CN111494320A - 一种载糖皮质激素的纳米载体及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种载糖皮质激素的纳米载体，包括糖皮质激素核心，所述的糖皮质激素核心由糖皮质激素和磷酸钙核心构成，在所述的糖皮质激素核心的外周含有脂质体，在所述的脂质体的表面含有载脂蛋白。本发明还提供了上述纳米载体的制备方法。本发明还提供了上述的纳米载体在制备治疗炎症及巨噬细胞相关免疫性疾病的药物中的应用。本发明的糖皮质激素纳米载体能够有效靶向炎症相关巨噬细胞，使包载的糖皮质激素在较低的给药剂量即可有效降低巨噬细胞炎症因子的水平，有效改善狼疮疾病活动度，并且有效的减轻副作用提高安全性。该纳米载体可应用于系统性红斑狼疮的治疗，制备流程简单，具有较好的临床应用及转化前景。

Description

一种载糖皮质激素的纳米载体及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种纳米生物医学材料，尤其涉及一种载糖皮质激素的纳米载体及其制备和应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一类由于免疫系统异常激活所致的自身免疫性疾病，常伴有致病性的自身抗体产生，累及皮肤、关节、肾脏、血液等多个系统，是重要的致残和致死疾病，给社会带来巨大负担。在疾病的发病中，有多个环节参与，包括B细胞的免疫耐受异常、自身抗体产生、免疫复合物沉积、补体活化、炎症反应和组织损伤等。
许多研究表明巨噬细胞参与狼疮的发病和进展。M1型的巨噬细胞引起修复异常和持续的炎症反应。M2a、M2c型的巨噬细胞在SLE中显著减少，可能这两种细胞亚群有助于抑制SLE的进展。M2b型巨噬细胞则表现为促进SLE进展的作用，M2b型巨噬细胞浸润数量与小鼠的肾炎缓解程度负相关，与复发正相关。在狼疮患者中，肾脏单核巨噬细胞浸润与患者的不良预后显著相关。在肾小球中巨噬细胞的浸润可能与足细胞损伤、蛋白尿有关。因此，巨噬细胞是SLE治疗靶标的选择之一。
糖皮质激素是经典的抗炎药物，在SLE治疗的诱导阶段及缓解阶段都不可或缺，对于炎症相关的巨噬细胞也有重要的治疗作用。主要作用机制包括基因型与非基因型两种机制。经典的基因组效应为糖皮质激素通过细胞膜后与胞质内的糖皮质激素受体等结合，进而与反应性DNA结合，与转录因子产生互相作用。基因组效应至少需要30分钟才可表现出临床作用，非基因组效应则可通过抑制花生四烯酸的释放等途径在数分钟内发挥作用。在临床工作中，两种效应共同作用，诱导炎症细胞活化、增殖、分化、存活和凋亡。但糖皮质激素具有诸多副作用，主要是因为糖皮质激素所结合的糖皮质激素受体广泛存在于各类细胞中，缺乏特异性，因而使其基因组效应会在各组织中出现。因此，加强糖皮质激素的靶向性具有重要的意义。
研究发现天然高密度脂蛋白(HDL)与表达丰富ATP结合盒转运蛋白(G1ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)和清道夫受体B类1型(scavenger receptorclass B type 1,SR-B1)的巨噬细胞有极高的亲和力。HDL与巨噬细胞结合，上调活化转录因子3(activating transcription factor 3，ATF3)阻断Toll样受体介导的巨噬细胞活化，抑制促炎因子的产生。因此，HDL类似物的纳米药物与糖皮质激素结合是治疗系统性红斑狼疮炎症反应的新思路，不仅在于药物递送上的优势，充分发挥糖皮质激素的作用，可能还在于它可直接抑制炎症反应。
现有的公开技术并无靶向巨噬细胞且有效治疗系统性红斑狼疮的纳米载体，故本发明的纳米载体具有较好的研究价值和对系统性红斑狼疮等巨噬细胞相关疾病患者的临床应用及转化前景。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种载糖皮质激素的纳米载体及其制备和应用，所述的这种载糖皮质激素的纳米载体及其制备和应用要解决现有技术中的药物对于系统性红斑狼疮的靶向效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种载糖皮质激素的纳米载体，包括糖皮质激素核心，所述的糖皮质激素核心由糖皮质激素和磷酸钙核心构成，在所述的糖皮质激素核心的外周含有脂质体，在所述的脂质体的表面含有载脂蛋白。
进一步的，在所述的糖皮质激素核心表面还修饰有1,2-油酰磷脂酸。
进一步的，所述脂质体由卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂及其衍生物中的任意一种或者两种以上的组合构成。
作为一个优选方案，所述载糖皮质激素核心与脂质的质量比为1:5-1:200，优选1:20。
进一步的，所述载脂蛋白是载脂蛋白A-I(ApoA-I)及其模拟肽、ApoA-II、ApoA-IV及其模拟肽、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III及其模拟肽、ApoE及其模拟肽中的任意一种或者两种以上的组合。
进一步的，所述糖皮质激素为泼尼松龙、氢化可的松、醋酸可的松、可的松、波尼松、甲波尼龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟替卡松、氟米龙、阿氯米松、丁氯倍他松的磷酸盐中的任意一种或者两种以上的组合。
作为一个优选方案，所述核心为波尼松龙磷酸钠。
本发明还提供了上述一种载糖皮质激素的纳米载体的制备方法，包括如下步骤：
a)采用沉淀诱导的方法制备载糖皮质激素的磷酸钙核心；
b)采用薄膜水化法制备载糖皮质激素磷酸钙核心的脂质体；
c)通过在上述b)制备的溶液中加入载脂蛋白，制备得到所述的载糖皮质激素的纳米载体。
本发明还提供了上述的一种载糖皮质激素的纳米载体在制备治疗炎症及巨噬细胞相关免疫性疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的炎症及巨噬细胞相关免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、痛风、硬皮病、肿瘤、动脉粥样硬化或者结缔组织病。
本发明的一种载糖皮质激素的纳米载体基于靶向炎症相关巨噬细胞的原理，通过载带糖皮质激素核心，能够靶向递送糖皮质激素类药物，由此克服目前的糖皮质类激素副作用大缺少靶向性的阻碍，以较小的给药剂量提高了对系统性红斑狼疮的治疗效果。
故而本发明制备包载糖皮质激素核心的纳米载体，有效降低巨噬细胞内炎症因子的表达，显著降低狼疮小鼠的疾病活动度，有效缓解关节肿胀的临床表现，显著改善狼疮性肾炎。长期治疗后未引起肝功能损伤，并且可减轻血糖升高。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的糖皮质激素纳米载体能够有效靶向炎症相关巨噬细胞，使包载的糖皮质激素在较低的给药剂量即可有效降低巨噬细胞炎症因子的水平，有效改善狼疮疾病活动度，并且有效的减轻副作用提高安全性。该纳米载体可应用于系统性红斑狼疮的治疗，制备流程简单，具有较好的临床应用及转化前景。
附图说明
图1显示了粒径仪及透射电镜观察载泼尼松龙磷酸钠核心的纳米载体的形态。(A)光散射粒径分布；(B)透射电子显微镜照片；标尺：50nm。
图2显示了载糖皮质激素的纳米载体被LPS刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7摄取。(A)高内涵分析仪拍摄荧光照片；(B)平均每个细胞摄取制剂后DiI荧光强度的统计图。*p<0.05，****p<0.0001。
图3显示了载糖皮质激素的纳米载体对系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠模型病灶的体内靶向效果。(A)MRL/lpr小鼠和MRL/mpj小鼠器官(肝脏、脾脏、肾脏、关节)中的制剂分布；(B)激光共聚焦显微镜下观察肝脏冰冻切片中制剂分布情况，放大倍数200倍；(C)激光共聚焦显微镜下观察肾脏冰冻切片中制剂分布情况，放大倍数200倍。
图4显示了载糖皮质激素的纳米载体体外降低巨噬细胞内炎症因子表达；**p<0.01。
图5显示了载糖皮质激素的纳米载体对系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠模型的体内短期药效学评价。1mg/kg给药7天后，(A)13周龄小鼠测得的前爪厚度。*p<0.05；(B)双侧腋窝淋巴结大体观；(C)小鼠体重；(D)短期治疗给药前后血清anti-dsDNA抗体水平；(E)短期治疗给药前后血清尿素氮水平；(F)各组肾脏代表性HE染色病理切片。放大倍数：40倍。
图6显示了载糖皮质激素的纳米载体对系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠模型的体内长期药效学评价。(A)给药8周前后血清补体C3水平；(B)给药8周前后血清抗双链DNA水平；(C)8周给药前后，各组小鼠的12小时尿蛋白/肌酐比；(D)8周给药前后，各组小鼠的血清尿素氮水平；(E)8周给药后，各组小鼠的肾脏HE染色代表性切片。放大倍数：100倍；(F)PBS组的代表性肾炎表现。放大倍数：200倍。H.肾小球硬化。放大倍数：400倍；(G)前爪厚度；(H)8周给药结束后，各组小鼠腋窝淋巴结重量；(I)8周给药结束后，各组小鼠腋窝淋巴结大体观；(J)8周给药结束后，各组小鼠的体重；(K)各组小鼠的生存曲线；(L)8周给药后，各组小鼠的肾脏HE染色代表性切片病理评分；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；。
图7显示了载糖皮质激素的纳米载体的安全性评价。(A)丙氨酸氨基转移酶(B)外周血白细胞计数(C)甘油三酯(D)血糖；*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体的制备和表征
(1)制备
采用共沉淀法制备载泼尼松龙磷酸钠(prednisolone disodium phosphate，PLP)的磷酸钙核心：
由14.5ml环己烷和6ml Igepal CO-520形成油相。首先将600μL浓度为2.5M的CaCl2溶液缓慢滴加入20mL油相中形成钙相。再将460μL 16.3mM Na2HPO4(a.q.)与140μL60mM PLP(a.q.)混合液缓慢滴加入另一份20mL油相中，形成磷相，并加入400μL 20mM 1,2-油酰磷脂酸(1,2-dioleoyl phosphatidic acid，DOPA)溶液。搅拌均匀后，将钙相缓慢加入磷相，补加400μL 20mM DOPA，混合搅拌45min。随后，将40mL无水乙醇加入到上述混合微乳中破乳。破乳后的混合液通过高速离心(12500g)20min。再加乙醇洗涤经同样离心操作进行两次后，即可制得载PLP的磷酸钙核心，将其分散于2mL氯仿中存放于玻璃瓶中用于后续实验。
采用薄膜水化法制备载PLP磷酸钙核心的脂质体：
称取脂质(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱/二油酰磷脂酰胆碱/二棕榈酰磷脂酰胆碱(DMPC/DOPC/DPPC)+/-胆固醇+/-胆固醇油酸酯)4mg置于500mL圆底烧瓶中，加入2mL乙醚，挥干除去磷脂中的水分，再加入上述制备的磷酸钙固相内核330μL及2mL氯仿溶液，置旋转蒸发仪上抽真空1h。加入4mL PBS溶液，于40℃水浴间歇振摇至薄膜水化脱落得到脂质体。探头超声进一步减小脂质体粒径，得到载PLP的磷酸钙核心脂质体(PLP-loadedlipoprotein nanocarrier,PLP-CaP-LNC)。
将800μL 1μg/μL载脂蛋白E3(apolipoprotein E-3，ApoE3)水溶液加入到上述PLP-CaP-LNC溶液中，混匀后，置于震荡摇床120rpm，37℃孵育36h，得到载PLP的磷酸钙核心ApoE重组高密度脂蛋白(PLP loaded ApoE-based reconstituted high densitylipoprotein with a calcium phosphate core，PLP-CaP-rHDL)。
(2)表征
载泼尼松龙磷酸钠的重组脂蛋白磷钨酸负染，透射电镜观察形态。激光粒度仪测定其粒径和表面电位。如图1，在电镜下载泼尼松龙磷酸钠的的重组脂蛋白粒径大小在20nm左右(A)，呈均一的球形，分散均匀(B)，通过激光粒度仪测定其表面电位约为-22mV左右。
实施例2.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体被LPS刺激的小鼠巨噬细胞系RAW264.7摄取
(1)制备
同实施例1采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，同时加入荧光染料DiI(20-100μg)放入500ml圆底烧瓶中，后同实施例1制备载泼尼松龙磷酸钠的重组高密度脂蛋白纳米递药系统，得到荧光标记的载泼尼松龙磷酸钠的重组高密度脂蛋白纳米递药系统。
(2)LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7建立体外炎症模型
将细胞提前铺板于24孔培养板，细胞密度为5*10^4，等待细胞贴壁后(约2小时)，按照实验需求加入100ng/ml的LPS，刺激细胞6h后，收取细胞。
(3)细胞摄取实验
小鼠巨噬细胞RAW264.7接种至96孔细胞培养板。将96孔板中细胞分组：DiI-PLP-CaP-LNC组、DiI-PLP-CaP-rHDL组、LPS刺激+DiI-PLP-CaP-LNC组、LPS+DiI-PLP-CaP-rHDL组；按照实验所需组别分别给药。培养一段时间后用PBS洗涤3次，每孔加入100μl 4％甲醛固定，再用100μl PBS洗涤3次。DAPI染核10分钟后，再用PBS洗涤3次。随后将96孔板放入高内涵分析仪定量分析，拍摄荧光照片。
结果如图2所示，巨噬细胞在正常状态或LPS刺激后，对于PLP-CaP-rHDL的摄取均明显高于PLP-CaP-LNC，提示PLP-CaP-rHDL具有对巨噬细胞良好的靶向性。LPS刺激后促进了RAW264.7细胞对于PLP-CaP-rHDL的摄取。LPS刺激产生的炎症状态可促进巨噬细胞对于PLP-CaP-rHDL的摄取量，提示PLP-CaP-rHDL具有对处于炎症状态的巨噬细胞的靶向性。
实施例3.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体对系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠模型的体内靶向效果
(1)制备
同实施例2制备载荧光标记DiR的功能性穿膜肽修饰的脂质纳米递药系统。
(2)小动物活体成像实验观察体内分布：
将MRL/lpr小鼠、MRL/mpj小鼠分别分为PBS组、DiI-CaP-LNC组和DiI-CaP-rHDL组。每组小鼠尾静脉注射给药，2小时后，腹腔注射水合氯醛麻醉，取组织(脑、心脏、脾脏、肺、双肾、双下肢)置于活体成像仪中，使用Maestro体内成像系统拍摄组织成像照片。
小鼠分组、给药方案与成像实验一致，给药2小时后将小鼠麻醉处死，解剖分离出左心室，灌流生理盐水，冲洗体内的血液至双肺呈乳白色，灌流4％多聚甲醛，至尾部变硬，取出组织，制作冰冻切片，用激光共聚焦显微镜拍摄冰冻切片照片。
如图3所示，在组织活体成像中，观察到各组小鼠的肝脏和脾脏内均有纳米制剂聚集(A)，提示纳米制剂进入体循环。在狼疮小鼠的肾脏和关节中(A)，可见明显的纳米制剂聚集，DiI-CaP-LNC和DiI-CaP-rHDL两者无明显差异。与组织活体成像结果一致，冰冻切片中可见在肝脏中各组小鼠均可见两种制剂聚集(B)，狼疮小鼠肾脏内可见明显DiI-CaP-rHDL的聚集(C)，DiI-CaP-LNC则分布较少，在对照组小鼠、PBS组中未观察到两种制剂聚集，提示DiI-CaP-rHDL可能具有靶向狼疮小鼠肾炎的趋势。
实施例4.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体对降低巨噬细胞内炎症因子表达的体外药效学评价
将细胞分为无LPS刺激、LPS刺激、LPS刺激+PLP、LPS刺激+PLP-CaP-LNC、LPS刺激+PLP-CaP-rHDL组，使用LPS 100ng/ml、游离药物或纳米制剂10μg/ml刺激小鼠巨噬细胞6小时后，收集细胞，用实时定量荧光PCR法检测细胞内炎症因子IL-6,IL-1b,TNF-a的mRNA表达。
结果如图4所示，LPS刺激后炎症通路得以充分活化，测得炎症因子mRNA表达水平的升高。与使用游离药物组相比，纳米制剂组处理细胞后，巨噬细胞内炎症因子IL-6(A),IL-1b(B),TNF-a(C)分mRNA的水平表达较前明显下降。与PLP-CaP-LNC相比，PLP-CaP-rHDL降低各炎症因子mRNA水平的作用更强。(*p<0.05，**p<0.01)
实施例5.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体对系统性红斑狼疮MRL/lpr小鼠模型的体内药效学评价
(1)短期治疗药效学评价
将12只雌性10周龄MRL/lpr狼疮小鼠随机分为4组，于12周开始，尾静脉注射给药，连续7天，每天1次；4组分别给予PLP-CaP-LNC、PLP-CaP-rHDL、PLP、PBS(给药量：1mg/kg)。
标本采集：分别于给药前和7天给药结束后，对小鼠称重、用游标卡尺测量小鼠双前爪厚度。给药前，眼球内眦采血约200μl，留取血清；7天给药结束后，收集全部血液，留取血清。小鼠用颈椎脱臼法处死后，分离腋下和肠系膜淋巴结、脾脏，测量大小，拍照；分离双侧肾，4％甲醛固定。
(2)长期治疗药效学评价
将20只雌性10周龄MRL/lpr狼疮小鼠随机分为4组，于12周开始，尾静脉注射给药，每周三次(每周一、三、五)，给药8周；4组分别给予PLP-CaP-LNC、PLP-CaP-rHDL、PLP、PBS(给药量：0.25mg/kg)。
标本采集：从小鼠12周龄开始(给药前)，每2周收集12小时尿液，保存于-80℃冰箱。每2周眼球内眦采血约200μl，留取血清，分装后保存于-80℃冰箱。每周纪录小鼠体重。如在一周内小鼠出现活动减少、体温骤减、体重骤降等体征，提示小鼠可能状态不佳，予以在小鼠存活时提前处死，保留标本。收集12小时尿液方法如下：将小鼠置于代谢笼中，共24小时，禁食、不禁水，将获得的尿液标本转移至5ml EP管中。于小鼠20周龄时(给药8周后)，用游标卡尺测量小鼠双前爪的厚度。用肝素抗凝管采集小鼠全血50μl，用于全血细胞分析检测。腹腔麻醉后摘除眼球取血，处死所有小鼠，留取血清、淋巴结、肾脏、脾脏、双侧膝关节标本。淋巴结、脾脏称重、拍照。血清分装后保存于-80℃冰箱。一侧肾脏放入4％多聚甲醛固定，一侧肾脏处理后分别保存于-80℃冰箱和液氮中。
BCA法蛋白定量：用PierceTM BCA Protein Assay Kit试剂测定。标准品分别稀释为25μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml。工作液按照试剂A：试剂B＝50:1的比例配制。尿液标本用ddH2O稀释50倍。标准品、待测样品各25μl，加入至96孔板，ddH2O作为空白对照孔。每孔内再加入200μl工作液。摇晃30秒后37℃孵育30分钟。取出后冷却至室温水平。用酶标仪在562nm处，测定各孔OD值。根据标准品的浓度和测得的OD值，绘制标准曲线。根据样品测得的OD值，在标准曲线上算得所对应的浓度。
尿肌酐测定：用Creatinine Assay Kit试剂检测尿肌酐含量。尿液标本用ddH2O稀释10倍。标准品、待测样品各6μl，加入至96孔板，ddH2O作为空白对照孔。每孔加入180μl酶溶液A，混匀后37℃孵育5分钟，于546nm波长处测定吸光值A1。每孔加入60μl酶溶液B，混匀后37℃孵育5分钟，于546nm波长处测定吸光值A2。肌酐含量(μmol/l)＝((测定A2-K*测定A1)-(空白A2-K*空白A1))/((标准A2-K*标准A1)-(空白A2-K*空白A1))＊标准品浓度。其中标准品浓度为442μmol/l。稀释因子K＝(加样量+酶溶液A体积)/(加样量+酶溶液A体积+酶溶液B体积)＝186/246。
血清抗双链DNA、血清补体C3的测定：采用预包被的ELISA试剂盒，使用前从4℃冰箱取出，放置于室温平衡，20分钟。按照20x的洗涤缓冲液：ddH2O＝1:20的比例配制洗涤液；按照样本：样本稀释液＝1:4的比例稀释样本。将不同浓度的标准品和稀释好的样品各50μl加入板条的孔内，每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，混匀后用封板膜封孔，置于37℃恒温箱温育60分钟。随后，弃去孔内液体，于吸水纸上印干，每孔加满洗涤液后静置约1分钟，甩干孔内洗涤液，充分洗板5次。接着，每孔加入各50μl的底物A和底物B，37℃避光孵育15分钟；每孔加入50μ终止液，混匀。在15分钟内，于酶标仪上在450nm处测定各孔的OD值。用标准品绘制线性回归曲线，按照方程计算每个样品的浓度。(抗双链DNA抗体试剂盒的标准品浓度为：0pg/ml、15pg/ml、30pg/ml、60pg/ml、120pg/ml、240pg/ml。补体C3试剂盒的标准品浓度为：0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml。)
血清尿素氮的测定：用ddH2O 50倍稀释血清样本。在96孔板各孔中分别加入50μl的样品和浓度分别为10mg/dl、5mg/dl、2.5mg/dl、1.25mg/dl、0.625mg/dl、0.3125mg/dl、0.156mg/dl的标准品。在空白孔中加入50μl的ddH2O作为空白对照。每孔中加入各75μl的试剂A和试剂B。混匀后，在室温中孵育30分钟。用酶标仪读取450nm处的OD值。计算每个副孔的平均值。减去空白孔的OD值，绘制线性标准曲线。根据标准曲线，计算样品的浓度。
肾脏苏木精/伊红染色：收集的肾脏标本于4％多聚甲醛内固定过夜(不超过24小时)，包埋，制成蜡块。用切片机切成2μm组织切片。苏木精染色10分钟，ddH2O洗1分钟；1％盐酸乙醇内分化10秒，ddH2O洗2分钟；1％氨水内反蓝10秒，ddH2O洗2分钟；1％伊红染色6分钟。ddH2O洗2分钟。从低浓度到高浓度乙醇中脱水：70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇和95％乙醇内分别脱水1分钟，无水乙醇内脱水2分钟。二甲苯透明脱蜡2分钟，共2遍。封片剂封片。在显微镜下观察，拍照记录。
短期治疗药效学评价结果如图5所示，短期治疗可显著减小MRL/lpr小鼠前爪厚度，缓解其关节肿胀(A)(*p<0.05)；与其他组相比，只有PLP-CaP-rHDL组部分小鼠已出现淋巴结体积减小(B)；各组小鼠均有体重不同程度减轻，PLP-CaP-rHDL组减轻程度近14％，而对照组减轻7-8％之间(C)；短期用药前后，小鼠抗双链DNA水平无明显差异，短期治疗对于改善疾病活动度指标anti-dsDNA无明显作用(D)；短期用药前后，各组血清尿素氮水平无显著差异(E)，组织切片可见短期用药对肾功能无明显保护、改善作用(F)。
长期治疗药效学评价结果如图6所示，PLP-CaP-rHDL可显著改善MRL/lpr小鼠血清免疫学疾病活动指标(补体C3、抗dsDNA抗体)(A、B)；PLP-CaP-rHDL引起了尿蛋白减少(C)(p<0.05)和血清尿素氮水平下降；病理切片中可见PLP-CaP-rHDL治疗组肾脏中炎症细胞浸润明显减轻，有少量的管型形成，肾小球结构基本正常，其余组均可见明显的肾脏病理改变(E、F)；PLP-CaP-rHDL可缓解MRL/lpr小鼠关节肿胀现象(G)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，PLP-CaP-LNC组治疗后体积最小(H)，各处理组体重变化无显著差异(J)；与普通的糖皮质激素相比，纳米制剂组可一定程度延长生存期(K)。由肾脏病理学专家随机盲法读片，评估是否存在符合ISN/RPS2003狼疮肾炎分类标准的各类病变。结果显示，肾小球损伤评分中PLP-CaP-rHDL组分数最低，病变最轻，与各组存在统计学差异，提示PLP-CaP-rHDL具有显著治疗作用(L、M)。
实施例6.载泼尼松龙磷酸钠的纳米载体的安全性评价
(1)制备
制备方法同实施例1。
(2)外周血白细胞计数和血清丙氨酸氨基转移酶、甘油三脂、血糖的检测：委托上海斯莱克实验动物中心完成，使用全自动生化分析仪和全自动血液分析仪根据动物种属进行检测。
结果如图7所示，纳米制剂给药组没有引起肝功能异常(A)；未见白细胞水平异常升高或下降(B)；各组间甘油三酯水平基本一致(C)；纳米药物可减轻血糖的升高(D)。

Claims (9)

1.一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：包括糖皮质激素核心，所述的糖皮质激素核心由糖皮质激素和磷酸钙核心构成，在所述的糖皮质激素核心的外周含有脂质体，所述的脂质体的表面含有载脂蛋白。
2.根据权利要求1所述一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：在所述的糖皮质激素核心表面还修饰有1,2-油酰磷脂酸。
3.根据权利要求1所述一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：所述脂质体由卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂及其衍生物中的任意一种或者两种以上的组合构成。
4.根据权利要求1所述一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：所述载糖皮质激素核心与脂质体的质量比为1:5-1:200。
5.根据权利要求1所述的一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：所述载脂蛋白是载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)及其模拟肽、ApoA-II、ApoA-IV及其模拟肽、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III及其模拟肽、ApoE及其模拟肽中的任意一种或者两种以上的组合。
6.根据权利要求1所述的一种载糖皮质激素的纳米载体，其特征在于：所述糖皮质激素为泼尼松龙、氢化可的松、醋酸可的松、可的松、波尼松、甲波尼龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟替卡松、氟米龙、阿氯米松、丁氯倍他松的磷酸盐中的任意一种或者两种以上的组合。
7.权利要求1所述一种载糖皮质激素的纳米载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a)采用沉淀诱导的方法制备载糖皮质激素的磷酸钙核心；
b)采用薄膜水化法制备载糖皮质激素磷酸钙核心的脂质体；
c)通过在上述b)制备的溶液中加入载脂蛋白，制备得到所述的载糖皮质激素的纳米载体。
8.权利要求1所述的一种载糖皮质激素的纳米载体在制备治疗炎症及巨噬细胞相关免疫性疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的炎症及巨噬细胞相关免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、痛风、硬皮病、肿瘤、动脉粥样硬化或者结缔组织病。
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