CN115737557B - 一种miR-55制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明要求保护载miR‑55制剂及其在抑制非酒精性脂肪性肝纤维化中的应用。通过调整各组分之间的配比，制备出粒径、电位及包封率优良的载miR‑55纳米乳和载miR‑55阳离子脂质体纳米粒，并证明其能够在体内体外抑制非酒精性脂肪性肝纤维化。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，涉及一种miR-55制剂及其制备方法，以及所述miR-55制剂在抑制非酒精性脂肪性肝纤维化中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是常见的慢性肝病之一，该病是指除酒精这一主要致病因素外，肝组织脂质代谢异常引起的脂肪异常堆积的综合性病症。NAFLD作为一个进展性疾病，主要包括三个主要病理阶段：非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及非酒精性脂肪性肝纤维化和肝细胞癌。由于该病与体内脂质代谢紊乱密切相关，因此随着肥胖症、糖尿病等代谢紊乱病症发病率的升高，NAFLD发病率也持续增高。肝纤维化作为NAFLD的发展过程中的关键阶段，主要表现为肝脏损伤，肝组织纤维样变，终末期会发展为肝硬化甚至原发性肝癌，因此肝纤维化的发展与慢性肝病发病率、死亡率的关系最为密切。如果能够在早期对非酒精性脂肪性肝纤维化进行诊断及干预，可以在缓解本病临床表现的同时，逆转纤维化向慢性肝病晚期发展。
根据传统中医学病因病机理论，非酒精性脂肪性肝纤维化并没有与之相对应的中医病名，根据NAFLD临床表现故将其归为“胁痛”“肝癖”“肥气”等。中医治疗NAFLD具有多层次，多靶点的优势，能够根据患者个人体质、整体状态、疾病进展灵活辩证，适当配伍，结合调整饮食结构，恢复人体内在阴阳平衡状态，实现中医理论中阴平阳秘的内在环境，最终达到在产生最少副作用的同时，达到治疗NAFLD的目的。
膈下逐瘀汤是清代医家王清任创立的名方，本方擅长疏肝行气止痛，配伍严谨，方中诸药均对机体紊乱的气血做以调理，尤擅活化肝脏所在的膈下瘀血，因此对以气滞血瘀为病机的非酒精性脂肪性肝纤维化具有较好的临床疗效。
成熟的microRNA（miRNA）长度约为18-24个核苷酸，通过破坏mRNA稳定性或阻止mRNA翻译来沉默基因表达，与mRNA和沉默基因中的互补序列互补参与生理活动，超过60%的人蛋白质编码基因受miRNA调控，因此人体生理活动与miRNA密切相关。若miRNA核苷酸序列与mRNA靶标中的序列不能完全互补，会导致mRNA翻译受阻，抑制miRNA或mRNA 降解，因此miRNA能够参与广泛生理活动。研究发现，miRNA除了可以内源性合成外，还可以从外界摄入获得，且外源性的miRNA在进入人体之后能够发挥跨界调控宿主生理功能的作用。
2012年，外源性miRNA首次被证实存在于人和小鼠血液中。张辰宇（Zhang L 等，2012）等发现外源植物miRNAs在人血清中长期存在，测序结果显示在我国健康受试者中发现了约30个已知的植物miRNA，其中MIR156a和MIR168a显示出相当高的表达水平，进一步的体外内研究表明，食源性外源植物MIR168a可以通过小鼠胃肠道进入循环和各种器官，特别是肝脏。小鼠在被喂饲富含miR168a大米后，血清中miR168a表达升高，提示植物miRNA能被吸收进入血循环。
Huang（Huang H 等，2017）等人通过改进后的植物miRNA检测方法，在玉米及大豆中检测到大量miR156a、miR164a和miR167a，通过qRT-PCR检测哺乳动物循环吸收外源性膳食miRNA情况，对饲喂玉米和大豆的C57BL/6小鼠的血浆、肝脏和粪便样本进行分析，结果表明依旧可以检测到植物miRNA。Liu（Liu Y C 等，2017）等人从410份人类血浆miRNA测序数据中鉴定出丰富的植物miRNAs序列，其中相对含量较高的是外源植物性miR2910，该miRNA是水果和蔬菜中特有的miRNA，此外该miRNA与has-miR-4259和has-miR-4715-5p具有相同的6mer和7mer-A1靶标种子序列，提示相同的靶标种子序列可能是外源性miRNA能稳定存在于人体内的前提。
Wang等（Wang Y，2019）认为miRNAs 可能是人参的生物活性化合物，通过制备新鲜人参，提取miRNA并进行测序，Illumina高通量检测水煎剂中miRNA，共鉴定出43个miRNA。通过PCR验证9个高表达miRNAs，Illumina测序结果和PCR检测结果一致。结果表明，在高温煮沸后，人参水煎剂中miRNAs的稳定存在。此外天麻、金银花等中药及其水煎剂均可检测到miRNAs，证实植物来源的miRNA在煎煮过程中具有较高的稳定性。
细胞外的miRNA富集在外泌体中，而外泌体可以起到保护miRNA的作用，使miRNA保持稳定。本发明模拟外泌体的作用制备载miR-55纳米乳和载miR-55脂质体，对最佳工艺制成的纳米乳、阳离子脂质体的电位、粒径、包封率和形态等表征进行优化，并用于体内和体外实验。
发明内容
本发明旨在对载miR-55纳米乳和载miR-55脂质体的制备工艺进行优化，并研究其在体内体外抑制非酒精性脂肪性肝纤维化的功能。
膈下逐瘀汤深度测序
Illumina平台进行miRNA测序的核心步骤是固相桥式扩增反应(solid-phasebridge amplification) 和SBS:先在提取的miRNA两端加上特定的RNA接头，经反转录生成cDNA;将cDNA注入表面耦联有大量固定接头的微流池中并在固相表面进行桥式扩增反应，同一个cDNA模板经扩增最多可形成1000个相同的cDNA并排列成簇。SBS基于碱基3'端可逆性的封闭原理，测序时加入带有特定荧光生色团且3'端被化学基团封闭的A、T、G、C 4种脱氧核糖核酸、与接头互补的引物和DNA聚合酶进行单链延伸反应，反应结束后，将游离碱基洗去，用对应4种不同荧光生色团的激光进行激发并用电荷耦合器件( charge coupleddevice, CCD)装置记录不同发射波长的荧光信号，根据不同的荧光信号识别这一轮反应在每个cDNA簇上的相应碱基。第一轮拍照结束后，用化学方法将碱基上携带的荧光基团和3'端的封闭基团去除，同上进行第二轮测序反应。如上重复进行30～36个反应循环，可测得不同cDNA簇上相应长度的核酸序列。
细胞外囊泡是蛋白质、mRNA、miRNA和脂质运输来完成细胞间通讯通路的重要媒介，根据它们的大小和发生分为三类，包括外泌体、微泡和凋亡小体。其中，外泌体（exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30-150 nm，内含有特定的蛋白质、脂质、细胞因子或遗传物质。能进行运输功能性蛋白质、mRNA、microRNA等物质。外泌体的存在，就像是细胞之间的“快递小王子”，在人体的新陈代谢中进行细胞间信息物质交流。来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，而且还包含其行使功能的关键分子。已有大量研究显示，细胞外miRNA富集在exosome中，且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性，本发明先对膈下逐瘀汤煎煮液中的外泌体进行提取，然后对外泌体中的小RNA进行Illumina深度测序。发明人发现，膈下逐瘀汤中可以提取到大量且质量较好的外泌体，为后续小RNA的测序奠定基础。
在传统中医中，草药通常要煮几个小时才能煮成汤剂。人们普遍认为RNA会在这个过程中被破坏。然而发明专利（CN113908170A）公开了金银花编码的非典型microRNA2911可以直接靶向甲型流感病毒，证明了miR2911能在煮沸的金银花中稳定存在且能发挥抗病毒的药效作用。本发明以膈下逐瘀汤为研究对象进一步证明了，虽然膈下逐瘀汤中的miRNAs在煮沸过程中会有不同程度的降解。然而，一种特殊的miRNA，miR-55，在最后的膈下逐瘀汤剂中被发现基本完整。
载miR-55纳米乳及载miR-55阳离子脂质体的制备工艺
口服给药是一种有吸引力的给药途径，在成本效益、给药便利性和患者依从性方面被认为是最有利的。由于胃肠道的高吸附表面积，该途径有可能提供药物的快速全身分布。基于RNAi药物的口服给药为治疗胃肠道局部发生的疾病(如炎症性肠病)和对抗全身病理状况提供了巨大的潜力。然而，这种给药方式存在相当大的障碍：暴露于胃肠道中高度活跃的酶促环境、极端的酸碱度条件和粘膜上皮屏障的存在是口服递送RNAi治疗剂的主要挑战，壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的衍生物，是第二丰富的天然高分子。它存在于昆虫、甲壳类动物和真菌的外骨骼中。壳聚糖在药物制剂中的应用是一个相对较新的发展，壳聚糖具有广泛的可用性、无毒性、生物相容性、可生物降解性。n-(2-羟基-3-三甲基铵)丙基)壳聚糖氯化物(HTCC)，是壳聚糖一种部分季铵化的衍生物，具有良好的粘附和促渗作用，被认为是开发口服给药系统的良好材料。在本发明中，发明人首先制备了HTCC纳米颗粒(HNP)用于口服递送miR-55。HTCC季铵化基团提供的多孔结构和正电荷将有助于miRNA的成功封装。
脂质体具有缓释作用，可以降低药物毒性并且可以提高药物的稳定性，同时对脂质体进行化学修饰可以使其具有靶向性。阳离子脂质体因其带正电，与带负电的细胞膜具有较强的亲和力，有利于细胞摄取阳离子脂质体，是基因治疗中常用的非病毒载体。
在实验过程中，由于 miRNA 半衰期短，易被酶降解，因此在配置HTCC和脂质体时需注意将所用的器材都经过 0.1% DEPC 水完全浸泡 24 小时以上除去酶原，高温高压灭菌后才可使用，配制所用的溶液，也需用 DEPC 处理过的水，防止器材和溶液中的酶导致miRNA 降解。
本发明采用电荷自组装原理，使带正电的HTCC/阳离子脂质体与带负电的 miRAN通过电荷的作用结合在一起，阳离子脂质体选择透明质酸与 miRNA 形成带负电的轭合物再与带正电的鱼精蛋白通过电荷的相互作用自组装形成复合物。
纳米给药系统作用于肝纤维化细胞的体外研究
LX2细胞是在研究中药抗肝纤维化中常用的人源细胞系，常用于肝纤维化的体外实验。本章对肝纤维化LX2细胞进行体外培养，考察载 miR-55 纳米乳对肝纤维化LX2细胞的体外抑制效果。
以四甲基偶氮唑盐（MTT）为基础的MTT 比色法，是检测细胞存活率和增殖情况的一种常用的方法。MTT 为黄色，能与氢原子结合，在存活细胞的线粒体中存在的琥珀酸脱氢酶，可以使 MTT 的四唑环开裂，生成蓝色的甲瓒结晶。甲瓒结晶的生成量与琥珀酸脱氢酶成正比，在死亡细胞中不存在琥珀酸脱氢酶，从而不能生成甲瓒结晶。DMSO 可以溶解甲瓒结晶生成蓝色溶液，使用酶联免疫吸附测定法测量490nm 处的吸光度 OD 值。可以反映出活细胞的数量比，进而计算出细胞的存活率。为了研究膈下逐瘀汤中提取出来的拷贝数量最多的miR-55对LX2细胞活性的影响，本发明采用 MTT 法检测不同浓度的载 miR-55 纳米乳作用 24、48 后 LX2细胞增殖的情况。结果显示，载 miR-55 纳米乳对 LX2 细胞的增殖具有明显的抑制作用。在时间相同的情况下，随着载 miR-55纳米乳浓度的升高，对 LX2 细胞的增殖抑制率逐渐增加，且呈现剂量依赖性；在浓度相同的情况下，随着作用时间的延长，抑制率也明显升高，且呈现时间依赖性。所以，推测载 miR-55纳米乳对肝纤维化细胞的增殖具有抑制作用。
肝纤维化指的是慢性肝脏疾病发展的过程中，肝细胞被反复破坏后再生，是肝脏对慢性损伤的病理性修复反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病后的重要环节，肝纤维化进一步发展，可引起肝脏的结构紊乱，肝细胞结节样再生，形成假小叶结构，即肝硬化。肝纤维化在组织学上是可逆的，如果在此期间给与积极治疗，仍可逆转。否则，肝纤维化进展至肝硬化阶段，甚至发展成肝癌将不可逆转。本发明采用细胞划痕法来检测载 miR-55纳米乳对 LX2 细胞迁移能力的影响。实验结果显示，在给药 12小时后，对照组划痕明显减小，细胞逐渐覆盖划痕间隙。给药组依然有明显划痕；在给药24h后，对照组划痕基本消失，细胞基本覆盖了划痕间隙，而给药组划痕虽有愈合，但愈合速度明显减慢，说明载 miR-55纳米乳具有抑制细胞迁移的能力。
带正电的纳米乳在电荷作用下能与带负电的细胞膜紧密结合，然后细胞膜内陷，纳米乳被胞吞入细胞内形成内涵体，该过程被称为吞噬作用，通过吞噬作用，纳米乳能够特异地将装载的基因转运到细胞房室内，也可携带不能透过浆膜的药物递送到溶酶体内。溶酶体破坏纳米乳后释放出所携带的药物，药物缓慢渗出进人细胞质。因此细胞对纳米乳的摄取效果作为抗纤维化效果的重要指标。本发明制备了装载miR-55的纳米乳，在给药 12小时 和 24 小时后，通过荧光倒置显微镜观察细胞摄取效果。结果表明，LX2细胞对载 FAM-miR-55 纳米乳的摄取效果显著。
发明人通过体外研究发现，载 miR-55纳米乳对肝纤维化LX2细胞增殖的抑制效果呈浓度-时间依赖性，能够明显抑制细胞迁移。LX2细胞对载 miR-55纳米乳的摄取效果良好。
非酒精性脂肪性肝纤维化动物模型的建立
建立理想的动物模型是进行一切实验的基础，在探究慢性肝病的致病机制、评估诊断途径、优选中医药防治等多方面均有重大意义。首先实验动物的病理特征及行为表现均应与人类疾病特征相似，病变具有一段时间的发展过程。本发明采用 MCD饮食诱导大鼠模型，通过查阅大量文献可知，MCD饲料由于缺少蛋氨酸及胆碱，脂蛋白合成受阻，病理过程与人类发病过程、病例特点极其相似。用其复刻肝纤维化模型操作简单，动物致死率低。本实验为进一步验证 MCD 饮食诱导大鼠肝纤维化的可行性，对大鼠造模病程中肝功能各项指标，如AST、ALT、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA 水平变化情况进行检测，进而判断各组大鼠的肝纤维化程度。采用 HE 基础病理染色法对所取大鼠肝脏组织进行脂肪变性、炎症活动以及肝纤维化程度的观察，为大鼠肝纤维化模型的成功复刻提供佐证。
纳米给药系统体内药效学研究
经过发明人大量的研究表明，膈下逐瘀汤对非酒精性脂肪性肝纤维化具有明显的治疗效果，选用膈下逐瘀汤作为口服给药的阳性对照。
大量实验证明肝功能指标、代谢学指标，肝纤四项指标对非酒精性脂肪性肝纤维化的病情诊断及病势演变具有极大指向性。ALT多在肝脏、心 脏、和骨骼肌细胞浆中广泛分布，而AST集中分布于心肌、肝脏等细胞浆的线粒体中。当肝功正常时，ALT只有少量释放入血，当肝功失常时，“转氨酶”会发生异常运转，肝细胞中ALT与AST敏感的呈现出特异性。ALT率先进入血液中，其轻微的改变都能表达出肝细胞的损伤情况。而当肝细胞呈现慢性损害时，AST的表达水平会显著升高。
PCIII、Ⅳ-C、LN、HA被称为肝纤维化四项检查，主要用来检查和诊断慢性肝病患者病情发展状况和治疗效果，是衡量炎症活动度，纤维化程度的重要依据。在早期肝纤维的诊断中，HA作为一种蛋白多糖，反应最为敏感，当胶原蛋白大量出现时，HA 水平表达增加，是维持间质胶体行，ECM 产生的重要指标，肝损伤程度与表达程度正相关。PCⅢ可直观反应肝脏Ⅲ型胶原的合成，随病势加重，表达增加。LN 作为基底膜合成的主要成分之一，当大量沉积时，会形成门脉高压。Ⅳ-C 作为细胞基底膜的重要成分，反应基底膜胶原的更新速率，相对于其他三项指标出现的更早，也更能反应肝纤维化的严重程度。
MDA、SOD是脂质过氧化与氧化应激最基本、最直观的指标。MDA对肝脏组织细胞有很强的毒副作用。通过损伤细胞膜结构，导致细胞过度肿胀坏死，还可以与细胞因子反应进一步加重肝细胞的损伤，加重肝脏炎症，因此MDA可直接反应体内细胞受到威胁的程度以及过氧化水平的指标。SOD是体内重要的抗氧化酶，可有效消除脂质过氧化过程中的自由基。
实验结果表明，miR-55纳米乳和载miR-55阳离子脂质体对肝纤维化细胞具有明显的修复作用，抑制PCIII、Ⅳ-C、LN、HA、MDA表达水平，提高SOD表达水平，在一定程度上抑制过氧化反应，改善大鼠肝纤维化状况。
本发明的有益效果：通过对膈下逐瘀汤进行深度测序，证明膈下逐瘀汤中miRNA经高温煎煮后仍能稳定存在，且发现miR-55的表达量最高。制备工艺优化后，制备出的载miR-55纳米乳和载miR-55阳离子脂质体纳米粒包封率、电位和粒径良好，二者均可有效抑制体外LX2细胞的增殖和迁移，细胞对纳米乳摄取效果良好，可有效抑制非酒精性脂肪性肝纤维化。
附图说明
图1. 细胞划痕实验。阴性对照：A（0h），B（12h），C（24h）；给药组：D（0h），E（12h），F（24h）。
图2. 细胞摄取实验。A：给药组：由上至下分别为0h、12h、24h；B：阴性对照：由上至下分别为0h、12h、24h。
图3. 对照组（A）与模型组（B）大鼠模型。
图4. 对照组（A）与模型组（B）大鼠肝脏组织。
图5. 给药前对照组及模型组肝脏组织Masson染色结果：A、对照组（10×）；B、对照组（40×）；C、模型组（10×）；D、模型组（40×）。
图6. 给药后各组肝脏组织Masson染色结果：A、CG组（10×）；B、MG组（10×）；C、GXZY组（10×）；D、miR-55组（10×）。
具体实施方式
实施例1膈下逐瘀汤深度测序
本实施例采用Illumina深度测序技术对膈下逐瘀汤中的所有短RNA片段(<30nt)进行分析。
实验动物为健康雄性SD大鼠25只，周龄6-8周，体质量200±20g，合格证号：SCXK（HEI）2020-0001，实验动物购自黑龙江中医药大学动物中心。
实验方法：
1．制备膈下逐瘀汤。膈下逐瘀汤方：桃仁（研泥）9 g、五灵脂（炒）6 g、赤芍 6 g、丹皮6 g、当归9g、元胡3g、川芎6g、乌药6g、甘草9g、红花9g、香附4.5g、枳壳4.5g。以上药材均购于黑龙江中医药大学附属第一医院。处方量药材加10倍量水、充分浸泡60min、煎煮提取2h。将膈下逐瘀汤放入离心机，1500转离心5-10分钟，收集上清。
2. 分离外泌体
（1）在 37℃中速融样本。
（2）将样本移动至一个新的离心管内，2000 × g，4℃，超速离心30 min。
（3）小心的将上清液移至新的离心管中，12,000 × g，4℃，再次超速离心45 min，以去除较大的囊泡。
（4）取上清，经 0.45 μm 滤膜过滤，收集过滤液。
（5）将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，110,000 × g 离心 70
min。
（6）去除上清，用 10 mL 预冷的 1×PBS 重悬后，选择超速转子，再次 4℃，
110,000 ×g，超速离心 70 min。
（7）去除上清，用 100 μL 预冷的 1×PBS 重悬，分两管，每管 50 μL 于- 80℃保存。
3. 外泌体 RNA 提取
（1）向外泌体重悬液中加入 700 μL QIAzol，漩涡震荡 10s。
（2）简短离心后在室温下孵育 5min。
（3）加入 140μL 氯仿/异戊醇（24：1），剧烈上下颠倒 15s，在室温下孵育 2~3min。
（4）4℃下 12,000×g 离心 8min。吸取上清到新的管中。
（5）加入两倍上清体积的无水乙醇，混匀。
（6）将混合液全部过柱纯化。
（7）加入 700μL RWT 缓冲液洗一次。
（8）加入 500μL RPE 缓冲液洗两次。
（9）12,000×g 离心 2min 以甩干膜，弃去收集管。
（10）将纯化柱移至新的收集管，加入 20μL RNA-Free water。室温孵育 1min，12,000×g 离心 2min 以洗脱 RNA。得到约 15μL 洗脱产物；
（11）洗脱 RNA 样本采用 Agilent 2100 进行检测。
膈下逐瘀汤中共检测出10699912个序列片段，其中有效短链为10120727，约占94.6%。经鉴定有17个miRNA，10个为已知miR，7个为本次新检测出miR，ath指miRNA种属，测序结果显示膈下逐瘀汤中miRNA属拟南芥。其中novel-ath-miR-55表达量最高提示其具有有较高的稳定性，检测结果如下表：
表1 外源性miRNA测序结果
实验结果显示，膈下逐瘀汤中存在大量miR-55，可对其进行进一步的研究。
实施例2 载miR-55纳米乳及载miR-55阳离子脂质体的制备
miR-55与 negative control miRNA（NC miRNA）由苏州吉马基因股份有限公司合成。合成序列见表 1。
表2 miRNA 序列
将实验器材清洗干净完全浸润在配制好的 0.1% DEPC 水中，24h后取出实验器材用牛皮纸包裹，系好棉绳。与 DEPC 水一起放入高温灭菌锅中，121℃高温灭菌 30min。灭菌完成后，将器材取出烘干，DEPC水放入4℃冰箱备用。
0.1% DEPC 水的配制：精密量取1ml DEPC加入到1000ml 的去离子水中 ，密封，在磁力搅拌下过夜，配制成 1% DEPC 水。
200µg/ml 鱼精蛋白的配制：精密称取 2mg 鱼精蛋白，加入 DEPC 处理过的水溶解定容到 DEPC 水处理过的 10ml 容量瓶中，备用。
200µg/ml 透明质酸的配制：精密称取 2mg 透明质酸放入 DEPC 水处理过的10ml 容量瓶中，加入 DEPC 处理过的水溶解定容，备用。
10mg/ml DSPE-PEG2000的配制：精密称取 50mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000 (DSPE-PEG2000)放入 DEPC 水处理过的 5ml 容量瓶中，加入 DEPC 处理过的水溶解定容，备用。
1、载miR-55纳米乳的制备及工艺优化
将GTMAC 11.2g 溶解在15mL去离子水中，并加入30mL壳聚糖悬浮液(0.1g/mL)。GTMAC与壳聚糖氨基的摩尔比为4。在80℃下反应4h后，将浑浊变黄的反应液倒入冷丙酮中，在冰浴中搅拌过夜。用丙酮多次洗涤后，通过抽滤过滤收集白色产物。
将含有质量分数2% 乳化剂(吐温-60)的CS和HTCC以1：1混合。溶解在pH 3.5的醋酸缓冲溶液中，作为水相(W)。液体石蜡与石油醚的1：2(v/v)混合作为油相(O)，含4%司盘80乳化剂。以一定的体积比量取W、O。在磁力搅拌的情况下缓慢将油相加入到水相中，在细胞破碎仪下破碎1min，通过0.45μm有机系滤膜，可以得到尺寸均匀的（W/O）纳米液滴。随后，将饱和的戊二醛甲苯(GST)缓慢逐滴滴入乳液中，使纳米液滴凝固成纳米颗/粒。25℃固化30min，然后缓慢升温至50℃，10h后收集HNP，用石油醚和去离子水洗涤3次。得到空白的HTCC纳米颗粒(HNP)。
为了制备miR-55功能化的HNP(HNP：miR-55)，将分散在DEPC处理的水中的miR-55与HNP在室温下孵育1h。离心洗涤2次以除去游离的miR-55。随后，将获得的HNP: miR-55前体(HNP: miR-55 -)加入HTCC溶液(2wt%)，孵育2 h。最后，HNP: miR-55用DEPC处理的水洗涤两次。
载miR-55纳米乳的工艺优化
1）HNP和miR-55体积比对复合物粒径和电位的影响
固定其他条件不变，按照HNP和miR-55的体积比为10：1、20：1、40：1、60：1、80：1和100：1的比例按照前述方法制备HNP：miR-55前体（HNP：miR-55—复合物），通过电位粒径仪测定所得复合物的粒径和电位大小。
表3 HNP：miR-55—复合物的粒径和电位
如表3所示，当HNP：miR-55体积比为60：1 时，此时的HNP：miR-55复合物纳米粒具有较大粒径，说明HNP与 miR-55开始大量聚集，当HNP：miR-55体积比为80：1时，复合物的粒径迅速降低。当HNP：miR-55体积比达到100：1时，复合物的粒径又迅速增大，此时电位为-21.5，说明此时所加入的HNP可能并未与miR-55结合，而是自生发生聚集。所以选择miR-55：HNP体积比1：80作为制备复合物的最优工艺。
2）HNP：miR-55—复合物与HTCC质量比对粒径和电位的影响
固定其他条件不变，按照HNP：miR-55—复合物与HTCC的质量比为20：1、30：1、50：1、60：1、70：1和80：1的比例按照前述方法制备载miR-55纳米乳，通过电位粒径仪测定所得复合物的粒径和电位大小。
表4 HNP：miR-55-复合物与HTCC结合的粒径和电位
如表 4所示，当HNP：miR-55—复合物与HTCC质量比为50：1时，纳米乳具有较小的粒径，质量比为60：1时，此时的载miR-55纳米乳的粒径迅速增大，电位迅速下降。当HNP：miR-55—复合物与HTCC质量比达到70：1时，载miR-55纳米乳的粒径为 300.85，且呈电中性，随着比例的继续增大，粒径变小，呈负电性，说明载体并未将miRNA完全包封。所以选择选择以 50：1为 HNP：miR-55—复合物与HTCC的最佳质量比，此时复合物为带正电荷的较小微粒。
最佳工艺
按照单因素变量确定各物质的优化量，将含有质量分数2% 乳化剂(吐温-60)的CS和HTCC(1：1)的混合物(质量分数0.5%)溶解在pH 3.5的醋酸缓冲溶液中，作为水相(W)。油相(O)为液体石蜡与石油醚的1：2(v/v)混合物，含4%司盘80乳化剂。W、O体积比固定为5：150。在磁力搅拌的情况下缓慢将油相加入到水相中，在细胞破碎仪下破碎1min，通过0.45μm有机系滤膜，可以得到尺寸均匀的（W/O）纳米液滴。随后，将饱和的戊二醛甲苯(GST)缓慢滴入乳液中（逐滴加入），使纳米液滴凝固成纳米颗粒。先将固化温度保持在25℃ 30min，然后缓慢升温至50℃，10h后收集HNP，用石油醚和去离子水洗涤3次。得到空白的HTCC纳米颗粒(HNP)。
为了制备miR-55功能化的HNP(HNP：miR-55)，以miR-55：HNP的体积比为1：80在室温下孵育1h。离心洗涤2次以除去游离的miR-55。随后，将获得的HNP: miR-55前体(HNP:miR-55-)以1: 50的比例加入HTCC溶液(2wt%)，孵育2 h。最后，HNP: miR-55用不含RNase的dH2O洗涤两次。完成载miR-55纳米乳的制备过程。
最佳工艺所制的载miR-55纳米乳的粒径为 136nm，电位为 38mV。
表5 载miR-55纳米乳的包封率
根据计算结果，载 FAM-miR-55纳米乳的包封率为 82.10％。 证明纳米乳对 miR-55有较好的包封率。
2、载miR-55阳离子脂质体纳米粒的制备和工艺优化
阳离子脂质体的制备：取 DOTAP：胆固醇的摩尔比为 1：1 混合后加入适量氯仿溶解。待溶解完全，使用旋转蒸发器除去有机溶剂，直至在瓶壁形成一层薄薄的脂质膜。 在真空干燥箱中干燥完全除去溶剂。加入适量 DEPC 处理水洗下薄膜，室温静置 1h，配置成浓度为 40mM 的脂质体溶液。细胞破碎仪下超声 60s，再缓慢推过 0.22μm 微孔 滤膜，重复过滤 5-10 次。
HA-miR-55-鱼精蛋白复合物的制备：从-20℃冰箱中取出 miR-55，加入适量 DEPC处 理过的水并摇晃溶解均匀。吸取适量的 miR-55溶液与同等体积的透明质酸混合，震摇均匀，加入适量的鱼精蛋白，室温静置 10min，即制成 HA- miR-55-鱼精蛋白复合物。
载 miR-55阳离子脂质体纳米粒的制备：向 HA- miR-55-鱼精蛋白复合物中加入已配制好的阳离子脂质体，静置 10min 后加入适量的 DSPE-PEG2000，在预热 50℃的水浴锅中放置 10min。
工艺优化
1）HA-miR-55与鱼精蛋白的体积比对粒径和电位的影响
固定其他条件不变，使HA-miR-55与鱼精蛋白的体积比为 0.80：1.00、0.85：1.00、0.90：1.00、0.95：1.00、1.00：1.00、1.05：1.00 的比例，量取相应的 HA-miR-55和鱼精蛋白，分别加入到离心管中振荡混匀，在室温下放置 10min，通过电位粒径仪测定各复合物的粒径和 zeta 电位。
表6 HA-miR-55与鱼精蛋白复合物的粒径和电位
如表6所示，当配制 HA-miR-55与鱼精蛋白的混合物时，当二者的体积比为 0.90：1.00 时，复合物粒径最大，说明 HA-miR-55与鱼精蛋白开始大量聚集，且整体呈电中性。选择以0.95：1.00 为 HA-miR-55与鱼精蛋白的最佳体积比，此时复合物为带负电荷的较小微粒。
2）阳离子脂质体的量对粒径和电位的影响
取无酶原离心管，将含有 33µg的miR-55的 HA-miR-55-鱼精蛋白复合物加入到无酶原离心管中，分别加入 10µl、20µl、30µl、40µl、50µl、60µl、70µl 的阳离子脂质体，将其混合均匀，静置 10min后，通过电位粒径仪测定所得脂质体纳米粒的粒径和电位大小。
表7 HA-miR-55-鱼精蛋白复合物脂质体结合的粒径和电位
如表 7所示，当在HA-miR-55-鱼精蛋白复合物中加入20µl阳离子脂质体时，阳离子脂质体纳米粒粒径最大，说明HA-miR-55-鱼精蛋白复合物与阳离子脂质体开始大量聚集，随着脂质体含量的升高，粒径开始下降，电位持续升高。当加入40µl的阳离子脂质体时，阳离子脂质体纳米粒的粒径为 134.5，电位为 35，随着阳离子脂质体量的继续增加，复合物粒径变化较小，电位持续升高。所以选择加入 40µl 阳离子脂质体作为制备阳离子脂质体纳米粒的最优工艺。
3）最佳工艺
按照单因素控制变量法确定好的各物质的最优量，制备阳离子脂质体复合物。取miR-55，加入 DEPC 处理过的水摇晃溶解。取含有 33µg miR-55的 miR-55 溶液与等体积的透明质酸溶液混合，静置 10min 形成 HA-miR-55。以 miR-55：鱼精蛋白体积比为 1：1混合，静置 10min 即得 HA-miR-55-鱼精蛋白复合物。再加入 50μl 配制好的脂质体，室温下静置 10min后加入 50μl DSPE-PEG2000，在 50℃ 水浴锅中静置 10min。
所制的载 miR-55阳离子脂质体纳米粒的粒径为 142nm，电位为 48mV，包封率如表8所示。
表8 载 miR-55阳离子脂质体纳米粒包封率
实施例3 纳米给药系统作用于肝纤维化细胞的体外研究
LX2（人肝星形细胞）购自武汉赛维尔，以DMEM高糖培养基及10%胎牛血清(FBS)，于37℃，5% CO2条件下进行培养。
配制完全培养基：在无菌条件下，用0.22μm 微孔滤膜过滤5ml胎牛血清到无菌的50ml 离心管中，加入 0.5ml 双抗和 44.5ml DMEM 培养基，充分混合均匀，用 0.22μm微孔滤膜过滤到另一无菌 50ml 离心管中，制成含有 10%胎牛血清和 1% 双抗的 DMEM 完全培养基。将离心管用封口膜密封，置于冰箱4℃保存备用。
配制细胞冻存液：在无菌条件下，将胎牛血清与DMSO按照9:1的比例进行配制，于2ml冻存管中备用。
配制MTT 溶液：称取 MTT[溴化 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑]25mg，用5mL PBS 溶解，配制成 5mg/mL 的 MTT 溶液。用0.22µm 微孔滤膜过滤，冰箱4℃避光保存备用。
MTT 法检测细胞毒性
（1）选取生长状态良好的LX2细胞，吸弃培养瓶中旧培养基，加入2ml无菌PBS洗涤细胞，重复两次。
（2）加入1ml胰酶细胞消化液溶液，轻轻摇晃，使胰酶细胞消化液铺满细胞表面。迅速放入37℃，5% CO2的培养箱中消化1min，倒置显微镜下观察到细胞皱缩变圆。
（3）加入5ml完全培养基摇晃混匀，停止消化。反复多次吹打细胞，使细胞脱离瓶壁形成细胞悬液。
（4）使用细胞计数板进行计数。
（5）根据细胞计数结果，使用完全培养基调整细胞到每100µl含约104个细胞。
（6）96孔板中接种细胞，每孔加入细胞悬液100µl。将96孔板放入培养箱中继续培养24h。
（7）吸去孔中完全培养基，更换为不含胎牛血清的DMEM基础培养基，每孔200µl。放入37℃，5% CO2培养箱中，继续培养24小时。
（8）取出96孔板，加入预先制备好的miR-55浓度为20nM、40nM、60nM、80nM、100nM的miRNA纳米乳，以0mM组作为阴性对照组，每一组设置三个复孔。放入培养条件为37℃，含有5% CO2培养箱中，继续培养24h，48h。
（9）在避光条件下，每孔加入20µl预先配置好的MTT溶液。
（10）放入培养条件为37℃，含有5% CO2培养箱中，继续培养4小时。
（11）取出细胞，小心吸弃96孔板中每孔中的上清液。在每孔中加入DMSO溶液150µl，将96孔板放到摇床上在低速下震荡10min。
（12）酶联免疫检测仪490nm下，测定各孔吸光度（Opticol density，OD）值，记录结果。
肿瘤细胞增殖抑制率（inhibitionrate,IR%）的计算公式如下：
IR(%)=（1-加药组OD值/对照组OD值）X 100%
实验结果显示，不同浓度的载miR-55纳米乳对LX2（人肝星形细胞）细胞的体外增殖具有抑制作用。
表9 纳米乳对LX2细胞的抑制作用（n=3）
如表9所示，在给药时间相同时，LX2细胞的生长抑制率随着纳米乳浓度的增加而逐渐增加。给药 24h 时，20nM 的miR-55 纳米乳对LX2细胞的抑制率为 13.19%，40nM 的miR-55抑制率为19.65%，miR-55的浓度到 60nM 时抑制率有了明显提高达到28.32%，80nM的miR-55抑制率为30.70%，100nM 的miR-55对LX2细胞的抑制率为 38.40%，与阴性对照组比较，具有统计学意义（P<0.05）。当给药时间为 48h 时，20nM miR-55纳米乳抑制率为20.25%，40nM miR-55抑制率为43.34%，当miR-55的浓度为 60nM时抑制率达到53.91%，80nM的miR-55抑制率为61.02%，100nM 的 miR-55对LX2的抑制率达到68.60%。说明载miR-55的纳米乳能明显抑制LX2细胞增殖，并且存在剂量依赖性。
浓度相同的纳米乳，随着作用时间的增加，对LX2细胞的增殖抑制率逐渐增加。当给药时间从24h增加到48h，20nM的载miR-55纳米乳对细胞的抑制率从13.19%增长到20.25%，40nM 的载miR-55纳米乳对细胞的抑制率从19.65%增长到43.34%，60nM 的载miRNA纳米乳对细胞的抑制率从 28.32%增长到53.91%，80nM 的载miRNA纳米乳对细胞的抑制率从 30.70%增长到61.02%，100nM 的载miR-55纳米乳对细胞的抑制率从 38.40%增长到68.60%。说明载miR-55的纳米乳不仅可以显著抑制LX2细胞增殖，而且对LX2细胞增殖的抑制存在时间依赖性。
细胞划痕实验
（1）取生长旺盛、处于对数生长期的LX2细胞，倾去培养瓶中旧培养基，加入2ml无菌PBS清洗细胞，重复两次。
（2）加入1ml胰酶细胞消化液溶液，水平摇晃，使胰酶细胞消化液铺满细胞表面，迅速放入培养条件为37℃，含5% CO2的培养箱中消化1min。
（3）倒置显微镜下观察到细胞皱缩变圆。
（4）加入5ml完全培养基终止消化。反复多次吹打细胞，使细胞脱离瓶壁形成细胞悬液。将所有细胞悬液，移入15ml离心管中。
（5）使用细胞计数板细胞计数。在800rpm条件下离心5min。
（6）吸弃上清液。根据细胞计数结果，加入适量完全培养基调整细胞浓度。轻轻吹打，重悬细胞。
（7）以每孔4105个细胞的密度接种到6孔细胞培养板上。在培养条件为37℃，含5% CO2的培养箱中培养过夜。
（8）用枪头垂直于底部，从孔的一端到另一端划下划痕。
（9）吸弃旧培养基，加入2ml无菌PBS，轻轻水平摇晃清洗细胞表面3次，除去划下的细胞。
（10）含1%胎牛血清的培养基作为阴性对照，给药组为miR-55纳米乳加含1%胎牛血清的培养基。
（11）放入培养箱中培养。
（12）12h，24小时观察细胞划痕。
如图 1 所示，将两组 LX2 细胞进行划痕实验，对照组在给药12 小时后，与 0小时相比划痕愈合明显，细胞生长明显。给药组 12 小时与 0小时相比划痕愈合不明显；当给药24h后，对照组划痕基本愈合，而给药组划痕虽有愈合，但愈合速度明显减慢，说明载miR-55纳米乳具有较明显的抑制细胞迁移的能力。
细胞摄取实验
（1）按照实施例2中的最优工艺，制备含 FAM-miR-55 的纳米乳。
（2）取生长旺盛、处于对数生长期的LX2细胞，弃去旧培养基，用2ml无菌PBS 清洗细胞两次。
（3）加入1ml 胰酶细胞消化液，轻轻水平摇晃使胰酶细胞消化液铺满细胞表面，放入培养条件为37℃，含 5% CO2的培养箱中消化 1min后，倒置显微镜下观察细胞皱缩变圆。
（4）加入含5ml 完全培养基停止消化，反复多次吹打细胞，使细胞脱离瓶壁形成细胞悬液。
（5）使用细胞计数板进行计数。根据计数结果调整细胞悬液浓度.
（6）将细胞接种到 6 孔细胞培养板上，每孔约 4105个细胞。37℃，5% CO2 的培养箱中培养过夜。
（7）不含药的 DMEM 完全培养基作为对照组，给药组为加含载 FAM-miR-55纳米乳的 DMEM 完全培养基。
（8）荧光倒置显微镜下观察作用 12、24 小时的细胞摄取情况。
实验结果如图2所示，经载 FAM-miR-55纳米乳处理过的LX2 细胞，培养 12、24 小时后，在荧光倒置显微镜均观察到绿色荧光，且给药24h的荧光数量大于给药 12 小时出现的荧光数量，而阴性对照组在给药12h、 24h后基本无绿色荧光。说明 LX2 细胞对载 FAM-miR-55纳米乳具有明显的摄取效果。
实施例4 非酒精性脂肪性肝纤维化模型建立
雄性 SD 大鼠 100只（黑龙江中医药大学实验动物中心），6~8 周龄，体质量（200±20g），合格证号：SCXK（HEI）2016-0001。
蛋氨酸胆碱缺乏饲料（Methionine Choline Deficient，MCD）购于ResearchDiets公司，货号：A02082002BR。
将所有从动物中心购买的C57BL/6J 雄性大鼠在温度22-25℃，相对湿度 45-60％的实验动物房适应性喂养 1 周后，随机分为两组：对照组（n=25）喂食普通饲料，模型组（n=85）喂食 MCD，连续喂养 8 周。
在造模的第 4、6、8 周，随机处死两组大鼠各 5 只。大鼠禁食12h，自由饮水，第二日称重后进行腹主动脉采血，3500 r/min 条件下离心吸取上层血清， 放入-20℃冰箱存储。沿大鼠腹部中线剪开腹腔，将大鼠肝脏取出，仔细观察肝脏的色泽，形态以及切片的油腻程度并称量重量。将取出的肝脏组织置于中性福尔马林中固定，进行石蜡包埋、切片、染色观察肝脏形态学改变。
采用酶联免疫法分别测定两组大鼠 4、6、8 周时的血清指标：TG、AST、ALT、PCⅢ、Ⅳ-C、HA 的水平。取血清样品，室温解冻平衡温度至 20-25℃待用。肝脏组织称量后用PBS（0.01 M, PH=7.4）充分清洗，3500 r/min 离心 20 min，仔细吸取上清液，参照 Elisa 试剂盒说明书步骤依次进行操作。
结果表明造模结束，模型组AST、ALT、TC、TG、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA等指标显著升高，与对照组相比具有显著差异（P＜0.01，P＜0.05）（见表11-14）；此外造模结束后模型组大鼠体质量小于对照组，肝脏指数升高，提示大鼠正常生理功能障碍。HE染色结果提示模型组大鼠镜下肝脏可见大量圆形脂滴，肝小叶完整性受损，肝细胞内脂滴将细胞核推向细胞边缘，散见炎性浸润（见图4）；Masson染色结果显示周围窦、汇管区蓝染提示纤维组织增生（见图5），证明MCD饲料诱导非酒精性脂肪性肝纤维化模型建立成功。结合文献，证明MCD饲料能够从饮食结构异常方面对NAFLD进行复刻，且饮食诱导造模过程安全可靠，能够精准反映非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展过程。
表10 大鼠体质量、肝指数结果（ 、n=5）/>
表11 大鼠ALT、AST（、n=5）
表12 大鼠血清TG、TC（、n=5）
表13 大鼠PCⅢ、IV-C（ 、n=5）
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表 14 大鼠 HA、LN（ 、n=5）
实施例4 纳米给药系统体内药效学研究
成功复刻模型后，重新将大鼠随机分为 8 组，10 只/组：对照组、模型组、膈下逐瘀汤组、miR-55灌胃组、NCmiRNA灌胃组、miR-55纳米乳灌胃组、静脉注射裸miR-55、静脉注射载miR-55阳离子脂质体。对动物模型干预 4 周，对照组与模型组在给药期间均给予与其他三组相同剂量的生理盐水。
参考徐叔云编著的《药理实验方法学》计算每只大鼠的给药量，以体表面积和临床等效剂量计算，将膈下逐瘀汤浓缩至 1 g/mL。
大鼠剂量=X mg/kg（临床剂量）×70 kg×0.018/大鼠体质量（200g），给药容量约为 2 mL/200g。
给药剂量：GXZY: 0.5 g/mL/d，合成miR-55: 0.1nmol/d。
灌胃用miR-55经吉玛基因公司验证并合成，结构稳定，符合灌胃要求。
表15 给药前后各组小鼠体质量变化（、n=10）
表 16 各组小鼠 ALT、AST 水平变化（、n=10）/>
表 17各组大鼠血清 PCⅢ、 Ⅳ-C、LN、HA 比较（、n=10）
表18 各组大鼠SOD水平变化（、n=10）/>
实验结果表明，miR-55纳米乳和miR-55阳离子脂质体对肝纤维化细胞具有明显的修复作用，抑制PCIII、Ⅳ-C、LN、HA表达水平，提高SOD表达水平，在一定程度上抑制过氧化反应，改善大鼠肝纤维化状况。
Claims (9)
1.一种miR-55制剂，其特征在于，所述miR-55的碱基序列为GCCGTCTTAGCTCAGTGGTA，所述miR-55制剂为miR-55纳米乳或miR-55阳离子脂质体。
2.一种miR-55纳米乳制剂，其特征在于，所述miR-55的碱基序列为GCCGTCTTAGCTCAGTGGTA，采用以下方法制备：将含有质量分数2% 乳化剂的CS和HTCC的混合物溶解在pH3.5的醋酸缓冲溶液中，作为水相(W)；油相(O)为液体石蜡与石油醚的体积比为1：2的混合物，含4%司盘80乳化剂；在磁力搅拌的情况下缓慢将油相加入到水相中，在细胞破碎仪下破碎1min，通过0.45μm有机系滤膜，可以得到尺寸均匀的纳米液滴；随后，将饱和的戊二醛甲苯(GST)缓慢滴入乳液中，使纳米液滴凝固成纳米颗粒；先将固化温度保持在25℃30min，然后缓慢升温至50℃，10h后收集HNP，用石油醚和去离子水洗涤3次，得到空白的HTCC纳米颗粒-HNP；以miR-55：HNP的体积比为1：（10-100）在室温下孵育1h；离心洗涤2次以除去游离的miR-55；随后，将获得的HNP: miR-55前体以1: （20-80）的比例加入HTCC溶液，孵育2 h；最后，HNP: miR-55用不含RNase的dH2O洗涤两次，从而制备获得miR-55纳米乳。
3.如权利要求2所述的miR-55纳米乳制剂，所述miR-55：HNP的比例为1:80。
4. 如权利要求2所述的miR-55纳米乳制剂，所述HNP: miR-55前体的比例为1:50。
5.权利要求2-4任一所述的miR-55纳米乳制剂在制备抑制肝脏纤维化的药物中的用途。
6.一种miR-55阳离子脂质体，其特征在于，所述miR-55的碱基序列为GCCGTCTTAGCTCAGTGGTA，由以下方法制备：取miR-55，加入 DEPC 处理过的水摇晃溶解；取含有 33µg miR-55的 miR-55 溶液与等体积的透明质酸溶液混合，静置 10min 形成 HA-miR-55；以 miR-55：鱼精蛋白体积比为（0.80-1.05）：1 混合，静置 10min 即得 HA-miR-55-鱼精蛋白复合物；再加入 10-70μl 配制好的脂质体，室温下静置 10min后加入 50μlDSPE-PEG 2000，在 50℃ 水浴锅中静置 10min。
7.如权利要求6所述的miR-55阳离子脂质体，所述miR-55：鱼精蛋白体积比为0.95：1.00。
8.如权利要求6所述的miR-55阳离子脂质体，所述脂质体的加入量为40μl。
9.权利要求6-8任一所述的miR-55阳离子脂质体在制备抑制肝脏纤维化的药物中的用途。
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