CN102000045A - 白藜芦醇在制备防治辐射诱导色素脱失性皮肤病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白藜芦醇在制备治疗或预防辐射诱导毛发色素脱失性皮肤病药物中的应用。它是利用白藜芦醇对辐射诱导IRM-2小鼠白癜风模型进行治疗，建立了一种治疗电离辐射诱导白癜风发生、发展的途径。对6Gy照射30天后的小鼠经口给药15天，结果用药组与对照组比较脱色抑制率达到了40％，效果显著。病理检测结果表明，白藜芦醇用药组小鼠病变部位毛囊分布更为密集，黑色素分布明显多于照射组和正常组。并且白藜芦醇用药组小鼠的外周血白细胞计数、股骨有核细胞计数、CFU-S和CFU-GM等免疫指标略高于照射组，说明白藜芦醇对受照小鼠造血及免疫功能具有一定的保护作用。各项结果表明白藜芦醇对辐射诱导小鼠白癜风发生发展具有积极的防治作用。

Description

白藜芦醇在制备防治辐射诱导色素脱失性皮肤病药物中的应用

技术领域

本发明属于中药材应用技术领域，涉及白藜芦醇在防治辐射诱导色素脱失性皮肤病药物中的应用，更具体的说是白藜芦醇在防治辐射诱导小鼠毛发脱色的发生发展中的应用。

背景技术

白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种生物活性很强的天然多酚类物质，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。白藜芦醇广泛存在于种子植物中，在传统中药藜芦和虎杖中含量丰富，其化学名为3，4，′5-三羟基-反-二苯乙烯(3，4，′5-trihydroxysitlbene)，具有顺式及反式两种结构，反式具有生物学活性。已有药理研究表明，它具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗突变、抗氧化、抗菌抗炎、保肝、诱导细胞凋亡及雌激素调节等生物药理活性。其中的抗炎、抗氧化、调节血脂、诱导肿瘤细胞凋亡和调节细胞周期等作用，引起了人们广泛的关注。近期有研究发现，白藜芦醇可以降低阿司匹林致小鼠损伤模型组小鼠血清中MDA含量，并使SOD含量升高，进一步肯定了其对自由基引起的过氧化损伤的防护作用。但关于白藜芦醇在制备治疗辐射诱导色素脱失性皮肤病(特别是白癜风)药物中的应用未见文献报道。

辐射损伤有射线的直接损伤，也有通过电离产生大量自由基的间接作用。在6Gy照射剂量下，IRM-2小鼠脱色发生早、病损面积广，并且脱色部位皮肤真皮组织有不同程度的毛细血管增生充血，是研究辐射导致皮肤脱色良好的实验动物模型。并且辐射诱导IRM-2小鼠毛发脱色改变，与白癜风后天形成，局限性色素脱失和在进展期色素脱失移行发展较快的临床表现极为相似。

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，临床表现为局部皮肤白斑，一旦发病，治愈率低且易迁延进展，给患者造成很大的身心压力。白癜风生化异常主要表现在两个方面：1)血尿中儿茶酚胺及其代谢产物升高；2)抗氧化系统失调，表皮内高水平的过氧化氢。高水平的过氧化氢使酪氨酸及其他单酚类发生羟化反应生成相应的儿茶酚类，进一步氧化成为苯醌。苯醌的长时间堆积后可作用于酪氨酸酶使后者形成半抗原，从而激发免疫反应。自由基的过氧化作用及抗氧化系统失调，成为主要致病因素之一。

发明内容

本发明目的是利用已有的药物白藜芦醇，治疗辐射诱导IRM-2小鼠的毛发色素脱失，并用于白癜风等色素脱失性疾病的治疗及发病机制的研究；用于了解白藜芦醇对辐射诱导小鼠免疫功能紊乱和色素调节功能紊乱的作用。

为此，本发明公开了白藜芦醇在制备治疗或预防辐射诱导毛发色素脱失性皮肤病药物中的应用。特别是白藜芦醇在制备治疗或预防辐射诱导白癜风皮肤病药物中的应用。

本发明所述的辐射诱导包括：辐射引起的免疫功能紊乱及色素调节功能紊乱。

本发明所述的应用，其中的应用包括电离或非电离辐射诱导，自发或化学试剂引起的色素脱失。

本发明更进一步公开了含有白藜芦醇与其它维生素类营养物质组合：维生素A、维生素D、维生素E、维生素B1、维生素B6、维生素B3、对氨基苯甲酸、叶酸、泛酸等。

本发明进一步公开了含有白藜芦醇的药物组合物，它是将治疗有效量的白藜芦醇与药学上可应用于放射性皮炎治疗的药物混合制成组合物。中药雷公藤：具有抗炎、免疫抑制、免疫调节、抗肿瘤、抗菌活血化瘀等作用，可用于日光性皮炎的治疗。糖皮质激素类药：作用1、免疫抑制和抗过敏作用；2、抗炎作用；3、抗毒素作用；4、抗休克作用；5、抗核分裂作用。此外还可影响糖、蛋白质、脂肪的代谢，影响水和电解质代谢，影响血细胞的生成，提高中枢神经的兴奋性，增加胃酸及胃蛋白的分泌等。可用于治疗急性放射性皮炎。

皮肤病的性质和病期是选方用药的首要依据。进行期、稳定期、退行期选方用药应有不同。此外药物的治疗效果，除药理作用外，剂型的物理作用亦有重要影响。

本发明进一步公开了白藜芦醇可与常用药用辅料混合制成各种制剂。特别是口服制剂。

一般的，本发明提供的各种制剂包括：经口给药，但也可以其他形式如皮下、肌肉、静脉内、皮内、鞘内和硬脑膜外给药。适合口服的形式可为：片剂或胶囊；粉剂或颗粒剂。可接受的口服固体制剂有：普通片剂、分散片、缓控释、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂等等；口服液体制剂有口服液、乳剂；注射剂有：小水针、输液、冻干粉针等等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与白藜芦醇混合，当白藜芦醇用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。

本发明所述的药用辅料包括：稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)、粘合剂(淀粉、微晶纤维素)、崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)、润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)、湿润剂(如丙二醇、乙醇)、稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。

本发明提供的白藜芦醇治疗或预防辐射诱导毛发脱色的治疗方法，包括以下步骤：

1)实验动物选择本单位自主培育的纯系小鼠IRM-2，具有在全身照射下易于出现毛发色素脱失的特性；

2)给药方法单次全身照射30天后开始口服给药，白藜芦醇20mg/kg/次，用吐温-80助溶，对照组给吐温生理盐水溶液，连续给药15天；

3)给药后观察并记录各组脱色的发生率、发生时间、发病的严重程度，及脱色分值；

4)免疫学改变：外周血细胞分类计数、股骨有核细胞计数、脏器指数等。

5)常规病理及电镜检测；包括形态学检查、毛囊个数、黑色素含量等。

6)数据分析。

本发明所述的选择纯系IRM-2小鼠分组是指，将IRM-2小鼠分为三组，雌雄兼有，每组9只，分为正常组、照射组、白藜芦醇+照射组(以下称白藜芦醇组)，照射组及白藜芦醇组接受¹³⁷Csγ射线全身一次性全身照射，照射剂量为6.0Gy，剂量率为0.76Gy/min。30天后白藜芦醇组开始给药，并定时观察皮肤脱色情况，做积分记录。

本发明所述的给药方法及白癜风模型构建方法是采用前述公开的方法获得。

本发明进一步公开了白藜芦醇对于辐射诱导IRM-2小鼠白癜风的治疗作用，包括：白藜芦醇对于辐射诱导IRM-2小鼠毛发色素脱失的发生、发展机制的研究；用于辐射引起的皮肤损伤机制的研究；用于因外伤引起的皮肤溃破的治疗作用研究；用于不明原因引起的脱发的治疗作用研究；用于辐射引起的免疫功能紊乱及色素调节功能紊乱机制的研究。

本发明所制备的药物与临床常用药物相比所具有的积极效果在于：

1)口服连续给药15天，无明显的毒副作用；

2)白藜芦醇组与照射组小鼠比较，毛发脱色的发生率低、发生时间晚、发生脱色的面积小；

3)病理改变：白藜芦醇组与照射组比较，病变部位毛囊分布更为密集，色素颗粒分布显著增加。

实验结果证明：本发明所建立的白藜芦醇对辐射诱导的小鼠毛发色素脱失的治疗作用，对于临床白癜风和色素脱失性疾病的治疗具有明确的指导意义。同时，本发明也有助于揭示辐射诱导毛发色素脱失发生、发展的机制。

附图说明：

图1为白藜芦醇对辐射诱导IRM-2小鼠毛发脱色阳性率的结果；

图2为白藜芦醇对辐射诱导小鼠毛发脱色分值的结果；

图3为白藜芦醇对辐射后脱色小鼠单侧股骨细胞计数的结果；

图4为各组小鼠骨髓细胞集落形成率(CFU-GM)的结果：其中Ctr为健康鼠，IR为照射组，IR+Res为照射后口服白藜芦醇组；

图5为各组小鼠皮肤镜下计数毛囊个数；

图6为各组小鼠皮肤HE染色结果：其中1为正常组照射组，2为照射组，3为白藜芦醇组。

具体实施方式

下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明，其中白藜芦醇有市售，实验中所用其它原料均有市售。

实施例1：

实验目的

观察应用白藜芦醇药物对辐射诱导IRM-2小鼠毛发脱色的治疗效果。

实验材料

1、实验动物IRM-2小鼠，来自中国医学科学院放射医学研究所，合格证号：SCXK(津)：2005-0001

2、试剂白藜芦醇由中国医学科学院药物研究所提供：购自浙江一新制药股份有限公司，含量为98％，批号20060718，用前用吐温80稀释。

3、实验仪器¹³⁷Csγ射线照射源：加拿大原子能有限公司，USD型，Autocell 140。显微镜OLYMPUS BX51、全自动血液分析仪sysmex poch-100i。

实验方法

4、实验分组及照射

本实验将小鼠分为正常组、照射组、照射+白藜芦醇组；每组9只，雌雄兼有，22-26g(6-8w)，共27只。照射处理：小鼠1次性全身照射，照射剂量为6Gy，于照射后30天开始给药并进行脱色观察。

5、试剂配制：白藜芦醇为白色粉末，用吐温-80助溶，于给药前30分钟用生理盐水配制。口服给药，对照组给等体积生理盐水+吐温-80溶液；给药剂量为20mg/kg。1次/日，连续15天。隔日1次软料，每周称体重两次。

6、脱色评价：小鼠毛发脱色评分标准：0分毛发无脱色；1分毛发有脱色；2分毛发脱色面积＞10％；3分毛发脱色面积＞25％；4分毛发脱色面积＞50％；5分毛发脱色面积＞75％。

7、观察指标连续给药15天后，拟进行以下指标检测。

8、观察小鼠毛发脱色变化程度，并记录分值；

9、观察外周血白细胞和红细胞计数以及外周血白细胞分类(中性粒细胞及淋巴细胞比例)。

10、股骨有核细胞计数：无菌取小鼠股骨，冲洗骨髓细胞，混匀后过滤，计数细胞，计数结果以每根股骨有核细胞数表示。

11、小鼠骨髓细胞集落形成率(CFU-GM)实验：无菌冲取小鼠单侧股骨，甲基纤维素培养基(

GF M3534)培养，第5天时在倒置显微镜下观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落。

12、病理取材：小鼠处死后，尽快剪取病变部位皮肤，中性福尔马林固定液固定，常规病理检测。

13、小鼠毛囊数量的统计，计数20倍镜下50个视野毛囊个数，求平均值。

实验结果

14、白藜芦醇组与照射组小鼠毛发脱色阳性率比较。

结果发现：第1天给药(照射后30天)，白藜芦醇组及照射组阳性率均为12.5％，脱色分值各1分；第5天给药(照射后34天)，白藜芦醇组阳性率为50％，照射组为75％；脱色分值白藜芦醇组4分，照射组8分。白藜芦醇组脱色阳性率和脱色分值均低于照射组。第9天给药(照射后38天)，白藜芦醇组阳性率为50％，照射组为100％；脱色分值白藜芦醇组6分，照射组13分；效果显著。停药后4天(照射后49天)白藜芦醇组阳性率均为62.5％，照射组为100％；脱色分值白藜芦醇组10分，照射组25分，实验结果见表1及附图1、附图2。

这一结果充分说明白藜芦醇不仅能够抑制辐照后小鼠毛发脱色的发生，而且能够延缓毛发脱色损伤的进一步发展。

表1白藜芦醇对IRM-2小鼠受照30天后不同时间毛发脱色阳性率结果：

15、白藜芦醇对小鼠免疫功能的影响。白藜芦醇组的股骨有核细胞数、脾脏指数及CFU-S均高于照射组，但无统计学意义，说明白藜芦醇对受照小鼠的免疫功能有一定的保护作用，结果见表2，(见附图3)。

表2白藜芦醇对小鼠免疫功能的影响

16、白藜芦醇对小鼠造血功能的影响。白藜芦醇组的白细胞数及淋巴细胞均高于照射组，但差异无统计学意义。说明白藜芦醇对受照小鼠造血系统的损伤有一定的保护作用，结果见表3。

表3白藜芦醇对小鼠外周血细胞数的影响

组别：	白细胞×103/ml	红细胞×100/ml	淋巴细胞％	嗜中性细胞％
					正常组	7.80±1.70	8.80±0.41	85.00±2.10	15±2.10

照射组	5.40±1.54	8.64±0.49	74.20±9.90	2440±9.15
					白藜芦醇组	5.49±1.84	8.51±0.69	81.60±12.20	18.40±12.20

17、白藜芦醇对小鼠骨髓细胞集落形成率(CFU-GM)的影响。结果显示，正常组、照射组和白藜芦醇组的集落形成率分别为137.7±20.08、105.2±10.65和121.0±8.72。白藜芦醇组显著高于照射组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明白藜芦醇对小鼠造血功能具有保护作用，(见附图4)。

18、白藜芦醇对小鼠毛囊数量的影响。毛发的生长周期一般可分为生长期、退行期和休止期。在生长期毛囊和毛发活跃生长，而在退行期退化，到休止期毛囊萎缩，毛易脱落。对IRM-2小鼠正常、照射和白藜芦醇组皮肤病理镜下观察，可见处于生长期的毛囊个数有明显差异。白藜芦醇组、照射组和正常组分别为52.2±7.5、32.4±6.3和29.4±2.3。结果显示：白藜芦醇组毛囊数显著高于照射组及正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)，(见附图5、6)。

综上所述，白藜芦醇对辐射诱导IRM-2小鼠的毛发脱色有明显的抑制作用。其发现为临床白癜风等色素脱失性疾病提供了新的、抗氧化损伤的治疗途径，同时也为色素脱失病因学的发展提供了参考。

实施例2

白藜芦醇20g，微晶纤维素80g，乳糖283g，交联羧甲基纤维素钠24g，3％羟丙基纤维素水溶液适量，硬脂酸镁4g常规制片，制成1000片。

实施例3

胶囊剂的制备：白藜芦醇60g，加糊精200g，乳糖370g，用70％乙醇制粒，干燥，装胶囊，制成胶囊剂1000粒。

Claims (6)

1.白藜芦醇在制备治疗或预防辐射诱导毛发色素脱失性皮肤病药物中的应用。

2.白藜芦醇在制备治疗或预防辐射诱导白癜风皮肤病药物中的应用。

3.权利要求1所述的应用，其中的辐射诱导包括：辐射引起的免疫功能紊乱及色素调节功能紊乱。

4.权利要求1所述的应用，其中的应用包括电离或非电离辐射诱导，自发或化学试剂引起的色素脱失。

5.权利要求1所述的应用，其特征在于白藜芦醇与药用辅料混合制成各种制剂。

6.权利要求4所述的应用，其特征在于白藜芦醇与药用辅料混合制成口服制剂。

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