CN104138595A - 仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ApoA-I及其模拟肽、ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。所述载脂蛋白优选ApoE3及其模拟肽中的一种或多种。本发明首次提出将仿生重组高密度脂蛋白应用于制备预防和治疗阿尔茨海默病药物，解决了天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点，其应用为阿尔茨海默病防治药物研发提供新的思路，具有重要的研究价值和临床应用前景。

Description

仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用

技术领域

本发明涉及神经药理学和化学制药领域，尤其涉及仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是发生在老年人群中最常见的以进行性痴呆为特征的中枢神经系统退行性病变。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，伴有各种神经精神症状和行为障碍。目前AD在老年人群中的发病率仅次于心血管病、癌症和脑卒中，已成为排名第四位的致死病因。随着人口老龄化进程的加剧，该类疾病的发病率日益上升。《世界阿尔茨海默病报告》指出，痴呆患者人数预计每20年增长近一倍，将由2010年的3600万增至2050年的1.15亿，且58%的患者居住于中低收入国家，到2050年，这一数字将增至71%；报告称，每年痴呆相关费用总计6040亿美元，约为全球国内生产总值（GDP）的1%。AD已成为人类健康和生存质量的严重威胁，是日益严重的公共卫生问题。

目前临床上使用的AD治疗药物本质上为对症治疗，包括乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制剂他克林、多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏和谷氨酸NMDA受体拮抗剂美金刚，仅能短期内改善胆碱能缺失导致的学习、记忆功能下降，但不能改变AD的病理进程。因此，亟需寻找和建立具有AD疾病修饰作用的新型防治方法。

老年斑和神经元纤维缠结是AD的重要病理特征。老年斑的主要组成物质是β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ），而神经元纤维缠结主要由过度磷酸化的Tau蛋白组成。Aβ是由39～43个氨基酸组成的多肽，Aβ40和Aβ42是其两种基本类型，来源于淀粉样前体蛋白(APP)。Aβ具有高度聚集能力，经神经元产生分泌后，会迅速聚集，形成可溶状态的寡聚体，而后进一步聚集形成Aβ纤维而沉积在脑内。当前的研究明确Aβ是AD的核心致病物质，其中Aβ寡聚体的神经毒性最强。Aβ在脑内过度产生和沉积，引起其周边神经元突触功能障碍、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激和继发炎性反应，导致神经元变性死亡，最终产生痴呆。这就是目前广泛接受的AD病因假说——Aβ级联假说（amyloidβcascade hypothesis）。由此，Aβ及其聚集体特别是寡聚体成为AD最重要的疾病生物标记物，而如何降低脑内Aβ水平也成为防治AD的重要策略。

减少产生和促进清除是降低脑内Aβ水平的关键手段。自20世纪90年代开始，首先探讨的是通过抑制Aβ产生的关键酶（β分泌酶和γ分泌酶）活性来减少Aβ的产生。但是，由于β分泌酶和γ分泌酶同时参与众多底物的代谢过程，简单地抑制其活性会因干扰神经元的正常生理功能而产生严重不良反应。γ分泌酶抑制剂（包括礼来的semagacestat和施贵宝的avagacestat）在临床试验中相继失败，使得APP代谢调节剂的研发热情跌至冰点。

在AD患者中，90%以上是迟发型病人。这些病人脑内Aβ产生速度与正常人相同，而Aβ清除速率明显低于正常对照。由此，加快脑内Aβ清除成为AD防治最重要的方向。免疫治疗是目前用于降低脑内Aβ水平最常用的策略，能够有效预防和清除Aβ沉积、抑制Aβ寡聚体的毒性作用、降低神经胶质增生、逆转神经突触损伤及改善认知功能。然而，免疫治疗本身存在一些重要的问题亟需解决：(1)Aβ-抗体免疫复合物诱发的不良反应：Aβ作为自身抗原，与进入脑内的抗体形成免疫复合物后，将可能诱发继发免疫反应而导致中枢神经系统炎症和血管壁的损伤，引起脑内炎症、脑微血管出血和血管源性脑水肿等不良反应；(2)目前有效的抗体都是针对Aβ氨基端的特异性抗体，由于Aβ氨基端的序列位于Aβ前体蛋白（APP）的胞外段，因此这些抗Aβ氨基端的抗体也会与神经元的APP结合而导致正常神经元遭到免疫攻击。鉴于免疫疗法的上述局限性，亟需探索新的降低脑内Aβ水平的策略。

高密度脂蛋白是一种天然的纳米载体，属脂蛋白中粒径最小的成员，由脂质和载脂蛋白（ApoA-I,ApoA-II,ApoE或ApoC）构成，介导体内胆固醇的逆向转运，具有抗动脉硬化、抗氧化、抗炎等功能。神经生物学研究表明，以ApoE为载脂蛋白成分的ApoE-高密度脂蛋白是脑内最主要的高密度脂蛋白类型，除了参与胆固醇转运外，同时参与Aβ代谢，介导其脑内降解和清除。该作用依赖于ApoE的亚型（ApoE2≈ApoE3>>ApoE4）及其脂化程度（ApoE-高密度脂蛋白>ApoE）。脑内ApoE的脂化主要由ABCA1蛋白介导。研究显示，ABCA1表达升高，脑内ApoE-高密度脂蛋白含量升高，Aβ沉积减少；反之，abca1基因敲除，脑内ApoE-高密度脂蛋白含量降低，Aβ沉积增加。由此可见，ApoE-高密度脂蛋白在介导脑内Aβ清除中起关键作用；此外，ApoA-I高密度脂蛋白也也被认为在AD中起着重要作用，同样可结合Aβ，减小其神经毒性。ApoA-I基因敲除可加速APP/PS1DeltaE9 AD模型鼠Aβ斑块沉积，加重记忆障碍；而其高表达可有效减少APP/PS1 AD模型鼠Aβ在血管壁的沉积，减少炎症，减轻记忆障碍。基于上述证据，我们认为，高密度脂蛋白具有天然的促进脑内Aβ清除的能力，提高体内高密度脂蛋白水平有望延缓AD疾病进程。

天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强。基于仿生学原理构建的重组高密度脂蛋白为解决该问题提供了一条途径。然而现有重组高密度脂蛋白直接药用仅见于动脉粥样硬化和糖尿病防治的零星报道，未见其在AD防治方面的应用研究。由此，本发明首次提出模拟机体天然的Aβ清除机制，构建仿生重组高密度脂蛋白，其体内应用将促进脑内Aβ清除，对AD疾病进程具有重要的调节作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

为了解决上述问题，本发明提供了仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成。

作为一个优选方案，所述脂质通过常规方法制备脂质体，而后与载脂蛋白共同孵育，通过自组装形成重组高密度脂蛋白，脂质质量占处方含量的20-95%，载脂蛋白质量占处方含量的5-80%。

作为一个优选方案，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ApoA-I及其模拟肽、ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。所述载脂蛋白优选ApoE及其模拟肽中的一种或多种。

作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白采用注射途径给药或者鼻腔途径给药。

作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为1-500nm，优选5-50nm。

作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白分散在药剂学上可以接受的缓冲溶液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

作为一个优选方案，所述仿生重组高密度脂蛋白可以包载药物，所述仿生重组高密度脂蛋白包载药物起协同防治阿尔茨海默病的作用，所述药物是指治疗或诊断阿尔茨海默病的药物，包括小分子化学药物，大分子多肽、蛋白、基因药物中的一种或者多种。

本发明所述的脂质可以是天然磷脂（蛋磷脂、豆磷脂）、合成磷脂（磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂）、鞘脂（鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂）、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。

所述的脂质体的制备方法采用薄膜水化法、注入法、复乳法、熔融法、冷冻干燥法、逆向蒸发法、高压乳匀法或超声法及Ca²⁺融合法。

本发明的优点在于，本发明首次提出将仿生重组高密度脂蛋白应用于制备预防和治疗阿尔茨海默病药物，解决了天然高密度脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点，其应用为AD防治药物研发提供新的思路，具有重要的研究价值和临床应用前景。仿生重组高密度脂蛋白的体内应用将对AD疾病进程具有重要的调节作用：①进入脑内的重组高密度脂蛋白通过高亲和力结合Aβ，增加脑内胰岛素降解酶、金属基质蛋白酶等对Aβ的胞外降解和小胶质细胞对Aβ的内吞和胞内降解；②降低脑内炎症反应；③血循环中的重组高密度脂蛋白，高亲和力结合Aβ，降低外周游离Aβ浓度，发挥外周漏漕效应，促进脑内Aβ的脑外转运。④此外，重组高密度脂蛋白是一种常用的药物载体，可载带其它药物以协同防治AD。

附图说明

图1为透射电镜观察(A)不载胆固醇酯的重组高密度脂蛋白（圆盘状）和(B)载胆固醇酯的重组高密度脂蛋白（球形）形态，标尺:20nm。

图2为重组高密度脂蛋白和对照脂质体与(A)Aβ_1-40单体、(B)Aβ_1-40寡聚体结合情况的比较，^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001与重组高密度脂蛋白存在显着性差异。

图3为重组高密度脂蛋白与(A)Aβ_1-42单体、(B)Aβ_1-42寡聚体的表面等离子共振结合曲线。

图4为与Aβ22℃共孵育48h后，点印记法考察ApoE3溶液和重组高密度脂蛋白对Aβ_1-40寡聚体形成的影响，(A)阴性对照：磷酸盐缓冲液；(B)ApoE3溶液；(C)重组高密度脂蛋白溶液。

图5为与Aβ37℃共孵育120h后，硫磺素T荧光法考察ApoE3溶液和重组高密度脂蛋白对Aβ_1-40纤丝形成的影响，以各组0h荧光值为100%，^***p<0.001，表明与阴性对照单独Aβ_1-40孵育组存在显着性差异。

图6为重组高密度脂蛋白(A)促进AD模型动物SAMP8小鼠的脑内Aβ清除，(B)减少小胶质细胞激活，^**p<0.01，^***p<0.001与生理盐水组存在显着性差异；^###p<0.001与正常对照组存在显着性差异。

图7为注射给药四周，Morris水迷宫实验考察重组高密度脂蛋白和载α-倒捻子素重组高密度脂蛋白对8月龄AD模型动物SAMP8小鼠潜伏期的影响，^*p<0.05,^**p<0.01表明与生理盐水组存在显着性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 重组高密度脂蛋白表征

(1)制备

脂质（磷脂酰胆碱+/-神经节苷脂+/-胆固醇+/-胆固醇油酸酯）（2-10mg）溶于氯仿中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加pH7.4磷酸盐缓冲液水化，50℃超声均质。加入0.5-5mg的ApoE3，继续超声50min。产品冷却至室温，孵育过夜，4℃保存备用。

(2)表征

重组高密度脂蛋白磷钨酸负染，透射电镜观察形态。激光粒度仪测定其粒径和表面电位。重组高密度脂蛋白成分分析：荧光分光光度计测定包载荧光探针量；HPLC测定包载药量；磷脂试剂盒（Phospholipids C assay kit）测定磷脂含量；Bradford法测定蛋白含量，计算ApoE3组装效率。

透射电镜结果如图1所示，不含胆固醇油酸酯的重组高密度脂蛋白呈规则扁平的圆盘状，多个叠加呈蚕茧状，膜结构清晰可见，粒径均一，小于20nM，与天然初生HDL形态相似（图1A）；而含胆固醇油酸酯的重组高密度脂蛋白呈粒径均一的圆球形，粒径15-20nm，与天然成熟HDL形态相似（图1B）。

实施例2 重组高密度脂蛋白结合Aβ_1-40单体、寡聚体

(1)制备

称取豆磷脂、蛋磷脂(2-10mg)和0.02mg荧光探针DiI放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，置于旋转蒸发仪20℃，避光真空1h除去有机溶剂。在圆底烧瓶中加入PBS溶液，37℃振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，40℃超声减小粒径，加入ApoE或ApoE模拟肽(0.1-10mg)，37℃孵育36h，4℃保存。

(2)重组高密度脂蛋白与Aβ_1-40单体、寡聚体的体外吸附结合实验

将Aβ_1-40单体（浓度为500μg/ml）或寡聚体（浓度为500μg/ml）的0.05MpH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠溶液加入到板孔中，每孔50μl，4℃孵育过夜。弃去孔内孵育液，将孵育过夜的板用封闭液（0.01M PBS，pH 7.4中含1%BSA，0.05%Tween-20）封闭1h，然后将荧光标记的重组高密度脂蛋白10μg/ml，50μg/ml，250μg/ml（按照磷脂量计算）分别加入到板孔中，37℃孵育过夜，PBS洗三遍，多功能酶标仪荧光检测，λem/ex为522nm/568nm。结果如图2所示，重组高密度脂蛋白与Aβ_1-40单体的结合荧光值在10μg/ml，50μg/ml，250μg/ml时分别为对照脂质体的1.94倍，1.26倍和1.48倍；与Aβ_1-40寡聚体的结合荧光值在10μg/ml，50μg/ml，250μg/ml时分别为对照脂质体的1.88倍，1.71倍和1.59倍，存在显着性差异。表明重组高密度脂蛋白具有较强的Aβ结合能力。

实施例3 重组高密度脂蛋白的Aβ亲合特性

(1)制备

称取磷脂酰胆碱、磷脂酸(2-10mg)放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，置于旋转蒸发仪减压除去有机溶剂。在圆底烧瓶中加入PBS溶液，37℃振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，40℃均质减小粒径，加入ApoE或ApoA-I(0.1-10mg)，37℃孵育36h，4℃保存。

(2)表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)实验验证重组高密度脂蛋白的Aβ亲合特性。

CM5芯片采用氨基偶联的方式将Aβ单体或者寡聚体固定：在用0.2MEDC和0.05M NHS对芯片表面进行活化后，将Aβ单体或者寡聚体稀释于pH4.0醋酸钠缓冲溶液中，使Aβ浓度为23μM，以30μl/min的速度注入420s，再用pH8.5的乙醇胺进行封闭。参比通道活化后直接用乙醇胺封闭。亲和力测试采用双信道模式检测：重组高密度脂蛋白稀释于pH 7.410mM PBS中，以30μl/min的速度注入到参比通道以及固定了Aβ的通道。接触时间为100s或300s，解离时间为400s。结果用Biacore T200 Evaluation Softeware程序进行分析，运用1:1结合模型计算亲和力值。结果显示，重组高密度脂蛋白与Aβ_1-42单体（monomer）、寡聚体（oligomer）均呈高亲和力结合（图3），动态法计算其与Aβ_1-42单体、寡聚体的亲和力常数KD值，分别为5.79nM和6.32nM（与抗原、抗体亲和力同一数量级），与天然HDL与Aβ的亲和力（5.7nM）相似，表明重组高密度脂蛋白具有良好的Aβ亲和特性。

实施例4 重组高密度脂蛋白抑制Aβ寡聚体、纤丝形成

(1)制备

称取2-10mg磷脂酰胆碱+/-鞘磷脂放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，旋转蒸发除去有机溶剂。加入Tris缓冲液，37℃振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，超声减小粒径。加入适量0.2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37℃50rpm孵育36h，4℃保存。

(2)点印记考察重组高密度脂蛋白对Aβ_1-40寡聚体形成的影响

取5μl 10mg/ml Aβ_1-40DMSO储备液3份分别加入以下溶液45μl：0.01MPBS、50μg/ml ApoE3溶液、重组高密度脂蛋白溶液（含ApoE3 50μg/ml，脂质250μg/ml）。置于恒温空气摇床400rpm，22℃，孵育48h，立即上样。Aβ寡聚体的特异性抗体A11和Aβ特异性抗体6E10分别对Aβ_1-40寡聚体和总Aβ_1-40免疫组化染色。结果如图4所示，ApoE3溶液和重组高密度脂蛋白均能抑制Aβ_1-40寡聚体形成。

(3)硫磺素T(ThT)荧光法考察重组高密度脂蛋白对Aβ_1-40纤丝形成的影响

取15μl 1mg/ml Aβ_1-40六氟异丙醇储备液，氮吹仪上氮气轻柔吹15min，挥干六氟异丙醇，加入34μl三蒸水，混匀，再分别加入16μl以下溶液：ApoE3溶液(50μg/ml)、重组高密度脂蛋白溶液（含ApoE3 50μg/ml，脂质250μg/ml），37℃孵育，并于0h，120h，取出样品进行ThT检测。结果如图5所示，重组高密度脂蛋白显着抑制Aβ_1-40纤丝形成。

实施例5 重组高密度脂蛋白注射给药促进AD模型动物脑内Aβ清除，减少小胶质细胞激活

(1)制备

称取2-10mg磷脂酰胆碱+/-鞘磷脂放入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解，旋转蒸发除去有机溶剂。加入Tris缓冲液，37℃振摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，超声减小粒径。加入适量0.2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37℃50rpm孵育36h，4℃保存。

(2)重组高密度脂蛋白促进AD模型动物SAMP8小鼠的脑内Aβ清除，减少小胶质细胞激活。

将10月龄AD模型小鼠SAMP8小鼠分为生理盐水组、重组高密度脂蛋白组。SAMR小鼠作为正常对照，给予生理盐水。静脉注射给药，连续给药2周。给药结束后，小鼠水合氯醛麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4%多聚甲醛溶液继续固定，浸蜡，包埋，切片，厚度4μm，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内Aβ聚集体免疫组化（一抗6E10），小胶质细胞激活（一抗anti-CD45）。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片观察并计数不同处理组动物大脑皮层、海马的Aβ沉积和小胶质细胞激活情况。

结果如图6所示，10月龄SAMP8小鼠连续15天尾静脉给予重组高密度脂蛋白（20mg/kg），脑内Aβ沉积和小胶质细胞激活情况明显少于生理盐水组。表明重组高密度脂蛋白能有效促进脑内Aβ清除，并降低脑内炎症，具有一定的AD疾病修饰作用。

实施例6 重组高密度脂蛋白鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用

(1)制备

脂质（DOTAP/DOPE+/-DMPC+/-PEG-DMPC）（2-10mg）溶于一定比例氯仿溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加含siRNA/MicroRNA(1-500μg)的Tris缓冲液水化，均质减小粒径。取1ml ApoE3/ApoA I模拟肽（0.5-5mg/ml）10min内加入，超声50min，继续孵育24h，4℃保存。

(2)重组高密度脂蛋白鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用

将7月龄AD模型小鼠APP/PS1转基因小鼠分为生理盐水组、重组高密度脂蛋白组。野生型B6小鼠作为正常对照，给予生理盐水。鼻腔给药4周。给药结束后，小鼠水合氯醛麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4%多聚甲醛溶液继续固定，浸蜡，包埋，切片，厚度4μm，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内Aβ聚集体免疫组化（一抗6E10），小胶质细胞激活（一抗anti-CD45）。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片观察并计数不同处理组动物大脑皮层、海马的Aβ沉积和小胶质细胞激活情况。结果显示，7月龄APP/PS1转基因小鼠连续4周鼻腔给予重组高密度脂蛋白，脑内Aβ沉积和小胶质细胞激活情况明显少于生理盐水组，表明重组高密度脂蛋白具有良好的AD疾病修饰作用。

实施例7 重组高密度脂蛋白与载带药物协同改善AD模型动物的空间学习记忆能力

(1)制备

脂质（DMPC/DMPE+/-GM1+/-胆固醇+/-胆固醇油酸酯）（2-10mg）、药物α-倒捻子素（0.1-2mg）溶于一定比例氯仿-甲醇混合溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加1ml Tris缓冲液水化，50℃超声减小粒径。取1ml ApoE3（0.5-5mg/ml）10min内加入，继续超声50min。产品冷却至室温，4℃过夜。

(2)重组高密度脂蛋白与载带药物协同改善AD模型动物的空间学习记忆能力

采用Morris水迷宫实验考察重组高密度脂蛋白和载多酚类药物α-倒捻子素的重组高密度脂蛋白对AD模型动物的空间学习记忆能力的改善作用。给药方法：将7月龄AD模型动物SAMP8小鼠分为生理盐水组，重组高密度脂蛋白(5mg/kg)，载α-倒捻子素的重组高密度脂蛋白(相当于给予α-倒捻子素1mg/kg)。SAMR小鼠作为正常对照，给予生理盐水。小鼠按照0.1ml/10g尾静脉注射给药，连续给药4周。

Morris水迷宫，水池直径120cm，高50cm，水深25cm，水温22±1℃。沿水池圆周等分为四个入水点，它们的连接线将圆形水池等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4个象限区域，在Ⅰ象限中心放置一个9cm黑色平台。平台低于水面约1cm。水池底、平台及四壁均以食用染料涂成黑色使平台不可见。采用Morris水迷宫视频分析系统2.0监测并记录小鼠的游泳轨迹。定位航行试验(Hiddenplatform test)：用于训练和测量小鼠的空间学习能力,与小鼠连续给药4周后休息2天开始，历时5天。将平台固定于Ⅰ象限中央，按照随机的原则分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的入水点将小鼠面向池壁放入水中，计算机监测并记录小鼠从入水开始寻找至找到并爬上黑色平台的路线、所需时间（潜伏期）及游泳速度等。如果小鼠60s内未找到平台，需将其引领到平台，并停留30s,这时潜伏期记为60s。每天训练4次/只，每次训练间隔30s。

结果如图7所示，正常对照小鼠SAMR组自第一天训练的后面两次就能比其它实验组动物更快地找到平台，整个实验过程中的潜伏期都比较短，且随着训练天数增加呈逐渐缩短的趋势，显示良好的空间学习记忆能力；相反，给予生理盐水的SAMP8小鼠直至第五天潜伏期依然很长(55.7±6.3s)，表现为明显的学习记忆障碍。给予重组高密度脂蛋白的SAMP8小鼠在训练前三天潜伏期明显缩短趋势，第三天潜伏期已与生理盐水组存在显着性差异，表明给予重组高密度脂蛋白能够有效提高SAMP8小鼠的空间学习记忆能力。给予α-倒捻子素的重组高密度脂蛋白更有效地缩短小鼠上台前潜伏期，训练第四天、第五天的潜伏期分别为37.5±6.0s，35.9±18.1s，与生理盐水组存在显着性差异，表明载药重组高密度脂蛋白可能通过重组高密度脂蛋白和多酚类药物的协同作用进一步增强对AD的疾病修饰作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白由脂质和载脂蛋白构成。

3.据权利要求2所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述脂质通过常规方法制备脂质体，而后与载脂蛋白共同孵育，通过自组装形成重组高密度脂蛋白，脂质质量占处方含量的20-95%，载脂蛋白质量占处方含量的5-80%。

4.根据权利要求2或3所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽、ApoA-I及其模拟肽、ApoA-II及其模拟肽、ApoC及其模拟肽中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述载脂蛋白是ApoE及其模拟肽中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白采用注射途径给药或者鼻腔途径给药。

7.根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为1-500nm。

8.根据权利要求7所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白的粒径范围为5-50nm。

9.根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白分散在药剂学上可以接受的缓冲溶液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液。

10.根据权利要求1所述的仿生重组高密度脂蛋白在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于，所述仿生重组高密度脂蛋白包载药物起协同防治阿尔茨海默病的作用，所述药物是指治疗或诊断阿尔茨海默病的药物，包括小分子化学药物，大分子多肽、蛋白、基因药物中的一种或者多种。