方法,分为3个治疗组和对照组,各组均为10例。治疗组分别给予口服ESC-Exos-Res、ESC-Exos、Res,每天口服ESC-Exos-Res或ESC-Exos 2×1011个或0.25克Res,对照组给予大黄蛰虫丸口服。4周为一个疗程,连续观察试验3个疗程。分别记录两组患者治疗前、治疗4周、治疗8周和治疗12周的皮损硬度积分,进行比较分析;记录两组患者治疗前后的生活质量情况,进行比较分析。观察结果显示,治疗4周时起,ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗组患者的皮损硬度积分与各自组内治疗前相比,均有显著性差异(P<0.05);治疗8周时起至治疗12周末,ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗组与对照组患者的皮损硬度积分相比较,存在显著性差异(P<0.01,P<0.05);治疗12周末时,ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗组与对照组患者的生活质量积分比较分析,存在显著性差异(P<0.05)。总结结果,ESC-Exos-Res治疗组的总有效率为96.59%,ESC-Exos治疗组的总有效率为83.57%,对照组的总有效率为63.78%,与对照组总有效率对比,具有显著性差异(P<0.05),而单纯用白藜芦醇治疗组未见明显疗效。结果表明,ESC-Exos-Res和ESC-Exos能够明显降低局限性硬皮病患者皮损硬度积分,以ESC-Exos-Res效果更佳;经ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗后,患者的生活质量改善明显,以ESC-Exos-Res效果更佳;ESC-Exos-Res和ESC-Exos治疗局限性硬皮病安全有效。
实施例6
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗特发性皮炎
特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种以炎症、癌痒为主的慢性、复发性皮肤病,常伴皮肤功能障碍及个人和(或)家族过敏性疾病史,如过敏性鼻炎及支气管哮喘等。患者往往有剧烈癌痒,严重影响其生活质量及身心健康。本实验将24只6周大的雄性BALB/c小鼠随机分为ESC-Exos-Res、ESC-Exos、Res 3个干预组和对照组(每组各6只),24只小鼠全部用二硝基氯苯经耳、背部皮肤致敏,以建立特应性皮炎小鼠模型。ESC-Exos-Res、ESC-Exos、Res干预组在开始建模时,同时予以含2×1011个ESC-Exos-Res或2×1011个ESC-Exos或0.5克Res生理盐水溶液每天灌胃,并测量小鼠耳厚度;生理盐水组(对照组)予以等量的生理盐水灌胃,并测量小鼠耳厚度。两周后处死小鼠并收集血样及背部皮损标本,用ELISA法检测小鼠血清总IgE水平;皮损标本进行石蜡切片HE染色和甲苯胺蓝染色,显微镜下观察皮肤表皮层角质形成细胞的改变与真皮层炎症细胞的浸润情况;提取皮损总RNA,RT-PCR法检测炎症因子IL-6、IFN-γ、IL-17的表达水平。结果:与生理盐水组相比,ESC-Exos-Res干预组小鼠耳厚度减小,表皮层角质形成细胞异常增生情况明显缓解,小鼠血清总IgE水平降低,肥大细胞数目减少,IL-6、IFN-γ、IL-17等相关细胞因子表达水平均下降。结果表明,ESC-Exos-Res和ESC-Exos可明显缓解二硝基氯苯诱导的特应性皮炎小鼠的症状,降低血清总IgE的水平、改善角质形成细胞异常增生以及肥大细胞的浸润,其可能通过下调Th17的分化以及抑制促炎因子IL-6、IFN-γ和IL-17的表达,而减轻炎症反应,且以ESC-Exos-Res效果最明显。单独用白藜芦醇治疗的疗效不显著。
实施例7
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗蕈样肉芽肿
蕈样肉芽肿是一种皮肤T细胞淋巴瘤,属于惰性肿瘤。本研究招募临床及病理及免疫病理诊断蕈样肉芽肿患者20例,诊断均经组织病理及免疫组织化学证实。组织病理均表现为真皮浅层密集淋巴样细胞浸润,部分病例细胞核呈脑回状;部分见亲表皮现象及Pautrier微脓肿;部分见淋巴细胞沿基底细胞呈线状排列;部分病例见到异形淋巴细胞。免疫组织化学表现为浸润淋巴细胞均强阳性表达CD3,不表达CD20,部分表达CD4和/或CD8,Ki67表达在5%左右。
通过ESC-Exos-Res或ESC-Exos每天口服结合局部涂抹对20例蕈样肉芽肿患者进行治疗,治疗周期为3-6个月。治疗结果显示,20例蕈样肉芽肿患者ESC-Exos-Res治愈8例,缓解2例;ESC-Exos治愈6例,缓解2例,无效2例。结果表明,ESC-Exos-Res和ESC-Exos对三期蕈样肉芽肿患者均安全、有效,以ESC-Exos-Res效果最突出。
实施例8
应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)和负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗银屑病
银屑病是一种复发率高、难以根治的慢性皮肤病,目前尚未见理想的治疗药物。本实验采用健康成年白化豚鼠造模,以5%心得安乳膏涂抹豚鼠耳部,一天3次,每次0.2mL/耳,连续8天造模,豚鼠耳部出现发热红肿,直至出现皮损视为银屑病皮损模型造模成功。将银屑病皮损模型豚鼠分ESC-Exos-Res治疗组、ESC-Exos治疗组和对照组。给药剂量为2×1011个ESC-Exos-Res或ESC-Exos/耳。给药一周左右,用10%水合氯醛(0.34mL/100g)对豚鼠腹腔麻醉,腹主动脉采血后,剪下豚鼠的双耳固定于10%福尔马林溶液,进行HE染色。在正置荧光显微镜下观察病理改变并拍照。随机选取5个视野,用Baker法对豚鼠的病理组织切片进行评分,根据Baker评分结果确定治疗效果。实验结果显示,与空白组相比,模型组棘层显著增厚且排列紊乱,颗粒层变薄,中性粒细胞浸润增多,Baker评分显著升高,显示造模成功;ESC-Exos-Res治疗组、ESC-Exos治疗组均有改善皮损的表现,与模型组相比均具有统计学意义,ESC-Exos-Res治疗组评分为(2.72±0.61),ESC-Exos治疗组评分为(3.53±0.61),对照组为(8.30±0.79)。说明ESC-Exos-Res治疗效果最好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.人多能干细胞外泌体作为制备治疗皮肤病用药物的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体,
所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的:
采用无饲养层培养方法,在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs,收集培养基,收集纯化培养基中的外泌体,即为人多能干细胞外泌体。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。
4.负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为制备治疗皮肤病用药物的应用。
5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体包括:人多能干细胞外泌体,及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述白藜芦醇的包裹浓度为5-100μg/mL。
7.根据权利要求5所述应用,其特征在于,通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。
8.根据权利要求5所述应用,其特征在于,通过超滤、离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。
9.如权利要求1或4所述应用,其特征在于,所述皮肤病包括色素障碍性皮肤病、鳞屑性皮肤病、结节或斑块类皮肤病,
所述色素障碍性皮肤病包括白斑、白癜风、色素沉着异常,
所述鳞屑性皮肤病包括银屑病、牛皮癣,
所述结节或斑块类皮肤病包括炎症性疾病、代谢性疾病、血管性疾病、皮肤及皮下组织新生物。
10.如权利要求1或4所述应用,其特征在于,制剂选择以下形式中的任一种:
A、悬浮剂:将所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中,以悬浮剂的形式存在;
B、缓释外泌体的复合物:由所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体与载体结合形成缓释外泌体的复合物,所述载体包括各种水凝胶、生物膜、纳米结构的生物材料;
C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂:以所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。
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