CN110613724B - 一种具有治疗肝细胞癌功效的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有治疗肝细胞癌功效的药物，所述药物为人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物。人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物可浓度依赖地抑制肝细胞癌生长并促进其凋亡，并且体外干预可抑制H22肝癌细胞系的活力，调控肝癌细胞PI3K/Akt信号转导。

Description

一种具有治疗肝细胞癌功效的药物
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有治疗肝细胞癌功效的药物。
背景技术
肝细胞癌是世界范围内普遍存在的恶性肿瘤之一，它位于全球癌症相关性死因的第3位，严重威胁人类健康和生命安全。作为病毒性肝炎的高流行区，我国已经成为全球肝细胞癌发病率最高的国家，患者数量占全球的55％，且发病低龄化趋势较为明显。阐明肝细胞癌的发生发展机制和干预靶点以及寻找有效的干预措施是肿瘤学领域一个亟待解决的重大课题。
人参被誉为“百草之王”，是名贵的中药材，具有多种生物活性，包括抑制肿瘤生长和转移等药理作用。人参皂苷是人参的主要有效成分，属于三萜类化合物，迄今已经发现了100余种人参皂苷。人参皂苷Rg2(Ginsenoside Rg2)是人参的单体成分之一，是由日本学者柴田承二于1963年首次发现并命名的三醇型人参皂苷。近年来，对人参皂苷Rg2的研究逐渐深入，发现其对神经系统和心脑血管系统具有保护作用。人参皂苷Rg2有20(R)和20(S)两种立体异构体，两种异构体均可减轻氧糖剥离/再灌注诱导的皮层神经元损伤，其中20(R)型的作用强于20(S)型，但两者均弱于天然型人参皂苷Rg2。人参皂苷Rg2通过其抗氧化应激和抗凋亡的作用保护H9c2心肌细胞免受H2O2损伤。有研究报道，mRg2(含60％人参皂苷Rg2的人参皂苷混合物)可通过修复DNA和减少凋亡使细胞免受紫外线诱导的基因毒性，其机制可能与p53信号通路中涉及的蛋白质水平的调节相关。另外，人参皂苷Rg2具有针对HaCaT角质形成细胞中紫外线诱导的皮肤老化的立体特异性保护性质。毒理学实验表明，人参皂苷Rg2是一种低毒、非致突变作用的药物。然而，人参皂苷Rg2在肿瘤中的干预作用尚无文献报道。
发明内容
本发明主要目的是提供人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用以及包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。本发明经药理实验发现，人参皂苷Rg2或包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米粒能够浓度依赖的抑制肝细胞癌生长并促进其凋亡，联用特异性Class IA PI3K抑制剂BYL719后人参皂苷Rg2的作用减弱。以及，人参皂苷Rg2或包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米粒能够体外干预可抑制H22肝癌细胞系的活力，且该作用具有时间和浓度依赖性。联用BYL719后人参皂苷Rg2的作用可被抑制。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用。
优选地，所述肿瘤或癌症为肝癌；人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物可浓度依赖地抑制肝细胞癌生长并促进其凋亡，并且体外干预可抑制H22肝癌细胞系的活力，该作用与给药时间和浓度有关。
优选地，所述人参皂苷Rg2的剂量为10-100mg·kg-1·d-1，优选为10-40mg·kg-1·d-1，更优选为40mg·kg-1·d-1。
优选地，所述以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物包括人参皂苷Rg2和选自药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂和溶媒中的一种或多种。
优选地，所述以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物包含人参皂苷Rg2和载体，所述载体为壳聚糖与三聚磷酸钠形成的纳米颗粒。
壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物，其分子量在300～2000kDa尤其在1800-2000kDa，脱乙酰度大于92％，其与带有长链阴离子的三聚磷酸钠通过阴阳离子间的静电作用自发形成纳米颗粒；所述纳米颗粒的粒径为200～800nm，优选粒径为220-480nm，更优选平均粒径为385nm。
在本发明的第二方面，本发明提供了包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH，得溶液I；
(2)将人参皂苷Rg2加入三聚磷酸钠(TPP)水溶液中溶解，用冰醋酸溶液调节pH，得溶液II；
(3)在磁力搅拌的同时，将溶液II滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。
优选地，步骤(1)中，所述壳聚糖分子量范围300～2000kDa，优选1800-2000kDa，脱乙酰度大于92％。
优选地，步骤(1)中，调节pH值至5.5～6.5，优选调节pH值至6.0。
优选地，步骤(1)中，冰醋酸的浓度为10％。
优选地，步骤(2)中，调节pH值至7.0～8.0，优选调节pH值至7.5。
优选地，步骤(2)中，冰醋酸的浓度为10％。
优选地，步骤(2)中，人参皂苷Rg2与三聚磷酸钠的质量体积比为12mg：4mL。
优选地，步骤(2)中，三聚磷酸钠的浓度为0.25mg/mL。
优选地，步骤(3)中，将溶液II滴加入溶液I的速度为1滴/3秒。
优选地，步骤(3)中，离心条件为4℃下12000转/分钟高速离心40分钟。
优选地，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为12-18：1，优选为15-18：1；
优选地，壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比(mg/mL)为6-9：1，优选为7.5-9：1。
壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物，其分子量在300～2000kDa尤其在1800-2000kDa，脱乙酰度大于92％，其与带有长链阴离子的三聚磷酸钠通过阴阳离子间的静电作用自发形成纳米颗粒，本发明通过实验发现，当壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比6-9：1或质量比为12-18：1时，能够形成较为良好的纳米颗粒，其粒径集中在200～800nm之间，优选为220-480nm，Zeta电位的绝对值在15-32mV之间，优选为20-32mV，低于该浓度则溶液清亮无法形成纳米颗粒，而高于高浓度则容易形成大颗粒的聚集物。尤其地，壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比7.5-9：1或质量比为15-18：1时，形成的纳米颗粒对人参皂苷Rg2具有更好的包载率，包载率最高可达78.4％。
在本发明的第三方面，本发明还提供了上述制备方法制备得到的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒。所述纳米颗粒的粒径集中在200～800nm之间，优选为220-480nm。Zeta电位的绝对值在15-32mV之间，优选为20-32mV。
以及，在本发明的第四方面，本发明提供了上述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用。
优选地，所述应用表现为人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备通过抑制肿瘤生长和/或促进癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞活力实现肿瘤治疗和/或抗癌作用的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤或癌症为肝癌。
此外，在本发明的第五方面，本发明还提供了人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备下述药物中至少任一种中的应用：
(1)制备(体内或体外)抑制肿瘤生长的药物；
(2)制备(体内或体外)促进癌细胞凋亡的药物；
(3)制备(体内或体外)抑制癌细胞活力的药物；
优选地，所述癌细胞为肝癌细胞，所述肿瘤为肝肿瘤。
优选地，所述以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒。
优选地，所述人参皂苷Rg2的剂量为10-100mg·kg-1·d-1，优选为10-40mg·kg-1·d-1，更优选为40mg·kg-1·d-1。
以及，在本发明的第六方面，本发明还提供了人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备调控肝癌细胞PI3K/Akt信号转导的药物中的应用。
优选地，所述以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物如上所述。
优选地，所述人参皂苷Rg2的剂量为10-100mg·kg-1·d-1，优选为10-40mg·kg-1·d-1，更优选为40mg·kg-1·d-1。
本发明所述的以人参皂苷Rg2为主要活性物质包括以人参皂苷Rg2为唯一活性成分。比如本发明包括人参皂苷Rg2作为唯一活性成分(或有效成分)或以人参皂苷Rg2为唯一活性成分(或有效成分)的组合物在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现人参皂苷Rg2具有部分依赖于PI3K/Akt信号转导通路的抑癌作用，可应用于肿瘤治疗，尤其肝癌的治疗，治疗过程中可显著减小肿瘤的体积和重量，体现出剂量依赖性，尤其在施用剂量不小于10mg·kg-1·d-1时有效果，在40mg·kg-1·d-1时效果显著。
本发明药物组合物为人参皂苷Rg2与壳聚糖制备得到的纳米颗粒，纳米粒形态为类球体，粒径集中在200～800nm间。人参皂苷Rg2的包封率可达78.4％。专利申请人构建了肝细胞癌荷瘤小鼠模型，本发明人参皂苷Rg2或包含人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒干预剂量依赖性地抑制肝细胞癌生长并促进其凋亡，联用特异性Class IA PI3K抑制剂BYL719后人参皂苷Rg2的作用减弱；人参皂苷Rg2体外干预可抑制H22肝细胞癌细胞的活力，且该作用具有时间和浓度依赖性，联用特异性Class IA PI3K抑制剂BYL719后人参皂苷Rg2的体外作用可被抑制。实验结果表明本发明药物组合物具有抑癌作用，该作用至少部分依赖于PI3K/Akt信号转导通路。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒透射电镜示意图(x105)。
图2为本发明的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒粒度分布图。
图3为本发明的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒干预对肝癌的抑制作用。其中，图3A示出了肿瘤体积、TUNEL阳性细胞的差异；图3B示出了肿瘤重量的差异；图3C示出了TUNEL阳性细胞数/总细胞数的差异；图3D示出了Caspase 3活性的差异。**P<0.01vs.空白溶媒组；##P<0.01vs.高剂量人参皂苷Rg2组。
图4为本发明的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒干预对H22肝癌细胞活力的影响。其中，图4A为干预后对细胞活力的影响与时间的关系图：24小时、48小时以及72小时上方三根数据柱均从左至右分别对应Vehicle组、Rg2组和Rg2+BYL719组；图4B为干预后对细胞活力的影响与浓度的关系图：0μM上方一根数据柱对应Vehicle组，1μM、10μM和100μM上方两根数据柱均从左至右分别对应Rg2组和Rg2+BYL719组。*P<0.05&**P<0.01vs.空白溶媒组；#P<0.05&##P<0.01vs.人参皂苷Rg2组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
人参皂苷Rg2：武汉天植生物技术有限公司；CAS号:52286-74-5；分子式：C42H72O13；分子量：785.02。
壳聚糖分子量在300～2000kDa，脱乙酰度大于92％。
实施例1包载天然人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒
(1)将18mg分子量为1800kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至6.0，得溶液I；
(2)取12mg天然人参皂苷Rg2加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(800转/分钟)均匀，用10％冰醋酸溶液调节pH至7.5，得溶液II；
(3)将上述溶液II以1滴/3秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心40分钟(12000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。
实施例2包载天然人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒
(1)将12mg分子量为300kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至6.0，得溶液I；
(2)取12mg天然人参皂苷Rg2加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(800转/分钟)均匀，用10％冰醋酸溶液调节pH至7.5，得溶液II；
(3)将上述溶液II以1滴/3秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心40分钟(12000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。
实施例3包载天然人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒
(1)将15mg分子量为2000kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至6.0，得溶液I；
(2)取12mg天然人参皂苷Rg2加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(800转/分钟)均匀，用10％冰醋酸溶液调节pH至7.5，得溶液II；
(3)将上述溶液II以1滴/3秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心40分钟(12000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。
试验例1载药壳聚糖纳米粒制备工艺优化
将包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒混悬液滴到铜网上，2％磷钨酸钠染色，采用透射电镜观察。所得纳米粒电镜下形态为类球体，如图1所示。利用光散射测定仪测定纳米颗粒制剂的粒径范围，结果显示，载药壳聚糖纳米颗粒的粒径集中于200～800nm之间。如图2所示。
采用高速冷冻离心法测定纳米颗粒的包载率：离心力作用下，纳米粒沉淀，去离子水重溶后，冷冻干燥，测定纳米粒中药物的含量。离心条件为：4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，计算公式如下：
包载率＝W1/W2×100％
其中，W1为包封的药物的质量、W2为体系中药物的总质量。
载药量测量：称取冻干后纳米粒样品m1溶于10ml容量瓶中，加入二甲亚砜破坏，按照药物检测方法检测药物含量m2，根据以下公式计算载药率，经计算载药量在32～55％左右。
载药量＝m2/m1×100％
表1为实施例1-3包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的物理性质以及载药性能。
表1
Figure GDA0002908843010000081
试验例2载药壳聚糖纳米颗粒对肝细胞癌的功效研究
(一)实验方法
(1)人参皂苷Rg2壳聚糖纳米颗粒干预对肝细胞癌影响的体内研究
(1.1)动物模型建立和分组干预：选择8周龄(18～22g)的雄性健康BALB/c小鼠160只，无菌条件下普通饮食饲养。在右上背部肌肉注射含有1x107个H22肝细胞癌细胞的0.1mLPBS缓冲液，以构建肝细胞癌荷瘤小鼠模型。注射肿瘤细胞7天后，将建模成功小鼠随机分成4组干预(每组20只)：空白溶媒组(在图3中标示为Vehicle)、小剂量(10mg·kg-1·d-1)实施例1包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒组(在图3中标示为Low-Rg2)、高剂量(40mg·kg-1·d-1)实施例1包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒组(在图3中标示为High-Rg2)和高剂量壳聚糖纳米颗粒+特异性Class IA PI3K抑制剂BYL719组(在图3中标示为High-Rg2+BYL719)。空白溶媒和载药壳聚糖纳米颗粒利用灌胃途径给药，每日分3次给药；BYL719采用皮下埋植渗透泵持续泵入给药，剂量为50mg·kg-1·d-1。
(1.2)分组干预4周后将小鼠安乐死(氟烷麻醉后颈部脱臼)，取出肿瘤，称重测量肿瘤负荷；Caspase-3活性检测试剂盒检测肿瘤组织中Caspase-3活性(购自美国Sigma公司)：将新鲜肿瘤组织匀浆15000转/min离心40min。利用上清液对显色底物Ac-DEVD-ρNA蛋白裂解，测定Caspase 3的活性。利用微孔板分光光度计在405nm波长检测底物的裂解。
(1.3)制备冰冻切片，TUNEL检测肿瘤细胞凋亡。小鼠用含4％多聚甲醛、5％蔗糖、20mM EDTA(pH 7.4)的PBS溶液灌注固定10min后，取出肿瘤，包埋于OCT中，储存于-80℃冰箱。应用冰冻切片机将肿瘤组织切成10μm厚的组织切片。利用TUNEL试剂盒(购自美国Millipore公司)检测小鼠肿瘤细胞的凋亡程度。将冰冻切片PBS洗涤15min后滴加蛋白酶K(浓度20mg/L)室温孵育30min；利用无核酸酶水洗涤3min×3次，3％H2O2甲醇溶液室温孵育10min抑制内源性过氧化物酶活性；切片用无核酸酶水洗涤1min，在室温下于1×TdT标记缓冲液中浸润10min；按操作说明，将TdT标记反应混合液滴加到切片上，在37℃湿盒中孵育1小时完成TdT反应；在室温下于1×TdT终止液中浸润10min；然后利用DAB显色液常规显色；利用甲基绿将细胞核反染。利用Image-Pro Plus v5.0.2软件定量分析，每张切片随机选取20个视野进行TUNEL阳性细胞计数，检测结果用TUNEL阳性细胞数/总细胞数x100％定量表示。
(2)人参皂苷Rg2壳聚糖纳米颗粒干预对H22肝细胞癌细胞活力影响的体外研究
体外培养H22小鼠肝癌细胞系，将载药壳聚糖纳米颗粒按照人参皂苷Rg2 0、1μM、10μM和100μM 4种浓度和24h、48h和72h 3个时间点干预，MTT法检测细胞活力。空白溶媒(在图4中标示为Vehicle)、载药壳聚糖纳米颗粒(在图4中标示为Rg2)或载药壳聚糖纳米颗粒联合BYL719(在图4中标示为Rg2+BYL719)处理过的细胞接种到96孔板上(1.5×104个细胞/孔)，在含5％CO2的37℃恒温箱内孵育。分别干预24、48及72小时后，按MTT试剂盒(购自美国Sigma公司)操作说明测定活性细胞的数量。
(3)数据处理
采用SPSS v19软件进行数据分析。连续型变量用平均值±标准误或中位数[四分位数间距]表示，如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，采用Bonferroni法两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，如果组间差异有统计学意义，采用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner法多重比较。双侧P＜0.05时认为差异有统计学意义。
(二)实验结果
如图3所示(**P<0.01vs.空白溶媒组；##P<0.01vs.高剂量人参皂苷Rg2组)，人参皂苷Rg2壳聚糖纳米粒干预剂量依赖性地抑制肝癌生长(A、B)并促进肝癌细胞凋亡(C、D)，联用特异性Class IA PI3K抑制剂BYL719后人参皂苷Rg2的作用减弱。
如图4所示(*P<0.05&**P<0.01vs.空白溶媒组；#P<0.05&##P<0.01vs.人参皂苷Rg2组)，人参皂苷Rg2壳聚糖纳米粒体外干预可抑制H22肝癌细胞系的活力，且该作用具有时间(A)和浓度(B)依赖性。联用BYL719后人参皂苷Rg2的作用可被抑制。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH，得溶液I；
(2)将人参皂苷Rg2加入三聚磷酸钠水溶液中溶解，用冰醋酸溶液调节pH，得溶液II；
(3)在磁力搅拌的同时，将溶液II滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得；
壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为12-18：1；
步骤(1)中，所述壳聚糖分子量范围300～2000kDa，脱乙酰度大于92％；
步骤(1)中，调节pH值至5.5～6.5；
步骤(2)中，调节pH值至7.0～8.0，人参皂苷Rg2与三聚磷酸钠的质量体积比为12mg：4mL，三聚磷酸钠的浓度为0.25mg/mL。
2.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述壳聚糖分子量范围1800-2000kDa。
3.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，调节pH值至6.0。
4.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，冰醋酸的浓度为10％。
5.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，优选调节pH值至7.5。
6.根据权利要求3所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，冰醋酸的浓度为10％。
7.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将溶液II滴加入溶液I的速度为1滴/3秒。
8.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，离心条件为4℃下12000转/分钟高速离心40分钟。
9.根据权利要求1所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比为6-9：1。
10.权利要求1至9中任一项所述包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒的制备方法制备得到的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒。
11.权利要求10所述的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用，其特征在于，所述应用表现为人参皂苷Rg2或以人参皂苷Rg2为主要活性物质的组合物在制备通过抑制肿瘤生长和/或促进肿瘤细胞凋亡和/或抑制癌细胞活力实现肿瘤治疗和/或抗癌作用的药物中的应用。
13.根据权利要求11所述的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒在制备肿瘤治疗药物和/或抗癌药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤或癌症为肝癌。
14.权利要求10所述的包载人参皂苷Rg2的壳聚糖纳米颗粒在制备调控肝癌细胞PI3K/Akt信号转导的药物中的应用。
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